Summary
Abbiamo già sviluppato una tecnica per impiantare i fili tetrode nel complesso centrale del cervello scarafaggi che ci permette di monitorare l'attività in singole unità di scarafaggi frenati. Qui vi presentiamo una versione modificata di quella tecnica che ci permette di registrare anche l'attività cerebrale nel muoversi liberamente insetti.
Abstract
Crescente interesse per il ruolo di attività cerebrale nel controllo degli insetti motore richiede che saremo in grado di monitorare l'attività neurale, mentre gli insetti eseguono comportamento naturale. Abbiamo già sviluppato una tecnica per impiantare i fili tetrode nel complesso centrale del cervello scarafaggi che ci hanno permesso di registrare l'attività da più neuroni contemporaneamente, mentre uno scarafaggio tethered acceso o la velocità alterata piedi. Mentre un grande passo avanti, preparati frenati fornire l'accesso a comportamenti limitati e spesso non hanno processi di feedback che si verificano nel muoversi liberamente animali. Presentiamo ora una versione modificata di quella tecnica che ci permette di registrare dal complesso centrale di muoversi liberamente scarafaggi mentre camminano in un'arena e affrontare le barriere ruotando, arrampicata o tunneling. Accoppiato con video ad alta velocità e taglio cluster, ora possiamo riguardare l'attività cerebrale di vari parametri del movimento degli insetti banche si comportano.
Introduction
Questo articolo descrive un sistema di successo per la registrazione dai neuroni all'interno del complesso centrale (CC), della scarafaggio, discoidalis Blaberus, come l'insetto entra in un'arena e si occupa di oggetti che causano a girarsi, tunnel sotto o scavalcare ostacoli. I fili possono essere collegati ad uno stimolatore per evocare attività nel neuropil circostante con cambiamenti comportamentali conseguenti.
Negli ultimi dieci anni grande attenzione è stata rivolta ai ruoli svolti dalle varie regioni del cervello a controllare il comportamento degli insetti. Gran parte di questa attenzione è stata rivolta verso la linea mediana neuropils cerebrali che sono indicate collettivamente come il complesso centrale (CC). Progressi sono stati compiuti a seguito di ampia varietà di tecniche rivolte domande sul ruolo del CC nel comportamento. Tali tecniche vanno da manipolazioni neurogenetici, principalmente in Drosophila, accoppiato con behavianalisi orale 1-3, a tecniche elettrofisiologiche che monitorano l'attività neurale all'interno del CC e il tentativo di mettere in relazione tale attività ai parametri comportamentale rilevanti.
Tecniche elettrofisiologiche includono la registrazione intracellulare da singoli neuroni identificati 4-9 e registrazione extracellulare, spesso con sonde multicanale 10,11. Queste due tecniche sono gratuiti. Registrazione intracellulare con elettrodi taglienti o cerotto cellula intera fornisce dati molto dettagliati sui neuroni identificati, ma si limita a una o due celle contemporaneamente, richiede limitato o nessun movimento, e può essere mantenuta per periodi relativamente brevi di tempo. Registrazioni extracellulari possono essere facilmente impostati, non richiedono moderazione, e può essere mantenuta per ore. Con tetrodi multicanale e taglio cluster, abbastanza grandi popolazioni di neuroni possono essere analizzati simultaneamente 9,12. Mentre tutta PATC cellulareh è stato utilizzato con successo negli insetti tethered 13, riteniamo che ci sia anche la necessità di tecniche che ci permettono di registrare l'attività neurale del cervello per lunghi periodi di tempo in banche comportarsi insetti hanno a che fare con le barriere al movimento in avanti.
La necessità di registrare come l'insetto si muove e rimbalza su e giù ci ha spinto verso metodi di registrazione extracellulari. Abbiamo avuto successo in buona registrazione preparazioni trattenuto con commercialmente disponibili sonde 16 canali silicio 11, tuttavia le piccole dimensioni anche di grandi scarafaggi significa che le sonde devono essere montati dal corpo. Questo, insieme con la delicatezza dei denti sonda, fatta inadeguate per una preparazione gratuita piedi. In due precedenti progetti, abbiamo utilizzato fasci di fili sottili che formano un tetrodo per compiere proprietà di registrazione simili, ma in una disposizione più robusto. Questi bundle tetrode ci ha permesso di registrare da scarafaggi frenati und riguardano l'attività dell'unità CC ai cambiamenti nella velocità di marcia 14 e girando comportamento risultante dal contatto antenne con una canna 10.
