Un test pour ligne latérale de régénération à l'âge adulte de poisson zèbre

Summary

Parce que de nombreux modèles de poisson zèbre de maladies neurologiques et non neurologiques sont étudiés dans les poissons adultes plutôt que l'embryon / larve, nous avons développé un dosage latéral de régénération de ligne quantitative qui peut être appliquée à des modèles de maladies de poisson zèbre adulte. Le dosage impliqué résolution au neuromastes 1) et 2) les niveaux cellulaires de cheveu.

Abstract

En raison de l'importance clinique de l'ouïe et troubles de l'équilibre chez l'homme, des organismes modèles tels que le poisson zèbre ont été utilisés pour étudier le développement de la ligne latérale et la régénération. Le poisson zèbre est particulièrement intéressante pour ces études en raison de son temps de développement rapide et sa grande capacité de régénération. À ce jour, les études de poisson zèbre de latéral régénération de ligne ont principalement utilisé des poissons des stades embryonnaires et larvaires en raison de la diminution du nombre de neuromastes à ces stades. Cela a fait de l'analyse quantitative de la ligne de régénération / et ou le développement plus facile dans les premiers stades de développement latéral. Parce que de nombreux modèles de poisson zèbre de maladies neurologiques et non neurologiques sont étudiés dans les poissons adultes et non dans l'embryon / larves, nous nous sommes concentrés sur le développement d'un test latéral quantitative ligne de régénération chez le poisson zèbre adulte ainsi qu'une analyse était disponible qui pourrait être appliquée à courant modèles de la maladie de poisson zèbre adulte. S'appuyant sur des études précédentes par Van Trump et al ^17. qui décrit les procédures d'ablation de cellules ciliées de poissons adultes mexicain aveugle de la grotte et le poisson zèbre (Danio rerio), notre test a été conçu pour permettre une comparaison quantitative entre les groupes témoins et expérimentaux. Cela a été réalisé en mettant au point une courbe étalon de neuromastes régénérative sur la base de la réapparition de neuromastes pour cent pendant une période de temps de 24 heures suivant la nécrose induite par la gentamicine, de cellules ciliées dans une région définie de la ligne latérale. L'essai a également été conçu pour permettre l'extension de l'analyse au niveau des cellules ciliées individu quand un niveau supérieur de résolution est requise.

Introduction

Le système (LL) de la ligne latérale est un organe mécanosensorielle trouvé dans les deux poissons et les amphibiens qui est responsable de l'audition, l'équilibre, rhéotactisme et les comportements de médiation telles que la scolarisation et l'évitement des prédateurs ^1-5. Elle est composée de grappes de cellules ciliées entourées par des cellules de soutien, qui sont tous deux positionnés dans des structures appelées neuromastes ^6. Ces neuromastes sont généralement organisés en lignes verticales (appelé points) le long de l'axe longitudinal du corps et de la queue avec quelques points horizontaux observés dans la tête du poisson. Chez l'adulte, neuromastes sont beaucoup plus nombreux dans les points par rapport à l'embryon ou larves de poissons ^6. Études biomédicales chez le poisson zèbre ont porté sur l'effet du traitement antibiotique, traumatisme induit par le bruit, une infection chronique, etc. sur les cellules ciliées ^7,8 pour tenter de mieux comprendre leurs effets sur les humains.

Contrairement à la plupart des vertébrés, teleosts, tels que le poisson zèbre (Danio rerio), ont la capacité de régénérer les cellules de cheveux perdus. Poisson zèbre sont particulièrement utiles en raison de leur temps de développement rapide et de haute capacité de régénération. A ce jour, toutefois, études de poisson zèbre sur le développement et / ou la régénération de la ligne latérale ont principalement utilisé le poisson embryonnaire et larvaire stade en raison de la réduction du nombre de neuromastes de la ligne latérale qui permet de faciliter le comptage et l'analyse ^6,9,10.

