Summary
لأنه يتم دراسة العديد من النماذج الزرد من الأمراض العصبية وغير العصبية في الأسماك البالغة بدلا من الجنين / اليرقات، وضعنا كمية الجانبي الخط التجديدي الفحص التي يمكن تطبيقها على نماذج المرض الزرد الكبار. تشارك مقايسة القرار في 1) neuromast و2) مستويات خلية الشعر الفردية.
Abstract
نظرا لأهمية سريرية السمع واضطرابات التوازن في الإنسان والكائنات نموذج مثل الزرد وقد استخدمت لدراسة تطوير وتجديد الخط الجانبي. الزرد هو جاذبية خاصة لمثل هذه الدراسات لما له من وقت التطوير السريع والقدرة العالية على التجدد. حتى الآن، وقد استخدمت الدراسات الزرد الوحشي من خط التجديد أساسا الأسماك من المراحل الجنينية واليرقات بسبب انخفاض عدد neuromasts في هذه المراحل. جعلت هذا التحليل الكمي من الخط الجانبي تجديد / أو تطوير وأسهل في المراحل التنموية السابقة. لأنه يتم دراسة العديد من النماذج الزرد من الأمراض العصبية وغير العصبية في الأسماك البالغة وليس في الجنين / اليرقات، ركزنا على تطوير الكمي الأفقي خط التجدد مقايسة في الزرد الكبار بحيث كان الفحص المتاحة التي يمكن تطبيقها على الحالي نماذج المرض الزرد الكبار. بناء على الدراسات السابقة من قبل فان Trumع وآخرون 17 التي وصفت إجراءات الاجتثاث من خلايا الشعر في الكبار المكسيكية الأسماك العمياء الكهف والزرد (دانيو rerio)، وقد صمم الاختبار لدينا للسماح المقارنة الكمية بين السيطرة والمجموعات التجريبية. وقد تحقق هذا من خلال تطوير منحنى القياسية neuromast التجدد على أساس المئة من ظهور neuromast على مدى فترة زمنية 24 ساعة التالية نخر الناجم عن جنتاميسين من خلايا الشعر في منطقة محددة من الخط الجانبي. وقد تم تصميم الفحص أيضا للسماح بتمديد التحليل إلى مستوى خلية الشعر الفرد عندما يطلب إلى مستوى أعلى من القرار.
Introduction
الخط الجانبي (LL) هو نظام الجهاز ميكانيكية حسية وجدت في كل من الأسماك والبرمائيات هي المسؤولة عن السمع والتوازن والتوسط انجذاب تياري والسلوكيات مثل التعليم وتجنب الحيوانات المفترسة 1-5. وتتكون من مجموعات من الخلايا محاطة خلايا الشعر الداعمة، وكلاهما المتمركزة في هياكل ودعا neuromasts 6. ويتم تنظيم هذه neuromasts عادة في خطوط عمودية (وتسمى غرزة) على طول المحور الطولي للجسم والذيل مع بعض الغرز الأفقي لوحظ في الرأس من الأسماك. في الكبار، neuromasts هي أكبر بكثير في عدد الغرز داخل بالمقارنة مع الجنينية أو اليرقات السمكية 6. وقد ركزت الدراسات الطبية الحيوية في الزرد على تأثير العلاج بالمضادات الحيوية، والصدمات النفسية الناجمة عن الضوضاء، والعدوى المزمنة، الخ. على خلايا الشعر 7،8 في محاولة لفهم أفضل لآثارها في البشر.
وخلافا لمعظم الفقاريات، الشركة المصرية للاتصالاتleosts، مثل الزرد (دانيو rerio)، لديها القدرة على تجديد خلايا الشعر المفقودة. الزرد هي مفيدة بشكل خاص بسبب وقتهم التطور السريع والقدرة على التجدد عالية. حتى الآن، ولكن؛ وقد استخدمت الدراسات الزرد على تطوير الخط الجانبي و / أو تجديد أساسا الأسماك واليرقات المرحلة الجنينية بسبب انخفاض عدد neuromasts الخط الجانبي الذي يسمح لتسهيل الفرز والتحليل 6،9،10.
