En analyse for sidelinje Regeneration i Voksen Zebrafisk

Summary

Fordi mange zebrafisk modeller af neurologiske og ikke-neurologiske sygdomme er undersøgt i voksne fisk snarere end embryo / larver, har vi udviklet en kvantitativ sidelinje regenerativ assay, der kan anvendes til voksne zebrafisk sygdomsmodeller. Analysen involverede opløsning på 1) neuromast og 2) individuelle hår celle niveauer.

Abstract

På grund af den kliniske betydning af hørelse og balance lidelser hos mennesker, har modelorganismer såsom zebrafisk er blevet brugt til at studere lateral udvikling og regeneration linje. Zebrafisken er særligt attraktivt for sådanne undersøgelser på grund af sin hurtige tid udvikling og dens høje regenerationsevne. Til dato har zebrafisk studier af sidelinje regenerering anvendes hovedsageligt fisk af embryonale og larvestadier på grund af det lavere antal neuromasts på disse stadier. Dette har gjort kvantitativ analyse af sidelinje regenerering / og eller udvikling lettere i de tidligere udviklingsstadier. Fordi mange zebrafisk modeller af neurologiske og ikke-neurologiske sygdomme studeres i den voksne fisk og ikke i embryoet / larver, vi fokuseret på at udvikle en kvantitativ sidelinje regenerativ assay i voksen zebrafisk, således at en analyse var til rådighed, der kunne anvendes til løbende voksne zebrafisk sygdomsmodeller. Med udgangspunkt i tidligere undersøgelser af Van Trump m.fl. ^17. der er beskrevet procedurer for ablation af hårceller i voksen mexicanske blind hule fisk og zebrafisk (Danio rerio), var vores analyse designet til at tillade kvantitativ sammenligning mellem kontrol og eksperimentelle grupper. Dette blev opnået ved at udvikle en regenerativ neuromast standardkurve baseret på procenten af ​​neuromast genkomst over en 24 timers periode efter gentamicin-induceret nekrose af hårceller i et defineret område af den laterale linie. Assayet blev også designet til at tillade forlængelse af analysen til de enkelte hår celle niveau, når en højere grad af opløsning er påkrævet.

Introduction

Den laterale linie (LL) system er en mechanosensory orgel findes i både fisk og padder, der er ansvarlig for hørelse, balance, rheotaxis og medierende adfærd, såsom skolegang og rovdyr undgåelse ^1-5. Det består af klynger af hårceller omgivet af støtte celler, som begge er placeret i strukturer, der kaldes neuromasts ^6. Disse neuromasts er typisk organiseret i lodrette linier (kaldet masker) langs længdeaksen af ​​kroppen og halen med nogle vandrette sting observeret i hovedet af fisken. I den voksne, neuromasts er betydeligt større i antal inden for de masker, som i forhold til embryonale eller fiskelarver ^6. Biomedicinske studier i zebrafisk har fokuseret på effekten af antibiotisk behandling, støj-induceret traumer, kronisk infektion osv. på hårceller ^7,8 i et forsøg på bedre at forstå deres effekter i mennesker.

I modsætning til de fleste hvirveldyr, teleosts såsom zebrafisk (Danio rerio), har evnen til at regenerere tabte hårceller. Zebrafisk er særligt nyttige på grund af deres hurtige udviklingstid og høj regenerationsevne. Til dato, men; zebrafisk undersøgelser af lateral udvikling og / eller regenerering linje har primært udnyttet den embryonale og larvestadiet fisk på grund af det reducerede antal sidelinje neuromasts der giver mulighed for lettere optælling og analyse ^6,9,10.

