Summary
우리는 이전에 우리가 닿는 바퀴벌레의 개별 단위의 활동을 모니터링 할 수 있습니다 바퀴벌레 뇌의 중심 단지로 사극 전선을 주입하는 기술을 개발했다. 여기에서 우리는 우리가 자유롭게 곤충을 움직이는 뇌 활동을 기록 할 수 있도록하는 기술의 수정 된 버전을 제시한다.
Abstract
곤충 모터 제어의 두뇌 활동의 역할에 대한 관심의 증가는 우리가 곤충이 자연적인 동작을 수행하는 동안 신경 활동을 모니터 할 수 있어야합니다. 속박 된 바퀴벌레가 설정 또는 변경 보행 속도 동안 우리는 이전에 우리가 동시에 여러 뉴런의 활동을 기록 할 수 바퀴벌레 뇌의 중심 단지로 사극 전선을 주입하는 기술을 개발했다. 주요 사전 동안 닿는 제제는 제한된 동작에 대한 액세스를 제공하고 종종 자유롭게 동물을 이동에서 발생 피드백 과정이 없다. 우리는 지금 우리가 경기장에서 도보로, 회전 상승 또는 터널링 장벽에 의해 처리로 자유롭게 바퀴벌레 이동의 중심 복잡한에서 기록 할 수 있도록하는 기술의 수정 된 버전을 제시한다. 고속 비디오 및 클러스터 절단과 함께, 우리는 이제 자유롭게 행동 곤충의 움직임의 다양한 매개 변수에 뇌의 활동을 관련 될 수있다.
Introduction
곤충은 아래에, 주위에 터널을 설정하거나 장애물을 통해 상승하는 원인이 개체와 경기장 및 상품의 안내로이 기사는 중앙 복잡한 바퀴벌레, Blaberus의 discoidalis의 (CC) 내에서 뉴런에서 기록하는 성공적인 시스템을 설명합니다. 전선은 필연적 인 행동 변화와 주변 neuropil 활동을 보여주고있는 자극에 연결할 수 있습니다.
지난 십 년간 상당한 관심 곤충의 행동을 제어하는 다양한 뇌 영역에서 수행하는 역할에 지시했습니다. 이 초점의 대부분은 공동으로 중앙 복잡한 (CC)이라고합니다 중간 선 뇌 neuropils 향한되었습니다. 진행 동작의 CC의 역할에 대한 질문을 대상으로 기술의 다양한 종류의 결과로 만들어진되었습니다. 이러한 기술은 behavi과 함께 주로 초파리 neurogenetic 조작, 범위CC와 행동으로 관련 매개 변수에 그 활동을 관련 시도에서 신경 활동을 모니터 전기 생리학 기술 경구 분석 1-3.
전기 생리학 기술들은 멀티 채널 프로브를 10, 11으로, 개인 식별 뉴런 4-9 및 세포 녹화에서 세포 내 기록이 (가) 있습니다. 이 두 기술은 무료로 이용하실 수 있습니다. 날카로운 전극 또는 전체 세포 패치 세포 내 기록이 확인 된 뉴런에 대한 매우 상세한 데이터를 제공하지만, 한 번에 하나 또는 두 개의 세포로 제한, 제한되거나 운동이 필요하고 시간이 상대적으로 짧은 기간 동안 유지 될 수있다. 세포 외 기록은 쉽게 억제를 필요로하지 않고, 설정 될 수 있고, 시간 동안 유지 될 수있다. 멀티 채널 tetrodes 및 클러스터 절단으로, 신경 세포의 상당히 큰 인구는 9,12 동시에 분석 할 수 있습니다. 반면 전체 휴대 덧대 어 깁기 Diy시간이 성공적으로 닿는 곤충 (13)에 사용 된, 우리는 그들이 앞으로 이동에 대한 장벽에 대처로 우리가 자유롭게 곤충 행동에 오랜 기간 동안 뇌의 신경 활동을 기록 할 수있는 기술에 대한 필요성도 있습니다 생각합니다.
아래 곤충의 움직임과 최대 반사와 같은 기록 할 필요가 세포 외 기록 방법으로 우리를 밀어. 우리는 상업적으로 이용 가능한 16 채널 실리콘 프로브 (11)에 구속 준비에 좋은 성공의 기록을 가지고있다, 그러나도 큰 바퀴벌레의 작은 크기는 프로브가 몸을 장착 할 필요가 있다는 것을 의미한다. 즉, 프로브 타인의 섬세함과 함께, 무료 도보로 준비하기에 부적절했다. 이전의 두 프로젝트에서 우리는 유사한 기록 속성을 달성하기 위해 사극을 형성하는 미세 와이어 번들을 사용하지만보다 강력한 배열. 이러한 사극 번들은 우리가 닿는 바퀴벌레에서 기록 할 수속도 14을 걷고로드 (10)와 더듬이 접촉으로 인해 발생하는 문제를 선회의 변화에 CC 유닛 활동을 관련 거라고.
