Een test voor laterale lijn Regeneration in Adult zebravis

Summary

Omdat veel zebravismodellen van neurologische en niet-neurologische ziekten worden bestudeerd in de volwassen vissen dan het embryo / larven ontwikkelden we een kwantitatieve dwarslijn regeneratieve test die kan worden toegepast bij de zebravis ziektemodellen volwassene. De test betrokken resolutie bij de 1) neuromast en 2) individuele haar cel niveaus.

Abstract

Vanwege het klinische belang van het gehoor en evenwichtsstoornissen bij de mens, hebben modelorganismen zoals de zebravis gebruikt om zijlijn ontwikkeling en regeneratie te bestuderen. De zebravis is met name aantrekkelijk voor dergelijke studies vanwege de snelle ontwikkeling van de tijd en de hoge regeneratieve capaciteit. Tot op heden zijn zebravis studies zijlijn regeneratie voornamelijk gebruikt vis van de embryonale en larvale stadia vanwege het lagere aantal neuromasten bij deze fasen. Dit heeft kwantitatieve analyse van laterale lijn regeneratie en / of de ontwikkeling gemakkelijker in de vroegere ontwikkelingsstadia gemaakt. Omdat veel zebravismodellen van neurologische en niet-neurologische ziekten worden bestudeerd in de volwassen vis en niet in het embryo / larven we ons gericht op het ontwikkelen van een kwantitatieve dwarslijn regeneratieve assay volwassen zebravissen zodat een test beschikbaar is die kan worden toegepast op de huidige volwassen zebravissen ziekte modellen. Voortbouwend op eerdere studies van Van Trump et al.. ¹⁷ dat de procedures voor ablatie van haarcellen in volwassen Mexicaanse blind grot vis en zebravis (Danio rerio) beschreven, is onze test ontworpen om kwantitatieve vergelijking tussen controle en experimentele groepen mogelijk te maken. Dit werd bereikt door de ontwikkeling van een regeneratieve neuromast standaardcurve gebaseerd op het percentage neuromast terugkeer over een 24 uurs periode na gentamicine-geïnduceerde necrose van haarcellen in een bepaald gebied van de laterale lijn. De test werd ook ontworpen om uitbreiding van de analyse om de individuele haar celniveau wanneer een hogere resolutie vereist mogelijk.

Introduction

De laterale lijn (LL) systeem is een mechanosensorische orgel gevonden in zowel vissen en amfibieën die verantwoordelijk is voor het gehoor, evenwicht, rheotaxis en bemiddelen gedrag, zoals scholing en roofdier vermijden ^1-5. Het is samengesteld uit clusters van haarcellen omgeven door steuncellen, die beide gelegen in structuren genoemd neuromasten ^6. Deze neuromasten worden typisch georganiseerd in verticale lijnen (zogenaamde st) langs de langsas van het lichaam en staart met een aantal horizontale steken waargenomen in de kop van de vis. In de volwassen, neuromasten aanzienlijk groter in aantal in de steken ten opzichte van embryonale of vislarven ^6. Biomedisch onderzoek in de zebravis hebben zich gericht op het effect van de behandeling met antibiotica, door lawaai trauma, chronische infectie, enz. op haarcellen ^7,8 in een poging om beter de effecten bij mensen begrijpen.

Anders dan de meeste gewervelde dieren, teleosts, zoals de zebravis (Danio rerio), hebben de mogelijkheid om verloren haarcellen te regenereren. Zebravis zijn vooral nuttig vanwege hun snelle ontwikkeltijd en hoge regeneratieve capaciteit. Tot dusver is; zebravis studies over zijlijn ontwikkeling en / of regeneratie hebben voornamelijk gebruik gemaakt van de embryonale en larvale stadium vis als gevolg van het verminderde aantal zijlijn neuromasten die zorgt voor eenvoudiger tellen en analyse ^6,9,10.