Men som mange zebrafisk modeller af neurologiske og ikke-neurologiske sygdomme ^11-16 undersøgt i den voksne fisk og ikke larverne, vi fokuseret på at udvikle en sidelinje regenerativ assay i voksen zebrafisk hjælp gentamicin (et aminoglykosid tidligere anvendt i zebrafisk larver og mere for nylig brugt med voksne fisk ^17), således at en analyse var til rådighed, der kunne anvendes på nuværende voksne zebrafisk sygdomsmodeller. Mens tidligere offentliggjorte procedurer Van Trump et al. ¹⁷ fastsat betingelserne for hår celle ablation i den voksne fisk, de ikke etablere en standard kurve for neuromast regeneration, som er nødvendig for kvantitativ sammenligning mellem kontrol og eksperimentelle grupper såsom ved brug af transgene zebrafisk linjer eller farmakologisk inducerede sygdomstilstande i zebrafisk ^18. Vi fulgte derfor procedurerne i Van Trump et al. ¹⁷ til hår celle ablation, men bygget på deres arbejde med at etablere en standard kurve neuromast regenerering at gøre det muligt for efterforskerne at bruge vores data, når man sammenligner kontrol og eksperimentelle grupper som med voksne zebrafisk sygdomsmodeller . Assayet blev også designet til at tillade forlængelse af analysen til de enkelte hår celle, når en højere grad af opløsning er påkrævet.

Protocol

Alle procedurer udføres efter de retningslinjer, der er beskrevet i "Principper for Laboratory Animal Care" (National Institutes of Health publikation ingen. 85-23, revideret 1985) og den godkendte Rosalind Franklin University Institutional Animal Care og brug Udvalg dyr protokol 08-19.

1. Gentamicin-induktion af hår cellenekrose

1. Forbered gentamicinsulfat i normalt saltvand til en slutkoncentration på 0,004% (4,32 mM).
2. Placer voksne fisk (D. rerio, 4-6 måneder gamle) i en beholder indeholdende 0,004% (4,32 mM) gentamicin løsning. Enhver beholder kan anvendes, men vi bruger en fisk beholder fra en Pharmacal Aquatic System, som er 7 i bred, 6 i høj og 7 i lang tid. Anbring beholderen med fisk i en inkubator indstillet på 28 ° C i 24 timer. Indstil det totale volumen af ​​væske i tanken på et tilstrækkeligt niveau til at fastholde fisk i en levedygtig tilstand for 24 hr periode. Bemærk: luftning af gentamicin væske er ikke necessary hvis tilstrækkelig volumen anvendes til antallet af fisk, der behandles.

2.. Vital Farvning af hårceller

1. Forbered en koncentration 0,08% (i normalt saltvand) i fluorescerende vitale farvestof [4-4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridiniumiodid (485 nm excitation λ og 603 nm emission λ i methanol) fra en arbejdende opløsning af 15 mg / ml i ethanol.
2. At afgøre, om gentamicin behandling var effektiv en delmængde af kontrol og gentamicin behandlede fisk farves straks ved at placere fisk i brønden af ​​en 6 godt kultur plade indeholdende den vitale farvestof. Brug et tilstrækkeligt antal fisk (og kultur plader som kræves for statistisk signifikans, der skal nås. Baseret på undersøgerens hastighed neuromast optælling placere fisk i pladerne i en forskudt over tid, så fiskene ikke er farvet i over 75 min som beskrevet i trin 2.3.
3. Placer pladerne fra trin 2.2 i en bænk skuffe af den fluorescerende mikroskop tilanvendes til undersøgelse af farvede neuromasts. Sluk værelse lysene for at forhindre afkøling af vital farvestof over 1 hr farvning periode ved stuetemperatur.
4. Forbered både farvestof wash-out og bedøvende vandtanke. Dye udvaskningsperiode vand er normalt fisk vand og bedøvelse vand, tilsæt tilstrækkeligt 2-phenoxyethanol, således at en 1:1000 fortynding i normalt fisk vand er opnået.
5. Placer fisk i overskud normal fisk vand til at skylle overskydende vital farvestof og fortsæt til trin 3,1 til observation af vital farvestof farvede fisk.
6. For at undersøge regenerering af neuromasts overføre gentamicin-behandlede fisk, der blev vasket i normal fisk vandet i en inkubator i mellem 8-16 timer ved 28 ° C.
7. På forskellige tidspunkter mellem 8-16 timer, er fisk fjernes fra inkubatoren, vaskes og farves som angivet i trin 2.1-2.4. Fortsæt til trin 3,1 til observation af vital farvestof farvede fisk.