이 닿는 준비가되었습니다 앞으로도 계속 될으로 유용한, 그들은 몇 가지 제한 사항을 제시 할. 첫째, 곤충 수행 할 수있는 행동은 하나의 평면에 제한됩니다. 즉, 우리가 쉽게 보행 속도 또는 회전의 변화를 불러 일으킬 수있는,하지만 등산과 터널링 작업은 적어도 일반적인 밧줄 배열로 가능하지 않았다. 둘째, 우리 곁에 준비 "루프"입니다. 즉, 그들이 시스템에 수직 운동과 관련된 피드백을 허용하지 않는 것이다. 바퀴벌레는 우리의 밧줄에 보니 따라서, 시각적 세계는 그에 따라 변경되지 않았습니다. 그것은 이런 종류의 피드백을 소개하는 폐쇄 루프 밧줄 시스템을 구축 할 수 있습니다. 그러나, 이들은 모의 시각적 환경의 프로그래밍 및 하드웨어의 복잡도에 의해 제한된다. Nevertheles의, 우리는 그것의 자연 환경에서와 마찬가지로 경기장 트랙 및 발견 된 개체에서 자유롭게 걸어 우리가 동물에서 기록하여 기존 닿는 기록 방법을 개선 할 수 있음을 느꼈다.
뇌의 활동 (15)를 기록하기위한 무선 시스템이 이상적인 것 있지만, 현재의 시스템은 레코딩 채널의 수, 데이터 수집, 배터리 수명과 무게의 시간에 한계가있다. 그러므로 우리는 자유롭게 준비를 이동에 사용하기 위해 우리 곁에 기록 시스템을 적용하기 위해 노력하기로했다. 나은 무선 시스템이 제공되면,이 기술은 좀처럼 그러한 장치에 적용될 수있다. 이 문서에 설명되어있는 시스템은 경량 매우 잘 작동하고 바퀴벌레의 행동에 약간 해로운 영향을 미칠 것으로 보인다. 저렴한 고속 카메라와 클러스터 절단 소프트웨어와 함께, 각각의 뇌 신경 세포의 활동은 운동과 관련 될 수있다. 여기서 우리는 prepar을 설명사극 와이어와 곤충의 뇌에 자신의 주입뿐만 아니라 전기 활동과 운동과 이러한 데이터를 기록하는 기술의 ATION 후속 분석을 위해 소집 할 수있다.
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Protocol
1. 사극 와이어의 제조
- 약 1.1 m 길이의 매우 얇은 니크롬 선 (12 μm의 직경, PAC 코팅)를 잡아 당깁니다. 양쪽 끝을 테이프 태그를 부착합니다. 두 끝은 벤치 탑 근처의 같은 높이에 있는지 등의 수평 나사 막대를 통해 와이어를 끊습니다.
- 4의 총 두 개 더 끝을 만들고, 두 번째 와이어를위한 단계 1.1를 반복 한 다음 첫 번째 선 (사이에 약 1 ㎝)에 배치합니다.
- 테이프 태그와 함께 네 개의 끝을 찌르고 전동 회전 권선 장치에 태그를 부착합니다. 이 장치는 저렴한 DC 모터로 제조 될 수있다.
- 2 분 (60 RPM)에 대해 일방향으로 사극을 감아 30 초간 반대 방향으로 긴장.
- 함께 전선을 융합 히트 건을 사용합니다. 총을 들고 전선을 만지지 마십시오. 각 패스는 약 10 초를 복용, 위아래로 통과 교류 방향에서 세 가지를 사용합니다.
- 위쪽 및 상처 와이어의 하단을 잘라. 4 개의 선을 꼬아거라고 일단 융합 그러나 다른에서 분리합니다.
- 지원 관을 추가합니다. 폴리에틸렌 관의 30 cm 길이 (: 내부 0.28 mm, 외부 0.61 mm 직경) 잘라. 아주 천천히 조심스럽게 지원 관에 틀리지 않도록 사극 실.
- 융합 단부가 다른 쪽을 나타나면 가이드 튜브의 양단의 와이어의 동일한 길이가 있기 때문에, 그것을 통해 당겨.
- 집게로 각 전선의 별도의 끝을 잡아. 가스 버너의 불꽃의 기본을 사용하여주의 깊게 각 전선의 마지막 2 ~ 3 ㎜의 오프 절연을 구울 수 있습니다. 이 점등 될 때까지 와이어를 가열하지만, 컬하지 않습니다.