Echter, zoals vele zebravis modellen van neurologische en niet-neurologische ziekten ^11-16 worden bestudeerd in de volwassen vissen en niet de larven, hebben we ons gericht op het ontwikkelen van een laterale lijn regeneratieve assay in volwassen zebravissen gebruikt gentamicine (een aminoglycoside eerder in zebravis larven en meer recent gebruik met volwassen vissen ¹⁷⁾ zodat een test beschikbaar is die kan worden toegepast bij lopende zebravis ziektemodellen volwassene. Terwijl eerder gepubliceerde procedures door Van Trump et al.. ¹⁷ zijn de voorwaarden voor haarcel ablatie in de volwassen vis, hebben ze een standaardcurve voor neuromast regeneratie vereist voor kwantitatieve vergelijking tussen controle en experimentele groepen zoals bij transgene zebravis lijnen of farmacologisch geïnduceerde ziekten niet vastgesteld in de zebravis ^18. We volgden dan ook de procedures van Van Trump et al.. ¹⁷ voor haar cel ablatie, maar gebouwd op hun werk om een standaard curve van neuromast regeneratie onderzoekers toelaten om onze gegevens te gebruiken bij het ​​vergelijken van de controle en experimentele groepen zoals met zebravissen ziektemodellen volwassen vestigen . De test werd ook ontworpen om uitbreiding van de analyse van de individuele haarcel uitgevoerd wanneer een hogere resolutie vereist.

Protocol

Alle procedures worden uitgevoerd volgens de in "Principles of Laboratory Animal Care" beschreven richtlijnen (National Institutes of Health publicatie nr. 85-23, herzien 1985) en de goedgekeurde Rosalind Franklin University Institutional Animal Care en gebruik Comite dier protocol 08-19.

1. Gentamicine-inductie van Hair celnecrose

1. Bereid gentamicinesulfaat in normale zoutoplossing bij een uiteindelijke concentratie van 0,004% (4,32 mM).
2. Plaats volwassen vissen (D. rerio, 4-6 maanden oud) in een container met de 0,004% (4,32 mM) gentamicine oplossing. Elke houder kan worden gebruikt, maar we een vis container uit een Pharmacal watersysteem dat 7 in brede, 6 hoge en 7 in lange. Plaats de houder met vissen in een incubator ingesteld op 28 ° C gedurende 24 uur. Stel het totale volume van de vloeistof in de tank op een voldoende niveau om te vissen in een levensvatbare staat te houden voor de periode van 24 uur. Opmerking: Beluchting van de gentamicine vloeistof is niet necessary als voldoende volume wordt gebruikt voor het aantal vissen wordt behandeld.

2. Vital Kleuring van haarcellen

1. Bereid een concentratie van 0,08% (normale zoutoplossing) van de fluorescerende vitale kleurstof [4-4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridiniumjodide (485 nm excitatie λ en 603 nm emissie λ in methanol) een werkvoorraad oplossing van 15 mg / ml in ethanol.
2. Om te bepalen of gentamicine behandeling effectief was een subset van controle en gentamicine behandelde vis onmiddellijk gekleurd door het plaatsen van vis in het putje van een 6 putjes plaat met de vitale kleurstof. Gebruik een voldoende aantal vissen (en cultuur platen zoals vereist voor statistische significantie te bereiken. Op basis van de onderzoeker snelheid van neuromast tellen, leg de vis in de platen in een verspringend aangebracht in de tijd, zodat vissen niet zijn gekleurd voor meer dan 75 min zoals beschreven in stap 2.3.
3. Plaats de platen uit stap 2.2 in een bench lade door de fluorescentiemicroscoop omworden gebruikt voor het onderzoek van gebrandschilderd neuromasten. Schakel verlichting in de kamer aan het doven van de vitale kleurstof over de 1 uur kleuring periode bij kamertemperatuur voorkomen.
4. Bereid zowel dye wash-out en verdoving watertanks. Dye wash-out water is normaal vis water en voor verdoving water, voeg voldoende 2-fenoxyethanol, zodat een 1:1000 verdunning in normale vis water wordt bereikt.
5. Leg vis boven normale vis water om overtollig vitale kleurstof spoelen en ga verder met stap 3.1 voor observatie van vitale kleurstof gekleurd vis.
6. Regeneratie van neuromasten onderzoeken, transfer-gentamicine behandelde vis die in de normale vis water werden gewassen om een ​​incubator voor tussen 8-16 uur bij 28 ° C.
7. Op verschillende tijdstippen tussen 8-16 uur, worden vissen uit de incubator verwijderd, gewassen en gekleurd zoals in stappen 2.1-2.4. Ga verder met stap 3.1 voor observatie van vitale kleurstof gekleurd vis.