Utile come queste preparazioni tethered sono stati e continueranno ad essere, fanno presentare alcune limitazioni. In primo luogo, i comportamenti che l'insetto può eseguire soltanto un piano. Cioè, potremmo facilmente evocare cambiamenti nella velocità di camminata o di svolta, ma le azioni di arrampicata e tunnel non fosse possibile, almeno con la disposizione tipica cavezza. In secondo luogo, la nostra preparazione frenati sono "a ciclo aperto". Cioè, non consentono il normale movimento correlata feedback al sistema. Così, come lo scarafaggio acceso nostra tether, il suo mondo visivo non è stata modificata di conseguenza. E 'possibile costruire sistemi ad anello cavezza chiusi per introdurre questo tipo di feedback. Tuttavia, essi sono limitate dalla complessità della programmazione e hardware dell'ambiente visivo simulato. Nevertheless, abbiamo sentito che potevamo migliorare i nostri metodi di registrazione frenati esistenti registrando dall'animale mentre camminava liberamente in un'arena o pista e oggetti che si incontrano come sarebbe nel suo ambiente naturale.
Sebbene sistemi wireless per registrare l'attività cerebrale 15 sarebbe ideale, sistemi attuali hanno limitazioni nel numero di canali di registrazione, il tempo di acquisizione dei dati, la durata della batteria e peso. Abbiamo, quindi, deciso di provare a migliorare il nostro sistema di registrazione tethered per l'uso in muoversi liberamente preparati. Poichè i migliori sistemi wireless saranno disponibili, questa tecnica può essere facilmente adattato a tali dispositivi. Il sistema che viene descritto in questo articolo è leggero, funziona molto bene e sembra avere un effetto deleterio sul comportamento del scarafaggio. Con una telecamera ad alta velocità poco costoso e software di taglio cluster, l'attività di singoli neuroni del cervello può essere legato al movimento. Qui si descrive la prepazione dei fili tetrode e il loro impianto nel cervello dell'insetto nonché tecniche di registrazione per attività elettrica e di movimento e come tali dati possono essere riuniti per successive analisi.
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Protocol
1. Preparazione dei Fili tetrodo
- Estrarre un nichelcromo filo molto sottile (12 micron di diametro, rivestimento PAC) di circa 1,1 m di lunghezza. Applicare un tag nastro ad ogni estremità. Appendere il filo su una barra orizzontale filettata tale che le due estremità sono alla stessa altezza vicino al banco.
- Ripetere passo 1.1 per un secondo filo, rendendo più due estremità per un totale di 4, e posizionarlo accanto al primo filo (circa 1 cm intermedie).
- Attaccare le quattro estremità insieme con un tag nastro e allegare il tag a un dispositivo motorizzato rotante di avvolgimento. Questo dispositivo può essere costituito da un motore a corrente continua economico.
- Avvolgere il tetrodo in una direzione per 2 min (60 rpm) e rilassarsi nella direzione opposta per 30 sec.
- Utilizzare una pistola di calore per fondere i fili insieme. Non toccare i fili con la pistola. Utilizzare tre su e giù passa da direzioni alterne, con ogni passaggio prendendo circa 10 sec.
- Tagliare la parte superiore e la parte inferiore dei cavi ferita. Le quattro fili sono intrecciati und fuse ad una estremità ma separare all'altra.
- Aggiungere il tubo portante. Tagliare una lunghezza di 30 centimetri di tubo di polietilene (diametro interno 0,28 millimetri, al di fuori 0,61 millimetri). Infilare il tetrodo molto lentamente e con attenzione nel tubo di supporto in modo da non piegare.
- Una volta che l'estremità fusa appare dal lato opposto, tirarlo attraverso modo che ci sia una lunghezza uguale di filo ad entrambe le estremità del tubo di guida.
- Afferra la fine separata di ciascun filo con una pinza. Utilizzando la base della fiamma di un bruciatore a gas, bruciare con attenzione l'isolamento off dell'ultimo 2 o 3 mm di ciascun filo. Riscaldare il filo fino a quando non brilla, ma non arricciare.