- 녹화 장치에 맞는 남녀 IC 소켓 어댑터로 사극을 연결합니다. 집게로 어댑터의 다른 소켓에 각 전선의 deinsulated 끝을 넣어. 작은 황동 핀 소켓에 전선을 안정. 좋은 점 납땜 인두를 사용하여 용융 된 솔더 소켓을 채 웁니다. 접촉하지 않도록주의하십시오납땜 인두 깨지기 쉬운 와이어.
- 각 전선의 임피던스 및 전선의 각 쌍의 상호 임피던스를 확인합니다.
- 식염수 용기에 융합, 트위스트 끝을 놓고 옴 미터에 생리 식염수에서 구리 전선 도체를 연결합니다.
- 와이어를 포함하는 소켓 핀 미터의 다른 쪽 끝을 연결합니다. 각 전선의 임피던스는 3 MΩ 이하이어야한다.
- 상기 값이 달성되지 않으면, 땜납 접속을 재 시도.
- 식염수에서 전선을 제거 물을 팁을 씻어, 각 페어링 간 와이어 임피던스 테스트 (N = 6). 간 임피던스는 5 MΩ 이상이어야합니다.
- 상기 값이 달성되지 않은 경우, 융합 끝에 팁 오프 소량 슬라이스 재시험.
- 전선의 모든 임피던스 요구 사항을 모두 충족하지 않는 와이어 세트를 폐기하십시오.
- 사극을 고정합니다.
- 작은 직사각형의 종이 상자 slig 배소켓 어댑터보다 큰 htly.
- 하단의 남성면 상자에 어댑터를 전송합니다. 어댑터의 나머지는 상자 안에있는 동안 남성 측의 모든 핀이 상자 이상이되도록 상자를 침투.
- 외부에있는 상자의 모서리를 테이프. 와이어의 개별 물가를 안정시키기 위해 상자의 안쪽에 양면 접착 테이프의 작은 조각을 사용합니다. 이 상자를 종료로 와이어가 융합되어야한다.
- 빠른 설정 2 부분 에폭시 혼합 어댑터와 모든 전선을 확보하기 위해 상자에 붓는다.
- 치과 용 왁스와 함께 박스의 일측에 상기 가이드 튜브의 단부 근처 부착하지만 튜빙 사극 양단에서 자유롭게 통해 당겨질 수 있도록 열 남긴다.
- 사극을 선명하게.
- 각 실험 전에 날카로운 메스 블레이드가 아닌 가위로 사극의 끝을 잘라. 이것은 분쇄 방지하고 다음 단계를 위해 클린 편평한 가장자리를 제공하면서 와이어 플레잉 종료한다.
- 원하는 결과는 각 와이어의 끝에서 제거 절연 소량의 뾰족한 끝을 직선에서 번들 끝을 변환합니다. 사극을 도금하기 전에 해부 현미경을 사용하여 점을 확인합니다. 모든 소모가 끝 부분에 발생하는 경우, 재 절단 및 repolish.
- 만약 subsequ 동안 임피던스 테스트엔트 도금 단계는 매우 낮은 간 와이어 값 (이하 4 MΩ)를 보여줍니다, 그것은 연마 단계에서 제거 재료를 너무 많이 나타냅니다. 재연 마 가공과 사극을 repolish.
- 각 실험 전에 날카로운 메스 블레이드가 아닌 가위로 사극의 끝을 잘라. 이것은 분쇄 방지하고 다음 단계를 위해 클린 편평한 가장자리를 제공하면서 와이어 플레잉 종료한다.
- 사극 플레이트. 포화 황산 구리 용액 (85 ㎖의 물, 5 ㎖의 황산, 50g의 황산 구리)로 사극의 팁을 넣어. 판 자극 아이솔레이터 2.5 μA의 전류를 각 전선. , 1 초에 전류를 주입 1 초 동안 일시 중지하고이 과정을 반복 배속.
- 각 전선의 임피던스 및 전선의 각 쌍의 interimpedance을 확인합니다. 각 전선의 임피던스는 0.5 MΩ 및 간 임피던스가 4 MΩ 이상이어야 사이 여야합니다.
- 멀티 채널 녹음 시스템의 headstage에 어댑터를 장착합니다.
- 미세 조작기에 구부러진 곤충 핀을 연결합니다. 치과 왁스와 곤충 핀에 사극의 끝을 연결합니다
2. 동물 준비
- 마취얼음 바퀴벌레.
