Summary
Biz daha önce bize gergin hamamböceği bireysel birimlerin etkinliğini izlemek için izin verir hamamböceği beyinlerinin merkezi kompleksi içine tetrode telleri implante için bir teknik geliştirdi. Burada bize de özgürce böcekler hareket beyin aktivitesini kaydetmenize olanak sağlayan tekniğin değiştirilmiş bir sürümü mevcut.
Abstract
Böcek motor kontrolünde beyin aktivitesinin rolü artan ilgi biz böcekler doğal davranışı gerçekleştirmek ise nöral aktiviteyi izlemek mümkün olmasını gerektirir. Bir gergin hamamböceği çıktı veya değiştirilmiş yürüme hızı Biz ise daha önce aynı anda birden bize nöronların aktivitesini kaydetmek için izin hamamböceği beyinlerinin merkezi kompleksi içine tetrode telleri implante için bir teknik geliştirdi. Büyük bir ilerleme olsa da, gergin hazırlıklar sınırlı davranışlara erişim sağlar ve genellikle serbestçe hayvanlar hareket meydana geribildirim süreçleri yoksundur. Şimdi bize de bir arenada yürümek ve dönüm tırmanma ya da tünel yoluyla engelleri ile uğraşmak gibi özgürce hamamböceği hareket merkezi kompleksinden kaydetmenize olanak sağlayan tekniğin değiştirilmiş bir sürümü mevcut. Yüksek hızlı video ve küme kesme ile birleştiğinde, biz şimdi özgürce davranmak böceklerin hareketinin çeşitli parametrelere beyin aktivitesini ilgili olabilir.
Introduction
Böcek o altında, etrafında tünel açmak, ya da engeller üzerinde tırmanmaya neden nesnelerle bir arenada ve fırsatlar yürür gibi bu makalede, merkezi kompleksi hamamböceği, Blaberus discoidalis ve (CC) içerisindeki nöronların kayıt için başarılı bir sistem anlatılmaktadır. Telleri de buna bağlı olarak davranış değişiklikleri ile çevresindeki nöropilde aktivitesi uyandırmak için bir uyarıcı bağlanabilir.
Son on yılda büyük ilgi böcek davranışlarını kontrol çeşitli beyin bölgeleri tarafından oynanan roller yönelik olmuştur. Bu odak çok toplu merkezi kompleksi (CC) olarak adlandırılan orta hat beyin neuropils doğru yönlendirilir edilmiştir. İlerleme davranış MK rolü hakkında sorular hedefleme teknikleri geniş çeşitleri bir sonucu olarak yapılmıştır. Bu teknikler davranışına ile birlikte esas olarak Drosophila nörogenetik manipülasyonlar, aralığıCC ve davranışsal ilgili parametreler için bu aktivite ile ilgilidir girişimi içinde nöral aktiviteyi izlemek elektrofizyolojik teknikler oral analiz 1-3.
Elektrofizyolojik teknikler çoğu zaman, çok kanallı probları 10,11 ile, tek tek tanımlanmış nöronlar 4-9 ve hücre dışı kayıt hücre içi kayıt içerir. Bu iki teknik ücretsizdir. Sivri elektrotlar veya bütün hücre yama ile hücre içi kayıt tespit nöronlarda çok ayrıntılı sağlar, ancak aynı anda bir veya iki hücreler ile sınırlıdır, sınırlı ya da hiç hareket gerektirir ve zaman nispeten kısa bir süre için muhafaza edilebilir. Ekstrasellüler kayıtları kolayca kısıtlama gerekmez, kurulabilir ve saat için muhafaza edilebilir. Çok kanallı tetrodes ve küme kesim, nöronların oldukça büyük nüfusları aynı anda 9,12 analiz edilebilir. Da bütün hücre patch başarıyla gergin böcekler 13 kullanılmıştır, biz onlar ileriye hareket engelleri ile uğraşmak gibi bize serbestçe böcekler davranıyor uzun süre için beyindeki nöral aktiviteyi kaydetmek için izin teknikleri için de ihtiyaç olduğunu hissediyorum.
Aşağı böcek hamle ve yukarı sıçrar ve olarak kaydetmek için ihtiyaç dışı kayıt yöntemleri bize doğru itti. Biz piyasada mevcut 16 kanal silikon sondalar 11 ile ölçülü hazırlıklarında iyi bir başarı kayıt vardı, ancak hatta büyük hamamböceği küçük boyutlu sondalar vücudunu monte edilmesi anlamına gelir. Yani, prob kollarının incelik ile birlikte, bir ücretsiz yürüyüş hazırlanması için uygun olmaktan yaptı. Önceki iki projelerde, benzer kayıt özelliklerini gerçekleştirmek için bir TETRODE oluşturan ince tellerin demetleri kullanılan ancak daha sağlam bir düzenleme. Bu tetrode demetleri bizi gergin hamamböceği kaydetmek için izin verilen birhızı 14 yürüme ve bir çubuk 10 ile antennal temas sonucunda davranış dönüm değişikliklere CC birim aktivite ile ilgilidir d.