3. Verlamming Vis en TL Tellen van neuromasten

1. Plaats het deksel op het podium van een fluorescerende stereo microscoop om een ​​digitaal beeld van de vitale kleurstof gebrandschilderde neuromasten van het midden van het lichaam steken verkrijgen.
2. Gebruik een digitale camera op de fluorescerende stereo microscoop set een vergroting van 2x om opnamen te maken voor verdere kwantitatieve analyse. Opmerking: De vergroting instelling van de stereo-microscoop kan afhangen van het merk van de microscoop gebruikt, maar de instelling moet het eenvoudig bekijken en het tellen van individuele neuromasten mogelijk binnen het midden lichaam steken.
3. Bepaal de hoeveelheid regeneratiegas door telling van het aantal zichtbare neuromasten binnen de vier aangewezen st het onderste ventrale zijde van de vis net proximaal naar rechts borstvin (zie figuur 1). Voor statistische analyse gebruik van een geschikte test zoals ANOVA or T-toets van de student. Experimenten moet minimaal 5 vissen per tijdstip gebruiken en alle experimenten moeten herhaald minimaal 3x.
4. Op basis van de neuromast regeneratie tijd curve (zie figuur 3), tel neuromasten tussen 8-16 uur na gentamicine wash-out te zijn binnen de lineaire fase van de regeneratie curve. Opmerking: Het gebruik van de lineaire tijdfase zorgt voor een goede kwantitatieve analyse van de controle-en experimentele groepen.

4. Fluorescerende Tellen van individuele haarcellen voor het verkrijgen van een hogere resolutie van de kwantitatieve analyse als de neuromast Analysis is niet statistisch significant

1. Als de kwantitatieve analyse op het niveau van neuromasten niet significant kan analyse op het niveau van de individuele haarcel ook worden gebruikt om een ​​hogere resolutie te verkrijgen. Selecteer vis op een bepaald tijdstip na gentamicine wash-out (tijdstip op basis van de eerdere neuromast studies), vitale kleurstof stain de vis zoals beschreven in Protocol nr. 2, en vervolgens euthanaseren de vis met behulp van 2-fenoxyethanol bij een 1:500 verdunning voor 1-5 minuten.
2. In gedempt licht te doven voorkomen, maken vier insnijdingen, zodat een vierkant huid flap preparaat wordt als volgt gemaakt. Een incisie langs de bovenste ribben van de vis totdat deze is uitgelijnd met de anale vinnen, maak dan een incisie in de buik, en tenslotte, maak twee verticale insnijdingen aan weerszijden van deze insnijdingen zodat het vierkant huidflap wordt gecreëerd. Opmerking: Dit preparaat huid zal medio lichaam steken gebruikt in de neuromast experimenten op te nemen.
3. Plaats de huid specimen op een glasplaatje en plaats dan een ronde glazen dekglaasje over de weggesneden huid specimen om het anker te helpen en plat de weefsel voor verdere digitale beeldbewerking.
4. Met behulp van de huid exemplaren uit stap 4.3, krijgen de digitale beelden van de haarcellen in elk neuromast van het midden van het lichaam steken. Maak opnamen op een vergroting van ten minste 60X en tel dan het haar cells binnen afzonderlijke neuromasten vergelijkende kwantitatieve analyse van de controle-en experimentele groepen (zie figuur 4).