- 바퀴벌레가 이동을 중지 한 후, 곤충에 걸쳐 큰 안장 핀 플랫 코르크 표면에 수직으로 바퀴벌레를 억제하지만 신체의 어떤 부분을 통과하지 않습니다.
- 플라스틱 용기에 준비를 전송하고 혈류 및 신체 움직임을 최소화하기 위해 동물의 주위에 얼음을 배치.
- 머리를 지원하고 안정화하기 위해 머리 주위에 치과 왁스를 배치 목에 플라스틱 고리를 배치합니다.
- 면도날 ocelli 사이에 작은 창을 잘라 머리에서 표피를 제거합니다.
- 뇌를 노출 집게로 결합 조직과 지방을 제거합니다.
- 뇌 조직을 커버하기 위해 머리를 캡슐에 어떤 바퀴벌레 식염수를 놓습니다.
- 뇌를 desheath하려면 부드럽게 뇌의 상단에 칼집을 잡고 와이어 이식 영역에서 떨어져 칼집을 찢어 다른 미세 집게를 사용하는 미세 집게를 사용합니다.
- 두뇌의 기지에 머리 캡슐 앞쪽에 작은 구멍을 엽니 다H 곤충 핀. 참조 / 접지 전극 역할을하는 구멍에 구리 와이어를 절연 세 가지 큰 직경 (56 μM)의 브레이드를 삽입합니다.
- 미세 조작기와 뇌 표면에 사극의 끝을 내리고 그 뇌 영역 근처에 위치.
- 조심스럽게 사극에 얇은 아세테이트 시트의 두 개의 작은 조각 머리 캡슐의 구멍보다 약간 큰 (2mm x 1 ㎜), 전방 및 후방 배치합니다.
- 녹화 시스템을 켭니다.
- 천천히 녹음 품질에 따라 뇌의 표면 아래의 사극 150 ~ 250 μm의를 내립니다.
- 기록 시스템의 전원을 끕니다.
- (그림 1A)을 터치하지 않고 가능한 한 사극에 가까운 아세테이트 시트의 두 조각을 이동합니다.
- 작은 주걱 평평 피하 주사 바늘을 가열 액체 왁스 주걱의 끝이되도록 치과 왁스에 넣어. 조심스럽게에서 아세테이트 시트의 각 조각의 끝을 터치액체 왁스가 각각의 조각에 흐르게하고 그리고 헤드 표피 사이의 틈새를 밀봉 할 수 있도록 주걱 사극.
- 2.16 단계를 반복합니다. 아세테이트 시트마다에 액체 왁스의 작은 금액을 삭제합니다. 멀리 사극의 절차를 시작하고 그것을 향해 서서히 이동합니다. 결국 사극 치과 왁스로 고정됩니다. 공동으로 뇌에 뜨거운 왁스를 받고 마십시오.
- 왁스의 참조 / 접지 전극을 고정하는 2.16 및 2.17 단계와 동일한 방법을 사용합니다.
- 그것에서 사극을 해제 미세 조작기에 사극을 첨부 왁스를 가열한다.
- 루프 스트레인 릴리프 (그림 1B)를 제공하기 위해 머리에 치과 왁스로 사극.
- 치과 왁스 (그림 1C)와 스트레인 릴리프 루프를 커버.
- 조심스럽게 제약 조건을 제거하고 배양 접시에 준비를 전송할 수 있습니다. 큰 안장 핀 준비 등의 측면을 억제합니다.
- 첨부접착제 총을 사용하는 등판 라드. 이것은 복부에 앞가슴 등판에서 확장하는 나무 막대기입니다.
- 치과 왁스로드의 후방 끝으로 사극 튜브의 끝을 연결합니다.
- 치과 용 왁스와로드의 전단에 사극 및 기준 / 접지 전극을 고정.
- 극력 튜브 소켓 단부로부터 사극 당겨, 그러나 동물 튜브 (도 1D)의 외부 사극의 부분이 손상 될 수있는 가능성을 제거하기 위해,에 잡아 당기지 않는다.
- 모든 제약 조건을 제거합니다. 치과 왁스 사극 튜브에 대한 참조 / 접지 전극을 연결합니다.
- 어떤 실험을하기 전에 얼음 마취에서 회복하기 위해 동물을 위해 최소한 60 분을 기다립니다.
3. 실험 절차
- 기록 시스템 및 직렬 포트 케이블에 USB를 사용하여 LED 조명 모두와 PC를 연결합니다.
- 신경 녹음을 시작합니다.
- 고속 카메라를 사용하여 실험을 등산 Motmot 이미지 수집 패키지 16 또는 120 FPS를 사용하여 실험을 산책 초당 20 프레임의 비디오 녹화를 시작합니다.
