Extracellulär Wire Tetrode inspelning i hjärnan av Fritt Walking Insekter

Summary

Vi har tidigare utvecklat en teknik för att implantera tetrode trådar i det centrala komplexet av kackerlacka hjärnor som tillåter oss att övervaka aktiviteten i enskilda enheter av uppbundna kackerlackor. Här presenterar vi en modifierad version av den teknik som tillåter oss att också registrera hjärnaktivitet i fritt rörliga insekter.

Abstract

Ökat intresse för rollen av hjärnaktivitet i insekts motorstyrning kräver att vi ska kunna övervaka neural aktivitet medan insekter utföra naturligt beteende. Vi har tidigare utvecklat en teknik för att implantera tetrode trådar i det centrala komplexet av kackerlacka hjärnor som tillät oss att spela in aktivitet från flera nervceller samtidigt medan en bunden kackerlacka vände eller förändrad gånghastighet. Samtidigt som ett stort framsteg, uppbundna förberedelser ger tillgång till begränsade beteenden och saknar ofta återkoppling processer som sker i fritt rörliga djur. Vi presenterar nu en modifierad version av den teknik som tillåter oss att spela in från den centrala komplex av fritt rörliga kackerlackor när de går i en arena och ta itu med hinder genom att vrida, klättring eller tunnel. Tillsammans med hög hastighet video och kluster skärning, kan vi nu relatera hjärnaktivitet till olika parametrar för förflyttning av fritt beter insekter.

Introduction

I artikeln beskrivs ett framgångsrikt system för registrering av nervceller i det centrala komplexet (CC) i kackerlacka, Blaberus discoidalis, eftersom insekten promenader i en arena och handlar om föremål som orsakar den för att slå runt, tunnel under eller klättra över hinder. Trådarna kan även vara kopplad till en stimulator för att framkalla aktiviteten i den omgivande neuropil med åtföljande beteendeförändringar.

Under det senaste årtiondet stor uppmärksamhet har riktats mot de roller som olika hjärnregioner i att kontrollera insekts beteende. Mycket av detta fokus har riktats mot mittlinjen i hjärnan neuropils som kollektivt hänvisas till som den centrala komplex (CC). Framsteg har gjorts som ett resultat av många sorter av metoder riktade frågor om den roll som CC i beteendet. Dessa tekniker varierar från neurogenetiska manipulationer, främst i Drosophila, tillsammans med behavimuntlig analys ^1-3, till elektrofysiologiska tekniker som övervakar neural aktivitet inom CC och försöka relatera denna verksamhet till beteendemässigt relevanta parametrar.

Elektrofysiologiska tekniker är intracellulära inspelning från enskilda identifierade nervceller ^4-9 och extracellulära inspelning, ofta med flerkanalssonder ^10,11. Dessa två tekniker är kostnadsfri. Intracellulär inspelning med skarpa elektroder eller hela cell patch ger mycket detaljerade uppgifter om identifierade nervceller, men är begränsad till en eller två celler på en gång, med begränsad, eller ingen rörelse, och kan bibehållas under relativt korta tidsperioder. Cellulära inspelningar kan enkelt ställa in, inte kräver återhållsamhet, och kan upprätthållas i timmar. Med flerkana tetrodes och kluster skärning, kan relativt stora populationer av nervceller analyseras samtidigt ^9,12. Medan helcells patch har framgångsrikt använts i uppbundna insekter ^13, känner vi att det också finns ett behov av teknik som tillåter oss att spela in neural aktivitet i hjärnan under lång tid i fritt bete sig insekter som de behandlar hinder för rörelse framåt.