Representative Results

Optimalisering van de procedures voor het kwantificeren neuromast regeneratie van de laterale lijn in volwassen zebravissen.

De neuromasten van larvale zebravis zijn gemakkelijk meetbaar zijn; De laterale lijn van de volwassen zebravissen een veel groter aantal neuromasten per steek van een kwantitatieve analyse bemoeilijkt ^6,17,19,20. Zoals in figuur 1A, de kop heeft een significant hoger aantal neuromasten vergeleken met elk van de midden-sectie of staart; met de staart gebied met het minst aantal neuromasten zoals weergegeven in figuur 1D. Door het patroon van steken in het hoofd is ingewikkeld en significant groter in aantal neuromasten, heeft zij zich niet leent als een gebied voor kwantitatieve analyse. Bovendien, ongeacht de concentratie gentamicine ons geteste volledige ablatie van neuromasten gehele kop was nauwelijks haalbaar; verlaten plekjes van neuromasten waargenomen na gentamicine behandeling zoals eerder beschreven door Van Trump et al.. ¹⁷ daarentegen de staart te weinig neuromasten, en als zodanig, we midden lichaamsgebied (figuur 1B) geselecteerd kwantitatief analyseren neuromast regeneratie bij volwassenen. In deze regio, identificeerden we vier hechtingen juist achter de laterale borstvinnen die consistent waren in neuromast aantal onder alle volwassenen [61,45 (n = 95)] (figuren 1B en 1E). Belangrijk, konden we consistent en volledig ablatie van de neuromasten van het gebied door een 24 uur 0,004% gentamicine behandeling (zoals eerder beschreven in Van Trump et al.. ¹⁷⁾ waardoor een volgende nauwkeurige bepaling van neuromast regeneratie (vergelijk figuren 1B en 1E en inzet met Figuur 2, 0 uur).

p_upload/51343/51343fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 1. Het fluorescerende patroon van neuromast binnen steken van de volwassen zebravissen weergegeven langs de langsas. Paneel A is het hoofdgebied, Paneel B is het Mid-lichaamsgebied met de vier hechtingen voor kwantitatieve analyse aangegeven met een doos. Panel C is de posterior-lichaam regio. Paneel D is de staartvin regio. Een hogere vergroting van de 4 st van de Mid-body regio gebruikt voor de kwantitatieve analyse wordt getoond in Panel E. Vergrotingsfactor van 1X en 2X.

Er werd gemeld dat kopersulfaat behandeling is een effectieve chemische methode snel necrose haarcellen induceren in embryo's en larven ^21. Hier hebben we getest kopersulfaat behandeling met de hoop dat het de tijd kan verkorten neuromast ablatie induceren. Kopersulfaat concentraties van5-50 mM voor verschillende blootstellingstijden tot 48 uur werden gebruikt zoals eerder is beschreven door Liang et al.. ²¹ Het bleek dat kopersulfaat was dodelijk bij de hogere concentraties en niet bij lagere concentraties in volwassen vissen (data niet getoond) . Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Parameters die worden gebruikt voor fluorescentie analyse van laterale lijn regeneratie bij volwassen zebravis.