- Collegare il tetrodo con un maschio-femmina IC presa adattatore che si inserisce il dispositivo di registrazione. Mettere fine deinsulated di ciascun filo in una presa diversa della scheda con una pinza. Stabilizzare il filo nella presa con un piccolo perno in ottone. Utilizzare una punta fine saldatore e riempire il portalampada con la saldatura fusa. Fare attenzione a non contattareil filo fragile con il saldatore.
- Controllare l'impedenza di ciascun filo e l'inter impedenza di ciascuna coppia di fili.
- Posizionare il fuso, fine ritorto in un contenitore di soluzione fisiologica e collegare un filo conduttore di rame dalla soluzione salina allo strumento ohm.
- Collegare l'altra estremità del metro al pin presa contenente il filo. L'impedenza di ciascun filo deve essere inferiore a 3 mW.
- Se i valori di cui sopra non vengono raggiunti, riprovare le connessioni di saldatura.
- Rimuovere i fili dal salino, sciacquare le punte con acqua, e testare l'impedenza del filo tra per ogni associazione (n = 6). L'impedenza tra deve essere superiore a 5 mW.
- Se i valori di cui sopra non vengono raggiunti, tagliare una piccola quantità della punta fino alla fine fuso e ripetere il test.
- Scartare qualsiasi insieme filo che non soddisfa entrambi i requisiti di impedenza per tutti i fili.
- Fissare il tetrodo.
- Piegare una piccola scatola di carta rettangolare SLIGhtly più grande della presa adattatore.
- Trasferire l'adattatore nella scatola con il lato maschio in basso. Penetrazione dell'acqua in modo tale che tutti i pin del lato maschio sono fuori area mentre il resto della scheda è all'interno della scatola.
- Nastro angoli della scatola all'esterno. Utilizzare piccoli pezzi di nastro adesivo a doppia facciata all'interno della scatola per stabilizzare eventuali singoli fili di filo. Il filo deve essere protetta in quanto esce dalla scatola.
- Mescolare velocemente set 2 parte epossidica e versare nella casella per fissare l'adattatore e tutti i cavi.
- Attaccare l'estremità vicina del tubo resoconto di un lato della scatola con cera dentale ma lasciano il tubo aprire tale che il tetrodo può essere tirato attraverso banche alle due estremità.
- Contrasta il tetrodo.
- Prima di ogni esperimento, tagliare la punta del tetrodo con una lama di bisturi affilato, non forbici. Questo impedisce frantumazione e divaricazione del filo termina fornendo un bordo piatto per la fase successiva.
- Il risultato desiderato trasforma l'estremità fascio da un regolo di una punta con piccole quantità di isolante rimosso dall'estremità di ciascun filo. Verificare il punto utilizzando un microscopio da dissezione prima placcatura tetrodo. Se qualche sfilacciamento si verifica sulla punta, ripassare e rilucidare.
- Se il test di impedenza durante il subsequpasso placcatura ent mostra valori filo interrelazioni estremamente basse (meno di 4 mW), indica troppo materiale rimosso durante la fase di lucidatura. Recut e rilucidare il tetrodo.
- Prima di ogni esperimento, tagliare la punta del tetrodo con una lama di bisturi affilato, non forbici. Questo impedisce frantumazione e divaricazione del filo termina fornendo un bordo piatto per la fase successiva.
- Piatto tetrodo. Mettere la punta del tetrodo in una soluzione satura di solfato di rame (acqua 85 ml, 5 ml di acido solforico, 50 g di solfato di rame). Piastra ogni filo con una corrente di 2,5 μA con un isolatore stimolo. Iniettare la corrente per 1 sec, una pausa di 1 sec e ripetere questo processo 4x.
- Controllare l'impedenza di ciascun filo e la interimpedance di ciascuna coppia di fili. L'impedenza di ciascun filo deve essere compresa tra 0,5-1 mW e tra l'impedenza deve essere superiore a 4 mW.
- Montare l'adattatore sulla headstage di un sistema di registrazione multicanale.
- Collegare un pin insetto piegato per un micromanipolatore. Fissare la punta del tetrodo al pin insetto con impronte dentarie
2. Preparazione degli animali
- Anestetizzare l'scarafaggio con ghiaccio.
- Dopo lo scarafaggio smette di muoversi, frenare lo scarafaggio verticale su una superficie di sughero piatta con grandi perni sella a cavallo che l'insetto, ma non penetrano qualsiasi parte del suo corpo.