3.. Bedøve fisk og Fluorescent Tælling af Neuromasts

1. Placer låget på scenen af ​​et fluorescerende stereo mikroskop for at få et digitalt billede af de vitale farvestof farvede neuromasts i midten kroppens sting.
2. Bruge et digitalt kamera placeret på fluorescerende stereomikroskop indstille en forstørrelse på 2X til at tage billeder til efterfølgende kvantitativ analyse. Bemærk: Den forstørrelsesindstilling af stereo mikroskop kan afhænge af mærke af mikroskop bruges, men indstillingen bør tillade nem visning og optælling af de enkelte neuromasts inden midten af ​​kroppen sting.
3. Bestem mængden af regenerering ved at tælle antallet af synlige neuromasts inden for de fire udpegede masker på den nederste ventrale side af fisken umiddelbart proksimalt til højre brystfinne (se figur 1). Til statistisk analyse bruge en passende test såsom ANOVA or Student T-test. Eksperimenter skal bruge mindst 5 fisk pr tidspunkt, og alle forsøg gentages mindst 3x.
4. Baseret på neuromast regenerering tidskurven (se figur 3), tælle neuromasts mellem 8-16 timer efter gentamicin vask for at være inden for den lineære fase af regenerering kurve. Bemærk: Anvendelse af den lineære tid fase giver mulighed for korrekt kvantitativ analyse mellem kontrol-og forsøgsgrupper.

4.. Fluorescerende Tælling af Individual hårceller til at opnå højere opløsning af den kvantitative analyse, hvis Neuromast Analysis er ikke statistisk signifikant

1. Hvis kvantitativ analyse på niveauet for neuromasts ikke er væsentlig, kan også anvendes analyse på niveauet for den enkelte hårcelle at opnå en højere grad af opløsning. Vælg fisk på et bestemt tidspunkt efter gentamicin udvaskning (tidspunkt baseret på de tidligere neuromast undersøgelser), vital farvestof stain fisk som beskrevet i protokol nr. 2, og aflive fisken ved hjælp af 2-phenoxyethanol ved en 1:500 fortynding i 1-5 min derefter.
2. I dæmpet lys for at forhindre, quenching, lave fire indsnit, således at en firkantet hud flap forberedelse er lavet som følger. Lav et snit langs de øverste ribben fisken, indtil det flugter med den anale finner, og derefter foretage et snit på tværs af maven, og endelig gøre to lodrette snit på hver side af disse indsnit, så pladsen hud flap er oprettet. Bemærk: Denne forberedelse hud vil indarbejde midten kroppens masker, der anvendes i neuromast eksperimenter.
3. Placer huden prøven på en glasplade og derefter placere en cirkulær dækglas over udskårne hud prøve at hjælpe anker og flade væv til efterfølgende digital billedbehandling.
4. Brug af huden prøver fra trin 4.3, få digitale billeder af hårcellerne i hver neuromast i midten kroppens sting. Tag billeder i en forstørrelse på mindst 60X og derefter tælle håret ceLLS inden for de enkelte neuromasts til komparativ kvantitativ analyse af kontrol-og forsøgsgrupper (se figur 4).

Representative Results

Optimering af procedurerne for kvantificering neuromast regenerering af sidelinjen i voksen zebrafisk.

De neuromasts af larve zebrafisk er let kvantificerbare; Men den laterale linie af den voksne zebrafisk har et langt større antal neuromasts pr sting gør kvantitative analyser sværere ^6,17,19,20. Som det ses i figur 1A, lederen har et betydeligt højere antal neuromasts forhold til enten midtersektionen eller hale; med halen region, der har det mindste antal neuromasts som vist i figur 1D. Fordi mønster sting i hovedet, er kompliceret og signifikant større i antal neuromasts, det ikke egner sig som en region til kvantitativ analyse. Desuden, uanset gentamicin koncentration, vi testede, komplet fjernelse af neuromasts hele hoved var sjældent opnåelige; forlader pletter af neuromasts observerede efter gentamicin behandling som tidligere beskrevet af Van Trump et al. ^17. Derimod halen har for få neuromasts, og som sådan, vi valgte midten kropsregion (figur 1B) for kvantitativt at analysere neuromast regenerering i voksen. I denne region, vi identificeret fire sting bare posteriort for laterale brystfinne der var konsekvent i neuromast nummer blandt alle voksne [61.45 (n = 95)] (figur 1B og 1E). Vigtigere er det, vi var i stand til konsekvent og helt ablatere neuromasts i denne region af en 24 hr 0,004% gentamicin behandling (som tidligere rapporteret i Van Trump et al. ¹⁷⁾ giver mulighed for en efterfølgende nøjagtig bestemmelse af neuromast regenerering (sammenlign figur 1B og 1E og indsat med figur 2, 0 time).