- 산책 실험 또는 58cm, 길이 5cm, 폭과 실험을 등산 5cm 높은 무대를 위해 X 40cm의 유리 야 경기장 40cm로 바퀴벌레를 놓습니다. 도보로 이동할 수있는 분야는 headstage가있는 위의 무대의 중심에 오른쪽 벽의 중간에서 연장 투명한 장벽이있다. 배리어는 카메라 뷰가 headstage 의해 차단 영역에서 산책에서 동물을 방지하기 위해 사용된다. 등반 경기장 아크릴 블록 (1.2 cm 1.8 cm 높은, 5 cm 넓은 중 하나) 또는 중앙에 필적하는 높이에있는 선반이 있습니다.
- 사용자 정의 MATLAB 명령을 사용하여 PC에서 TTL 펄스를 생성합니다. (S = 직렬 ( 'COM4');하면 fopen (들) s.RequestToSend = '오프'/ s.RequestToSend = / '에'; fclose를 (들))의 (삭제 ;). TTL 펄스는 배를 생성기록 시스템 탐포 및 켜거나 LED가 빛을 차단 하나.
- 그것은 걷는 실험에 30 초 이상 이동이 멈출 때까지 바퀴벌레가 경기장을 탐험 할 수 있습니다. 바퀴벌레 실험을 등반을위한 선반을 통해 블록 / 선반이나 터널을 통해 등반을하거나 할 수 있습니다.
- 비디오 녹화를 중지합니다.
- 신경 녹음을 중지합니다.
- TTL 펄스에 의해 생성 된 타임 스탬프를 기록합니다.
- 경기장에서 바퀴벌레를 제거하고 적어도 3 분을 기다립니다.
- 반복은 다음 재판 3.2-3.10 단계를 반복합니다.
- 일단 모든 녹음이 완료되었습니다 와이어 팁 (양극)과 와이어의 끝에서 뇌에 구리를 증착하는 기준 전극 (음극) 중 하나를 통해 5 μA DC 전류를 5 초를 전달합니다.
4. 오프라인 분석
- LED 조명이 전환 프레임에 기록 시스템에 의해 기록 된 타임 스탬프를 링크하여 비디오 및 신경 데이터 동기화그 순간.
- 마크 와이어 팁 명소. 12 μm의 시리얼 부분 (17)에 구리를 석출 관찰 팀스 강하게 절차를 사용합니다. 눈에 띄는 예금은 3-8 인접 섹션 (지역의 지느러미 복부 평면의 길이에 대한 18-48% 우리의 기록) (그림 2)에서 볼 수 있어야합니다.
- 하나의 뉴런의 활동에 특정 전기 신호의 상관 관계. 다른 10,14,18 세부에 배치 정렬 절차 스파이크 따릅니다. 초기, 자동 클러스터링을 생성하는 프로그램 KlustaKwik (버전 1.5, 저자 K. 해리스, 러트 거스 대학교)를 사용합니다. 더 정제 및 분석 (그림 3)의 프로그램에 MClust (버전 3.5을, 저자 AD redish입니다 등., 미네소타 대학)을 가져옵니다.
- 바퀴벌레의 움직임을 추적 할 수 있습니다. 실험을 걷기를 들어, VID의 각 프레임의 질량과 그것의 몸 방향의 바퀴벌레의 (영상) 센터의 위치를 추출및 MATLAB (19)에 대한 관련 FixErrors 도구 상자, Caltech의 여러 비행 트래커 (http://ctrax.sourceforge.net/ 버전 0.1.5.6)를 사용하여 EO 녹음. 실험을 상승, 모션 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 영상의 각 프레임에서 블록 및 바퀴벌레의 머리와 등판의 위치를 추출한다.
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Representative Results
우리는 도보로 실험 27 준비의 CC에서 50 단위의 신경 활동을 기록했다. 그 준비 (23 대)의 15의 경우, 등반 실험도 수행 하였다. 개별 단위 (예 : 장치 1-2 준비 1 부 (2)를 나타냅니다) 준비와 장치 번호에 따라 이름이 지정됩니다.
