Summary
Nós já desenvolveu uma técnica para implantar fios tetrode no complexo central do cérebro de barata que nos permite monitorar a atividade em unidades individuais de baratas amarrados. Aqui apresentamos uma versão modificada do que a técnica que nos permite também gravar a atividade cerebral em insetos se movendo livremente.
Abstract
O crescente interesse no papel de atividade cerebral no controle motor inseto exige que sejamos capazes de monitorar a atividade neural enquanto insetos executar o comportamento natural. Nós já desenvolveu uma técnica para implantar fios tetrode no complexo central do cérebro de barata que nos permitiram gravar a atividade de vários neurônios simultaneamente, enquanto uma barata amarrados virou velocidade de caminhada ou alterado. Enquanto um grande avanço, os preparativos amarrados fornecer acesso a comportamentos limitados e muitas vezes não têm os processos de feedback que ocorrem em animais movendo-se livremente. Apresentamos agora uma versão modificada do que a técnica que nos permite gravar a partir do complexo central da movendo-se livremente baratas como andam em uma arena e lidar com as barreiras, transformando, escalada ou tunelamento. Juntamente com o vídeo de alta velocidade e de corte cluster, agora podemos relacionar a atividade cerebral de vários parâmetros do movimento de insetos comportando livremente.
Introduction
Este artigo descreve um sistema bem sucedido para a gravação de neurônios dentro do complexo central (CC) da barata, discoidalis Blaberus, como o inseto entra em uma arena e lida com objetos que fazem com que se virar, túnel sob, ou passar por cima de obstáculos. Os fios podem também ser ligados a um estimulador de evocar actividade no neuropil circundante, com as consequentes alterações comportamentais.
Na última década, considerável atenção tem sido direcionada para os papéis desempenhados por várias regiões do cérebro em controlar o comportamento de insetos. Grande parte desse foco foi direcionado para as neuropils cerebrais da linha média que são referidos coletivamente como o complexo central (CC). Registaram-se progressos, como resultado de uma ampla variedade de técnicas que visam questões sobre o papel do CC no comportamento. Essas técnicas variam de manipulações neurogenéticos, principalmente em Drosophila, juntamente com behavianálise oral, 1-3, a técnicas eletrofisiológicas que monitoram a atividade neural dentro do CC e tentativa de relacionar a atividade com os parâmetros comportamentais relevantes.
Técnicas eletrofisiológicas incluem gravação intracelular de neurônios individuais identificados 4-9 e gravação extracelular, muitas vezes com múltiplas sondas canal 10,11. Estas duas técnicas são gratuitos. Gravação intracelular com eléctrodos cortantes ou remendo célula completa fornece dados muito pormenorizados sobre neurónios identificados, mas está limitada a uma ou duas células ao mesmo tempo, requer pouco ou nenhum movimento, e pode ser mantido durante períodos relativamente curtos de tempo. Gravações extracelular pode ser facilmente configurado, não necessitam de restrição, e pode ser mantido por horas. Com tetrodes multicanal e corte cluster, bastante grandes populações de neurônios podem ser analisados simultaneamente 9,12. Enquanto PATC célula inteirah foi usado com sucesso em insetos amarrados 13, sentimos que há também uma necessidade de técnicas que nos permitem gravar a atividade neural no cérebro por longos períodos de tempo em se comportando livremente insetos como eles lidam com as barreiras ao movimento para a frente.
A necessidade de gravar como os insetos se move e salta para cima e para baixo nos empurrou em direção a métodos de gravação extracelulares. Tivemos sucesso em boa gravação preparações contido com comercialmente disponíveis sondas 16 canais de silício 11, no entanto, o tamanho pequeno do mesmo grandes baratas significa que as sondas têm de ser montados fora do corpo. Isso, juntamente com a delicadeza dos dentes sonda, fez uma preparação inadequada para andar livre. Em dois projetos anteriores, foram utilizados feixes de fios finos, formando uma tetrodo para realizar propriedades de gravação semelhantes, mas em um arranjo mais robusto. Estes pacotes tetrode nos permitiu gravar a partir de baratas amarrados umd relacionar atividade unidade CC às mudanças na velocidade de andar 14 e virando comportamento resultante do contato da antena com uma haste 10.