Behovet av att spela in som insekts rör sig och studsar upp och ner drivit oss mot extracellulära inspelningsmetoder. Vi har haft god framgång inspelning i återhållsamma beredningar av kommersiellt tillgängliga 16 kanaler kisel sonder ^11, men den lilla storleken av även stora kackerlackor innebär att prober måste vara monterade utanför kroppen. Det, i kombination med delikatess av sond pinnar, gjorde dem olämpliga för en fri vandring förberedelse. I två tidigare projekt använde vi buntar av fina trådar som bildar en tetrode att åstadkomma liknande inspelnings egenskaper men i en mer robust arrangemang. Dessa tetrode buntar tillät oss att spela in från bundna kackerlackor end relatera CC-enheten aktivitet på förändringar i gånghastighet ¹⁴ och vrida beteende till följd av antenn kontakt med en stav ^10.

Som användbara eftersom dessa tjudrade förberedelser har varit och kommer att fortsätta att vara, de presentera några begränsningar. Först de beteenden som insekten kan utföra är begränsade till ett plan. Det vill säga, vi kan lätt framkalla förändringar i gånghastighet eller svarvning, men klättring och tunnel åtgärder inte var möjliga, åtminstone med den typiska tjuder arrangemanget. För det andra, våra bundna preparat "open loop". Det vill säga, att de inte tillåter normal rörelse relaterad återkoppling till systemet. Således, eftersom kackerlacka aktiverat vår tjuder, dess visuella värld ändrades inte i enlighet därmed. Det är möjligt att bygga slutna slingförankringssystem för att införa denna typ av feedback. De är dock begränsad av komplexiteten av programmering och hårdvara för den simulerade visuell miljö. Nevertheless, ansåg vi att vi kunde förbättra våra befintliga uppbundna inspelningsmetoder genom att spela in från djuret som det gick fritt i en arena eller spår och stött på föremål som det skulle i sin naturliga omgivning.

Även trådlösa system för registrering av hjärnaktivitet ¹⁵ skulle vara perfekt, dagens system har begränsningar i antalet inspelningskanaler, tid för datainsamling, batteritid och vikt. Vi därför valt att försöka anpassa vårt bundna registreringssystem för användning i fritt rörliga förberedelser. Såsom bättre trådlösa system blir tillgängliga, kan denna teknik lätt anpassas till sådana anordningar. Systemet som beskrivs i denna artikel är låg vikt, fungerar mycket bra och verkar ha liten skadlig effekt på kackerlacka beteende. Med en billig höghastighetskamera och kluster skärande programvara, kan aktiviteten i enskilda hjärnans nervceller vara relaterade till rörelse. Här beskriver vi den förberederation av tetrode ledningar och deras implantering i insektens hjärna samt inspelningstekniker för elektrisk aktivitet och rörelse och hur dessa data kan sammanföras för efterföljande analys.