한 등반 재판의 비디오 스냅 샷은 그림 4에 나타내었다. 전체 비디오 (사운드 유닛 1 ~ 2입니다) 보충 비디오 1에서 사용할 수 있습니다. 기록은 바로 팬 모양의 본체 (FB)에서 만들어졌다. 이 블록을 발생하여 블록 (그림 4A-C)을 평가하기 위해 안테나를 사용하면 바퀴벌레 산책 중단했다. 그런 바퀴벌레는 (그림 4 층-I)는 블록의 위쪽으로의 다리를 흔들 전에 몸 기판의 각도 (그림 4D-E)를 변경, 몸의 전면을 올리고 그 위에 올랐다. 일의 속도와 높이E 바퀴벌레뿐만 아니라 제에서 현재 프레임이 정렬 유닛의 순시 연소율은 각각의 프레임 위에 표시된다. 순간적인 연소율은 50 밀리 초 폭의 가우시안 커널을 사용하여 각 유닛의 스파이크 회 부드럽게하여 계산 하였다. 단위 1-1의 발사 속도를 등반하는 동안 증가 속도를 발사의 증가 속도의 증가 (그림 4I)를 앞에. 단위 1-2 등반하기 전에 침묵 만 상승 (그림 4I)을 시작한 후에 발생하기 시작했다. 현재 프레임의 1 초 내에 두 개의 정렬 유닛의 스파이크는 각각의 프레임 아래에 표시된다. 주황색 선은 각 프레임 및 청색 사각형 의해 덮여 시간 두번 현재 프레임에 대한 순시 연소율을 계산하는 데 사용 하였다 커널의 폭을 나타낸다 나타낸다.
한 분야의 탐사 시험의 영상 중 하나 스냅 샷은 그림 (a)에 표시됩니다. 전체 비디오는 유명하다ailable 보충 비디오 2 (소리는 장치 2-1)입니다. 녹화 중간 FB 년에 만들어졌습니다. 각 프레임에서 바퀴벌레와 그 보디 방향의 위치는 Ctrax를 사용하여 추출하고 포워드 계산 속도뿐만 아니라 순시 연소율을 향하기 위해 사용되었다. 전체 비디오에서 바퀴벌레의 궤도는 그림 (b)에 표시됩니다. 각각의 검은 점은 각 프레임에서 바퀴벌레의 위치를 표시하고 경로 부 2-1의 순시 연소율 코딩 색이다. 우리는 일정한 프레임 레이트 (즉, 20 fps)의 각각의 재판 기록으로, 더 이상 그 시간에 두 개의 점, 빠른 속도 사이의 거리. 단위 2-1의 발사 속도는 바퀴벌레가 걷기 시작했을 때 증가와 보행 속도의 상관 관계를 보였다. 동물의 운동 상태 (즉, 속도 및 방향)로 각 유닛의 튜닝을 조사하기 위해, 우리는 순방향 보행 속도 및 TUR에 근거 속도 맵을 소성 지어진각 기기 닝 속도. 많은 CC 단위의 경우, 증가 발사 속도는 특정 운동 상태에 제한되었다. 예를 들어, 장치 (2-1)에 관계없이 (그림 5C) 선회 속도의 걷기 전달하도록 조정했다.
그림 1. 바퀴벌레 머리 캡슐의 동물 준비. AC 정면보기의 사진. A. 아세테이트 시트의 두 조각이 왁스의 기본을 제공하는 사극 부근에 배치했다. B.를 스트레인 릴리프는 왁스로 사극을 절곡하여 D를 만들 수 있었다. C에게 . 사극은 완전히 치과 왁스로 덮여 있었다. 바퀴벌레 몸의 D. 지느러미보기를. 나무 막대는 동물의 앞가슴 등판에 부착하고, 사극 튜브는로드에 부착 하였다. 사극과 기준 / 접지 전극 우리다시 더로드의 앞쪽에 부착하여 고정하는 것은. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 마크 와이어 팁 명소. 팬 모양의 본체 (FB). CC의 B. 도식 드로잉 및 와이어 팁의 위치에서 한 갈색 구리 증착 사이트를 보여주는 준비 N O를 2의 뇌. 섹션. PB, protocerebral 다리; FB, 부채 모양의 몸; EB, 타원체의 몸은. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. &# 160; 전형적인 사극 촬영 한 사극 번들 내에서 하나의 전극에서 A. 원시 전압 추적.. 다른 전극 사이에 전압 흔적의 차이가 있습니다. B. 세 단위는 네 개의 전극의 세 가지에 기록 된 파형의 에너지 MClust. C. 3 차원 뷰를 사용하여 정렬되었다. 각 점은 궁극적으로 할당 된 클러스터에 의해 코딩 된 하나의 임계 값 이벤트, 색입니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