Regeneratie werd gevolgd immers neuromasten binnen de vier mid-body hechtingen geablateerd na 24 uur gentamicine-behandeling (Figuur 2, vergelijk 0 uur met controle) en positieve regeneratie werd bepaald door het verschijnen van ten minste drie neuromasten binnen een steek. (Figuur 2, 0 uur). Door 8 HPG, ongeveer een derde van de vis had een teken van herstel (n = 34); hoewel de intensiteit van neuromasten was zwak in de regenererende steken (figuur 2, 8 uur, vage steken door dozen geschetst). Het aantal neuromasten en de intensiteit blijven stijgen lineair tot regeneratie bereikt een plateau bij 16 HPG (vergelijk figuur 2, 16 figuur 2 uur, 8 uur). Het was niet tot ten minste 24 HPG dat alle vis behandeld met gentamicine volledig was hersteld met zowel een gelijk aantal en intensiteit van de neuromasten binnen de laterale lijn steken in vergelijking met controles (figuur 2, 24 uur). Een tijdlijn voor neuromast regeneratie na gentamicine opname is weergegeven in figuur 3 waarin de lineaire en plateau fase van het herstel curve toont. We merken dat minder dan 5% van de gevallen, de regenererende steken niet weergegeven als afzonderlijke entiteiten maar verscheen als een uitstrijkje van fluorescentie.

Figuur 2. Fluorescerende beelden van neuromasten. Controle vis, 0 Hr vis (onmiddellijk na 24 uur van 0,004% gentamicine behandeling), 8 Hr vis (8 HPG) met een aantal zwakke kleuring van neuromasten binnen de 4 st gebruikt voor kwantitatieve analyse (slechts 30% van alle vis toonde dit patroon van vlekken op 8 HPG; 70% toonde geen neuromast kleuring op dit tijdstip, de witte vakjes een overzicht van de vaag-lood neuromasten die werden gezien in de 30% van de vis die een zekere mate van regeneratie bij 8 HPG toonde), 16 Hr vis, en 24 Hr vis. Volledige regeneratie van neuromasten binnen de 4 steken met betrekking tot 1) het aantal neuromasten en 2) de intensiteit van de kleuring van neuromasten werd waargenomen door 24 HPG. Klik hier ombekijk een grotere versie van deze figuur.

Figuur 3. Grafiek toont het tijdsverloop van neuromasten regeneratie na de terugtrekking van 24 uur behandeling van volwassen zebravissen met 0.004% gentamicine. Zoals afgebeeld, herstel begint bij de 8 HPG tijdstip en bereikte een plateau op de 16 HPG tijdstip. Dit bepaalde de liner fase van neuromast regeneratie tussen 8-16 uur en tijdstip binnen deze lineaire fase zou moeten worden gebruikt om de controle en experiment groepen kwantitatief vergelijken.

Neuromast toxiciteit wordt veroorzaakt door langdurige blootstelling aan fluorescente kleuring kleurstoffen.

In onze schatting een ideale manier om deze experimenten is om de vis opnieuw kleuren met de fluorescerende kleurstof voorafgaand aan de behandeling, vlek op 0 uur opnieuw vlek eent regeneratie tijdstippen. Echter, we complicatie deze studies is het feit dat haarcel fluorescente kleuring kleurstoffen zoals 4-Di-2-Asp, zoals ook bij andere mitochondriale vlekken ²² hebben een toxische effect op haarcellen ²³ zijn. Dit feit vereist wij afzonderlijke soorten vis gebruiken omdat herhaalde kleuring van dezelfde vis kon niet worden toegepast. In alle gevallen de experimentele vis, waaronder controles werden parallel behandeld experimentele variabiliteit elimineren.

Confocale analyse op het niveau van individuele haarcellen.

Als de resultaten van de neuromast analyseresultaten zijn niet statistisch significant tussen de controle-en experimentele groepen, kan men deze studies uit te breiden tot het niveau van de individuele hagel cellen een hogere resolutie voor kwantitatieve vergelijkingen verkrijgen. Zoals in figuur 4, neuromasten van een controlegroep (eenEuromast op 12 uur van de wedergeboorte is weergegeven in deze figuur) kunnen worden bekeken door confocale microscopie van de huid preparaten uit het midden van het lichaam regio. Om 8 uur, 10 uur en 12 uur van regeneratie tijd, vonden we dat controlegroepen (7 dieren / groep) had een bereik van 0-4 haarcellen / neuromast. Zoals verwacht controlegroepen bij kwantitatief geanalyseerd geen statistisch verschil tussen neuromasten gedetecteerd in termen van het aantal haarcellen per neuromast bij de bovengenoemde punten (P-waarden varieerden 0,230-0,472). Een dergelijke benadering kan worden tussen een controle-en experimentgroep wanneer nodig zijn verkregen uit de eerste fase van neuromast studies gegevens verlengen of bevestigen.