Protocol

1. Beredning tetrodens Wires

1. Dra ut en mycket tunn nikromtråd (12 ^ m diameter, PAC beläggning) av ca 1,1 m längd. Fäst en tejp tagg till varje ände. Häng upp tråden över en horisontell gängad stång så att de två ändarna är på samma höjd nära bänk.
2. Upprepa steg 1.1 för en andra tråd, vilket gör ytterligare två ändar för totalt 4, och placera den bredvid den första tråden (ca 1 cm i mellan).
3. Klistra fast de fyra ändarna tillsammans med ett band tagg och bifoga taggen till en motordriven roterande lindningsanordning. Denna anordning kan tillverkas av ett billigt likströmsmotor.
4. Vira tetrode i en riktning för 2 min (60 rpm) och dra ut det i den motsatta riktningen för 30 sek.
5. Använd en värmepistol för att smälta samman trådarna. Rör inte trådarna med pistolen. Använd tre upp och ner går från alternerande riktningar, med varje pass tar ca 10 sek.
6. Skär av toppen och botten av de lindade ledarna. De fyra trådarna är tvinnade ettd smält samman i ena änden men skilja på den andra.
7. Lägg till det stödjande röret. Skär en 30 cm längd av polyeten slang (diameter: inne 0,28 mm, utanför 0,61 mm). Trä tetrode mycket långsamt och försiktigt in i stödröret, så att den inte kinkar.
8. När smält änden visas ut på andra sidan, dra den igenom så att det finns en lika lång tråd i båda ändarna av styrröret.
9. Ta den separata änden av varje tråd med en pincett. Använda flammans bas av en gasbrännare, noggrant bränna isoleringen bort av de sista 2 eller 3 mm för varje tråd. Värm tråden tills den glöder, men inte rullas ihop.
10. Anslut tetrode med en manlig-kvinnlig IC uttagsadapter som passar din inspelningsenhet. Sätt deinsulated änden av varje tråd i ett annat uttag på adaptern med en pincett. Stabilisera kabeln i uttaget med en liten mässingsstift. Använd en fin spets lödkolv och fylla sockeln med smält lod. Var noga med att inte kontaktaden sköra tråden med lödkolven.
11. Kontrollera impedansen hos varje tråd och bland impedansen hos varje par av trådar.
    1. Placera det kondenserade, tvinnade änden i en behållare med saltlösning och ansluta en koppartråd ledaren från saltlösningen till ohmmeter.
    2. Anslut den andra änden av maskinen till konsprinten innehållande viran. Impedansen för varje tråd ska vara under 3 Mohm.
    3. Om ovanstående värden inte uppnås, reattempt anslutningarna löda.
    4. Ta bort kablarna från koksaltlösning, skölj tips med vatten, och testa bland tråd impedansen för varje hoppar (n = 6). Den inter impedans bör vara över 5 Mohm.
    5. Om ovanstående värden inte erhålls, skär en liten mängd av spetsen av vid det sammansmälta änden och om testet.
    6. Kassera tråd uppsättning som inte uppfyller båda impedans kraven för alla trådarna.
12. Säkra tetrode.
    1. Vik en liten rektangulär pappkartong slightly större än uttagsadapter.
    2. Överför adaptern i lådan med den manliga sidan längst ner. Tränga in i lådan så att alla stiften i den manliga sidan är utanför boxen medan resten av adaptern är i lådan.
    3. Tejpa hörnen på lådan på utsidan. Använd små bitar av dubbelhäftande tejp på insidan av rutan för att stabilisera de enskilda trådändar. Tråden ska sammansmälta när det kommer ut i rutan.
    4. Blanda snabbt set 2 del epoxy och häll i rutan för att säkra adaptern och alla kablar.
    5. Fäst nära änden av styrslangen till en sida av lådan med dental vax men lämna slangen öppna så att tetrode kan dras genom fritt i båda ändar.
13. Vässa tetrode.
    1. Före varje experiment, skär spetsen på tetrode med ett vasst skalpellblad, inte sax. Detta förhindrar krossning och splaying av tråden slutar samtidigt som det ger en ren plan kanten för nästa steg. Använd en liten roterande verktyg monteras vertikalt med medium och fin kornslipskivor (dessa kan kombineras på en plattform) för att polera tetrode och ta bort en del spets isolering. Håll i knippet nära dess ände med pincett. Luta kabeln satt stopp för en 45 ° vinkel i förhållande till slipskivan och försiktigt röra den till måttlig hastighet snurrande skiva i ca 1 eller 2 sek vardera på mediet och sedan de fina gryn. Upprepa detta tre gånger, axiellt rotera bunten 90 ° varje gång. Är det kritiskt att riktningen av snurr på slip diskar är borta från liten vinkel av trådändar, annars separering av trådarna kan förekomma.
    2. Det önskade resultatet omvandlar knippänden från en rak kant till en spets med små mängder av isoleringen avlägsnas från änden av varje tråd. Verifiera punkten med hjälp av en dissekera mikroskop innan plätering av tetrode. Om någon fransning inträffar vid spetsen, skäras och repolish.
    3. Om impedansen testning under subsequent plätering steg visar extremt låga inter tråd-värden (mindre än 4 MQ), betyder det för mycket material tas bort under poleringssteg. Recut och repolish den tetrode.
14. Plate på tetrode. Sätt spetsen på tetrode i en mättad kopparsulfatlösning (85 ml vatten, 5 ml svavelsyra, 50 g kopparsulfat). Platta varje tråd med en ström av 2,5 iA med en stimulans isolator. Injicera ström 1 sek, paus i 1 sek och upprepa denna process 4x.
15. Kontrollera impedansen hos varje tråd och interimpedance av varje par av ledningar. Impedansen för varje tråd bör vara mellan 0,5-1 Mohm och bland impedans bör vara över 4 Mohm.
16. Montera adaptern på huvudsteg av en flerkanalig registreringssystem.
17. Bifoga en böjd insekt stift till en mikromanipulator. Fäst spetsen på tetrode att insekten stift med dental vax