Por mais útil que estas preparações amarrados foram e continuarão a ser, eles apresentam algumas limitações. Em primeiro lugar, os comportamentos que o inseto pode executar são limitados a um avião. Ou seja, poderíamos facilmente evocar mudanças na velocidade de caminhada ou de viragem, mas as ações de escalada e túnel não fosse possível, pelo menos com o arranjo típico corda. Em segundo lugar, os preparativos estão amarrados "circuito aberto". Ou seja, eles não permitem o retorno normal de movimento relacionado ao sistema. Assim, como a barata ligado a corda, o mundo visual não foi alterado em conformidade. É possível construir sistemas de amarrar em malha fechada para introduzir este tipo de feedback. No entanto, eles são limitados pela complexidade da programação e de hardware do ambiente visual simulada. Nevertheless, sentimos que poderíamos melhorar nossos métodos de gravação amarrados existentes através da gravação a partir do animal, uma vez que andava livremente em uma arena ou pista e objetos encontrados como faria em seu ambiente natural.
Embora os sistemas sem fios para registo da actividade do cérebro 15 seria o ideal, os sistemas actuais têm limitações no número de canais de gravação, o tempo de aquisição de dados, a duração da bateria e do peso. Nós, portanto, optou por tentar adaptar o nosso sistema de gravação tethered para uso em preparações se movendo livremente. Como melhores sistemas sem fios tornar-se disponíveis, esta técnica pode ser facilmente adaptado a esses dispositivos. O sistema que é descrito neste artigo é leve, funciona muito bem e parece ter pouco efeito deletério sobre o comportamento da barata. Com uma câmara de alta velocidade e de baixo custo de software de corte de cluster, actividade em neurónios individuais do cérebro pode ser relacionada com o movimento. Aqui nós descrevemos a preparção dos fios tetrode e sua implantação no cérebro do inseto, bem como as técnicas de gravação de atividade elétrica e movimento e como esses dados podem ser reunidos para análise posterior.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação de Fios TETRODE
- Puxe um fio de nicromo muito fina (12 mM de diâmetro, revestimento PAC) de cerca de 1,1 m de comprimento. Prenda uma etiqueta de fita para cada extremidade. Pendurar o fio ao longo de um varão roscado horizontal de tal modo que as duas extremidades estão à mesma altura perto da bancada.
- Repita o passo 1.1 para um segundo fio, fazendo mais duas extremidades para um total de 4, e colocá-lo ao lado do primeiro fio (cerca de 1 cm entre eles).
- Fure as quatro pontas com uma etiqueta de fita e coloque a tag para um dispositivo de enrolamento rotativo motorizado. Este dispositivo pode ser feito a partir de um motor de corrente contínua de baixo custo.
- Enrole o tetrode em uma direção por 2 min (60 rpm) e descontrair-lo na direção oposta para 30 seg.
- Use uma pistola de calor para fundir os fios juntos. Não toque nos fios com a arma. Use três para cima e para baixo, passa a partir de direções alternadas, a cada passagem, tendo cerca de 10 seg.
- Cortar a parte superior e a parte inferior dos fios enrolados. Os quatro fios são trançados umd fundidos juntos numa extremidade, mas separam-se do outro.
- Adicionar o tubo de suporte. Corte um comprimento 30 centímetros de tubo de polietileno (diâmetro: dentro de 0,28 milímetros, 0,61 milímetros fora). Passe o tetrodo muito lentamente e cuidadosamente para dentro do tubo de apoio, de modo que ele não dobre.
- Uma vez que a extremidade fundida aparece para o outro lado, puxá-lo de forma a que haja um comprimento igual de fios em ambas as extremidades do tubo de guia.
- Agarre a final em separado de cada fio com uma pinça. Utilizando a base da chama de um queimador de gás, queimar cuidadosamente o material isolante do último 2 ou 3 mm de cada um dos fios. Aqueça o fio até que ele brilha, mas não enrolar.
- Conecte o tetrode com um adaptador de tomada IC masculino-feminino que se encaixa o seu dispositivo de gravação. Coloque a extremidade deinsulated de cada fio em uma tomada diferente do adaptador com uma pinça. Estabilize o fio no soquete com um pequeno pino de metal. Use um ferro de solda ponta fina e preencha o soquete com a solda derretida. Tenha cuidado para não entrar em contatoo fio frágil com o ferro de solda.
- Verificar a impedância de cada fio e a entre a impedância de cada par de fios.
- Coloque a fundido, a extremidade torcido em um recipiente de solução salina e conectar um condutor de fio de cobre a partir da solução salina para o medidor de ohm.
- Ligar a outra extremidade do medidor para o pino encaixe contendo o arame. A impedância de cada fio deve ser inferior a 3 mohms.