Figuur 4. Analyse van haar cel / neuromast regeneratie behulp van de huid voorbereidingen van de gedefinieerde zijlijn regio beschreven in protocol stap 3.3. Fluorescent confocale beeld van haarcellen binnen een neuromast verkregen van een zebravis voorbereiding huid. Twee vitale kleurstof gekleurd haarcellen zijn vertegenwoordigd in een neuromast van controlevissen (figuur 4). Dit beeld werd verkregen 12 uur na verwijdering van gentamicine (lineaire regeneratie fase). De beugel symbool wit () geeft een individu neuromast terwijl de witte pijl geeft een ondersteunende cel rond de haarcellen. Ondersteunende cellen niet vlek onder deze omstandigheden en verschijnen als zwarte velden. Vergroting, 60X.

1	1. Gentamicine behandeling [0.004% (4,32 mM)] controle en experimentele vissen gedurende 24 uur bij 28 ° C met een incubator.
2	2. Uitwassen van gentamicine tot regeneratie van haarcellen initiëren. Terug vis aan de 28 ° C incubator voor onderzoeker geselecteerde perioden tussen 8-16 uur.
2	3. Vitale kleurstof vlek [0.08% 4-4-diethylaminostyryl-N-methylpyridiniumjodide (4-Di-2-Asp)] controle en experimentele vis voor 1 uur bij kamertemperatuur geroerd en vervolgens wassen vlek met vis water voor fluorescentie beeldvorming.
1 of 2	4. Indien noodzakelijk vanwege niet-significante resultaten van de analyse van neuromasten, herhaal protocollen 1-3 met een aparte groep van de controle en experimentele vis, maar dan is een voorbereiding van de huid voor confocale analyse van individuele haarcellen te verkrijgen.

Tabel 1. Een samenvatting van het protocol hierboven beschreven.

Discussion

Op basis van de uitgebreide hoeveelheid literatuur die is vastgesteld voor de analyse van de laterale lijn (LL) regeneratie in embryonale en larvale zebravis ^8,24,25, het doel van ons onderzoek was een kwantitatieve test voor laterale lijn regeneratie in zebravis ontwikkelen dat kon worden toegepast ziektemodellen die het best bestudeerd in de volwassen vissen. We vonden dat bepaalde kritieke punten zijn van belang bij de toepassing van procedures ontwikkeld voor de embryonale / larvale vis aan de volwassen vissen. De belangrijkste van deze punten beschouwd: 1) het aantal zijlijn neuromasten langs de langsas van de vis, 2) de duur van kleuring van neuromast haarcellen, 3) de concentratie en de behandelingsduur van de aminoglycoside, en 4) de timing van de zijlijn regeneratie na aminoglycoside behandeling. Deze punten zullen worden behandeld in de volgende bespreking.

Met betrekking tot het aantal neuromasten langs de zijlijn van de zebravisEmbryonale en larvale zebravis hebben het onmiskenbare voordeel dat de neuromasten een eenvoudig patroon vanwege hun lagere nummer binnen een bepaalde steek ten opzichte van volwassen vissen. Dit lage aantal is toegestaan ​​onderzoekers om nauwkeurig elk neuromast en een naam toewijzen aan het ^6. Zo kan regeneratie studies het opnieuw verschijnen van een bepaalde neuromast op naam gekwantificeerd door daarvan terugtrekking uit een aminoglycoside middel. Het grootste aantal neuromasten per steek in de volwassen introduceert aanzienlijke moeilijkheden nauwkeurige telling en kwantificering tijdens de terugkeer van regenererende neuromasten vergelijking met die van embryo's of larven. Zoals afgebeeld, onderzochten we het patroon van de zijlijn neuromasten binnen steken van de volwassen en bepaald dat het midden van de body (Figuren. 1 en 2) op voorwaarde dat de optimale regio steken voor analyse.