2. Djurpreparering

1. Bedövakackerlacka med is.
2. Efter kackerlacka slutar röra sig, hålla tillbaka kackerlacka vertikalt mot en plan kork yta med stora sadel stift som grenslar insekten men inte tränga någon del av sin kropp.
3. Överför preparatet i en plastbehållare och placera is runt djuret att minimera blodflödet och kroppsrörelser.
4. Placera en plastkrage vid halsen för att stödja huvudet och placera tand vax runt huvudet för att stabilisera den.
5. Skär ett litet fönster mellan ocelli med ett rakblad och ta bort hinnor från huvudet.
6. Avlägsna bindväv och fett med en pincett för att exponera hjärnan.
7. Placera en kackerlacka saltlösning i huvudet kapseln att täcka hjärnvävnaden.
8. Till desheath hjärnan använder en fin pincett för att försiktigt ta tag i manteln på toppen av hjärnan och använda en annan fin pincett för att riva manteln isär i tråden implanterade området.
9. Öppna ett litet hål i huvudet kapseln anterior till hjärnan with en insekt stift. Sätt i en fläta av tre större diametrar (56 mikrometer) isolerade koppartrådar i hålet för att fungera som en referens / jordelektrod.
10. Sänk spetsen på tetrode till hjärnans yta med mikromanipulator och placera den i närheten av hjärnan regionen av intresse.
11. Placera försiktigt två små bitar av tunna acetatark (2 mm x 1 mm), något större än hålet i huvudet kapseln, främre och bakre till tetrode.
12. Slå på inspelningssystem.
13. Långsamt sänka tetrode 150-250 nm under hjärnytan beroende på inspelningskvaliteten.
14. Stäng av inspelningssystem.
15. Flytta två bitar av acetatark så nära tetrode som möjligt utan att vidröra den (Figur 1A).
16. Värm en liten spatel eller tillplattad injektionsnål och lägg den i dentala vax så att det finns flytande vax på spetsen av spateln. Rör försiktigt den bortre änden av varje acetatark fråntetrode med spateln, så att flytande vax kan strömma in på varje del och täta gapet mellan den och huvudet nagelbanden.
17. Upprepa steg 2,16. Släpp en liten mängd flytande vax på acetatet ark varje gång. Starta processen långt ifrån tetrode och gradvis gå mot den. Så småningom tetrode kommer att förankras genom dentala vax. Undvik att få hett vax i kaviteten och på hjärnan.
18. Använd samma metod som steg 2.16 och 2.17 för att förankra referens / jordelektrod med vax.
19. Värm vaxet som fäster tetrode till mikromanipulator att frigöra tetrode från den.
20. Loop den tetrode i dental vax på huvudet för att ge en dragavlastning (Figur 1B).
21. Täck dragavlastningsslinga med dentala vax (Figur 1C).
22. Ta försiktigt bort de begränsningar och överlåta beredningen på en petriskål. Hindra beredningen ryggsidan upp med stora sadel stift.
23. Fästen stång till pronotum med en limpistol. Detta är en träpinne som sträcker sig från den pronotum över buken.
24. Fäst spetsen på tetrode slangen till den bakre änden av stången med dental vax.
25. Förankra tetrode och referens / jordelektrod till den främre änden av stången med dentala vax.
26. Dra tetrode från eluttaget änden av slangen så mycket som möjligt, men inte ryck på det, för att eliminera risken för att djuret kan skada den del av tetrode utanför röret (figur 1D).
27. Ta bort alla begränsningar. Fäst referens / jordelektrod till tetrode slangen med dentala vax.
28. Vänta minst 60 minuter för djuret att återhämta sig från isen anestesi innan något experiment.