- Se os valores acima não são atingidos, tente novamente as conexões de solda.
- Retire os fios do soro fisiológico, lavar as pontas com água, e testar a impedância entre fio para cada par (n = 6). As inter impedância deve estar acima de 5 mohms.
- Se os valores acima não são atingidos, corte uma pequena quantidade da ponta off no final fundido e teste novamente.
- Descarte qualquer conjunto de arame que não atende às exigências de impedância para todos os fios.
- Fixe o tetrode.
- Dobre uma pequena caixa de papel rectangular slightly maior do que o adaptador de tomada.
- Transfira o adaptador na caixa com o lado macho na parte inferior. Penetram na caixa de tal forma que todos os pinos de o lado macho estão fora da caixa, enquanto o resto da placa está dentro da caixa.
- Tape os cantos da caixa do lado de fora. Use pequenos pedaços de fita adesiva de dupla face no lado de dentro da caixa para estabilizar quaisquer fios individuais de fios. O fio deve ser fundida à medida que sai da caixa.
- Misture rapidamente definir epóxi 2 parte e despeje na caixa para garantir o adaptador e todos os fios.
- Anexar a extremidade próxima do tubo de guia para um lado da caixa, com impressões dentárias, mas deixam o tubo de tal forma que abra o tetrodo pode ser puxado através livremente em ambas as extremidades.
- Afie a tetrode.
- Antes de cada experiência, corte a ponta do tetrodo com uma lâmina de bisturi afiada, não tesoura. Isto impede de esmagamento e espalhamento de as extremidades dos fios, proporcionando uma borda plana limpa para o próximo passo.
- O resultado desejado transforma o pacote final a partir de um bordo rectilíneo a uma ponta aguçada, com pequenas quantidades de isolamento removido da extremidade de cada fio. Verifique o ponto de usar um microscópio de dissecação antes do plaqueamento o tetrode. Se algum desgaste ocorre na ponta, recut e repolir.
- Se o teste de impedância durante o subsequpasso ent chapeamento mostra extremamente baixos valores inter-fio (menos do que 4 mohms), que indica muito material removido durante a etapa de polimento. Recorte e repolir o tetrode.
- Antes de cada experiência, corte a ponta do tetrodo com uma lâmina de bisturi afiada, não tesoura. Isto impede de esmagamento e espalhamento de as extremidades dos fios, proporcionando uma borda plana limpa para o próximo passo.
- Placa do tetrode. Colocar a ponta da tetrodo em uma solução saturada de sulfato de cobre (85 ml de água, de ácido sulfúrico a 5 ml, 50 g de sulfato de cobre). Placa de cada arame com uma corrente de 2,5 mA, com um isolador de estímulo. Injetar a corrente por 1 segundo, pause por 1 segundo e repita este processo de 4x.
- Verificar a impedância de cada fio e a interimpedance de cada par de fios. A impedância de cada fio deve estar compreendida entre 0,5-1 mohms e inter impedância deve ser acima de 4 mohms.
- Monte o adaptador na headstage de um sistema de gravação multicanal.
- Anexar um pino inseto se inclinou para um micromanipulador. Prenda a ponta do tetrode ao pino inseto com cera dental
2. Preparação animal
- Anestesiar oBarata com gelo.
- Após a barata pára de se mover, conter a barata verticalmente contra uma superfície plana de cortiça com grandes pinos de sela que estendem o inseto, mas não penetrar em qualquer parte de seu corpo.
- Transferir a preparação em um recipiente de plástico e colocá-gelo à volta do animal para minimizar os movimentos do corpo do fluxo sanguíneo e.
- Coloque um colar de plástico no pescoço para apoiar a cabeça e colocar cera dental em torno da cabeça para estabilizá-lo.
- Corte uma pequena janela entre o ocelos com uma lâmina de barbear e remover a cutícula da cabeça.
- Remover tecidos conjuntivos e gordura com uma pinça para expor o cérebro.
- Colocar um pouco de soro fisiológico barata na cápsula cabeça para cobrir o tecido cerebral.
- Para desheath o cérebro, utilizar uma pinça fina para agarrar suavemente a bainha na parte superior do cérebro e utilizar outro pinça fina para rasgar o invólucro para além de fios da área de implante.
- Abra um pequeno buraco na cabeça cápsula anterior à sagacidade cérebroh um pino de inseto. Insira uma trança de três diâmetros maiores (56 um) com isolamento de fios de cobre no furo para servir como um eletrodo de referência / chão.