p_upload/51343/51343fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Fig. 1. Den fluorescerende mønster af neuromast inden sting i den voksne zebrafisk er vist langs den langsgående akse. Panel A er hovedregionen Panel B er Mid-organ region med de fire masker, der anvendes til kvantitativ analyse er skitseret med en kasse. Panel C er posterior kroppen regionen. Panel D er halefinnen region. En større forstørrelse af de 4 sting i Mid-krop region anvendes til kvantitativ analyse er vist i panel E. Forstørrelseskraft 1X og 2X.

Det er blevet rapporteret, at kobbersulfat behandling er en effektiv kemisk metode til at inducere hurtig nekrose af hårceller i embryoner og larver ^21. Her testede vi kobbersulfat behandling med det håb, at det kan forkorte tiden til at fremkalde neuromast ablation. Kobbersulfat koncentrationer fra5-50 mM for forskellige eksponeringstider op til 48 timer blev anvendt som tidligere beskrevet af Liang et al. ^21. Det blev konstateret, kobbersulfat var dødelig ved de højere koncentrationer og ikke effektive ved lave koncentrationer i voksen fisk (data ikke vist) . Klik her for at se en større version af dette tal.

Parametre, der anvendes til fluorescerende analyse af sidelinje regenerering i voksen zebrafisk.

Regeneration blev overvåget efter alle neuromasts inden for de fire midt-body masker blev ablated efter 24 timers gentamicin-behandling (figur 2, sammenligne 0 hr med kontrol) og positive regenerering blev bestemt ved fremkomsten af mindst tre neuromasts indenfor et søm. (Figur 2, 0 time). Ved 8 hpg, omkring en tredjedel af fiskene havde nogle tegn på bedring (n = 34); selvom intensiteten af neuromasts var svag i regenererende masker (Figur 2, 8 timer, svage sting skitseret af feltet). Antallet af neuromasts og deres intensitet fortsatte med at stige lineært indtil regenerering nåede et plateau ved 16 hpg (sammenlign figur 2, 16 timer med figur 2, 8 timer). Det var ikke før mindst 24 hpg at alle fisk behandlet med gentamicin havde fuldt tilbagebetalt med både lige antal og intensiteten af neuromasts inden sidelinjen masker sammenlignet med kontroller (figur 2, 24 timers). En tid-line til neuromast regenerering efter gentamicin tilbagetrækning er vist i figur 3, som viser de lineære og plateau faser af opsvinget kurven. Vi bemærker, at i mindre end 5% af tilfældene har de regenererende masker vises ikke som individuelle enheder, men i stedet viste sig som en udstrygning af fluorescens.

Figur 2. Fluorescerende billeder af neuromasts. Kontrol fisk, 0 Hr fisk (umiddelbart efter 24 timers på 0,004% gentamicin behandling), 8 timers fisk (8 hpg) med nogle svag farvning af neuromasts inden for de 4 masker, der anvendes til kvantitativ analyse (kun 30% af alle fisk viste dette mønster af farvning ved 8 hpg, 70% viste ingen neuromast farvning på dette tidspunkt, de hvide kasser skitsere de svagt farvede neuromasts, der blev set i 30% af fisk, der viste en vis grad af regenerering på 8 hpg), 16 Hr fisk, og 24 Hr fisk. Fuldstændig regenerering af neuromasts inden for de 4 masker med hensyn til 1) Antallet af neuromasts og 2) intensiteten af farvning af neuromasts blev observeret af 24 hpg. Klik her for atse en større version af dette tal.

Figur 3.. Graf, der viser tidsforløbet af neuromasts regenerering efter tilbagetrækning fra 24 timers behandling af voksne zebrafisk med 0,004% gentamicin. Som vist, nyttiggørelse begynder ved 8 hpg tidspunkt og nåede et plateau på 16 hpg tidspunkt. Det definerede liner fase af neuromast regenerering mellem 8-16 hr og tidspunkter i denne lineære fase bør anvendes til kvantitativt at sammenligne kontrol og eksperiment grupper.

Neuromast toksicitet induceret af langvarig udsættelse for fluorescensfarvede farvestoffer.