3. Experimentella förfaranden

1. Anslut en dator med både registreringssystemet och en LED-ljus med hjälp av en USB till serieport-kabel.
2. Starta neurala inspelningar.
3. Starta videoinspelningar vid 20 bilder per sekund för promenader experiment med hjälp av Motmot bilden förvärvet paket ¹⁶ eller 120 fps för klättring experiment med hjälp av en höghastighetskamera.
4. Placera kackerlacka i en 40 cm x 40 cm Plexiglas arena för promenader experiment eller en 58 cm lång, 5 cm bred och 5 cm hög arenan för att klättra experiment. Gång arena har en genomskinlig barriär som sträcker sig från mitten av den högra väggen till mitten av arenan, över vilken huvudsteg är belägen. Barriären används för att förhindra djuren från att gå i områden där kameran vyn blockeras av huvudsteg. Klättringen arena har ett akrylblock (antingen 1,2 cm eller 1,8 cm hög och 5 cm bred) eller en hylla som ligger på en jämförbar höjd i centrum.
5. Generera en TTL puls från datorn med hjälp av en anpassad MATLAB-kommando. (N = seriell ('COM4'); fopen (s), s.RequestToSend = 'off' / s.RequestToSend = 'på' /; fclose (s), ta bort (s) ;). TTL puls genererar gångertamp för registreringssystemet och antingen sätter på eller stänger av LED-ljus.
6. Låt kackerlacka att utforska arenan så långt det går att flytta i mer än 30 sekunder för promenader experiment. Låt kackerlacka att antingen klättra över blocket / hylla eller tunnel genom hyllan för klättring experiment.
7. Stoppa videoinspelningar.
8. Sluta neurala inspelningar.
9. Skriv ner tidsstämpeln som genereras av TTL-puls.
10. Ta kackerlacka från arenan och vänta minst 3 minuter.
11. Upprepa steg från 3,2 till 3,10 för nästa försök.
12. När alla inspelningar har avslutats, passera 5 sek av 5 iA DC ström genom en av tråd tips (anod) och referenselektrod (katod) för att avsätta koppar in i hjärnan vid trådspetsen.

4. Offline Analys

1. Synkronisera video-och neurala uppgifter genom att länka ramen där LED-ljuset tänds och tidsstämpeln registrerats av färdsystemet viddet ögonblicket.
2. Mark tråd spets platser. Använd Timms intensifiering rutiner för att fälla ut och observera koppar i 12 um seriella sektioner ^17. Framstående insättningar ska synas i 3-8 intilliggande sektioner (ca 18-48% av längden på ryggventrala planet av det område vi spela in från) (Figur 2).
3. Korrelera specifika elektriska impulser till aktiviteten av enskilda nervceller. Följ spik sorterings förfaranden som i detalj på annan plats ^10,14,18. Använd programmet KlustaKwik (version 1.5, författare K. Harris, Rutgers University) för att generera initialt, automatisk klustring. Importera dem till programmet MClust (version 3.5, författare AD Redish et al., University of Minnesota) för vidare förädling och analys (Figur 3).
4. Spåra kackerlacka rörelser. För promenader experiment, extrahera positionen för kackerlacka s (visuell) masscentrum och dess kroppsorientering i varje bildruta i VIDeo inspelningar med Caltech Multiple Fly Tracker (version 0.1.5.6, http://ctrax.sourceforge.net/) och tillhörande FixErrors verktygslåda för MATLAB ^19. För att klättra experiment extrahera positionen för blocket och kackerlacka huvud och pronotum i varje ram av videon med rörelseanalys programpaketet.

Representative Results

Vi spelade in den neural aktivitet av 50 enheter från CC i 27 förberedelser för promenader experiment. För 15 av dessa preparat (23 enheter), var klättring experiment också utförts. Individuella enheter benämns efter förberedelse och enhetsnummer (t.ex. enhet 1-2 indikerar beredning 1, enhet 2).