Bu gergin hazırlıklar olmuştur ve olmaya devam edecektir olarak yararlı, bazı sınırlamalar mevcut yapmak. İlk olarak, böcek gerçekleştirebilir davranışlar bir düzleme sınırlıdır. Yani, biz kolayca yürüme hızında ya da dönüm değişiklikleri uyandırmak olabilir, ama tırmanma ve tünel eylemleri en azından tipik urgan düzenleme ile mümkün değildi. İkincisi, bizim gergin hazırlıkları "açık döngü" vardır. Yani sisteme normal hareket ile ilgili geribildirim için izin kalmamasıdır. Hamamböceği Sabrımızın açık olarak Böylece, görsel dünya buna göre değişmiş değildi. Bu geribildirim, bu tür tanıtmak için kapalı döngü urgan sistemleri kurmak mümkündür. Bununla birlikte, simüle edilmiş görsel ortamının programlama ve donanım karmaşıklığı ile sınırlıdır. Nevertheless, biz bunun doğal ortamda olduğu gibi bir arena veya pist ve karşılaşılan nesneler özgürce yürürken biz hayvandan kaydederek, mevcut gergin kayıt yöntemleri geliştirmek olduğunu hissettim.
Beyin aktivitesini 15 kayıt için kablosuz sistemler ideal olacaktır rağmen, mevcut sistem kayıt kanallarının sayısının, veri toplama, pil ömrü ve ağırlık zamanında sınırlamaları vardır. Biz bu nedenle, özgürce hazırlıkları hareketli kullanım için gergin kayıt sistemi adapte etmeye seçti. Daha iyi bir kablosuz sistemler kullanılabilir hale gibi, bu tekniğin bu tür cihazlara kolaylıkla adapte edilebilir. Bu makalede açıklanan sistem, hafif çok iyi çalışır ve böceğin davranışına çok az zararlı bir etkiye sahip olduğu görülmektedir. Ucuz bir yüksek hızlı kamera ve küme kesme yazılım ile, bireysel beyin nöronları aktivite hareketi ile ilgili olabilir. Burada Prepar tariftetrode teller ve böceğin beyin içine implantasyonu yanı sıra elektriksel aktivite ve hareket ve nasıl bu veri için kayıt teknikleri tirme sonraki analiz için bir araya getirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Tetrode Teller hazırlanması
- Yaklaşık 1.1 m uzunluğunda çok ince nikrom tel (12 mikron çapında, PAC kaplama) çekin. Her ucuna bir teyp etiket takın. Iki ucu, masa üstü yanında aynı yükseklikte olacak şekilde yatay dişli çubuk üzerinde tel asın.
- 4 bir toplam iki ucu yapma, ikinci bir kablo için bir adım 1.1 yineleyin ve sonraki birinci tel arasında (yaklaşık 1 cm) için koyun.
- Bir kaset etiketi ile birlikte dört ucu sopa ve bir motorlu döner sarma cihazına iliştirirsiniz. Bu cihaz, ucuz bir DC motorundan yapılabilir.
- 2 dakika boyunca (60 rpm) için, bir yönde tetrode rüzgar ve 30 saniye için ters yönde açmak.
- Birlikte telleri kaynaştırmak için bir ısı tabancası kullanın. Tabanca ile teller dokunmayın. Her geçiş yaklaşık 10 saniye alarak, yukarı ve aşağı geçer alternatif yönlerde üç kullanın.
- Üst ve yara tellerin alt kesin. Dört teller bükülür bird bir ucunda birbirine bağlı ama diğer ayrılmasına.
- Destek tüpü ekleyin. Polietilen boru 30 cm uzunluğunda (: inside 0.28 mm, dış 0.61 mm çap) kesin. Çok yavaş ve dikkatli bir şekilde destek borusu içine doğru kıvırmayın kalmaması TETRODE geçirin.
- Kaynaşık ucu ise diğer yan göründüğünde, kılavuz tüpün her iki uçta tel eşit uzunlukta olacak şekilde, içinden geçirin.
- Bir forseps ile her telin ayrı ucunu tut. Bir gaz brülör alev tabanı kullanılarak, dikkatle her tel son 2 veya 3 mm kapalı yalıtım yakmak. O parlıyor kadar tel ısıtmak, ama kıvırın değil.
- Lütfen kayıt cihazı uyan bir erkek-kadın IC priz ile TETRODE bağlayın. Bir forseps ile adaptörü farklı bir prize her telin deinsulated sonuna koyun. Küçük bir pirinç iğne ile sokete tel stabilize. Ince bir nokta havya kullanın ve erimiş lehim ile soketi doldurun. Temas etmemeleri için dikkatli olunhavya ile kırılgan tel.
- Her bir tel empedansını ve tellerin her bir çiftin arası empedans kontrol edin.