ومع ذلك، يتم دراسة العديد من نماذج الزرد من الأمراض العصبية وغير العصبية 11-16 في الأسماك البالغة وليس اليرقات، ركزنا على تطوير التجدد فحص الخط الجانبي في الزرد الكبار باستخدام الجنتاميسين (أمينوغليكوزيد المستخدمة سابقا في اليرقات الزرد و تستخدم في الآونة الأخيرة مع الأسماك البالغة 17) بحيث كان الفحص المتاحة التي يمكن تطبيقها على الكبار نماذج المرض الزرد الحالي. في حين نشرت سابقا الإجراءات التي كتبها فان ترامب هر آل 17 التي أنشئت شروط الاجتثاث خلية الشعر في الأسماك البالغة، إلا أنها لم تنشئ المنحنى القياسي لتجديد neuromast وهو مطلوب للمقارنة كمية بين السيطرة والمجموعات التجريبية مثل عند استخدام خطوط الزرد المعدلة وراثيا أو الحالات المرضية التي يسببها عقاقيري- في الزرد 18. وبالتالي فإننا الإجراءات المتبعة فان ترامب وآخرون (17) لالاجتثاث خلية الشعر، ولكن مبنية على عملهم لإنشاء منحنى القياسية للتجديد neuromast لتمكين الباحثين لاستخدام البيانات المتوفرة لدينا عند مقارنة الضابطة والتجريبية مثل مع نماذج مرض الزرد الكبار . وقد تم تصميم الفحص أيضا للسماح بتمديد التحليل إلى خلية الشعر الفردية عندما يكون مطلوبا مستوى أعلى من القرار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم تنفيذ كافة الإجراءات التالية الإرشادات الموضحة في "مبادئ رعاية الحيوان المعملية" (المعاهد الوطنية للصحة المنشور رقم 85-23، منقحة 1985) وبروتوكول الحيوان اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام روزاليند فرانكلين جامعة افق 08-19.
1. جنتاميسين-تحريض الشعر خلية نخر
- إعداد جنتاميسين سلفات في المياه المالحة العادية في تركيز النهائي من 0.004٪ (4.32 ملم).
- وضع الأسماك البالغة (D. rerio، 4-6 أشهر من العمر) في وعاء يحتوي على 0.004٪ (4.32 ملم) حل الجنتاميسين. أي حاوية يمكن استخدامها، ولكن نحن نستخدم وعاء الأسماك من نظام المائية صيدلي وهو 7 في نطاق واسع، 6 في ارتفاع، و 7 في طويلة. وضع الحاوية مع الأسماك في حاضنة وضعت في 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. تعيين إجمالي حجم السائل في الخزان على مستوى كاف للحفاظ على الأسماك في دولة قابلة للحياة لفترة ساعة 24. ملاحظة: تهوية السائل جنتاميسين ليس necessary إذا تم استخدام حجم كاف لعدد من الأسماك التي يجري علاجها.
2. تلطيخ الحيوية من خلايا الشعر
- إعداد تركيز 0.08٪ (في المياه المالحة العادي) من الصبغة الحيوية الفلورسنت [4-4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridinium يوديد (485 نانومتر الإثارة λ و 603 نانومتر λ الانبعاثات في الميثانول) من محلول المخزون من العمل 15 ملغ / مل في الايثانول.
- لتحديد ما إذا كان العلاج الفعال جنتاميسين مجموعة فرعية من السيطرة وجنتاميسين هي ملطخة الأسماك تعالج على الفور عن طريق وضع الأسماك في بئر من لوحة 6 جيدا الثقافة تحتوي على الصبغة الحيوية. استخدام عدد كاف من الأسماك (وألواح الثقافة كما هو مطلوب للدلالة إحصائية لتحقيقه. بناء على سرعة الفاحص العد neuromast، ضع السمك في لوحات بطريقة متداخلة مع مرور الوقت بحيث لا يتم ملطخة أن الأسماك لأكثر من 75 دقيقة كما هو موضح في الخطوة 2.3.
- وضع لوحات من الخطوة 2.2 في درج مقاعد البدلاء بواسطة المجهر الفلورسنت لأن تستخدم لفحص neuromasts الملون. إطفاء الأنوار غرفة التبريد لمنع الصبغة الحيوية خلال الفترة تلطيخ 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد كل من الصبغة غسل التدريجي وخزانات المياه مخدر. صبغ المياه تغسل هي أسماك المياه العادية والمياه مخدر، إضافة الكافي 2-فينوكسييثانول بحيث يتم التوصل إلى التخفيف 1:1،000 في أسماك المياه العادية.
- وضع الأسماك في المياه الزائدة السمك العادي لشطف الصبغة الحيوية الزائدة وانتقل إلى الخطوة 3.1 لمراقبة صبغ الملون الأسماك الحيوية.
- لدراسة تجديد neuromasts، ونقل الأسماك المعالجة جنتاميسين التي تم غسلها في الماء السمك العادي إلى حاضنة لمدة تتراوح بين 8-16 ساعة عند 28 درجة مئوية.
- في أوقات مختلفة بين 8-16 ساعة، يتم إزالة الأسماك من الحاضنة، وغسلها وملطخة كما هو مبين في الخطوات 2،1-2،4. انتقل إلى الخطوة 3.1 لمراقبة صبغ الملون الأسماك الحيوية.
3. الأسماك التخدير والعد نيون من Neuromasts
- وضع غطاء على مسرح المجهر الفلورسنت ستيريو للحصول على الصور الرقمية من الصبغة neuromasts الملون الحيوية للغرز منتصف الجسم.
- استخدام كاميرا رقمية توضع على المجهر الفلورسنت ستيريو ضبط التكبير من 2X لالتقاط الصور للتحليل الكمي لاحقة. ملاحظة: الإعداد التكبير للمجهر ستيريو قد تعتمد على نوع من المجهر المستخدمة، ولكن الإعداد ينبغي أن يسمح عرض سهلة والعد من neuromasts فرد داخل غرز منتصف الجسم.