I vores vurdering en ideel måde at udføre disse forsøg vil være at farve fisken med det fluorescerende farvestof forud for behandlingen, pletten igen ved 0 hr derefter pletten igen ett restitution tidspunkter. Men vi stødte på en komplikation til disse undersøgelser, som er det faktum, at håret celle fluorescensfarvede farvestoffer såsom 4-Di-2-Asp, som også kan være tilfældet med andre mitokondrie pletter ²² kan have en giftig virkning på hårceller ^23. Dette faktum krævede os siden gentagne farvning af den samme fisk kunne ikke være ansat til at bruge separate grupper af fisk. I alle tilfælde den eksperimentelle fisk, herunder kontrol blev behandlet parallelt at eliminere eksperimentelle variation.

Konfokal analyse på de enkelte hårceller.

Hvis resultaterne fra neuromast analyser ikke statistisk signifikant forskel mellem kontrol-og forsøgsgrupper, kan man udvide disse undersøgelser til niveauet for de enkelte hagl celler til opnåelse af en højere grad af opløsning for kvantitative sammenligninger. Som angivet i figur 4 neuromasts fra en kontrolgruppe (enEuromast efter 12 timer regenerering er vist i denne figur) kan ses ved konfokal mikroskopi af hudpræparater fra midten af ​​kroppen regionen. Ved 8 timer, 10 timer, og 12 timer af regenerering tid, fandt vi, at kontrolgrupperne (7 dyr / gruppe) havde en række 0-4 hår celler / neuromast. Som forventet for kontrolgrupper, når analyseres kvantitativt, ingen statistisk forskel mellem neuromasts blev detekteret i forhold til antallet af hårceller pr neuromast på de tidspunkter, der er angivet ovenfor (P-værdier varierede fra 0,230 til 0,472). Kan træffes en sådan tilgang mellem nogen kontrol og eksperiment gruppe når det er nødvendigt at forlænge eller bekræfte oplysningerne fra den første fase af neuromast studier.

Figur 4.. Analyse af hår celle / neuromast regenerering hjælp hud præparater af den definerede sidelinje region beskrevet in protokol trin 3.3. Fluorescerende konfokal billede af hårceller inden for en neuromast opnået fra en zebrafisk forberedelse hud. To vitale farvestof farvede hår celler er vist inden for en neuromast en kontrol fisk (Figur 4). Dette billede blev opnået 12 timer efter fjernelse af gentamicin (lineær regenereringsfasen). Den hvide beslag symbol () angiver en individuel neuromast mens den hvide pil viser en bærende celle omkring hårceller. Supporting celler farves ikke under disse betingelser, og vises som sorte rum. Forstørrelse, 60X.

1	1. Gentamicin behandling [0,004% (4,32 mM)] af kontrol og eksperimentel fisk i 24 timer ved 28 ° C under anvendelse af en inkubator.
2	2. Vask gentamicin at indlede regenerering af hårceller. Retur fisk til 28 ° C inkubator for investigator valgte tidsperioder mellem 8-16 timer.
2	3.. Vital farvestof pletten [0,08% 4-4-diethylaminostyryl-N-methylpyridiniumiodid (4-di-2-Asp)] kontrol og eksperimentel fisk i 1 time ved stuetemperatur og derefter udvaske pletten med fisk vand til fluorescerende billeddannelse.
1 eller 2	4. Hvis det er nødvendigt på grund af ikke er væsentlige resultater af analysen af ​​neuromasts, gentag protokoller 1-3 med en separat gruppe af kontrol-og eksperimentel fisk, men derefter få et præparat huden konfokal analyse af de enkelte hårceller.

Tabel 1.. Et resumé af protokollen beskrevet ovenfor.

Discussion

Baseret på den omfattende litteratur, der er blevet etableret for analyse af sidelinje (LL) regenerering i embryonale og larve zebrafisk ^8,24,25, målet for vores undersøgelse var at udvikle en kvantitativ analyse for sidelinje regenerering i zebrafisk, der kunne anvendes på sygdomsmodeller, der er bedst undersøgt i den voksne fisk. Vi fandt, at visse kritiske punkter er vigtige, når anvendelse af procedurer, der er udviklet til embryonale / fiskelarver til voksne fisk. Den vigtigste af disse punkter betragtes: 1) antallet af sidelinje neuromasts langs den langsgående akse i fisken, 2) varigheden af ​​farvning af neuromast hårceller, 3) koncentrationen og varigheden af ​​behandling af aminoglycosidet og 4) timingen af ​​sidelinje regeneration efter aminoglykosid behandling. Disse punkter vil blive behandlet i den efterfølgende diskussion.