Cependant, comme de nombreux modèles de poisson zèbre de maladies neurologiques et non neurologiques ^11-16 sont étudiés dans les poissons adultes et non les larves, nous nous sommes concentrés sur le développement d'un test de régénération de la ligne latérale chez le poisson zèbre adulte en utilisant la gentamicine (un aminoglycoside déjà utilisé dans les larves de poisson zèbre et plus récemment utilisé avec les poissons adultes ¹⁷⁾ de sorte qu'une analyse était disponible qui pourraient être appliquées à des modèles de maladies adultes actuels de poisson zèbre. Bien que les procédures précédemment publié par Van Trump et al. ¹⁷ fixe les conditions pour l'ablation des cellules ciliées dans les poissons adultes, ils n'ont pas établi une courbe standard pour la régénération neuromastes qui est nécessaire pour la comparaison quantitative entre les groupes témoins et expérimentaux tels que l'utilisation de lignes de poisson zèbre transgénique ou états pathologiques pharmacologiquement induits chez le poisson zèbre ^18. Nous avons donc suivi les procédures de Van Trump et al. ¹⁷ pour l'ablation des cellules ciliées, mais construit sur ​​leur travail pour établir une courbe standard de régénération neuromastes pour permettre aux enquêteurs d'utiliser nos données lorsque l'on compare les groupes témoins et expérimentaux tels que des modèles de la maladie de poisson zèbre adulte . L'essai a également été conçu pour permettre l'extension de l'analyse à la cellule individuelle lorsque les cheveux un plus haut niveau de résolution est requise.

Protocol

Toutes les procédures sont effectuées suivant les directives décrites dans les «Principes de protection des animaux de laboratoire» (National Institutes of Health publication no. 85-23, révisée 1985) et le protocole de l'animal Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux Université Rosalind Franklin approuvé 08-19.

1. Gentamicine-induction de cheveux nécrose des cellules

1. Préparer le sulfate de gentamicine dans du sérum physiologique à une concentration finale de 0,004% (4,32 mM).
2. Placer le poisson adulte (D. rerio, 4-6 mois) dans un récipient contenant le 0,004% (4,32 mM) de solution de gentamicine. Tout récipient peut être utilisé, mais nous utilisons un conteneur de poissons à partir d'un système aquatique Pharmacal qui est 7 de large, 6 en haut, et 7 dans longtemps. Placer le récipient avec des poissons dans un incubateur réglé à 28 ° C pendant 24 heures. Régler le volume total de fluide dans le réservoir à un niveau suffisant pour maintenir le poisson dans un état viable pour la période de 24 heures. Remarque: L'aération du fluide gentamicine n'est pas necessaire si suffisamment de volume est utilisée pour le nombre de poissons à traiter.

2. Coloration vitale des cellules ciliées

1. Préparer une concentration de 0,08% (dans une solution saline normale) du colorant vital fluorescent [4-4-diethylaminostyryl)-N-méthylpyridinium (485 nm excitation λ et 603 nm émission λ dans le methanol) à partir d'une solution de travail de réserve de 15 mg / ml dans de l'éthanol.
2. Pour déterminer si le traitement a été efficace gentamicine un sous-ensemble de contrôle et de la gentamicine poissons traités sont colorées immédiatement en plaçant le poisson dans le puits d'une plaque de culture 6 puits contenant le colorant vital. Utilisez un nombre suffisant de poissons (et des plaques de culture comme l'exige la signification statistique à atteindre. Basé sur la vitesse de l'examinateur de comptage neuromastes, placer le poisson dans les plaques de manière échelonnée dans le temps afin que les poissons ne sont pas tachés de plus de 75 min comme décrit dans l'étape 2.3.
3. Placez les plaques de l'étape 2.2 dans un tiroir de banc par le microscope à fluorescence àêtre utilisé pour l'examen de neuromastes colorées. Éteignez les lumières de la pièce pour éviter l'extinction du colorant vital au cours de la période de coloration 1 h à température ambiante.
4. Préparer la fois colorant wash-out et des réservoirs d'eau anesthésiques. Eau de wash-out colorant est de l'eau de poisson normale et de l'eau anesthésie, ajouter suffisamment de 2-phénoxyéthanol sorte qu'une dilution de 1:1000 dans l'eau du poisson normale est atteint.
5. Placer le poisson dans l'eau en excès de poisson normale pour rincer l'excès de colorant vital et passez à l'étape 3.1 pour l'observation de colorant teinté poissons vital.
6. Pour la régénération de la neuromastes, transférer les poissons de la gentamicine traités qui ont été lavés à l'eau du poisson normale dans un incubateur pour entre 8-16 heures à 28 ° C.
7. À divers moments entre 8-16 heures, les poissons sont retirées de l'incubateur, lavées et colorées comme indiqué dans les étapes 2.1 à 2.4. Passez à l'étape 3.1 pour l'observation de colorant teinté poissons vital.