- Abaixe a ponta do tetrode à superfície do cérebro com o micromanipulador e posicioná-lo próximo a região do cérebro de interesse.
- Com cuidado, coloque dois pequenos pedaços de folha de acetato fino (2 mm x 1 mm), ligeiramente maior do que o buraco na cápsula cabeça, anterior e posterior à tetrode.
- Ligue o sistema de gravação.
- Lentamente abaixe o tetrode 150-250 mM abaixo da superfície do cérebro, dependendo da qualidade de gravação.
- Desligue o sistema de gravação.
- Mover os dois pedaços de chapa de etilo como perto do tetrodo possível sem tocá-lo (Figura 1A).
- Aquece-se uma pequena espátula ou agulha hipodérmica achatada e colocá-lo em cera dentária tal que existe cera líquida na ponta da espátula. Tocar com cuidado a extremidade de cada pedaço de folha de acetato a partir doTETRODE com a espátula de modo a que a cera líquida pode fluir para cada pedaço e vedar a folga entre ele e a cabeça da cutícula.
- Repita o passo 2.16. Largar uma pequena quantidade de cera líquida sobre a folha de acetato de cada vez. Inicie o processo longe da tetrode e mover-se gradualmente em direção a ela. Eventualmente o tetrode será ancorado por cera dental. Evite ficar cera quente para dentro da cavidade e para o cérebro.
- Use o mesmo método que os passos 2.16 e 2.17 para ancorar o eletrodo de referência / chão com cera.
- Aquece-se a cera que se liga a tetrodo para o micromanipulador para libertar o tetrodo a partir dele.
- Passe o tetrode na cera dental na cabeça para proporcionar um alívio de tensão (Figura 1B).
- Cubra o ciclo de alívio de tensão com cera dental (Figura 1C).
- Retire cuidadosamente as restrições e transferir a preparação para uma placa de Petri. Contenha lado a preparação dorsal com grandes pinos de sela.
- Anexaruma haste ao pronotum usando uma pistola de cola. Este é um pedaço de madeira que se estende do pronoto sobre o abdome.
- Anexar a ponta do tubo tetrodo para a extremidade posterior da haste com cera dental.
- Ancorar a tetrodo eo eletrodo de referência / terra até à extremidade anterior da haste com cera dental.
- Puxar o tetrodo da extremidade de encaixe do tubo, tanto quanto possível, mas não puxar nela, a fim de eliminar a possibilidade de que o animal pode danificar a parte do tetrodo fora do tubo (Figura 1D).
- Remover todas as restrições. Conecte o eletrodo de referência / terreno para a tubulação tetrode com cera dental.
- Espere pelo menos 60 minutos para que o animal se recuperar da anestesia gelo antes de qualquer experiência.
3. Procedimentos Experimentais
- Conecte um PC tanto com o sistema de gravação e uma luz LED usando um cabo USB para porta serial.
- Comece gravações neurais.
- Iniciar gravações de vídeo em 20 quadros por segundo para andar experimentos usando o pacote de aquisição de imagem Motmot 16 ou 120 fps para subir experimentos usando uma câmera de alta velocidade.
- Coloque a barata em um 40 cm x 40 cm Plexiglas arena para andar experiências ou de 58 centímetros de comprimento, 5 cm de largura e 5 cm de altura de arena para subir experimentos. A arena curta tem uma barreira transparente que se estende desde o centro da parede do lado direito para o centro da arena, acima do qual está localizado o andar de entrada. A barreira é usado para evitar que os animais de andar em áreas onde a visão da câmera é bloqueada pela headstage. A arena de escalada tem um bloco de acrílico (ambos 1,2 centímetros ou 1,8 cm de altura e 5 cm de largura) ou uma prateleira localizada a uma altura comparável no centro.
- Gerar um pulso TTL a partir do PC usando um comando personalizado MATLAB. (S = de série ("COM4 '); fopen (s); s.RequestToSend =' desligado '/ s.RequestToSend =' on '/; fclose (s); excluir (s) ;). O pulso TTL gera vezestamp para o sistema de gravação e ou liga ou desliga a luz LED.
- Permitir a barata para explorar a arena até que ele pára de se mover por mais de 30 segundos para andar experimentos. Permitir a barata, quer subir ao longo do bloco / prateleira ou um túnel através da plataforma para subir experimentos.
- Pare de gravações de vídeo.
- Pare gravações neurais.