- Trasferire il preparato in un contenitore di plastica e posizionare ghiaccio intorno all'animale di minimizzare il flusso di sangue e movimenti del corpo.
- Posizionare un collare di plastica al collo per sostenere la testa e mettere la cera dentale intorno alla testa per stabilizzarlo.
- Tagliare una piccola finestra tra il ocelli con una lama di rasoio e rimuovere la cuticola dalla testa.
- Rimuovere i tessuti connettivi e grassi con una pinza per esporre il cervello.
- Mettere un po 'di soluzione salina scarafaggio nella capsula testa per coprire il tessuto cerebrale.
- Per desheath cervello, utilizzare una pinza sottile per afferrare delicatamente la guaina sulla parte superiore del cervello e utilizzare un altro pinza sottile strappare la guaina a parte nella zona impiantato filo.
- Aprire un piccolo foro nella testa capsula anteriore per l'arguzia cervelloh un pin insetto. Inserire una treccia di tre diametri più grandi (56 micron) isolati fili di rame nel foro per servire come un elettrodo di riferimento / massa.
- Abbassare la punta del tetrodo alla superficie del cervello con micromanipolatore e posizionarlo vicino alla regione del cervello di interesse.
- Posizionare con cura due piccoli pezzi di foglio di acetato sottile (2 millimetri x 1 mm), leggermente più grande del foro nella capsula testa, anteriore e posteriore al tetrodo.
- Accendere il sistema di registrazione.
- Abbassare lentamente il tetrodo 150-250 micron sotto la superficie del cervello a seconda della qualità di registrazione.
- Spegnere il sistema di registrazione.
- Spostare i due pezzi di lamiera acetato più vicino al tetrodo possibile senza toccarlo (Figura 1A).
- Scaldare una piccola spatola o appiattita ago ipodermico e metterlo in cera dentale tale che vi sia cera liquida sulla punta della spatola. Toccare con attenzione il fondo di ogni pezzo di foglio di acetato dallatetrodo con la spatola in modo che la cera liquida può affluire su ogni pezzo e sigillare il divario tra essa e la cuticola testa.
- Ripetere passo 2.16. Drop un piccola quantità di cera liquida sul foglio di acetato di volta in volta. Avviare il processo lontano dal tetrodo e muoversi gradualmente verso di esso. Alla fine il tetrodo sarà ancorato da impronte dentarie. Evitare di entrare cera calda nella cavità e sul cervello.
- Utilizzare lo stesso metodo passaggi 2.16 e 2.17 per ancorare l'elettrodo di riferimento / terra con cera.
- Riscaldare la cera che attribuisce tetrodo al micromanipolatore per rilasciare il tetrodo da esso.
- Loop tetrodo nella cera dentale sulla testa per fornire un sollievo strain (Figura 1B).
- Coprire il ciclo antistrappo con cera dentale (Figura 1C).
- Rimuovere con attenzione i vincoli e trasferire la preparazione su una piastra di Petri. Frena la parte di preparazione dorsale con grandi perni sella.
- Allegareun'asta per il pronoto utilizzando una pistola per colla. Questo è un bastone di legno che si estende dal pronoto sopra l'addome.
- Fissare la punta del tubo tetrodo alla estremità posteriore della barra con cera dentale.
- Ancorare il tetrodo e l'elettrodo di riferimento / terra per l'estremità anteriore della canna con la cera dentale.
- Estrarre il tetrodo dal terminale del tubo, per quanto possibile, ma non tirare su di esso, in modo da eliminare la possibilità che l'animale può danneggiare la parte del tetrodo fuori del tubo (Figura 1D).
- Rimuovere tutti i vincoli. Fissare l'elettrodo di riferimento / terra per il tubo tetrodo con cera dentale.
- Attendere almeno 60 minuti per consentire all'animale di riprendersi dall'anestesia ghiaccio prima di ogni esperimento.
3. Procedure sperimentali
- Collegare un PC sia con il sistema di registrazione e di una luce a LED utilizzando un cavo USB per porta seriale.
- Iniziate le registrazioni neurali.
- Inizia registrazioni video a 20 fotogrammi al secondo per camminare esperimenti utilizzando il pacchetto di acquisizione di immagini Motmot 16 o 120 fps per salire esperimenti utilizzando una telecamera ad alta velocità.