- تحديد مقدار التجديد عن طريق حساب عدد من neuromasts مرئية داخل غرز أربعة المعينة على الجانب السفلي معظم بطني من الأسماك فقط الأقرب إلى الحق في الزعنفة الصدرية (انظر الشكل 1). لاستخدام التحليل الإحصائي لاختبار ANOVA المناسبة مثل سص T-اختبار الطالب. يجب الاستفادة من التجارب ما لا يقل عن 5 الأسماك في نقطة زمنية وينبغي تكرار كل التجارب الحد الأدنى من 3X.
- استنادا إلى منحنى الوقت neuromast تجديد (انظر الشكل 3)، عد neuromasts بين 8-16 ساعة آخر جنتاميسين غسل إلى أن تكون ضمن المرحلة خطية من المنحنى التجدد. ملاحظة: استخدام المرحلة الزمن الخطي يسمح للتحليل الكمي السليم بين السيطرة والمجموعات التجريبية.
4. عد نيون من الخلايا الفردية الشعر لقرار الحصول العالي من التحليل الكمي إذا كان التحليل Neuromast ليست ذات دلالة إحصائية
- إذا كان التحليل الكمي على مستوى neuromasts ليست كبيرة، والتحليل على مستوى الخلية الفردية الشعر يمكن أيضا أن تستخدم للحصول على درجة أعلى من القرار. اختر الأسماك في نقطة زمنية معينة آخر جنتاميسين-تغسل (نقطة زمنية استنادا إلى دراسات neuromast في وقت سابق)، صبغة حيوية شارععين السمكة كما هو موضح في البروتوكول 2، ومن ثم الموت ببطء الأسماك باستخدام 2-فينوكسييثانول في التخفيف 1:500 لمدة 1-5 دقيقة.
- في ظل هادئا لمنع التبريد، وجعل أربعة شقوق بحيث يتم إعداد ساحة رفرف الجلد على النحو التالي. إجراء شق على طول أضلاعه العلوي من الأسماك حتى يتم محاذاة مع زعانف الشرج، ثم إجراء شق في جميع أنحاء البطن، وأخيرا، وجعل اثنين من الشقوق العمودية على كل جانب من هذه الشقوق حتى يتم إنشاء مربع رفرف الجلد. ملاحظة: هذا الإعداد الجلد دمج غرز جسم منتصف المستخدمة في التجارب neuromast.
- وضع عينة الجلد على شريحة زجاجية ثم وضع غطاء زجاجي دائري الانزلاق على عينة الجلد رفعه للمساعدة مرساة ولشد الأنسجة للتصوير الرقمي لاحقة.
- باستخدام عينات الجلد من الخطوة 4.3، الحصول على الصور الرقمية من خلايا الشعر داخل كل neuromast من غرز منتصف الجسم. التقاط صور في التكبير من 60X على الأقل ثم عد م الشعرLLS داخل neuromasts الفردية للتحليل الكمي المقارن من السيطرة والمجموعات التجريبية (انظر الشكل 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تعظيم الاستفادة من إجراءات لقياس neuromast تجديد الخط الجانبي في الزرد الكبار.
وneuromasts من الزرد اليرقات هي قابلة للقياس بسهولة؛ ومع ذلك، فإن الخط الجانبي من الزرد الكبار لديها عدد أكبر بكثير من neuromasts في غرزة جعل التحليلات الكمية أكثر صعوبة 6،17،19،20. كما رأينا في الشكل 1A، رئيس لديها عدد أكبر بكثير من neuromasts مقارنة إما إلى منتصف القسم أو الذيل؛ مع وجود الذيل المنطقة أقل عدد من neuromasts كما هو مبين في الشكل 1D. لأن نمط غرز في الرأس معقد وأكبر بكثير في عدد من neuromasts، فإنه لا تصلح كمنطقة للتحليل الكمي. بالإضافة إلى ذلك، بغض النظر عن تركيز الجنتاميسين اختبرنا، وكان الاجتثاث الكامل من neuromasts في جميع أنحاء الرأس نادرا ما يمكن بلوغه؛ بقع من ترك neuromasts وحظ بعد العلاج الجنتاميسين كما ذكرت سابقا من قبل فان ترامب وآخرون 17 وفي المقابل، فإن الذيل لديه عدد قليل جدا من neuromasts، وعلى هذا النحو، اخترنا منطقة منتصف الجسم (الشكل 1B) لتحليل كمي تجديد neuromast في الكبار. في هذه المنطقة، حددنا أربعة غرز فقط الخلفية إلى الزعانف الصدرية الجانبية التي تتفق في عدد neuromast بين جميع البالغين [61.45 (ن = 95)] (الأرقام 1B و 1E). الأهم من ذلك، كنا قادرين على الدوام وبشكل كامل على يجتذ neuromasts من هذه المنطقة قبل 24 ساعة 0.004٪ جنتاميسين العلاج (كما ذكرت سابقا فان في ترامب وآخرون 17) والسماح لتحديد دقيق لاحقة من neuromast تجديد (قارن أرقام 1B و1E وأقحم مع الشكل 2، 0 ساعة).