Ögonblicksbilder från videon av en klättring studie visas i Figur 4. Hela videon finns i kompletterande Video 1 (Ljudet från enheten 1-2). Inspelningen gjordes i den högra solfjäderformad kropp (FB). Den kackerlacka slutade gå när det mötte blocket och använt sina antenner för att bedöma blocket (fig. 4A-C). Därefter kackerlacka höjt framför sin kropp, att ändra kroppssubstratvinkeln (fig 4D-E), innan den svängs benet mot överdelen av blocket och klättrade över den (fig 4F-I). Den hastighet och höjd av the kackerlacka samt den momentana eldhastighet av de två sorterade enheterna från den första till den aktuella ramen visas ovanför varje bildruta. Den momentana avfyrningshastigheten beräknades genom att jämna spik gånger för varje enhet med hjälp av en Gauss-kärna med en bredd på 50 msek. Den eldhastighet av enhet 1-1 ökade under klättring och ökningen av eldhastighet föregås ökningen av hastigheten (figur 4I). Enhet 1-2 var tyst innan klättring men började skjuta efter klättring inleddes (Figur 4I). Spikarna hos de två sorterade enheterna inom en sekund av den nuvarande ramen visas under varje ram. Den orange linjen visar den tid som täcks av varje bildruta och den blå rektangeln visar två gånger bredden av kärnan som användes för att beräkna den momentana eldhastighet för den aktuella ramen.

En ögonblicksbild av videon på en arena utforskning studie visas i figur 5A. Hela videon är AVAILABLE i kompletterande Video 2 (Ljudet från enheten 2-1). Inspelningen gjordes i mitten FB. Positionen av kackerlacka och dess kropp orientering i varje ram extraherades med användning Ctrax och användes för att beräkna fram och rubrik hastighet samt momentan eldhastigheten. Banan för den kackerlacka i hela video visas i figur 5B. Varje svart prick indikerar positionen av kackerlacka i varje ram och den väg är färgkodade med den momentana eldhastighet av enheten 2-1. När vi spelade in varje prövning vid en konstant bildhastighet (dvs. 20 fps), ju längre avståndet mellan två punkter, desto snabbare hastighet på den tiden. Den eldhastighet av enhet 2-1 ökade när kackerlacka började gå och var korrelerad med gånghastighet. För att undersöka inställningen av enskilda enheter till djurets rörelsetillstånd (dvs. hastighet och riktning), vi konstruerat eldhastighet kartor som baseras på den gånghastighet och TURNing hastighet för varje enhet. För många CC enheter, ökade eldhastighet begränsade till vissa locomotion stater. Till exempel var enhet 2-1 trimmad att vidarebefordra gå oavsett vända hastighet (figur 5C).

Figur 1. Bilder av animaliskt beredning. AC frontvy av kackerlacka huvudet kapsel. A. Två bitar av acetat ark placerades nära den tetrode att tillhandahålla basen för vax. B. En dragavlastning var skapa d genom att böja tetrode i vax. C . Den tetrode var helt täckt av dentala vax. D. Dorsal vy av kackerlacka kroppen. En trä stav fästes till djurets pronotum och tetrode slangen var fäst vid stången. Den tetrode och referens / jordelektrod vire ytterligare säkras genom att fästa dem till den främre av stången. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2. Mark tråd spets platser. A. En sektion av hjärnan hos preparatet n ^o 2, som visar en brun kopparavsättningsplatsen i fläktformad kropp (FB). B. Schematisk ritning av CC och viran spetsläget. PB, protocerebral bro, FB, solfjäderformad kropp,. EB, ellipsoid kropp Klicka här för att visa en större bild.

Figur 3. &# 160; En typisk tetrode inspelning A. Raw spänning spår från enskilda elektroder inom en tetrode bunt.. Notera skillnaden i spännings spår mellan olika elektroder. B. Tre enheter sorterades med användning MClust. C. 3-dimensionell vy av den energi vågformen som registreras på tre av de fyra elektroderna. Varje punkt är en enda tröskelhändelse, färgkodade av klustret det slutligen tilldelats. Klicka här för att visa en större bild.