- Tuzlu su bir kap içine erimiş, bükülmüş ucunu ve ohm metre tuzlu bir bakır tel iletken bağlayın.
- Teli içeren soket pin metre diğer ucunu. Her bir tel empedansı 3 MQ altında olmalıdır.
- Yukarıdaki değerler elde değilseniz, lehim bağlantıları reattempt.
- , Tuzlu gelen kabloları çıkarın suyla durulayın ipuçları ve her bir eşleştirme için inter tel empedans testi (n = 6). Arası empedans 5 MQ üzerinde olmalıdır.
- Yukarıdaki değerler elde değilseniz, kaynaşmış sonunda ucu kapalı küçük bir miktar dilim ve yeniden test edin.
- Tellerin tüm empedans gereksinimleri hem uymayan herhangi bir kablo seti atın.
- TETRODE sabitleyin.
- Küçük bir dikdörtgen kağıt kutusu Slig Foldpriz daha büyük ı çözünebilir durumda bulundu.
- Altındaki erkek tarafı ile kutunun içine adaptörü aktarın. Adaptörün kalan kutunun içinde iken erkek tarafı bütün iğneler kutunun dışında olduğu şekilde kutuyu nüfuz.
- Dış kutunun köşelerine bantlayın. Tel herhangi bir bireysel ipliklerini dengelemek için kutunun iç çift taraflı yapışkan bant arasında küçük parçalar kullanın. Bu kutu çıkan kablo bağlı olmalıdır.
- Hızlı set 2 parça epoksi karıştırın ve adaptörü ve tüm kabloları sabitlemek için kutunun içine dökün.
- Diş balmumu ile kutunun bir tarafına kılavuz boru yakın ucunu ancak boru tetrode her iki uçta da serbest bir şekilde çekilebilir şekilde açık bırakır.
- TETRODE netleştirin.
- Her deneyden önce, keskin bir neşter bıçak, makas değil ile TETRODE ucunu kesti. Bu ezme önler ve bir sonraki aşama için bir temiz ve düz bir kenar sağlarken telin meyletme sona erer.
- Arzu edilen sonuç, her bir telin ucundan çıkarılır yalıtım az miktarda olan bir sivri ucu düz bir kenardan paket ucu dönüştürür. TETRODE kaplama önce bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak noktasını doğrulayın. Herhangi bir yıpranma ucunda oluşursa, recut ve repolish.
- Eğer subsequ boyunca empedans testient kaplama adım son derece düşük inter tel değerleri (az 4 MQ) gösterir, bu parlatma adımı sırasında çıkarılan çok malzemeyi gösterir. Recut ve TETRODE repolish.
- Her deneyden önce, keskin bir neşter bıçak, makas değil ile TETRODE ucunu kesti. Bu ezme önler ve bir sonraki aşama için bir temiz ve düz bir kenar sağlarken telin meyletme sona erer.
- TETRODE Plate. Doymuş bakır sülfat çözeltisi (85 mi su, 5 ml sülfürik asit, 50 g bakır sülfat) içine tetrode ucu koyun. Levha bir uyaran izolatör ile 2.5 uA bir akım ile her tel. , 1 saniye akımı enjekte 1 saniye duraklama ve bu işlemi 4x tekrarlayın.
- Her bir tel empedansını ve tellerin her bir çiftin interimpedance edin. Her telin empedans 0.5-1 MQ ve arası empedans 4 MQ üzerinde olmalıdır arasında olmalıdır.
- Çok kanallı kayıt sistemi headstage üzerine montaj adaptörü.
- Bir micromanipulator bükük bir böcek pin takın. Diş balmumu ile böcek pimine tetrode ucu takın
2. Hayvan Preparasyon
- Uyutmakbuz ile hamamböceği.
- Hamamböceği hareket durduktan sonra, böcek apışıp büyük eyer iğneler ile düz bir mantar yüzeye karşı dikine hamamböceği dizginlemek ama onun vücudunun herhangi bir bölümünü nüfuz etmezler.
- Plastik bir kap içine aktarın hazırlama ve kan akışı ve vücut hareketleri en aza indirmek için, hayvanın etrafında buz yerleştirin.
- Başını desteklemek ve stabilize başının etrafında diş mumu yerleştirmek için boynunda bir plastik bilezik yerleştirin.
- Bir jilet ile ocelli arasında küçük bir pencere kesin ve baş kütikül çıkarın.
- Beyin ortaya çıkarmak için forseps ile bağ dokuları ve yağ çıkarın.
- Beyin dokusu kapsayacak baş kapsülü içine bazı hamamböceği tuzlu yerleştirin.
- Beyin desheath için, hafifçe beyin üstüne kılıfı kapmak ve tel implante alanında ayrı kılıfı gözyaşı başka bir ince forseps kullanılacak bir ince forseps kullanır.