p_upload/51343/51343fig1highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الشكل 1. ويظهر نمط الفلورسنت من خلال غرز neuromast من الزرد الكبار على طول المحور الطولي. لوحة A هي منطقة الرأس، لوحة (ب) هي منطقة منتصف الجسم مع غرز الأربعة المستخدمة للتحليل الكمي المبينة مع مربع. لوحة C هي المنطقة الخلفي للجسم. لوحة D هي المنطقة الزعنفة الذيلية. ويرد التكبير أعلى من ال 4 غرز في منطقة منتصف الجسم المستخدمة في التحليل الكمي في لوحة E. التكبير قوة 1X 2X و.
وقد أفيد أن العلاج كبريتات النحاس هي طريقة كيميائية فعالة للحث على نخر السريع لخلايا الشعر في الأجنة واليرقات 21. نحن هنا اختبار النحاس كبريتات العلاج على أمل أنه قد تقصر من الوقت للحث على الاجتثاث neuromast. تركيزات تتراوح بين كبريتات النحاس5-50 ملم لمرات التعرض مختلفة استخدمت ما يصل إلى 48 ساعة كما ذكرت سابقا من قبل ليانغ وآخرون 21 وقد وجد أن كبريتات النحاس كانت قاتلة في تركيزات أعلى ويست فعالة في تركيزات أقل في الأسماك البالغة (لا تظهر البيانات) . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
المعايير المستخدمة للتحليل الفلورسنت للتجديد الخط الجانبي في الزرد الكبار.
تم رصد التجديد بعد أن ذاب كل neuromasts داخل غرز منتصف الجسم الأربعة التالية 24 ساعة جنتاميسين المعالجة (الشكل 2، قارن 0 ساعة مع مراقبة) وتقرر تجديد إيجابي بظهور ما لا يقل عن ثلاثة neuromasts داخل غرزة. (الشكل 2، 0 ساعة). بنسبة 8 HPG، وكان ما يقرب من ثلث أسماك بعض علامة على الانتعاش (ن = 34)؛ على الرغم من أن كثافة neuromasts كان خافت في غرز تجديد (الشكل 2، 8 ساعة، غرز خافت حددها مربعات). واصل عدد من neuromasts وحدتها لزيادة بطريقة خطية حتى وصل التجديد هضبة في 16 HPG (قارن الشكل 2، 16 ساعة مع الشكل 2، 8 ساعة). لم يكن حتى على الأقل 24 HPG أن جميع الأسماك تعامل مع جنتاميسين قد تعافى تماما مع كل من الأرقام وشدة متساوية من neuromasts داخل غرز الخط الجانبي بالمقارنة مع الضوابط (الشكل 2، 24 ساعة). يظهر سطر الوقت لتجديد neuromast بعد الانسحاب الجنتاميسين في الشكل 3 الذي يبين الخطية وهضبة مراحل منحنى الانتعاش. نلاحظ أنه في أقل من 5٪ من الحالات، لم تظهر غرز تجديد بوصفها كيانات الفردية ولكن بدلا من ذلك يبدو كما مسحة من مضان.
الرقم 3. الرسم البياني يبين مدار الساعة من neuromasts التجديد بعد الانسحاب من 24 ساعة من العلاج الزرد الكبار مع 0.004٪ جنتاميسين. كما هو مبين، ويبدأ الانتعاش في نقطة زمنية وصلت إلى 8 HPG هضبة في نقطة زمنية 16 HPG. يعرف هذا ينبغي أن تستخدم المرحلة بطانة من neuromast التجديد بين 8-16 نقطة ساعة ووقت خلال هذه المرحلة الخطية لمقارنة كميا السيطرة والتجربة المجموعات.
هو فعل سمية Neuromast عن التعرض لفترات طويلة لتلطيخ الأصباغ الفلورية.
في تقديرنا وسيلة مثالية لتنفيذ هذه التجارب ستكون وصمة عار على الأسماك مع صبغة الفلورسنت قبل العلاج، وصمة عار مرة أخرى في ساعة 0 ثم مرة أخرى وصمة عارنقاط زمنية ر التجدد. ومع ذلك، واجهنا مضاعفات لهذه الدراسات وهو أن خلية الشعر الأصباغ تلوين الفلورسنت مثل 4-دي-2-الحية، كما يمكن أيضا أن تكون الحال مع البقع الأخرى الميتوكوندريا 22 يمكن أن يكون لها تأثير سام على خلايا الشعر 23. هذه الحقيقة تتطلب منا استخدام مجموعات منفصلة من الأسماك منذ تلطيخ المتكررة لا يمكن أن تستخدم نفس السمك. في جميع الحالات تم التعامل مع الأسماك التجريبية بما في ذلك الضوابط بالتوازي للقضاء على التباين التجريبية.