3. Anesthésier le poisson et comptage fluorescent de Neuromastes

1. Placer le couvercle sur la scène d'un microscope stéréo fluorescent pour obtenir une image numérique des colorants neuromastes colorées vitaux des points du corps milieu.
2. Utilisez un appareil photo numérique placé sur le microscope stéréo fluorescent fixé un grossissement de 2X pour capturer des images pour l'analyse quantitative ultérieure. Remarque: Le réglage de grossissement du microscope stéréo peut dépendre de la marque de microscope utilisé, mais le réglage doit permettre l'affichage et le comptage des neuromastes individuels facile dans le milieu des points du corps.
3. Déterminer la quantité de régénération en comptant le nombre de neuromastes visibles dans les quatre points désignés sur le côté inférieur le plus ventrale du poisson juste en amont de la nageoire pectorale droite (voir la figure 1). Pour l'analyse statistique en utilisant un test approprié tel que ANOVA or T-test de Student. Les expériences doivent utiliser un minimum de 5 poissons par point de temps et toutes les expériences doivent être répétées au moins 3x.
4. Sur la base de la courbe de temps neuromastes de régénération (voir la figure 3), compter neuromastes entre 8-16 heures après la gentamicine wash-out pour être dans la phase linéaire de la courbe de régénération. Remarque: L'utilisation de la phase de temps linéaire permet une analyse quantitative adéquate entre les groupes témoins et expérimentaux.

4. Comptage fluorescent de cellules ciliées individuelle pour l'obtention d'une résolution plus élevée de l'analyse quantitative si l'analyse neuromastes n'est pas statistiquement significative

1. Si l'analyse quantitative au niveau de neuromastes n'est pas significative, une analyse au niveau de la cellule individuelle de cheveux peut également être utilisée pour obtenir un plus haut degré de résolution. Sélectionnez poisson à un particulier le point de temps après la gentamicine de wash-out (point de temps sur la base des études de neuromasts antérieures), colorant vital stain le poisson tel que décrit dans le protocole 2, puis euthanasier les poissons en utilisant le 2-phénoxyéthanol à une dilution 1:500 1-5 min.
2. Dans une lumière tamisée pour éviter l'extinction, faire quatre incisions ainsi qu'un carré préparation de lambeau de peau est faite comme suit. Faire une incision le long des côtes supérieures du poisson jusqu'à ce qu'il soit aligné avec les nageoires anales, puis faire une incision dans le ventre, et enfin, faire deux incisions verticales de chaque côté de ces incisions de sorte que le volet carré de la peau est créé. Note: Cette préparation de la peau intégrera les points du corps milieu utilisés dans les expériences de neuromasts.
3. Placer l'échantillon de peau sur une lame de verre, puis placez une circulaire lamelle de verre sur le spécimen excisé de la peau pour aider à l'ancre et aplatir le tissu pour l'imagerie numérique ultérieure.
4. En utilisant les échantillons de peau provenant de l'étape 4.3, d'obtenir des images numériques de cellules ciliées dans chaque neuromastes des points milieu du corps. Prenez des photos à un grossissement d'au moins 60X et puis de compter le CE de cheveuxlls dans neuromastes individuels pour l'analyse quantitative comparative de la commande et les groupes expérimentaux (voir figure 4).

Representative Results

Optimisation des procédures pour quantifier neuromastes régénération de la ligne latérale chez le poisson zèbre adulte.