- Beyin zekâ baş kapsül anterior küçük bir delik açınh bir böcek pin. Bir referans / toprak elektrot olarak hizmet deliğe bakır teller izolasyonlu üç büyük çaplarda (56 mikron) bir örgü yerleştirin.
- Mikromanipülatör ile beyin yüzeyine TETRODE ucu düşürmek ve faiz beyin bölgesi yakınında konumlandırmak.
- Dikkatlice tetrode ince asetat tabaka iki küçük parçalar kafa kapsül içindeki delik biraz daha büyük (2 mm x 1 mm), ön ve arka yerleştirin.
- Kayıt sistemi açın.
- Yavaşça kayıt kalitesine bağlı olarak beyin yüzeyinin altında tetrode 150-250 mikron düşük.
- Kayıt sistemini kapatın.
- (Şekil 1A) dokunmadan mümkün olduğunca TETRODE yakın olarak asetat levha iki adet taşıyın.
- Küçük bir spatula veya düzleştirilmiş derialtı iğne ısıtın ve sıvı balmumu spatula ucunda olduğu şekilde diş mumu koydu. Dikkatle gelen asetat tabakanın her parçasının uzak ucuna temassıvı balmumu her parça üzerine akmasına ve onunla baş manikür arasındaki boşluğu kapamak böylece spatula ile TETRODE.
- Adımı 2.16 tekrarlayın. Asetat tabaka her üzerine sıvı balmumu küçük bir miktar bırakın. Uzakta TETRODE gelen işlemini başlatın ve doğru yavaş yavaş hareket. Sonunda tetrode diş balmumu tarafından demirlemiş olacaktır. Boşluğuna ve beynin üzerine sıcak balmumu kaçının.
- Balmumu ile başvuru / toprak elektrot demirlemek için 2,16 ve 2,17 adımları gibi aynı yöntemi kullanın.
- Ondan TETRODE serbest bırakmak için micromanipulator TETRODE verdiği balmumu ısıtın.
- Döngü bir gerginlik rahatlama (Şekil 1B) sağlamak için kafasına diş balmumu içine tetrode.
- Dişçilik mumları (Şekil 1C) ile gerginlik kabartma döngü örtün.
- Dikkatlice kısıtlamaları ortadan kaldırmak ve bir Petri kabı üzerine hazırlanmasını aktarın. Büyük eyer pimleri ile hazırlık dorsal yüzü yukarı dizginlemek.
- IliştirmekBir tutkal tabancası kullanarak pronotum bir çubuk. Bu karın üzerinde pronotum uzanan bir tahta sopa.
- Diş balmumu ile çubuğun arka ucuna tetrode boru ucu takın.
- Diş balmumu ile çubuğun ön ucuna tetrode ve referans / toprak elektrotu Çapa.
- Mümkün olduğunca boru soketi ucundan tetrode çekin, ama hayvan boru (Şekil 1D) dışında tetrode bölümünü hasar ihtimalini ortadan kaldırmak amacıyla, üzerinde römorkör yoktur.
- Tüm kısıtlamalar çıkarın. Diş balmumu ile tetrode boru için başvuru / toprak elektrot takın.
- Her deneyden önce buz anestezi kurtarmak için bir hayvan için en az 60 dakika bekleyin.
3. Deney Prosedürleri
- Kayıt sistemi ve seri port kablosu için bir USB kullanarak bir LED ışık hem de bir PC'ye bağlayın.
- Sinir kayıtları başlayın.
- Yüksek hızlı kamera kullanarak deneyler tırmanma Motmot görüntü toplama paketini 16 veya 120 fps kullanarak deneyler yürüyüş için saniyede 20 kare video kayıtları başlayın.
- Yürüyüş deneyler ya bir 58 cm uzun, 5 cm genişliğinde ve deneyleri tırmanış için 5 cm yüksek arena için x 40 cm pleksiglas arena 40 cm içine hamamböceği yerleştirin. Yürüme arena headstage bulunduğu yukarıda arenada merkezine doğru duvarının ortasında uzanan şeffaf bir engel vardır. Bariyer kamera görünümü headstage tarafından engellenen alanlarda yürüyüş hayvanlar önlemek için kullanılır. Tırmanma arena bir akrilik blok (1.2 cm ya da 1.8 cm yüksekliğinde ve 5 cm genişliğinde olarak) veya merkezde benzer bir yükseklikte yer alan bir raf sahiptir.
- Özelleştirilmiş bir MATLAB komutunu kullanarak PC'den bir TTL darbe üretir. (S = seri ('COM4'); fopen (ler); s.RequestToSend = 'off' / s.RequestToSend = / 'üzerinde'; fclose (ler);) s (silin ;). TTL darbe bir kez oluştururkayıt sistemi için bastırmaya ve açılır veya LED ışığı kapanır ya.
- Bu yürüyüş deneyler için daha 30 saniye boyunca durana kadar hamamböceği arenada keşfetmenizi sağlayacak. Hamamböceği deneyleri tırmanma için raf yoluyla blok / raf veya tünel tırmanmak ya izin verir.