- Posizionare lo scarafaggio in un 40 centimetri x 40 centimetri plexiglas arena per esperimenti a piedi o A 58 cm di lunghezza, 5 cm di larghezza e 5 cm di altezza arena per l'arrampicata esperimenti. Il walking arena ha una barriera trasparente che si estende dal centro della parete destra al centro dell'arena, sopra il quale si trova il headstage. La barriera è usato per impedire agli animali di camminare in zone in cui la telecamera è bloccata dal headstage. L'Arena arrampicata ha un blocco acrilico (sia 1,2 centimetri o alta 1,8 centimetri e larga 5 cm) o una mensola situata ad un'altezza paragonabile al centro.
- Genera un impulso TTL dal PC utilizzando un comando MATLAB personalizzata. (S = di serie ('COM4'); fopen (s); s.RequestToSend = 'off' / s.RequestToSend = 'on' /; fclose (s), delete (s) ;). L'impulso TTL genera voltetamp per il sistema di registrazione e sia accende o si spegne la luce del LED.
- Lasciare lo scarafaggio per esplorare la scena fino a quando non si ferma per più di 30 secondi per esperimenti a piedi. Lasciare lo scarafaggio a uno scavalcare il blocco / scaffale o tunnel attraverso la piattaforma per l'arrampicata esperimenti.
- Smettere di registrazioni video.
- Smettere di registrazioni neurali.
- Annotare il timestamp generato dal impulso TTL.
- Rimuovere lo scarafaggio dall'arena e attendere almeno 3 minuti.
- Ripetere i passaggi 3,2-3,10 per la prova successiva.
- Una volta che tutte le registrazioni sono state completate, passare 5 sec di corrente 5 μA DC attraverso una delle estremità del filo (anodo) e l'elettrodo di riferimento (catodo) per depositare rame nel cervello sulla punta del filo.
4. Analisi Offline
- Sincronizzare video e dati neurali collegando il fotogramma in cui si accende la luce LED e il timestamp registrato dal sistema di registrazione aquel momento.
- Segna località punta del filo. Utilizzare le procedure intensificazione Timms per precipitare e osservare il rame in 12 sezioni micron di serie 17. Depositi prominenti dovrebbero essere visibili in 3-8 sezioni adiacenti (circa 18-48% della lunghezza del piano ventrale dorsale della zona abbiamo da registrare) (Figura 2).
- Correlare specifici impulsi elettrici per l'attività dei singoli neuroni. Seguire picco procedure di selezione indicate nel dettaglio altrove 10,14,18. Utilizzare il programma KlustaKwik (versione 1.5, autore K. Harris, Rutgers University) per generare iniziale, clustering automatico. Importarli nel programma MClust (versione 3.5, gli autori AD Redish et al., University of Minnesota) per un ulteriore affinamento e l'analisi (Figura 3).
- Seguire i movimenti del scarafaggio. Per camminare esperimenti, estrarre la posizione di (visivo), il centro di scarafaggio della massa e del suo orientamento corpo in ogni fotogramma del vidregistrazioni eo utilizzando il Caltech multipla Fly Tracker (versione 0.1.5.6, http://ctrax.sourceforge.net/) e il FixErrors toolbox associato per MATLAB 19. Per l'arrampicata esperimenti, estrarre la posizione del blocco e la testa del scarafaggio e pronoto in ogni fotogramma del video utilizzando il pacchetto software di analisi del movimento.
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Representative Results
Abbiamo registrato l'attività neurale di 50 unità dal CC in 27 preparazioni per esperimenti a piedi. Per 15 di questi preparati (23 unità), sono stati eseguiti esperimenti di arrampicata. Le singole unità sono denominati in base ai numeri di preparazione e di unità (ad esempio unità 1-2 indica di preparazione 1, 2 unità).