تحليل متحد البؤر على مستوى خلايا الشعر الفردية.
إذا كانت النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل neuromast ليست ذات دلالة إحصائية بين السيطرة والمجموعات التجريبية إحصائيا، يمكن للمرء أن تمتد هذه الدراسات إلى مستوى الخلايا الفردية البرد للحصول على درجة أعلى من القرار لإجراء المقارنات الكمية. كما هو مبين في الشكل (4)، neuromasts من مجموعة التحكم (لويرد يوروماست في 12 ساعة للتجديد في هذا الشكل) يمكن عرضها من قبل المجهري متحد البؤر الاستعدادات الجلد من منطقة منتصف الجسم. في 8 ساعات، 10 ساعة، و 12 ساعة من وقت التجديد، وجدنا أن مجموعات المراقبة (7 الحيوانات / مجموعة) كان مجموعة من 0-4 خلايا الشعر / neuromast. كما هو متوقع لمجموعات المراقبة، عند تحليلها كميا، تم الكشف لا فرق إحصائية بين neuromasts من حيث عدد خلايا الشعر في neuromast عند نقاط الزمني المشار إليه أعلاه (تراوحت القيم P 0،230-0،472). يجوز اتخاذ مثل هذا النهج بين أي مجموعة المراقبة والتجربة عند الحاجة لتوسيع أو تأكيد البيانات التي تم الحصول عليها من المرحلة الأولى من الدراسات neuromast.
الشكل 4. تحليل الشعر خلية / neuromast تجديد استخدام مستحضرات الجلد في المنطقة الخط الجانبي تعريف ووصف طن البروتوكول الخطوة 3.3. صورة متحد البؤر نيون خلايا الشعر داخل neuromast الحصول عليها من إعداد البشرة الزرد. وترد اثنين صبغة خلايا الشعر الملون الحيوية داخل neuromast سمكة التحكم (الشكل 4). تم الحصول على هذه الصورة 12 ساعة لإزالة آخر جنتاميسين (المرحلة التجديد الخطي). رمز قوس أبيض () يشير إلى neuromast الفردية بينما يشير السهم الأبيض خلية دعم المحيطة خلايا الشعر. خلايا دعم لا وصمة عار في ظل هذه الظروف وتظهر المساحات السوداء. التكبير، 60X.
| 1 | 1. العلاج جنتاميسين [0.004٪ (4.32 ملم)] الرقابة والأسماك تجريبية لمدة 24 ساعة عند 28 درجة مئوية باستخدام حاضنة. |
| 2 | 2. اغسل من الجنتاميسين لبدء تجديد خلايا الشعر. عودة الأسماك إلى الحاضنة 28 درجة مئوية لمدة المحقق فترات زمنية محددة بين 8-16 ساعة. |
| 2 | 3. الصبغة الحيوية وصمة عار [0.08٪ 4-4-diethylaminostyryl-N-methylpyridinium يوديد (4-دي-2-ASP)] السيطرة والأسماك تجريبية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ثم تغسل وصمة عار مع أسماك المياه للتصوير الفلورسنت. |
| 1 أو 2 | 4. إذا لزم الأمر بسبب النتائج nonsignificant من تحليل neuromasts، كرر البروتوكولات 1-3 مع مجموعة منفصلة من السيطرة والأسماك التجريبية، ولكن بعد الحصول على إعداد البشرة لتحليل متحد البؤر من خلايا الشعر الفردية. |
الجدول 1. ملخص للبروتوكول المبينة أعلاه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
استنادا إلى مجموعة كبيرة من المؤلفات التي أنشئت لتحليل الخط الجانبي (LL) في تجديد الجنينية واليرقات الزرد 8،24،25، كان الهدف من دراستنا لوضع مقايسة الكمية لتجديد خط الجانبي في الزرد التي يمكن أن يتم تطبيقها على نماذج المرض التي من الأفضل أن تدرس في الأسماك البالغة. وجدنا أن بعض النقاط الحرجة هي مهمة عند تطبيق الإجراءات التي وضعت لالجنينية الأسماك / اليرقات إلى الأسماك البالغة. أهم هذه النقاط تعتبر: 1) عدد الخط الجانبي neuromasts على طول المحور الطولي للأسماك، 2) مدة تلطيخ خلايا الشعر neuromast، 3) التركيز ومدة العلاج من أمينوغليكوزيد، و 4) توقيت تجديد خط الجانبية بعد العلاج أمينوغليكوزيد. وسيتم تناول هذه النقاط في المناقشة التالية.