- Video kayıtları durdurmak.
- Sinir kayıtları durdurmak.
- TTL darbe tarafından oluşturulan damgası yazın.
- Arenada hamamböceği çıkarın ve en az 3 dakika bekleyin.
- Tekrar bir sonraki duruşma için 3,2-3,10 adımları.
- Bir kez tüm kayıtları tamamlandı, tel uçları (anot) ve tel ucunda beyin içine bakır yatırmak için referans elektrot (katot) biri aracılığıyla 5 uA DC akım 5 saniye geçmektedir.
4. Çevrimdışı Analizi
- LED ışık açıldığında çerçeve ve en kayıt sistemi tarafından kaydedilen damgası bağlayarak video ve nöral verileri senkronizeo an.
- Mark tel ucu yerleri. 12 mikron seri bölümleri 17 bakır çöktürmek ve gözlemlemek için Timms yoğunlaşma işlemleri kullanın. Tanınmış mevduat 3-8 bitişik bölümleri (alan dorsal ventral uçağın uzunluğunun yaklaşık 18-48% biz kayıt) (Şekil 2) görünür olmalıdır.
- Tek bir nöron aktivitesi özgü elektrik darbeleri Correlate. Başka 10,14,18 ayrıntılı ortaya koydu sıralama prosedürleri başak izleyin. İlk, otomatik kümelenme oluşturmak için programı KlustaKwik (sürüm 1.5, yazar K. Harris, Rutgers Üniversitesi) kullanın. Ileri arıtma ve analizi (Şekil 3) için programa MClust (sürüm 3.5, yazarlar AD Redish vd., Minnesota Üniversitesi) aktarmak.
- Böceğin hareketlerini takip. Deneyleri yürüyüş için, vid, her çerçeve içinde kitle ve vücut yönelim böceğin (görsel) merkezi konumunu ayıklamakve MATLAB 19 için ilişkili FixErrors araç kutusunu, Caltech Çoklu Fly Tracker (http://ctrax.sourceforge.net/ version 0.1.5.6) kullanılarak eo kayıtları. Deneyleri tırmanışı için, hareket analizi yazılım paketi kullanarak videonun her karesinde blok ve böceğin baş ve pronotum konumunu ayıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz yürüme deneyleri için 27 hazırlıklarında CC 50 adet nöral aktiviteyi kaydetti. Ancak bu preparasyonların (23 adet) 15 için, deneyler tırmanma yapıldı. Bireysel birimler (örneğin birim 1-2 hazırlık 1, ünite 2 gösterir) hazırlama ve birim numaralarına göre adlandırılır.
Bir tırmanma deneme video Anlık Şekil 4'te gösterilmiştir. Tüm video (ses ünitesi 1-2 dan) ek video 1'de kullanılabilir. Kayıt doğru fan biçimli gövde (FB) içinde yapıldı. Bu blok karşılaşılan ve bloğu (Şekil 4A-C) değerlendirmek için olan anten kullanıldığında hamamböceği yürüyüş durdu. Sonra hamamböceği (Şekil 4F-I) bu bloğun üstüne doğru bacağını salladı önce, vücut yüzey açısı (Şekil 4D-E) değişerek, vücudun ön kaldırdı ve üzerine tırmandı. Th hız ve yükseklike hamamböceği gibi birinci, mevcut çerçeve için, iki sıralı birimlerinin anlık ateşleme hızı her çerçevede, yukarıda gösterilmiştir. Anlık ateşleme hızı 50 milisaniye genişliğinde bir Gauss çekirdeği kullanarak her birimin başak kez yumuşatma hesaplanmıştır. Ünitesinin 1-1 ateşleme hızı tırmanma sırasında artmış ve ateşleme hızı artış hızı artışı (Şekil 4I) öncesinde. Birim 1-2 tırmanma önce sessiz ama tırmanma (Şekil 4i) başlatılmıştır sonra ateş etmeye başladı. Geçerli karenin 1 saniye içinde iki sıralı birimlerin kramponları her karenin altında görüntülenir. Turuncu çizgi, her çerçeve ve mavi dikdörtgen kapsadığı zaman iki kez, mevcut çerçeve için anlık ateşleme oranını hesaplamak için kullanılan çekirdeğin genişliğini gösterir gösterir.