.. 그림 4 개의 등반 재판의 비디오 스냅 샷 각 프레임의 위 : 정상화 속도, 바퀴벌레의 높이뿐만 아니라에 대한 첫 번째에서 두 개의 정렬 단위의 순간 발사 속도현재 프레임. 시간 0 등반의 시작을 나타냅니다. 발사 속도는 0-1 정상화하고, 속도와 높이를 표시 목적으로 0-0.5 정상화되었다. 각 프레임 아래 : 현재 프레임의 1 초 내에 두 개의 정렬 유닛의 스파이크. 주황색 선은 각 프레임 및 청색 사각형 의해 덮여 시간 두번 현재 프레임에 대한 순시 연소율을 계산하는 데 사용 하였다 커널의 폭을 나타낸다 나타낸다. 개별 단위가 준비와 장치 번호에 따라 이름이되었다 (예를 들면. "단위 1-2"준비 1을 나타내는 단위 2). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
한 분야의 탐사 시험 A. 빨간색 비디오의 그림 5. 하나의 스냅 샷타원형 라인이 그 프레임에서 바퀴벌레의 형상을 나타내고 붉은 점선은 이전 프레임 (10)의 질량의 바퀴벌레의 중심의 위치를 나타낸다. 오른쪽 : 회전 및 앞으로 걷는 속도뿐만 아니라 그 프레임의 단위 2-1의 순간 발사 속도. 아래 : 현재 프레임의 4 초 이내에 장치 (2-1)의 스파이크. 도 4에서와 같이, 오렌지 라인은 각각의 프레임과 청색 사각형 의해 덮여 시간 두번 현재 프레임에 대한 순시 연소율을 계산하는 데 사용 된 커널의 폭을 나타내는 나타낸다. B. 전체에서 바퀴벌레의 궤적 비디오. 큰 검은 색 점은 바퀴벌레의 시작점을 나타내고, 각각의 작은 검은 점은 각 프레임에서 바퀴벌레의 위치를 나타낸다. 궤도는 색 빨강 (높음). C. 단위 2-1의 발사 속도 맵 (낮음) 파란색에서, 단위 2-1의 순간 발사 속도로 코딩되었다. 전체 앞으로 실험 및 TU에 대한rning 속도뿐만 아니라 스파이크 시간은 150 밀리의 폭 가우시안 커널을 사용하여 평활화하고, 겹치지 않는 50 밀리 긴 섹션으로 나누어졌다. 분할 된 각 섹션에 대해 속도 벡터는 앞으로 평균 각각 그 기간 내에서 속도를 설정하여 생성되었습니다. 각각의 속도 벡터에 대한 발사 속도도 계산 하였다. 모든 속도 벡터는 (10mm / 앞으로 걷는 속도와 선회 속도 10도 / 초 초)과 변 가능했다 발사 속도 맵은 그 해당 속도 벡터 모든 발사 속도를 평균하여 각 빈의 평균 발사 속도를 중첩에 의해 생성 된 그 빈에 빠졌다. X 축 회전 속도이고 y 축은 순방향 보행 속도이다. 긍정적 인 회전 속도 우회전을 나타내며 음의 회전 속도는 좌회전을 나타냅니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
곤충의 뇌의 CC 또는 다른 지역에 이전 전기 생리학 연구는 행동의 중앙 제어에 대한 통찰력으로 우리를 제공하고 있지만, 대부분은 절제된 준비 9,11 또는 닿는 것 10,14 하나에서 수행되었다. 그 결과, 동물의 감각 경험과 생리 학적 상태는 자연 환경과는 매우 다를 수 있습니다. 또한, 동물이 수행 할 수있는 행동 작업은 그 상황에서 하나의 비행기로 제한됩니다. 여기에 우리가 자유롭게 행동 바퀴벌레의 CC에서 기록 할 수있는 방법을 제시했다. 바라 건데, 우리는 당신이 자유롭게 자신의 실험실에서 곤충을 행동에 전기 생리학 녹음을 캡처해야합니다 필요한 모든 정보를 제공하고 있습니다. # 우리는 (Neuralynx, MClust, WinAnalzye 및 Ctrax)를 사용하는 시스템을위한 절차를 제시하지만, 레코딩 전극이 주입되면, 녹화 셋업 용이 다른 시스템에 적용 할 수있다. &(160);
우리는 27 준비를 수행 한, 그리고 바퀴벌레 와이어 세트를 손상하기 때문에 아직 현재 실험 중 어느 것도이 종료되지 않았다. 우리는 와이어 세트, 왁스, 또는로드를 청소하거나 제거하는 동물에 의해 시도를 관찰하지 않았습니다. 주입 된 바퀴벌레는 보통의 걸음 걸이에 걸어 갔다. 그들은 경기장을 탐험 등반 업무 단지뿐만 아니라 그대로 사람을 수행 할 수 있었다. 사극이 이식 된 후 우리의 실험은 보통 2-4 시간 지속. 때때로 일부 단위가 사라 또는 활동 시간에 걸쳐 감소하지만, 대부분의 기록은 전체 실험을하는 동안 매우 안정적이었다. 우리는 또한 일부 과목을 분리하고 녹음을 반환하고 다음 날 자극했다. 이 방법은 자유롭게 곤충 행동에 세포 레코딩의 오랜 기간 동안 안정적인 나타납니다.