.. Figur 4 ögonblicksbilder av video från en klättrande försök Ovanför varje ram: normaliserad hastighet, höjd på kackerlacka samt momentan eldhastighet av de två sorterade enheterna från den första till denaktuella ramen. Tid 0 indikerar uppkomsten av klättring. Eldhastighet normaliserades 0-1, och hastighet och höjd normaliserades 0-0,5 för visningsändamål. Nedanför varje ram: spikar av de två sorterade enheterna inom en sekund av den aktuella ramen. Den orange linjen visar den tid som täcks av varje bildruta och den blå rektangeln visar två gånger bredden av kärnan som användes för att beräkna den momentana eldhastighet för den aktuella ramen. Individuella enheter namnges enligt förberedelse-och enhetsnummer (t ex. "Enhet 1-2" indikerar beredning 1, enhet 2). Klicka här för att visa en större bild.

Figur 5. En ögonblicksbild av videon på en arena utforskning rättegång A. Den rödaoval linje visar formen på kackerlacka i den ramen och den röda streckade linjen anger positionen för kackerlacka masscentrum i de föregående 10 bildrutor. Höger: svarvning och framåt gånghastighet samt den momentana eldhastighet av enhet 2-1 i den ramen. Nedan: spikar av enhet 2-1 inom 4 sekunder av den aktuella ramen. Liksom i figur 4, indikerar den orange linjen den tid av varje ram och den blå rektangeln indikerar två gånger bredden på den kärna som användes för att beräkna den momentana eldhastighet för den aktuella ramen. B. banan för kackerlacka i hela video. Den stora svart punkt indikerar startpunkten för det kackerlacka och varje liten svart prick indikerar positionen av kackerlacka i varje ram. Banan var färgkodade med den momentana eldhastighet av enhet 2-1, från blå (låg) till rött (hög). C. eldhastighet karta över enheten 2-1. För hela experimentet, framåt och turning hastighet samt spik gånger var jämnas med hjälp av en Gausskärna med en bredd på 150 ms och delades in nonoverlapping 50 ms långa sektioner. För varje uppdelad sektion ades en hastighetsvektor genererad genom medelvärdes framåt och vrida hastighet inom den perioden respektive. Eldhastighet för varje hastighetsvektor beräknades också. Alla hastighetsvektorerna binned (10 mm / sek för framåtgånghastighet och 10 grad / sek för svarvning hastighet) och en tändsats karta genererades genom att överlagra den medelvärdes eldhastighet för varje fack erhålls genom medelvärdes alla tändsatser vars motsvarande hastighetsvektorerna föll in i det facket. X-axeln är svänghastighet och y-axeln är den främre gånghastighet. Positiv svänghastighet indikerar rätt svarvning och negativa svänghastighet indikerar vänster svarvning. Klicka här för att visa en större bild.

Discussion

Medan tidigare elektrofysiologiska studier på CC eller andra regioner av insekten hjärnan har gett oss insikter i den centrala kontrollen av beteende, de flesta av dem utfördes i antingen återhållsamma förberedelser ^9,11 eller uppbundna kära ^10,14. Som ett resultat kan djurets sensorisk upplevelse och fysiologiska tillstånd vara mycket olika dem i en naturlig miljö. Vidare är de beteendemässiga uppgifter, att djuret kan utföra är begränsade till ett plan i enlighet med dessa situationer. Här presenterade vi en metod för att spela in från CC i fritt beter kackerlackor. Förhoppningsvis har vi gett dig all nödvändig information du behöver för att fånga elektrofysiologiska inspelningar i fritt beter insekter i ditt eget laboratorium. Vi presenterade förfarandena för de system som vi använder (Neuralynx, MClust, WinAnalzye och Ctrax), men när omkodningen elektroder implanteras, kan spela in inställningar lätt anpassas till andra system. & #160;