Kleuring van neuromasten met haarcellen kleurstoffen zoals 2 - [4 - (dimethylamino) styryl]-N-ethylpyridinium jodide (DASPEI) of 4-Di-2-Asp maakt het mogelijk om neuromasten van de zijlijn te visualiseren met behulp van fluorescerende stereomicroscopie ^26,27 in larvale en juveniele vis. Dezelfde vlekken zijn ook effectief in de volwassen vissen en ons kwantitatieve analyse gaf aan dat er geen significant verschil in het aantal neuromasten in het midden lichaamsgebied waargenomen bij normale controle zebravis (met een gemiddelde van 61,45 neuromasten in normale controle volwassen vissen).

Er werd gemeld dat haarcel kleurstoffen zoals 2 - [4 - (dimethylamino) styryl]-N-ethylpyridinium jodide (DASPEI) of 4-Di-2-Asp kunnen zelf toxisch voor cellen neuromast ²⁴ en vis niet herhaaldelijk worden gekleurd met deze fluorescerende stoffen als men-aminoglycoside geïnduceerde regeneratie volgen. Herhaalde kleuring van dezelfde vis introduceert meerdere toxiciteit gebeurtenissen (door zowel de vlek en de aminoglycoside) dat het experiment niet-interpreteerbare ²³ maakt. Bijgevolg, alle experimentenin onze studie vereist parallelle 4-Di-2-Asp kleuring van meerdere sets van vis om aan te tonen dat neuromasten waren 1) aanwezig in de niet behandelde gentamicine controle conditie, 2) volledig onmiddellijk weggenomen na gentamicine blootstelling, en 3) het regenereren op een bepaald uur na gentamicine-behandeling na terugtrekking en uitwassen van deze aminoglycoside. Zo was vis eenmaal gekleurd met de kleurstof neuromast.

Er zij op gewezen dat hoewel de werkwijze van Van Trump et al.. ¹⁷ stellen de voorwaarden haarcel ablatie in de volwassen vis, zij geen standaard curve voor neuromast regeneratie vereist voor kwantitatieve vergelijking tussen controle en experimentele groepen stellen. We volgden dan ook de procedures van Van Trump et al.. ¹⁷ voor haar cel ablatie (gentamicine concentratie van 0,004% met een 24 uur belichtingstijd, zie figuur 2 voor haar cel ablatie resultaten bij 24hr) maar uitgebreid hun werk om een ​​standaard curve van neuromast regeneratie vestigen. Dit maakt vergelijking van LL regeneratie in de volwassen zebravissen met de vier hechtingen van het midden lichaamsgebied dat we vastgesteld onze assay (zie figuren 1 en 2). Om te bepalen of een kortere periode haarcellen ablatie zou kunnen worden verkregen, hebben we ook het effect getest van kopersulfaat die effectief gebruikt bij vislarven perioden zo kort als 2 uur. Onze studies aangegeven dat kopersulfaat (5-50 mM voor verschillende blootstellingstijden tot 48 uur zoals eerder door Liang et al.. ²¹ gerapporteerd voor larven) werd niet gevonden effectief bij volwassen vis als agent voor haarcel ablatie zijn. Dit benadrukt het feit dat voor ablatie van haarcellen in embryo's en larven omstandigheden niet altijd direct overgebracht voor gebruik met de volwassen vissen.