Bir arena keşif yargılanma video bir anlık Şekil 5A gösterilmiştir. Tüm video av olduğunuAILABLE tamamlayıcı Videolu 2 (Ses ünitesinde 2-1 dan). Kayıt orta FB yapıldı. Her çerçeve içinde hamamböceği ve vücut yönlendirme konumu Ctrax ile ekstre edilmiş ve ileri hesaplamak ve hız gibi anlık ateşleme hızı başlığı için kullanılmıştır. Tüm video hamamböceği yörünge Şekil 5B 'de gösterilmiştir. Her siyah nokta her karede hamamböceği konumunu belirtir ve yol ünite 2-1 anlık ateşleme hızı ile renk kodlu. Biz sürekli bir kare hızı (yani 20 fps) her deneme kaydedildiği gibi, artık o anda iki nokta, daha hızlı hızı arasındaki mesafe. Ünitesinin 2-1 ateşleme hızı hamamböceği yürümeye başladı artmış ve yürüme hızı ile korelasyon. Hayvanın lokomosyon devletin (yani hız ve yön) bireysel birimlerinin ayar incelemek için, biz ileriye yürüme hızı ve TUR dayalı oranı haritalar ateş inşaher birim için Koşma hızı. Birçok CC birimler için, artan ateşleme hızı belirli hareket devletlere sınırlıydı. Örneğin, birim 2-1 bakılmaksızın (Şekil 5C) hızı dönüm yürüyüş iletmek için ayarlanmıştır.
Şekil 1. Hamamböceği baş kapsül hayvan hazırlanması. AC Frontal bakış Resimleri. A. asetat yaprağının iki adet mum için temel sağlamak için TETRODE yakın yerleştirildi. B. A suşu kabartma balmumu içine TETRODE bükerek d oluşturmak oldu. C . Tetrode tamamen diş balmumu ile kaplıydı. Hamamböceği vücudun D. Dorsal görünümü. Bir ahşap çubuk hayvanın pronotum bağlanmıştır ve tetrode boru çubuğa bağlanmıştır. Tetrode ve referans / toprak elektrot bizre daha çubuğun ön takarak güvenli. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. Mark tel ucu yerleri. Fan biçimli gövde (FB). MK B. şematik çizim ve tel ucu konumu bir kahverengi bakır birikimi sahasını gösteren hazırlık n o 2 beyninin bir. Bir kesiti. PB, protocerebral köprü, FB, yelpaze şeklinde gövde;. EB, elips beden büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Şekil 3,. Ve# 160; tipik tetrode kayıt biri tetrode paket içinde tek elektrotları A. Ham gerilim izleri.. Farklı elektrotlar arasındaki gerilim izlerin fark olduğuna dikkat edin. B. üç tane dört elektrot üç üzerine kaydedilmiş olarak dalga enerjinin MClust. C. 3-boyutlu görünümünü kullanarak kriteri edilmiştir. Her nokta sonuçta atandı küme tarafından kodlanmış tek bir eşik olay renktir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
.. Şekil 4 bir tırmanma yargılanma video Anlık her çerçeve Üstü: normalize hız, hamamböceği yüksekliği yanı sıra ilk gelen iki sıralı birimlerin anlık ateşleme hızıGeçerli kare. Zaman 0 tırmanma başlangıcını gösterir. Ateşleme hızı 0-1 normalize edilmiş, ve hız ve yükseklik gösterim amaçlı 0-0,5 normalize edildi. Her çerçeve aşağıda: Geçerli karenin 1 saniye içinde iki sıralı birimlerin sivri. Turuncu çizgi, her çerçeve ve mavi dikdörtgen kapsadığı zaman iki kez, mevcut çerçeve için anlık ateşleme oranını hesaplamak için kullanılan çekirdeğin genişliğini gösterir gösterir. Bireysel birimleri hazırlama ve birim numaralarına göre isimlendirilmiştir (örneğin. "Birim 1-2" hazırlık 1 gösterir, ünite 2). resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Bir arena keşif deneme A. kırmızı videonun Şekil 5. One anlıkoval çizgi bu çerçeve içinde hamamböceği şeklini gösterir ve kırmızı kesikli çizgi önceki 10 kare kütle böceğin merkezinin konumunu gösterir. Sağ: dönüm ve ileriye yürüme hızı gibi o karedeki birimin 2-1 anlık ateşleme hızı. Aşağıda: Geçerli karenin 4 sn içinde birimin 2-1 sivri. Şekil 4'te olduğu gibi, turuncu çizgi her çerçeve ve mavi dikdörtgen kapsadığı zaman iki kez, mevcut çerçeve için anlık ateşleme oranını hesaplamak için kullanılan çekirdeğin genişliğini gösterir gösterir. B. in the entire hamamböceği yörünge Video. Büyük bir siyah nokta hamamböceği başlangıç noktasını gösterir ve her küçük siyah nokta her karede hamamböceği konumunu