강조의 원 포인트 WIR의 깨지기 쉬운 성격이다전자 세트. 큰 관심은 건설 및 주입 동안 촬영하지 않은 경우 그들은 쉽게 손상 될 수 있습니다. 항상 그들을거나 부딪 히거나 찢어지지 않도록주의하면서 천천히 그 근처의 전선 및 해부 도구를 이동합니다. 전선은 조심스럽게 두 개 또는 세 개의 사용을 허용 실험 lesioning을 완료 한 후에는 준비에서 가져온 수 있습니다. , 다시 테스트 repolish, 각 사용하기 전에 replate해야합니다.
성공적인 준비의 핵심은 멀리 바퀴벌레에서 와이어 세트를 유지하는 것입니다. 우리는 복부 위에서 앞가슴 등판에서 연장하는 긴 막대를 사용하여로드의 후방 끝으로 사극 튜브를 연결합니다. 결과적으로, 사극 튜브는 곤충의 더듬이 또는 다리에 튜브를 도달 할 수 있도록 경기장의 주위에 이동하는 바퀴벌레의 뒤에 항상있다. 바퀴벌레 뒤에 와이어 세트를 배치하면 동물의 몸에 여유 공간을 제공합니다. 이것은 우리의 경기장 experime의 비디오 품질을 향상카메라가 무대 위에 위치 국세청 때문이다. 동물의 머리와 사극 튜브 사이에 여분의 전선을 남겨주. 곤충의 더듬이 또는 다리 선을 도달 할 수있는 경우를 중단합니다. 이 방법에서는, 튜브 슬라이드 자유롭게 네트워크를 통해, 우리는 여분의 와이어를 위로 끌어 headstage 근처에 고정 할 수 있도록.
우리의 방법 중 하나는 잠재적 인 제한은 바퀴벌레가 탐험 할 수있는 경기장의 크기입니다. 사극은 전체 40 × 40 ㎠의 분야에 대한 액세스를 제공하기 위해 충분한 길이 40 cm입니다. 우리는 소음과 사극 품질 등의 문제가 발생하지 않았습니다. 우리는 더 큰 무대를 위해 더 이상 tetrodes을 그러나, 이러한 문제가 나타날 수 있습니다. 이상 사극의 또 다른 잠재적 인 문제는 사극의 중량이다. 우리의 사극과로드는 분명히 2-3g 바퀴벌레를 방해하지 않는 약 0.25 g의 무게. 우리는 ELEC에 사용 된 것과 같은 무대를 탐험 그대로 바퀴벌레를 관찰trophysiology 실험. 도보로 이동할 수있는 활동 및 전반적인 속도는로드와 사극을 들고 바퀴벌레 방해 동물 사이에 유사했다. 그러나, 우리는 바퀴벌레가 성능 하락하기 전에 수행 할 수있는 부하의 한계를 시험하지 않았다. 긴 와이어의 한계를 해결하는 한 가지 방법은 headstage 카메라의 자동화 플랫폼을 구축하는 것입니다. 이러한 시스템에서 카메라가 플랫폼을 따라 이동할 수 있도록 모터에 실시간으로 출력에있는 바퀴벌레의 움직임을 추적 할 수 있습니다. headstage 직접 동물 위에 남아있을 것이기 때문에, 따라서, 비교적 짧은 사극이 큰 분야에 충분하다.
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Disclosures
저자는 관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 제안 닉 Kathman 감사하고 원고를 준비에 도움이됩니다. 이 기술은 부여 FA9550-10-1-0054와 RER에 부여 번호 IOS-1120305 아래에있는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 AFOSR에서 지원하는 작업과 함께 개발되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nichrome wire | Sandvik Heating Technology | Kanthal RO-800 | Use for tetrode |
| Biomedical polyethylene tubing | A-M Systems | 800700 | Use for tetrode tubing |
| Lynx-8 | Neuralynx | Use for multiunit recording | |
| Cheetah 32 | Neuralynx | Use for multiunit recording | |
| High speed camera | Basler | A602f | Use for video recording for walking experiments |
| High speed camera | Casio | EX-FC150 | Use for video recording for climbing experiments |
| WINanalyze | Winanalyze | version 1.4 3D | Use for video tracking |
| MATLAB | MathWorks | MATLAB R2012b | Use for TTL pulse generation and offline data analysis |
References
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