Med hensyn til antallet af neuromasts langs sidelinjen af ​​zebrafiskEmbryonisk og larve zebrafisk har den klare fordel, at neuromasts har et simpelt mønster på grund af deres lavere antal inden for en given søm i forhold til voksne fisk. Denne lave tal har tilladt efterforskere til klart at identificere hver neuromast og tildele et navn til den ^6.. På denne måde kan regenerering undersøgelser kvantificere genkomst af en bestemt neuromast ved navn på noget tidspunkt efter tilbagetrækning fra et aminoglykosid agent. Det større antal neuromasts pr sting i den voksne introducerer signifikant vanskelighed ved præcis optælling og kvantificering under genkomst regenerere neuromasts når sammenlignet med embryoner eller larver. Som vist, vi vurderede mønster af sidelinje neuromasts inden sting af den voksne og besluttet, at den mid-krop (Figures. 1 og 2), forudsat den optimale region masker til analyse.

Farvning af neuromasts med hårceller farvestoffer, såsom 2 - [4 - (dimethylamino) styryl]-N-ethylpyridinium iodid (DASPEI) eller 4-Di-2-Asp tillader en at visualisere neuromasts af den laterale linie med fluorescerende stereomikroskopi ^26,27 i larve-og ungfisk. Disse samme pletter er også effektive i voksne fisk og vores kvantitativ analyse viste, at der ingen signifikant forskel i antallet af neuromasts inden midten af ​​kroppen region blev observeret blandt normal kontrol zebrafisk (med et gennemsnit på 61,45 neuromasts i normal kontrol voksne fisk).

Det er blevet rapporteret, at håret celle farvestoffer, såsom 2 - [4 - (dimethylamino) styryl]-N-ethylpyridinium iodid (DASPEI) eller 4-di-2-Asp selv kan være toksisk for neuromast celler ^24, og fisk kan ikke være flere gange farves med disse fluorescerende stoffer, hvis én er at overvåge aminoglycosid-induceret regenerering. Gentagen farvning af den samme fisk introducerer flere begivenheder toksicitet (af både pletten og aminoglykosider), som gør forsøget un-fortolkelige ^23. Således er alle eksperimenteri vores undersøgelse kræves parallel 4-di-2-Asp farvning af flere sæt af fisk med henblik på at vise, at neuromasts var 1) til stede i ubehandlet gentamicin kontrol tilstand, 2) fuldt ablated umiddelbart efter gentamicin eksponering, og 3) at regenerere på nogle time efter gentamicin-behandling efter tilbagetrækning og vask ud af denne aminoglykosider. På denne måde blev alle fisk kun farves gang med neuromast farvestof.

Det skal bemærkes, at mens procedurerne i Van Trump et al. ¹⁷ fastsætte betingelserne for hår celle ablation i den voksne fisk, de ikke etablere en standard kurve for neuromast regenerering, som er nødvendig for kvantitativ sammenligning mellem kontrol og eksperimentelle grupper. Vi fulgte derfor procedurerne i Van Trump et al. ¹⁷ til hår celle ablation (gentamicin koncentration på 0,004% ved hjælp af en 24 timers eksponeringstid, se figur 2 for hår celle ablation resultater ved 24hr) men udvidet deres arbejde med at etablere en standard kurve neuromast regenerering. Dette giver mulighed for en sammenlignende analyse af LL regenerering i den voksne zebrafisk hjælp af de fire sting i midten kroppens område, som vi etablerede for vores assaybetingelserne (se figur 1 og 2). For at afgøre, om der kunne opnås en kortere periode for hår celle ablation, vi også testet effekten af ​​kobber sulfat, som reelt er blevet brugt i fiskelarver i perioder så korte som 2 timer. Vore undersøgelser viste, at kobbersulfat (5-50 mM for forskellige eksponeringstider op til 48 timer som tidligere beskrevet af Liang et al. ²¹ for larver) blev ikke fundet at være effektiv i voksne fisk som et middel til hårcelle ablation. Dette understreger, at betingelser, der anvendes til fjernelse af hårceller i embryoner og larver kan ikke altid overføres direkte til brug med voksne fisk.