- Anote o timestamp gerado pelo pulso TTL.
- Remover a barata da arena e esperar pelo menos 3 min.
- Repita os passos 3,2-3,10 para a próxima prova.
- Uma vez que todas as gravações de ter sido concluída, passar 5 seg de corrente de 5 mA DC através de uma das pontas de fio (ânodo) e o eléctrodo de referência (cátodo) para depositar o cobre no cérebro na ponta do fio.
4. Análise off-line
- Sincronizar vídeo e dados neurais ligando o quadro onde a luz do LED é ligado eo timestamp registrado pelo sistema de gravação emnesse momento.
- Marcar locais ponta do fio. Use procedimentos de intensificação Timms para precipitar e observar o cobre em 12 mM cortes seriados 17. Proeminentes depósitos devem ser visíveis em 3-8 secções adjacentes (cerca de 18-48% do comprimento da placa ventral dorsal da área que gravar a partir de) (Figura 2).
- Correlacionar impulsos elétricos específicos para a atividade de neurônios individuais. Siga pico procedimentos de classificação estabelecidos em detalhe em outro lugar 10,14,18. Use o programa KlustaKwik (versão 1.5, autor K. Harris, da Universidade Rutgers) para gerar, clustering automatizada inicial. Importá-los para o programa MClust (versão 3.5, os autores AD avermelhado et al., Da Universidade de Minnesota), para posterior refinamento e análise (Figura 3).
- Acompanhe os movimentos da barata. Para experiências que anda, extrair a posição (visual), o centro da barata da massa e a sua orientação do corpo em cada quadro da vidEO gravações usando o Caltech múltipla Fly Tracker (versão 0.1.5.6; http://ctrax.sourceforge.net/) ea caixa de ferramentas FixErrors associado para MATLAB 19. Para subir experiências, extrair a posição do bloco e cabeça da barata e pronoto em cada quadro do vídeo usando o pacote de software de análise de movimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gravamos a atividade neural de 50 unidades do CC em 27 preparações para experiências de locomoção. Para 15 dessas preparações (23 unidades), as experiências de escalada também foram realizadas. Unidades individuais são nomeados de acordo com números de preparação e de unidade (por exemplo, unidade de 1-2 indica preparação 1, unidade 2).
Instantâneos do vídeo de um ensaio de escalada são mostrados na Figura 4. Todo o vídeo está disponível em vídeo suplementar 1 (O som é de unidade 1-2). A gravação foi feita no corpo em forma de leque direita (FB). A barata parou de andar quando ele encontrou o bloco e usou suas antenas para avaliar o bloco (Figuras 4A-C). Em seguida, a barata levantada a parte frontal do corpo, a alteração do ângulo de substrato do corpo (Figuras 4E-E), antes de ser oscilado a sua perna para a parte superior do bloco e subiu sobre ele (Figuras 4F-I). A velocidade ea altura do diae barata, bem como a taxa de disparo instantâneo das duas unidades classificadas a partir do primeiro para o quadro corrente são mostrados por cima de cada quadro. A taxa de disparo instantâneo foi calculada por alisamento vezes pico de cada unidade, utilizando um núcleo gaussiano, com uma largura de 50 milissegundos. A taxa de disparo da unidade de 1-1 aumentou durante a escalada e do aumento da taxa de disparo precedeu o aumento da velocidade (Figura 4I). Unidade 1-2 ficou em silêncio antes de subir, mas começou a disparar após escalada foi iniciada (Figura 4I). Os picos das duas unidades classificadas dentro de 1 segundo do quadro atual são exibidas abaixo de cada quadro. A linha laranja indica o tempo coberto por cada quadro eo retângulo azul indica duas vezes a largura do kernel que foi usado para calcular a taxa de disparo instantâneo para o quadro atual.