Vi har utfört 27 preparat, och som av ännu inget försök avbröts på grund av att kackerlacka skadade tråduppsättningar. Vi har inte observerat några försök av djuret för att rengöra eller ta bort tråduppsättningar, vax, eller stav. De implanterade kackerlackor gick i en normal gång. De kunde utforska arenan och utför klättring arbetsuppgifter lika bra som intakta sådana. Våra experiment varade vanligtvis 2-4 timmar efter tetrode implanterades. Ibland vissa enheter försvunnit eller deras aktivitet minskat under hela tiden, men de flesta inspelningarna var mycket stabil under hela experimentet. Vi har också isolerat vissa ämnen och återvände till registrering och stimulering följande dag. Denna metod verkar pålitligt under längre perioder cellulära inspelningar i fritt bete sig insekter.

En punkt av vikt är den bräckliga natur wire-apparater. De är lätt skadas om stor omsorg inte tas under byggtiden och implantation. Flytta alltid trådarna och eventuella dissekera instrument i närheten av dem sakta, försiktigt så att inte stöta eller riva dem. Trådar kan försiktigt dras från beredningen efter experimentet och lesioning är klara, vilket möjliggör två eller tre användningsområden. Var noga med att åter testa, repolish, och förnyad utbredning före varje användning.

Nyckeln till en lyckad förberedelse är att hålla tråduppsättningar från kackerlacka. Vi använder en lång stav som sträcker sig från pronotum ovan buken och fäst tetrode slangen till den bakre änden av stången. Följaktligen är det tetrode slangen alltid bakom kackerlacka när den rör sig runt i en arena så att insekten inte kan nå slangen med dess antenner eller ben. Placering av tråduppsättningar bakom kackerlacka ger också klare över djurets kropp. Detta förbättrar videokvaliteten på vår arena experiments eftersom kameran är placerad ovanför arenan. Lämna inga överflödiga kablar mellan djurets huvud och tetrode slangen. Om insekten kan nå trådarna med dess antenner eller ben, kommer det att bryta dem. I denna metod, fritt slangen glider över kabeln, vilket tillåter oss att dra överflödig tråd upp och fäst den nära huvudsteg.

En potentiell begränsning av vår metod är storleken på den arena där den kackerlacka kan utforska. Den tetrode är 40 cm i längd, som är tillräckligt för att ge tillgång till hela 40 x 40 cm ² arena. Vi har inte stött på problem som buller och tetrode kvalitet. Däremot kan sådana problem visas som vi gör längre tetrodes för en större arena. Ett annat potentiellt problem med en längre tetrode är vikten på tetroden. Vår tetrode och stav väger ca 0,25 g, som uppenbarligen inte hindrar en 2-3 g kackerlacka. Vi observerade intakta kackerlackor utforska samma arena som används för eltrophysiology experiment. Gång verksamheten och den hastighet var liknande mellan kackerlackor bär en stav och tetrode och icke pantsatta djur. Vi har dock inte testat gränsen för den last som en kackerlacka kan bära innan dess prestanda sjunker. En lösning på de begränsningar av en längre tråd är att bygga en motordriven plattform för huvudsteg och kameran. I ett sådant system, kan kameran spåra kackerlacka rörelser i realtid och utmatning till motorn, så att plattformen kan röra sig i enlighet därmed. Därför skulle en relativt kort tetrode vara tillräcklig för en stor arena eftersom huvudsteg skulle förbli direkt ovanför djuret.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nichrome wire	Sandvik Heating Technology	Kanthal RO-800	Use for tetrode
Biomedical polyethylene tubing	A-M Systems	800700	Use for tetrode tubing
Lynx-8	Neuralynx		Use for multiunit recording
Cheetah 32	Neuralynx		Use for multiunit recording
High speed camera	Basler	A602f	Use for video recording for walking experiments
High speed camera	Casio	EX-FC150	Use for video recording for climbing experiments
WINanalyze	Winanalyze	version 1.4 3D	Use for video tracking
MATLAB	MathWorks	MATLAB R2012b	Use for TTL pulse generation and offline data analysis