في ما يتعلق عدد من neuromasts على طول الخط الجانبي من الزرد، الزرد الجنينية واليرقات لديها ميزة واضحة أن neuromasts لها نمط بسيط بسبب انخفاض عددهم في غرزة نظرا بالمقارنة مع الأسماك البالغة. وقد سمح هذا العدد المنخفض للمحققين أن يحددوا بوضوح كل neuromast وتعيين اسم لها 6. بهذه الطريقة، يمكن للدراسات التجديد قياس ظهور لneuromast خاصة بالاسم في أي وقت بعد الانسحاب من وكيل أمينوغليكوزيد. عدد أكبر من neuromasts في غرزة في الكبار يدخل صعوبة كبيرة في العد دقيقة والكمي خلال ظهور تجديد neuromasts بالمقارنة إلى أن من الأجنة أو اليرقات. كما هو مبين، قمنا بتقييم نمط neuromasts الخط الجانبي داخل غرز من الكبار، وقرر أن منتصف الجسم (Figures. 1 و 2) وفرت المنطقة الأمثل للغرز للتحليل.
تلطيخ neuromasts مع خلايا الشعر الأصباغ مثل 2 - [4 - (dimethylamino) styryl]-N-ethylpyridiيوديد nium (DASPEI) أو 4-دي-2-الحية يسمح احد لتصور neuromasts من الخط الجانبي باستخدام stereomicroscopy الفلورسنت 26،27 في الأسماك واليرقات الأحداث. هذه البقع نفسها هي أيضا فعالة في الأسماك البالغة وأشار التحليل الكمي لدينا أنه لا يوجد اختلاف كبير في عدد neuromasts داخل المنطقة منتصف الجسم وقد لوحظ بين السيطرة العادي الزرد (بمتوسط 61.45 neuromasts في الحالات العادية الأسماك سيطرة الكبار).
وقد أفيد أن الأصباغ خلية الشعر مثل 2 - [4 - (dimethylamino) styryl] يوديد-N-ethylpyridinium (DASPEI) أو 4-دي-2-ASP يمكن نفسها أن تكون سامة للneuromast الخلايا 24، والأسماك لا يمكن أن يكون مرارا وتكرارا ملطخة هذه العوامل الفلورسنت إذا كان واحد هو رصد الناجم عن أمينوغليكوزيد التجدد. تلطيخ المتكررة من نفس السمك يدخل الأحداث سمية متعددة (من قبل كل من وصمة عار وأمينوغليكوزيد) التي تجعل من تجربة الامم المتحدة والتأويل 23. وفقا لذلك، وجميع التجاربفي دراستنا المطلوبة موازية تلطيخ 4-دي-2-الحية من مجموعات متعددة من الأسماك من أجل إظهار أن كانت neuromasts 1) موجودة في حالة nontreated السيطرة الجنتاميسين، 2) ذاب بالكامل مباشرة بعد التعرض جنتاميسين، و3) تجديد في بعض آخر ساعة جنتاميسين المعاملة بعد الانسحاب وغسل للخروج من هذا أمينوغليكوزيد. في هذه الطريقة، كانت ملطخة جميع الأسماك مرة واحدة فقط مع الصبغة neuromast.
وينبغي الإشارة إلى أنه في حين أن الإجراءات فان ترامب وآخرون 17 تهيئة الظروف لالاجتثاث خلية الشعر في الأسماك البالغة، فإنها لا إنشاء منحنى القياسية لتجديد neuromast وهو مطلوب للمقارنة كمية بين السيطرة والمجموعات التجريبية. وبالتالي فإننا الإجراءات المتبعة فان ترامب وآخرون (17) لالاجتثاث خلية الشعر (تركيز الجنتاميسين من 0.004٪ باستخدام وقت التعرض على مدار 24 ساعة، انظر الشكل 2 للحصول على نتائج الاجتثاث خلية الشعر في 24ساعة) فحسب، بل امتد عملهم لإنشاء منحنى القياسية من neuromast التجدد. وهذا يسمح للتحليل مقارن للتجديد ليرة لبنانية في الزرد الكبار باستخدام غرز أربعة من منطقة منتصف الجسم التي أنشأنا لظروف مقايسة لدينا (أنظر الشكلين 1 و 2). من أجل تحديد ما إذا كان يمكن الحصول على فترة أقصر لالاجتثاث خلية الشعر، ونحن أيضا اختبار تأثير كبريتات النحاس التي كانت تستخدم بشكل فعال في الأسماك اليرقات لفترات قصيرة قدر 2 ساعة. أشارت الدراسات التي لدينا كبريتات النحاس (5-50 ملم لمرات التعرض مختلفة تصل إلى 48 ساعة كما ذكرت سابقا من قبل ليانغ وآخرون 21 لليرقات) لم يتم العثور على أن تكون فعالة في الأسماك البالغة وكيلا للالاجتثاث خلية الشعر. هذا يسلط الضوء على حقيقة أن الظروف المستخدمة لالاجتثاث من خلايا الشعر في الأجنة واليرقات لا يمكن دائما أن يتم تحويلها مباشرة للاستخدام مع الأسماك البالغة.