Um instantâneo do vídeo de um ensaio de exploração arena está mostrado na Figura 5A. Todo o vídeo é avdisponív eis no suplementar Vídeo 2 (O som é de unidade 2-1). A gravação foi feita no FB meio. A posição da barata e sua orientação do corpo em cada quadro foram extraídos utilizando Ctrax e usadas para calcular a frente e velocidade, bem como a taxa de disparo instantâneo posição. A trajectória da barata em todo o vídeo é mostrado na Figura 5B. Cada ponto preto indica a posição da barata em cada quadro e o caminho é codificada com a taxa de disparo instantâneo da unidade de 2-1. Como registramos cada ensaio em um frame rate constante (ou seja, 20 fps), quanto maior a distância entre dois pontos, maior será a velocidade naquele momento. A taxa de disparo da unidade de 2-1 aumentou quando a barata começou a andar e foi correlacionada com a velocidade de caminhada. A fim de examinar a afinação de unidades individuais para a locomoção do animal do estado (ou seja, velocidade e direção), construímos disparando mapas de taxa com base na velocidade de andar para a frente e turVelocidade ning para cada unidade. Para muitas unidades de CC, o aumento da taxa de disparo era restrito aos estados de locomoção específicos. Por exemplo, a unidade de 2-1 foi afinado para encaminhar caminhando independentemente da velocidade de rotação (Figura 5C).
Figura 1. Fotos de vista animais preparação. AC frontal da cápsula cabeça barata. A. Dois pedaços de folha de acetato foram colocados perto do tetrode para fornecer a base de cera. B. Um alívio de tensão era criar d dobrando o tetrode em cera. C . O tetrodo foi totalmente coberto pela cera dental. Vista D. dorsal do corpo da barata. Uma haste de madeira foi ligado a pronotum do animal e da tubagem tetrodo foi montado na haste. O tetrodo eo eletrodo de referência / térreo,re ainda mais assegurado, anexando-os para o anterior da haste. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. Marcar locais ponta do fio. A. Uma seção do cérebro de preparação n o 2, mostrando um marrom local de deposição de cobre no corpo em forma de leque (FB). B. desenho esquemático do CC e da localização da ponta do fio. PB, ponte protocerebrais; FB, corpo em forma de leque;. EB, corpo elipsóide Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 3. E# 160; Uma gravação tetrodo típico vestígios de tensão A. primas de eletrodos individuais dentro de um pacote tetrode.. Observe a diferença dos traços de tensão entre os diferentes eletrodos. B. Três unidades foram classificados usando MClust C. vista. 3-dimensional da energia da forma de onda, como registrado em três dos quatro eletrodos. Cada ponto é um evento único limiar, codificados por cores pelo cluster foi finalmente atribuído. Clique aqui para ver imagem ampliada.
.. Figura 4 Snapshots do vídeo de um ensaio escalada Acima de cada quadro: velocidade normalizada, altura da barata, bem como taxa de disparo instantânea das duas unidades classificadas do primeiro aoquadro atual. Tempo 0 indica o início da escalada. Taxa de disparo foi normalizado 0-1, e velocidade e altura foram normalizados 0-0,5 para fins de exibição. Abaixo de cada quadro: os picos das duas unidades classificadas dentro de 1 segundo do quadro atual. A linha laranja indica o tempo coberto por cada quadro eo retângulo azul indica duas vezes a largura do kernel que foi usado para calcular a taxa de disparo instantâneo para o quadro atual. Unidades individuais foram nomeados de acordo com preparação e unidades de números ("unidade de 1-2", por exemplo. Indica preparação 1, unidade 2). Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 5. Um instantâneo do vídeo de um ensaio exploração Arena A. O vermelholinha oval indica a forma da barata nesse quadro ea linha tracejada vermelha indica a posição do centro da barata de massa nos últimos 10 quadros. Direita: viragem e velocidade de caminhada para a frente, assim como a taxa de disparo instantâneo da unidade 2-1 naquele quadro. Abaixo: os picos de unidade 2-1 dentro de 4 segundos do quadro atual. Tal como na Figura 4, a linha de laranja indica que o tempo coberto por cada quadro e o rectângulo azul indica duas vezes a largura do núcleo de que foi usado para calcular a taxa de disparo instantâneo para o quadro actual. B. A trajectória da barata no todo vídeo. O grande ponto preto indica o ponto de partida e a barata cada pequeno ponto preto indica a posição da barata em cada quadro. A trajetória foi codificado por cores, com a taxa de disparo