Zoals met betrekking tot de zijlijnregeneratie in de volwassen, vonden we gelijkaardige termijnen voor de regeneratie van neuromasten tussen die van embryo / larvale en volwassen vissen. Zoals eerder gemeld door anderen, zebravis embryo's en larven tonen neuromast regeneratie bij 12-24 uur na aminoglycoside wash-out ^8. We observeerden de lineaire fase van neuromast regeneratie die in de 8-12 termijn (niet als volledige st voor de 8 uur tijdspunt zoals getoond in figuur 2) met een plateau bereikt 16 HPG. Volledige controle-achtige uiterlijk van neuromasten binnen steken werd niet waargenomen tot 24 HPG zoals gerapporteerd voor embryo's en larven. Volledige controle-achtige uitstraling geeft zowel het aantal en de intensiteit van neuromasten binnen alle vier de steken van het midden-lichaam regio in volwassen zebravissen. Bovendien, als de verkregen ter hoogte van de neuromasten kwantitatieve resultaten niet statistisch significant, de onderzoeker hun studie uitstrekken tot het niveau van de individuele haarcellen in het neuromastenvia confocale microscopie zoals beschreven door onze procedures.

De neuromasten / haar celregeneratie assay beschreven in dit artikel kan worden toegepast op ziektetoestanden die het best tot uiting in de volwassen zebravissen in plaats van in de vroege larvale / embryonale stadia. Een beperking van de assay betreft het effect van de experimentele conditie of het 1) de transgene stam die een bepaalde ziektetoestand of 2) een farmacologisch geïnduceerde ziektetoestand] stamcellen in het zijlijnsysteem volwassen zebravissen nabootst. In dit verband, een bepaalde ziektetoestand van de volwassen zebravissen dan niet beïnvloeden stamcellen van het haar cellijn, en het is belangrijk op te merken dat neuromast regeneratie volledig afhankelijk van deze stamcel proliferatie / differentiatie processen ^8,24,25 .

Als voorbeeld van deze beperking, zullen we experimenten uitgevoerd op volwassen zebravissen model van type I diabetes te beschrijven. Deze particular ziektemodel is ontwikkeld in volwassen zebravissen om de lange termijn secundaire complicatie veroorzaakt door hyperglycemie ²⁸ bestuderen. Voor een aantal redenen eerder ^28,29 beschreven, kunnen deze studies alleen worden uitgevoerd met volwassen zebravissen. Omdat perifere zenuwen, samen met de gespecialiseerde celstructuren ze innerveren nadelig worden beïnvloed bij patiënten met diabetes, wilden we bepalen of laterale lijn regeneratie van neuromasten / haarcellen ook was aangetast bij diabetische zebravis. Met behulp van de laterale lijn regeneratie test geen statistisch significante vertraging werd gedetecteerd in neuromast regeneratie. Om dit negatieve resultaat te bevestigen, werden de experimenten herhaald op meer verfijnde niveau van de individuele haarcel. Opnieuw werd geen statistisch significant verschil waargenomen in het haar celregeneratie tussen controle en diabetische groepen. Daarom is de data waren niet consistent met de veronderstelling dat hyperglycemie belemmert neuromast / haar cel regeneratie; possibly verband met de weerstand van stamcellen van het haar cellijn aan hyperglycemische omstandigheden. Met deze beperking in het achterhoofd, de neuromasten / haar cel regeneratie assay beschreven in dit artikel biedt wel een manier om te testen of een bepaalde volwassen zebravissen ziektemodel houdt dysfunctie in het haar cel regeneratieve proces gecontroleerd met behulp van de laterale lijn systeem. Positieve resultaten zouden betrokkenheid stamcellen impliceren en verdere studies zou dus gerechtvaardigd zijn.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml)	Sigma Aldrich	G1397
2 Phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol	Aldrich	D-3418	485 nm excitation λ and 603 nm emission λ
6-well Plates	Mid Sci	TP92006
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
Glass Bottom Microwell Dishes	Matek Corporation	P35G-1.5-14-C
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting  Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
ImageJ software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.
Confocal microscope	Olympus	FV10i	Any high resolution fluorescent microscope is suitable
Aquatic System	KG Aquatics ZFS Rack System		Any aquatic system can be used