كما تتعلق الخط الجانبيالتجديد في البالغين، وجدنا أطر زمنية مماثلة للتجديد neuromasts بين أن الجنين / اليرقات والكبار الأسماك. كما ذكرت سابقا من قبل الآخرين، وإظهار الأجنة الزرد اليرقات neuromast التجديد في 12-24 ساعة آخر أمينوغليكوزيد-تغسل 8. لاحظنا المرحلة خطية من neuromast تجديد الظهور في 8-12 الإطار الزمني (لا ينظر إليها على أنها غرز الكامل لنقطة زمنية 8 ساعة كما هو مبين في الشكل 2) مع الهضبة تم التوصل إليها في 16 HPG. لم يكن لوحظ كاملة للسيطرة على مثل ظهور neuromasts داخل غرز حتى 24 HPG كما ذكرت لأجنة ويرقات. كاملة للسيطرة على مثل المظهر يدل على كل من عدد وشدة neuromasts في جميع غرز أربعة من منطقة منتصف الجسم في الزرد الكبار. بالإضافة إلى ذلك، إذا كانت النتائج الكمية التي تم الحصول عليها في مستوى neuromasts ليست ذات دلالة إحصائية، يمكن المحقق تمديد دراستهم إلى مستوى خلايا الشعر فرد داخل neuromastsباستخدام متحد البؤر المجهري كما وصفها إجراءاتنا.
وneuromasts / شعر تجديد الخلايا مقايسة الموصوفة في هذه المقالة يمكن تطبيقها على الحالات المرضية التي من الأفضل أن تتجلى في الزرد الكبار وليس في مراحل اليرقات / الجنينية المبكرة. وجود قيود على مقايسة تتعلق تؤثر على حالة تجريبية سواء كان ذلك 1) سلالة معدلة وراثيا الذي يحاكي حالة مرض معين أو 2) حالة المرض الناجم عن عقاقيري] على الخلايا الجذعية داخل منظومة الخط الجانبي من الزرد الكبار. في هذا الصدد، حالة مرض معين من الزرد الكبار قد أو قد لا تؤثر على الخلايا الجذعية من سلالة خلية الشعر، وأنه من المهم أن نلاحظ أن التجديد هو neuromast تعتمد اعتمادا كليا على هذه تكاثر الخلايا الجذعية / تمايز عمليات 8،24،25 .
كمثال على هذا القيد، فإننا سوف تصف تجارب أجريت على نموذج الزرد الكبار من النوع الأول من مرض السكري. هذا particulوقد تم تطوير نموذج ع المرض في الزرد الكبار من أجل دراسة المضاعفات الثانوية المدى الطويل الناجمة عن ارتفاع السكر في الدم 28. لعدد من الأسباب التي سبق وصفها 28،29، لا يمكن إلا أن يتم تنفيذ هذه الدراسات باستخدام الزرد الكبار. لأن الأعصاب الطرفية جنبا إلى جنب مع الهياكل الخلوية المتخصصة التي تتأثر سلبا يعصب في المرضى الذين يعانون من مرض السكري، وأردنا لتحديد ما إذا كان ضعف تجديد الخط الجانبي من neuromasts / خلايا الشعر أيضا في الزرد السكري. باستخدام خط الجانبي تجديد الفحص والكشف عن أي تأخير ذات دلالة إحصائية في تجديد neuromast. لتأكيد هذه النتيجة السلبية، تكررت التجارب على مستوى أكثر دقة للخلية الشعر الفردية. مرة أخرى، لم يلاحظ أي فروق ذات دلالة إحصائية في الشعر تجديد الخلايا بين السيطرة والجماعات السكري. لذلك، كانت البيانات غير متناسقة مع افتراض أن ارتفاع السكر في الدم يعوق neuromast / شعر تجديد الخلايا؛ عossibly بسبب مقاومة خلايا جذعية من سلالة خلية الشعر لظروف فرط سكر الدم. مع هذا القيد في الاعتبار، فإن neuromasts / شعر تجديد الخلايا مقايسة الموضحة في هذه المقالة لا توفر وسيلة لاختبار ما إذا كان أي شخص بالغ الزرد نموذج مرض معين ينطوي على خلل في عملية التجدد الخلوي الشعر كما رصدها باستخدام نظام الخط الجانبي. أن النتائج الإيجابية تعني تورط الخلايا الجذعية وبالتالي سوف يكون له ما يبرره مزيد من الدراسات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml) | Sigma Aldrich | G1397 | |
| 2 Phenoxyethanol | Sigma Aldrich | P1126 | |
| 4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol | Aldrich | D-3418 | 485 nm excitation λ and 603 nm emission λ |
| 6-well Plates | Mid Sci | TP92006 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Matek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | TMZ-1500 | Any dissecting microscope is fine. |
| Camera for Imaging | Nikon | Q imaging | Any camera is suitable. |
| ImageJ software | National Institutes of Health | NIH Image | |
| NIS Elements | Nikon | Any imaging software is suitable. | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | Any high resolution fluorescent microscope is suitable |
| Aquatic System | KG Aquatics ZFS Rack System | Any aquatic system can be used |
References
- Dambly-Chaudire, C., Sapde, D., Soubiran, F., Decorde, K., Gompel, N., Ghysen, A. The Lateral Line of Zebrafish: a Model System for the Analysis of Morphogenesis and Neural Development in Vertebrates. Biol. Cell. 95 (9), 579-587 (2003).