instantâneo da unidade de 2-1, de azul (baixo) ao vermelho (alto). C. O mapa de taxa de disparo da unidade de 2-1. Durante todo o experimento, para a frente e tuVelocidade rning, bem como tempos de pico foram suavizadas usando um kernel gaussiano com uma largura de 150 ms e foram divididos em 50 ms não sobrepostas longas seções. Para cada secção dividido, um vector de velocidade foi gerado através da média para a frente e voltando velocidade dentro desse período, respectivamente. Firing taxa para cada vetor de velocidade também foi calculado. Todos os vetores de velocidade foram finalmente resolvido (10 mm / s para a velocidade da marcha para a frente e 10 graus / s para velocidade de rotação) e uma taxa de disparo mapa foi gerado através da sobreposição da taxa de disparo em média para cada bin obtido pela média de todas as taxas de disparo cuja velocidade correspondente vetores caiu em que bin. Eixo X é a velocidade de rotação e eixo y é a velocidade da marcha para a frente. Velocidade de rotação positiva indica virar à direita e velocidade de rotação negativo indica viragem à esquerda. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enquanto os estudos eletrofisiológicos anteriores sobre o CC ou de outras regiões do cérebro do inseto nos forneceu insights sobre a central de controle do comportamento, a maioria deles foram realizados tanto em preparações contido 9,11 ou aqueles amarrados 10,14. Como resultado, o animal de experiência sensorial e estado fisiológico pode ser muito diferentes daqueles em um ambiente natural. Além disso, as tarefas de comportamento que o animal pode realizar são limitados a um avião nessas situações. Aqui apresentamos um método para gravar a partir do CC nas baratas comportando livremente. Felizmente, nós fornecemos-lhe com todas as informações necessárias que você precisa para capturar registros eletrofisiológicos em comportar livremente insetos em seu próprio laboratório. Nós apresentamos os procedimentos para os sistemas que usamos (Neuralynx, MClust, WinAnalzye e Ctrax), mas uma vez que os eletrodos são implantados recodificação, configuração de gravação pode ser facilmente adaptado para outros sistemas. & #160;
Efetuamos 27 preparações, e até o momento nenhum dos experimentos foi encerrado porque a barata danificou os conjuntos de fios. Nós não observamos qualquer tentativa por parte do animal para limpar ou remover a conjuntos de fios, cera, ou vara. As baratas implantados andou em uma marcha normal. Eles foram capazes de explorar a arena e executar tarefas de escalada tão bem como aqueles intactos. As nossas experiências geralmente dura 2-4 horas após a tetrodo foi implantado. Ocasionalmente algumas unidades desapareceram ou diminuíram sua atividade ao longo do tempo, mas a maioria das gravações foram muito estáveis durante todo o experimento. Também foram isolados alguns indivíduos e devolvido para a gravação e estimulação do dia seguinte. Este método parece confiável por longos períodos de gravações extracelular em comportando livremente insetos.
Um ponto de destaque é a natureza frágil da wire conjuntos. Eles são facilmente danificados se um grande cuidado não for tomado durante a construção e implantação. Sempre se movem os fios e quaisquer instrumentos de dissecação perto deles lentamente, tomando cuidado para não bater ou rasgá-los. Os fios podem ser cuidadosamente removido a partir da preparação depois da experiência e a lesão são concluídas, permitindo dois ou três usos. Certifique-se de testar novamente, repolir e replate antes de cada utilização.
A chave para uma preparação bem sucedida é a de manter os conjuntos de fios longe da barata. Nós usamos uma longa haste que se estende do pronoto acima do abdômen e conectar o tubo tetrodo para a extremidade posterior da haste. Consequentemente, a tubulação tetrodo está sempre atrás da barata quando ele está se movendo em torno de uma arena de tal forma que o inseto não pode alcançar a tubulação com suas antenas ou pernas. Colocar os conjuntos de fios atrás da barata também fornece folga sobre o corpo do animal. Isso melhora a qualidade de vídeo do nosso experime Arenants porque a câmera está posicionada acima da arena. Deixar sem fios em excesso entre a cabeça do animal e da tubulação tetrode. Se o inseto pode atingir os fios com suas antenas ou pernas, ele vai quebrá-las. Neste método, os slides de tubulação livremente ao longo do fio, permitindo-nos tirar o excesso de fio para cima e fixe-o perto do headstage.