Istantanee del video di una prova arrampicata sono mostrati in Figura 4. L'intero video è disponibile in supplementare Video 1 (Il suono è da unità 1-2). La registrazione è stata effettuata nel corpo di destra a forma di ventaglio (FB). Lo scarafaggio fermò quando ha incontrato il blocco e le sue antenne utilizzato per valutare il blocco (Figure 4A-C). Poi lo scarafaggio sollevata la parte anteriore del suo corpo, modificando l'angolo substrato corpo (Figure 4D-E), prima che batte la sua gamba verso la parte superiore del blocco e salì su di esso (Figure 4F-I). La velocità e l'altezza dei the scarafaggio così come la frequenza di scarica istantanea delle due unità ordinati dal primo al frame attuale sono indicati sopra ogni fotogramma. La frequenza di attivazione istantanea stato calcolato lisciatura volte spike di ciascuna unità utilizzando un kernel gaussiano con una larghezza di 50 msec. Il tasso di cottura di 1-1 unità aumentato durante l'arrampicata e l'aumento del tasso di sparare preceduto l'aumento della velocità (Figura 4I). Unità 1-2 rimase in silenzio prima di salire, ma ha iniziato a sparare dopo l'arrampicata è stata avviata (Figura 4I). Le punte delle due unità ordinate nel raggio di 1 sec del frame corrente al di sotto ciascun frame vengono visualizzati. La linea arancione indica il tempo coperta da ogni fotogramma e il rettangolo blu indica il doppio della larghezza del kernel che è stato utilizzato per calcolare il tasso di cottura istantanea per il frame corrente.
Uno un'istantanea del video di una esplorazione prova Arena è mostrato in Figura 5A. L'intero video è available nel supplementare Video 2 (Il suono è da unità 2-1). La registrazione è stata effettuata nel blocco centrale. La posizione del scarafaggio e il suo orientamento corpo in ciascun frame sono stati estratti utilizzando Ctrax e utilizzato per calcolare avanti e voce velocità nonché gittata istantaneo. La traiettoria del scarafaggio in intero video è illustrato nella Figura 5B. Ogni punto nero indica la posizione del scarafaggio in ogni fotogramma e il percorso è codificato a colori con la frequenza di scarica istantanea di unità 2-1. Come abbiamo registrato ogni prova con un frame rate costante (cioè 20 fps), maggiore è la distanza tra due punti, maggiore sarà la velocità in quel momento. Il tasso di cottura di 2-1 unità aumenta quando lo scarafaggio ha iniziato a camminare ed è stata correlata con velocità di deambulazione. Al fine di esaminare la messa a punto delle singole unità allo stato locomozione dell'animale (cioè velocità e direzione), abbiamo costruito sparare mappe tasso basato sulla velocità di camminata avanti e turvelocità ning per ogni unità. Per molte unità CC, aumento della frequenza di scarica è stata limitata a specifici stati di locomozione. Per esempio, unità 2-1 era sintonizzata trasmette camminare indipendentemente la velocità di rotazione (Figura 5C).
Figura 1. Foto di animali preparazione. Vista AC frontale della capsula testa di scarafaggio. A. Due pezzi di foglio di acetato sono stati collocati vicino al tetrodo a fornire la base per la cera. B. Un sollievo ceppo è stato creare d piegando il tetrodo in cera. C . Il tetrodo è stato interamente coperto da impronte dentarie. Vista D. dorsale del corpo scarafaggio. Un'asta di legno era attaccato Protorace dell'animale e il tubo tetrodo era attaccato alla canna. Il tetrodo e l'elettrodo di riferimento / terra abbiamore ulteriormente garantito da allegandoli ad anteriore della canna. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 2. Segna località punta del filo. A. Una sezione del cervello di preparazione n o 2, che mostra uno marrone sito deposizione di rame nel corpo a ventaglio (FB). B. Disegno schematico del CC e la posizione di punta del filo. PB, ponte protocerebral, FB, corpo a forma di ventaglio,. EB, corpo ellissoidale Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3. &# 160; Una registrazione tipico tetrodo tracce di tensione A. prime provenienti elettrodi singoli all'interno di un fascio tetrodo.. Nota la differenza delle tracce tensione tra elettrodi differenti. B. Tre unità sono state filtrate utilizzando MClust. C. vista dimensionale 3 dell'energia forma d'onda come registrato su tre dei quattro elettrodi. Ogni punto è un singolo evento di soglia, colore codificato dal cluster è stato infine assegnato. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