- Montgomery, J., Carton, G., Voigt, R., Baker, C., Diebel, C. Sensory Processing of Water Currents by Fishes. Phil. Trans. Royal Soc. London B Biol. Sci. 355 (1401), 1325-1327 (2000).
- Buck, L. M., Winter, M. J., Redfern, W., Whitfield, T. T. Ototoxin-Induced Cellular Damage in Neuromasts Disrupts Lateral Line Function in Larval Zebrafish. Hearing Res. 284 (1-2), 1-2 (2012).
- Engelmann, J., Hanke, W., Mogdans, J., Bleckmann, H. Hydrodynamic Stimuli and the Fish Lateral Line. Nature. 408 (6808), 51-52 (2000).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguch, M., Liao, J. C. Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line. PloS One. 7 (5), e36661 (2012).
- Raible, D. W., Kruse, G. J. Organization of the Lateral Line System in Embryonic Zebrafish. J. Comp. Neurol. 421 (2), 189-198 (2000).
- Coffin, A. B., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. Extracellular Divalent Cations Modulate Aminoglycoside-Induced Hair Cell Death in the Zebrafish Lateral. 253 (1-2), 1-2 (2009).
- Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).
- Ma, E. Y., Rubel, E. W., Raible, D. W. Notch Signaling Regulates the Extent of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral Line). J. Neurosci. 28 (9), 2261-2273 (2008).
- Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and Fins: Non-Mammalian Models for Hair Cell Regeneration. Brain Res. 1277, 12-23 (2009).
- Bibliowicz, J., Tittle, R. K., Gross, J. M. Toward a Better Understanding of Human Eye Disease Insights From the Zebrafish, Danio Rerio. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 100, 287-330 (2011).
- Mione, M. C., Trede, N. S. The Zebrafish As a Model for Cancer. Dis. Model. Mech. 3 (9-10), 9-10 (2010).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult Zebrafish As a Model Organism for Behavioural Genetics. BMC. Neurosci. 11, (2010).
- Mathur, P., Guo, S. Use of Zebrafish As a Model to Understand Mechanisms of Addiction and. Complex Neurobehavioral Phenotypes. Neurobiol. Dis. 40 (1), 66-72 (2010).
- Ignatius, M. S., Langenau, D. M. Zebrafish As a Model for Cancer Self-Renewal. Zebrafish. 6 (4), 377-387 (2009).
- Milan, D. J., MacRae, C. A. Zebrafish Genetic Models for Arrhythmia. Prog. Biophys. Mol. Biol. 98 (2-3), 2-3 (2008).
- Van Trump, W. J., Coombs, S., Duncan, K., McHenry, M. J. Gentamicin Is Ototoxic to All Hair Cells in the Fish Lateral Line System. Hear. Res. 261 (1-2), 1-2 (2010).
- Littleton, R. M., Hove, J. R. Zebrafish: a Nontraditional Model of Traditional Medicine. J. Ethnopharmacol. 145 (3), 677-685 (2013).
- Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line). PLoS One. 7 (5), 36661-36 (2012).
- Liang, J., Wang, D., Renaud, G., Wolfsberg, T. G., Wilson, A. F., Burgess, S. M. The Stat3/Socs3a Pathway Is a Key Regulator of Hair Cell Regeneration in Zebrafish [Corrected. J. Neurosci. 32 (31), 10662-10673 (2012).
- Nakae, M., Asaoka, R., Wada, H., Sasaki, K. Fluorescent Dye Staining of Neuromasts in Live Fishes: An Aid to Systematic Studies. Ichthyol Res. , 286-290 (2012).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent Probes That Stain Living Nerve Terminals. The J. Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Owens, K. N., Coffin, A. B., Hong, L. S., Bennett, K. O., Rubel, E. W., Raible, D. W. Response of Mechanosensory Hair Cells of the Zebrafish Lateral Line to Aminoglycosides Reveals Distinct Cell Death Pathways. Hear. Res. 253 (1-2), 1-2 (2009).
- Namdaran, P., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. Identification of Modulators of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral. 32 (10), 3516-3528 (2012).
- Herrera, A. A., Banner, L. R. The Use and Effects of Vital Fluorescent Dyes: Observation of Motor Nerve Terminals and Satellite Cells in Living Frog Muscles. J. Neurocytol. 19 (1), 67-83 (1990).
- Hickey, P. C., Jacobson, D., Read, N. D., Louise Glass,, L, N. Live-Cell Imaging of Vegetative Hyphal Fusion in Neurospora Crassa. Fungal. Genet. Biol. 37 (1), 109-119 (2002).
- Olsen, A. S., Sarras, M. P., Intine, R. V. Limb Regeneration Is Impaired in an Adult Zebrafish Model of Diabetes Mellitus. Wound Repair Regen. 18 (5), 532-542 (2010).
- Olsen, A. S., Sarras, M. P., Leontovich, A., Intine, R. V. Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression. Diabetes. 61 (2), 485-491 (2012).