Uma limitação potencial do nosso método é que o tamanho da área onde a barata pode explorar. O tetrodo é de 40 cm de comprimento, que é suficiente para fornecer acesso a toda a 40 x 40 cm 2 arena. Nós não encontrou problemas como o ruído ea qualidade tetrode. No entanto, tais problemas poderiam aparecer como fazemos tetrodes mais longos para uma arena maior. Outro problema potencial com uma tetrodo é mais o peso do tetrodo. Nossa tetrode e haste pesam cerca de 0,25 g que, aparentemente, não impede a 2-3 g barata. Observamos baratas intactas explorando a mesma arena usada para elecexperimentos trophysiology. A atividade de caminhar e velocidade geral foram semelhantes entre as baratas carregando uma vara e tetrode e animais desonerados. No entanto, não testei o limite da carga que uma barata pode levar antes de suas gotas de desempenho. Uma solução para as limitações de um fio já é construir uma plataforma motorizada para o andar de entrada e a câmara. Com um tal sistema, a câmara pode acompanhar os movimentos da barata em tempo real e de saída para o motor, de modo que a plataforma pode mover em conformidade. Portanto, um relativamente curto tetrodo seria suficiente para uma grande área, porque o headstage permaneceria diretamente acima do animal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores agradecem Nick Kathman para sugestões e ajudar na preparação para o manuscrito. Esta técnica foi desenvolvida em conjunto com o trabalho apoiado pela AFOSR sob concessão FA9550-10-1-0054 e da National Science Foundation, Grant No. IOS-1120305 para RER.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nichrome wire | Sandvik Heating Technology | Kanthal RO-800 | Use for tetrode |
| Biomedical polyethylene tubing | A-M Systems | 800700 | Use for tetrode tubing |
| Lynx-8 | Neuralynx | Use for multiunit recording | |
| Cheetah 32 | Neuralynx | Use for multiunit recording | |
| High speed camera | Basler | A602f | Use for video recording for walking experiments |
| High speed camera | Casio | EX-FC150 | Use for video recording for climbing experiments |
| WINanalyze | Winanalyze | version 1.4 3D | Use for video tracking |
| MATLAB | MathWorks | MATLAB R2012b | Use for TTL pulse generation and offline data analysis |
References
- Strauss, R. The central complex and the genetic dissection of locomotor behaviour. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 633-638 (2002).
- Pick, S., Strauss, R. Goal-driven behavioral adaptations in gap-climbing Drosophila. Curr. Biol. 15, 1473-1478 (2005).
- Triphan, T., Poeck, B., Neuser, K., Strauss, R. Visual targeting of motor actions in climbing Drosophila. Curr. Biol. 20, 663-668 (2010).
- Heinze, S., Gotthardt, S., Homberg, U. Transformation of polarized light information in the central complex of the locust. J. Neuorosci. 29, 11783-11793 (2009).
- Heinze, S., Homberg, U. Maplike representation of celestial E-vector orientations in the brain of an insect. Science. 315, 995-997 (2007).
- Heinze, S., Homberg, U. Neuroarchitecture of the central complex of the desert locust: Intrinsic and columnar neurons. J. Comp. Neurol. 511, 454-478 (2008).
- Heinze, S., Homberg, U. Linking the input to the output: new sets of neurons complement the polarization vision network in the locust central complex. J. Neurosci. 29, 4911-4921 (2009).
- Heinze, S., Reppert, S. M. Sun compass integration of skylight cues in migratory monarch butterflies. Neuron. 69, 345-358 (2011).
- Brill, M. F., et al. Parallel processing via a dual olfactory pathway in the honeybee. J Neurosci. 33, 2443-2456 (2013).
- Guo, P., Ritzmann, R. E. Neural activity in the central complex of the cockroach brain is linked to turning behaviors. J. Exp. Biol. 216, 992-1002 (2013).
- Ritzmann, R. E., Ridgel, A. L., Pollack, A. J. Multi-unit recording of antennal mechanosensitive units in the central complex of the cockroach, Blaberus discoidalis. J. Comp. Physiol. A. 194, 341-360 (2008).
- Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neurosci. 7.5, 446-445 (2004).
- Huston, S. J., Jayaraman, V. Studying sensorimotor integration in insects. Curr. Opin. Neurobiol. 21, 527-534 (2011).
- Bender, J. A., Pollack, A. J., Ritzmann, R. E. Neural activity in the central complex of the insect brain is linked to locomotor changes. Curr. Biol. 20, 921-926 (2010).
- Harrison, R. R., et al. Wireless Neural/EMG telemetry systems for small freely moving animals. IEEE. 5, 103-111 (2011).
- Straw, A. D., Dickinson, M. H. Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis. Source Code Biol. Med. 4, 5 (2009).
- Strausfeld, N. J., Miller, T. A. Neuroanatomical Techniques. Insect Nervous System. , Springer Verlag. (1980).
- Daly, K., Wright, G., Smith, B. Molecular features of odorants systematically influence slow temporal responses across clusters of coordinated antennal lobe units in the moth, Manduca sexta. J. Neurophsyiol. 92, 236-254 (2004).
- Branson, K., Robie, A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6, 451-457 (2009).