.. Figura 4 istantanee del video di uno studio arrampicata Sopra ogni frame: velocità normalizzata, altezza del scarafaggio così come frequenza di scarica istantanea delle due unità ordinati dal primo alfotogramma corrente. Tempo 0 indica l'inizio della scalata. Tasso di cottura è stata normalizzata 0-1, e la velocità e l'altezza sono stati normalizzati 0-0,5 per la visualizzazione. Sotto ogni fotogramma: le punte delle due unità ordinate nel raggio di 1 sec del frame corrente. La linea arancione indica il tempo coperta da ogni fotogramma e il rettangolo blu indica il doppio della larghezza del kernel che è stato utilizzato per calcolare il tasso di cottura istantanea per il frame corrente. Le singole unità sono stati nominati in base alla preparazione e unit numeri (ad es. "Unitari 1-2" indica preparazione 1, unità 2). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 5. Uno snapshot del video di un'arena esplorazione prova A. Il rossolinea ovale indica la forma del scarafaggio nel frame e la linea tratteggiata rossa indica la posizione del centro di scarafaggio di massa nei precedenti 10 fotogrammi. A destra: rotazione e la velocità in avanti a piedi così come la frequenza di scarica istantanea di unità 2-1 in quel fotogramma. Sotto: le punte di 2-1 unità entro 4 sec del frame corrente. Come nella figura 4, la linea arancione indica il tempo coperta da ogni fotogramma e il rettangolo blu indica il doppio della larghezza del kernel che è stato utilizzato per calcolare il tasso di cottura istantanea per il frame corrente. B. La traiettoria del scarafaggio nell'intera video. Il grande punto nero indica il punto di partenza della scarafaggio e ogni piccolo punto nero indica la posizione del scarafaggio in ogni fotogramma. La traiettoria è colore codificato con il tasso di cottura istantanea di unità 2-1, dal blu (basso) al rosso (alto). C. La mappa tasso di cottura di 2-1 unità. Per l'intero esperimento, in avanti e tuvelocità rning e tempi picco sono state levigate usando un kernel gaussiano con una larghezza di 150 msec e sono stati divisi in 50 msec sovrapposte lunghi tratti. Per ogni sezione divisa, un vettore di velocità è stato generato da una media avanti e la velocità di rotazione entro tale periodo, rispettivamente. Tasso di cottura per ogni vettore di velocità è stato anche calcolato. Tutti i vettori di velocità sono state cestinate (10 mm / sec per la velocità di camminata avanti e 10 gradi / sec per la velocità di rotazione) e una mappa tasso di cottura è stata generata sovrapponendo il tasso di cottura media per ogni bin ottenuto facendo la media di tutti i tassi di cottura cui velocità corrispondente vettori cadde in che bin. Asse X è la velocità di rotazione e l'asse y è la velocità di avanzamento a piedi. Velocità di rotazione positivo indica svolta a destra e la velocità di rotazione negativo indica svolta a sinistra. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
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Discussion
Mentre precedenti studi elettrofisiologici sulla CC o di altre regioni del cervello dell'insetto ci hanno fornito intuizioni nella centrale di controllo del comportamento, la maggior parte di loro sono stati eseguiti sia in preparazioni trattenuti 9,11 o quelli frenati 10,14. Come risultato, dell'animale esperienza sensoriale e lo stato fisiologico potrebbe essere molto diverse da quelle in un ambiente naturale. Inoltre, i compiti comportamentali che l'animale può eseguire soltanto un aereo sotto quelle situazioni. Qui abbiamo presentato un metodo per registrare dal CC in scarafaggi banche si comportano. Speriamo, vi abbiamo fornito tutte le informazioni necessarie è necessario acquisire le registrazioni elettrofisiologiche in banche comportarsi insetti nel proprio laboratorio. Abbiamo presentato le procedure per i sistemi che usiamo (Neuralynx, MClust, WinAnalzye, e Ctrax), ma una volta gli elettrodi vengono impiantati ricodifica, l'installazione di registrazione può essere facilmente adattato ad altri sistemi. & #160;
Abbiamo effettuato 27 preparazioni, e di come ancora nessuno degli esperimenti è stato interrotto perché lo scarafaggio danneggiato i set di filo. Noi non abbiamo osservato alcun tentativo da parte degli animali di pulire o rimuovere il set di filo, cera, o asta. Gli scarafaggi impiantati camminavano in un andatura normale. Sono stati in grado di esplorare l'arena ed eseguire attività di arrampicata proprio così come quelli intatti. I nostri esperimenti di solito duravano 2-4 ore dopo il tetrodo è stato impiantato. Di tanto in tanto qualche unità scomparse o la loro attività diminuiti nel corso del tempo, ma la maggior parte delle registrazioni erano molto stabili durante l'intero esperimento. Abbiamo anche isolato alcuni soggetti e restituito alla registrazione e stimolazione il giorno seguente. Questo metodo sembra affidabile per lunghi periodi di registrazioni extracellulari a comportarsi liberamente insetti.