Som hørende til den laterale linieregenerering i den voksne, fandt vi tilsvarende tidsrammer for regenerering af neuromasts mellem det af embryo / larve og voksne fisk. Som tidligere rapporteret af andre, zebrafisk embryoner og larver show neuromast regenerering på 12-24 timer efter aminoglycosid udvaskning ^8. Vi observerede den lineære fase af neuromast regenerering anført i 8-12 tidsramme (ikke betragtes som fuld masker for 8 timers tidspunkt, som vist i figur 2) med et plateau nås ved 16 hpg. Fuldstændig kontrol-lignende udseende neuromasts inden sting blev ikke observeret indtil 24 hpg som rapporteret for embryoner og larver. Fuldstændig kontrol udseende betegner både antallet og intensiteten af ​​neuromasts inden for alle fire sting i midten af ​​kroppen region i voksen zebrafisk. Desuden, hvis de kvantitative resultater opnået på niveau med de neuromasts er ikke statistisk signifikante, kan investigator udvide deres studier på niveauet for de enkelte hårceller indenfor neuromastsved hjælp af konfokal mikroskopi som beskrevet af vores procedurer.

Den neuromasts / hår celle regenerering assay beskrevet i denne artikel kan anvendes på sygdomstilstande, der er bedst manifesteret i den voksne zebrafisk snarere end i de tidlige larve / fosterstadiet. En begrænsning af analysen vedrører påvirke af den eksperimentelle betingelse om det være 1) det transgene stamme, der efterligner en særlig sygdomstilstand eller 2) et farmakologisk induceret sygdomstilstand] på stamceller i sidelinje voksen-zebrafisk. I denne henseende er en særlig sygdomstilstand af den voksne zebrafisk kan eller kan ikke påvirke stamceller af hår cellelinie, og det er vigtigt at bemærke, at neuromast regenerering er helt afhængig af disse stamcelleproliferation / differentiering processer ^8,24,25 .

Som et eksempel på denne begrænsning vil vi beskrive eksperimenter udført på en voksen zebrafisk model af type I diabetes. Denne particular sygdommen model blev udviklet hos voksne zebrafisk for at studere på lang sigt sekundære komplikationer induceret ved hyperglykæmi ^28. Af en række grunde, der tidligere ^28,29 beskrevet, kan disse undersøgelser kun udføres ved hjælp voksen zebrafisk. Fordi perifere nerver sammen med de specialiserede cellulære strukturer, de innerverer påvirkes negativt hos patienter med diabetes, vi ønskede at afgøre, om sidelinje regenerering af neuromasts / hårceller blev også forringet i diabetisk zebrafisk. Brug sidelinjen regenerering assay ingen statistisk signifikant forsinkelse blev påvist i neuromast regenerering. For at bekræfte denne negative resultat blev forsøgene gentaget på mere raffineret for den enkelte hår celle. Igen var der ingen statistisk signifikant forskel observeret i håret celle regenerering mellem kontrol og diabetiske grupper. Derfor er dataene var i modstrid med den antagelse, at hyperglykæmi hæmmer neuromast / hår celle regenerering; possibly skyldes resistensen af ​​stamceller af hår cellelinie til hyperglykæmiske tilstande. Med denne begrænsning i tankerne, neuromasts / hår celle regenerering assay er beskrevet i denne artikel, giver et middel til at teste, om en særlig voksen zebrafisk sygdom model indebærer dysfunktion i håret celle regenererende proces som overvåges ved hjælp sidelinjen system. Positive resultater ville indebære stamceller engagement og yderligere undersøgelser vil derfor være berettiget.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml)	Sigma Aldrich	G1397
2 Phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol	Aldrich	D-3418	485 nm excitation λ and 603 nm emission λ
6-well Plates	Mid Sci	TP92006
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
Glass Bottom Microwell Dishes	Matek Corporation	P35G-1.5-14-C
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting  Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
ImageJ software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.
Confocal microscope	Olympus	FV10i	Any high resolution fluorescent microscope is suitable
Aquatic System	KG Aquatics ZFS Rack System		Any aquatic system can be used