gösterir. Yörünge rengi kırmızı (yüksek). C. biriminin 2-1 ateşleme hızı haritası (düşük), maviden biriminin 2-1 anlık ateşleme oranı ile kodlandı. Tüm ileri deney ve tu içinrning hızı gibi başak kez 150 msn genişliğinde bir Gauss çekirdeği kullanılarak düzeltti ve örtüşmeyen 50 msn uzun bölümler ayrılmıştır. Her bölünmüş bir bölüm için, bir hız vektörü ileri ortalama ve sırasıyla bu süre içinde hız çevirerek oluşturulmuştur. Her hız vektörü için Atış oranı da hesaplanmıştır. Tüm hız vektörleri (10 mm / ileriye yürüme hızı ve hız dönüm için 10 derece / sn sn) ve binned olduğu bir ateşleme hızı haritası, karşılık gelen hız vektörleri tüm ateşleme oranı ortalaması alınarak elde edilen her bin için ortalama atış hızına yerleştirilmesi ile oluşturulan o kutu içine düştü. X ekseni dönme hızı ve y ekseni ileriye yürüme hızıdır. Pozitif dönüş hızı sağ dönüşünü gösterir ve negatif dönüş hızı sola çevirme gösterir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Böcek beyin KK yada diğer bölgelerde önceki elektrofizyolojik çalışmalar davranışın merkezi kontrol içgörü ile bize vermiş olsa da, çoğu ölçülü hazırlıkları 9,11 veya bağlı olanlar 10,14 ya yapılmıştır. Sonuç olarak, hayvan duyusal deneyimi ve fizyolojik durum doğal bir ortamda bu çok farklı olabilir. Bundan başka, hayvan gerçekleştirebilir davranış görevleri olan durumlar altında bir düzlemde sınırlıdır. Burada özgürce davranıyor hamamböceği CC kayıt için bir yöntem sundu. Umarım, biz özgürce kendi laboratuvarında böcekler davranıyor elektrofizyolojik kayıtları yakalamak için gereken tüm gerekli bilgileri ile sağladı. # Biz (Neuralynx, MClust, WinAnalzye ve Ctrax) kullanan sistemler için prosedürleri sunulan, ancak yeniden kodlama elektrotlar implante edildikten sonra, kayıt kurulum kolayca diğer sistemlere adapte edilebilir. Ve160;
Biz 27 hazırlıkları gerçekleştirdik ve hamamböceği tel setleri hasarlı çünkü henüz olarak deneylerin hiçbiri sona erdirildi. Biz tel setleri, mum, ya da çubuk temizlemek veya kaldırmak için hayvan tarafından herhangi bir girişimde gözlenen değil. Implante hamamböceği normal yürüme yürüdü. Onlar arena keşfetmek ve tırmanma görevleri sadece yanı sıra bozulmamış olanları gerçekleştirmek başardık. Tetrode implante sonra Deneylerimiz genellikle 2-4 saat sürdü. Bazen bazı birimler kayboldu ya da faaliyet süre boyunca azalmış, ancak çoğu kayıtları bütün deney boyunca çok kararlı idi. Biz de bazı konuları izole edilmiş ve kayıt döndü ve ertesi gün bir uyaranın var. Bu yöntem serbestçe böcekleri davranıyor dışı kayıtların uzun süre güvenilir görünür.
Vurgu Bir nokta wir kırılgan doğasıe setleri. Büyük bakım yapılışı ve implantasyon sırasında alınmadığı takdirde kolayca zarar görür. Her zaman onları çarpmak veya gözyaşı için dikkatli olmak, yavaş yavaş onlara yakın teller ve herhangi bir diseksiyon aletleri taşımak. Teller dikkatli bir şekilde iki ya da üç kullanımlar için izin, deney ve lezyona tamamlandıktan sonra hazırlık çekilmiş olabilir. , Yeniden test repolish ve her kullanımdan önce replate emin olun.
Başarılı bir hazırlık anahtarı uzakta hamamböceği gelen tel setleri tutmaktır. Bu karın yukarıda pronotum uzanan uzun bir çubuk kullanmak ve çubuğun arka ucuna tetrode boru ekleyin. Sonuç olarak, tetrode boru o böceğin antenleri veya bacakları ile tüp ulaşamadığı şekilde bir arena etrafında hareket hamamböceği arkasında her zaman. Hamamböceği arkasında tel setleri yerleştirilmesi de hayvanın vücut üzerinde boşluk sağlar. Bu bizim arena experime video kalitesini artırırKamera arenada yukarıda konumlandırılmış NTS çünkü. Canlının kafası ve tetrode boru arasında hiçbir aşırı kabloları bırakın. Böceğin antenleri veya bacakları telleri ulaşabilir, eğer onları kıracak. Bu yöntemde, boru slaytlar serbestçe tel üzerinde, bize aşırı tel yukarı çekmek ve headstage yakın sabitlemek için izin.