Un punto di rilievo è la natura fragile del wire insiemi. Sono facilmente danneggiati se la grande cura non è stata presa durante la costruzione e l'impianto. Spostare sempre i fili e gli strumenti di dissezione vicino lentamente, facendo attenzione a non urtare o strappare loro. I cavi possono essere accuratamente tirato dalla preparazione dopo l'esperimento e lesione sono completate, consentendo per due o tre usi. Essere sicuri di ripetere il test, rilucidare, e replate prima di ogni utilizzo.
La chiave per una preparazione di successo è quello di mantenere i set di filo di distanza dal scarafaggio. Usiamo una lunga asta che si estende dal pronoto sopra l'addome e collegare il tubo tetrodo alla fine posteriore della canna. Di conseguenza, il tubo tetrodo è sempre dietro lo scarafaggio quando manovra in un'arena tale che l'insetto non può raggiungere il tubo con le antenne o gambe. Posizionamento i set di filo dietro lo scarafaggio prevede anche della distanza tra il corpo dell'animale. Questo migliora la qualità video della nostra arena experimenti perché la fotocamera è posizionata sopra l'arena. Lasciare senza fili in eccesso tra la testa dell'animale e il tubo tetrodo. Se l'insetto può raggiungere i fili con le antenne o le gambe, li rompere. In questo metodo, le diapositive tubi liberamente sul filo, che ci permette di tracciare il filo in eccesso up e fissarlo vicino alla headstage.
Una potenziale limitazione del nostro metodo è la dimensione dell'arena dove lo scarafaggio può esplorare. Il tetrodo è di 40 cm di lunghezza, che è sufficiente per fornire l'accesso a tutto il 40 x 40 cm 2 arena. Non abbiamo incontrato problemi come il rumore e la qualità tetrodo. Tuttavia, tali problemi potrebbero apparire come facciamo tetrodi più lunghi per un arena più grande. Un altro problema potenziale con un tetrodo è più il peso del tetrodo. Il nostro tetrodo e l'asta pesano circa 0,25 g che apparentemente non ostacoli un 2-3 g scarafaggio. Abbiamo osservato scarafaggi intatte esplorare la stessa arena usata per eletesperimenti trophysiology. L'attività piedi e la velocità generale erano simili tra scarafaggi che trasportano una canna e tetrodo e animali non gravate. Tuttavia, non abbiamo testato il limite del carico che uno scarafaggio può portare prima le sue gocce di prestazioni. Una soluzione alle limitazioni di un filo più lungo è di costruire una piattaforma motorizzata per headstage e la fotocamera. Con questo sistema, la telecamera può seguire i movimenti del scarafaggio in tempo reale e di uscita al motore in modo che la piattaforma può muoversi di conseguenza. Pertanto, relativamente brevi tetrodo sarebbe sufficiente per una grande arena perché headstage rimarrebbe direttamente sopra l'animale.
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Disclosures
Gli autori dichiarano assenza di conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Nick Kathman per suggerimenti e aiuto a preparare per il manoscritto. Questa tecnica è stata sviluppata in collaborazione con il lavoro sostenuto dal AFOSR in concessione FA9550-10-1-0054 e la National Science Foundation sotto Grant No. IOS-1120305 RER.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nichrome wire | Sandvik Heating Technology | Kanthal RO-800 | Use for tetrode |
| Biomedical polyethylene tubing | A-M Systems | 800700 | Use for tetrode tubing |
| Lynx-8 | Neuralynx | Use for multiunit recording | |
| Cheetah 32 | Neuralynx | Use for multiunit recording | |
| High speed camera | Basler | A602f | Use for video recording for walking experiments |
| High speed camera | Casio | EX-FC150 | Use for video recording for climbing experiments |
| WINanalyze | Winanalyze | version 1.4 3D | Use for video tracking |
| MATLAB | MathWorks | MATLAB R2012b | Use for TTL pulse generation and offline data analysis |
References
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