Bizim yöntemin potansiyel bir sınırlama hamamböceği keşfedebilirsiniz arena boyutudur. Tetrode tamamı 40 x 40 cm 2 alana erişim sağlamak için yeterli uzunluğu 40 cm'dir. Biz gürültü ve tetrode kalitesi gibi sorunlarla karşılaşmadım. Biz büyük bir arenada daha uzun tetrodes yapmak gibi Ancak, bu tür sorunlar görünebilir. Daha uzun bir tetrode ile ilgili bir diğer potansiyel sorun tetrode ağırlığıdır. Bizim tetrode ve çubuk görünüşe göre 2-3 g hamamböceği engellemez yaklaşık 0.25 gr ağırlığında. Biz elektrot için kullanılan aynı arenada keşfetmek bozulmamış hamamböceği gözlenentrophysiology deneyler. Yürüme aktivitesi ve genel hızı bir çubuk ve TETRODE taşıyan hamamböceği ve ipoteksiz hayvanlar arasında benzerdi. Ancak, biz bir hamamböceği performans damla önce taşıyabileceği yükün limitini test değil. Uzun bir tel sınırlamaları bir çözüm headstage ve kamera için motorlu bir platform oluşturmaktır. Böyle bir sistemde, kamera platformu buna göre hareket edebilir şekilde motora gerçek zamanlı ve çıkış böceğin hareketlerini izleyebilirsiniz. Headstage doğrudan hayvan üzerinde kalacağını çünkü nedenle, nispeten kısa bir tetrode büyük bir arena için yeterli olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar önerileriniz için Nick Kathman teşekkür ve yazının hazırlanma yardımcı olur. Bu teknik, hibe FA9550-10-1 0054 ve RER Hibe No IOS-1120305 altında Ulusal Bilim Vakfı altında AFOSR tarafından desteklenen çalışma ile birlikte geliştirilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nichrome wire | Sandvik Heating Technology | Kanthal RO-800 | Use for tetrode |
| Biomedical polyethylene tubing | A-M Systems | 800700 | Use for tetrode tubing |
| Lynx-8 | Neuralynx | Use for multiunit recording | |
| Cheetah 32 | Neuralynx | Use for multiunit recording | |
| High speed camera | Basler | A602f | Use for video recording for walking experiments |
| High speed camera | Casio | EX-FC150 | Use for video recording for climbing experiments |
| WINanalyze | Winanalyze | version 1.4 3D | Use for video tracking |
| MATLAB | MathWorks | MATLAB R2012b | Use for TTL pulse generation and offline data analysis |
References
- Strauss, R. The central complex and the genetic dissection of locomotor behaviour. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 633-638 (2002).
- Pick, S., Strauss, R. Goal-driven behavioral adaptations in gap-climbing Drosophila. Curr. Biol. 15, 1473-1478 (2005).
- Triphan, T., Poeck, B., Neuser, K., Strauss, R. Visual targeting of motor actions in climbing Drosophila. Curr. Biol. 20, 663-668 (2010).
- Heinze, S., Gotthardt, S., Homberg, U. Transformation of polarized light information in the central complex of the locust. J. Neuorosci. 29, 11783-11793 (2009).
- Heinze, S., Homberg, U. Maplike representation of celestial E-vector orientations in the brain of an insect. Science. 315, 995-997 (2007).
- Heinze, S., Homberg, U. Neuroarchitecture of the central complex of the desert locust: Intrinsic and columnar neurons. J. Comp. Neurol. 511, 454-478 (2008).
- Heinze, S., Homberg, U. Linking the input to the output: new sets of neurons complement the polarization vision network in the locust central complex. J. Neurosci. 29, 4911-4921 (2009).
- Heinze, S., Reppert, S. M. Sun compass integration of skylight cues in migratory monarch butterflies. Neuron. 69, 345-358 (2011).
- Brill, M. F., et al. Parallel processing via a dual olfactory pathway in the honeybee. J Neurosci. 33, 2443-2456 (2013).
- Guo, P., Ritzmann, R. E. Neural activity in the central complex of the cockroach brain is linked to turning behaviors. J. Exp. Biol. 216, 992-1002 (2013).
- Ritzmann, R. E., Ridgel, A. L., Pollack, A. J. Multi-unit recording of antennal mechanosensitive units in the central complex of the cockroach, Blaberus discoidalis. J. Comp. Physiol. A. 194, 341-360 (2008).
- Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neurosci. 7.5, 446-445 (2004).
- Huston, S. J., Jayaraman, V. Studying sensorimotor integration in insects. Curr. Opin. Neurobiol. 21, 527-534 (2011).
- Bender, J. A., Pollack, A. J., Ritzmann, R. E. Neural activity in the central complex of the insect brain is linked to locomotor changes. Curr. Biol. 20, 921-926 (2010).
- Harrison, R. R., et al. Wireless Neural/EMG telemetry systems for small freely moving animals. IEEE. 5, 103-111 (2011).
- Straw, A. D., Dickinson, M. H. Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis. Source Code Biol. Med. 4, 5 (2009).
- Strausfeld, N. J., Miller, T. A. Neuroanatomical Techniques. Insect Nervous System. , Springer Verlag. (1980).
- Daly, K., Wright, G., Smith, B. Molecular features of odorants systematically influence slow temporal responses across clusters of coordinated antennal lobe units in the moth, Manduca sexta. J. Neurophsyiol. 92, 236-254 (2004).
- Branson, K., Robie, A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6, 451-457 (2009).