Les neuromastes de poisson zèbre larves sont facilement quantifiables; Cependant, la ligne latérale de poisson zèbre adulte a un plus grand nombre de neuromastes par point faisant des analyses quantitatives plus difficile ^6,17,19,20. Comme on le voit sur ​​la figure 1A, la tête a un nombre significativement plus élevé de neuromastes rapport soit à la mi-section ou de la queue; avec la région de la queue ayant le plus petit nombre de neuromastes comme le montre la figure 1D. Étant donné que le motif de points dans la tête est sensiblement plus compliqué et du nombre de neuromastes, il ne se prête en tant que région pour l'analyse quantitative. En outre, quelle que soit la concentration de gentamicine nous avons testé, l'ablation complète de neuromastes tout au long de la tête est rarement atteint; taches laissant de neuromastes observés après le traitement de la gentamicine comme indiqué précédemment par Van Trump et al. ¹⁷ En revanche, la queue a trop peu de neuromastes, et en tant que tel, nous avons sélectionné la région mi-corps (figure 1B) pour analyser quantitativement régénération neuromastes chez l'adulte. Dans cette région, nous avons identifié quatre points juste derrière la nageoire pectorale latérale qui correspondaient au nombre de neuromastes parmi tous les adultes [61.45 (n = 95)] (figures 1B et 1E). Surtout, nous avons pu réaliser l'ablation constamment et complètement les neuromastes de cette région par un 24 heures de 0,004% du traitement de gentamicine (comme indiqué précédemment dans Van Trump et al. ¹⁷⁾ permettant une détermination précise ultérieure de neuromastes régénération (comparer les figures 1B et 1E et encadré à la figure 2, 0 h).

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Figure 1. L'motif fluorescent de neuromastes dans mailles du poisson zèbre adulte est représenté le long de l'axe longitudinal. Groupe A est la région de la tête, partie B est la région Mid-corps avec les quatre points de suture utilisés pour l'analyse quantitative décrite avec une boîte. Groupe C est la région postérieure du corps. Groupe D est la région caudale. Un grossissement plus élevé des quatre points de la région mi-corps utilisé pour l'analyse quantitative est représenté dans E. Groupe Force de grossissement de 1X et 2X.

Il a été rapporté que le traitement par le sulfate de cuivre est un procédé chimique efficace pour induire une nécrose rapide des cellules ciliées chez les embryons et les larves ^21. Ici, nous avons testé un traitement de sulfate de cuivre avec l'espoir qu'il pourrait raccourcir le temps d'induire ablation neuromastes. Les concentrations de sulfate de cuivre allant de5 à 50 mM pour diverses durées d'exposition allant jusqu'à 48 heures ont été utilisés comme il a été précédemment rapporté par Liang et al. ²¹ On a trouvé que le sulfate de cuivre était létale aux concentrations plus élevées et pas efficace à des concentrations plus faibles chez les poissons adultes (données non présentées) . S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les paramètres utilisés pour l'analyse de fluorescence de la régénération de la ligne latérale chez le poisson zèbre adulte.

Régénération a été contrôlée après tous neuromastes dans les quatre points à mi-corps ont été ablation suivant 24 h gentamicine traitement (figure 2, comparer 0 h avec contrôle) et la régénération positive a été déterminé par l'apparition d'un minimum de trois neuromastes dans un point. (Figure 2, 0 h). En 8 HPG, environ un tiers des poissons avait des signes de reprise (n = 34); bien que l'intensité de neuromastes était faible dans les points de régénération (Figure 2, 8 h, points faibles soulignés par des boîtes). Le nombre de neuromastes et leur intensité ont continué d'augmenter de façon linéaire jusqu'à ce que la régénération atteint un plateau à 16 HPG (comparer la figure 2, 16 h à la figure 2, 8 h). Il a fallu attendre au moins 24 HPG que tous les poissons traités par la gentamicine ont complètement récupéré avec les deux nombres égaux et intensités des neuromastes dans les points latéraux de ligne que par rapport aux témoins (Figure 2, 24 h). Un calendrier pour neuromastes régénération après le retrait de la gentamicine est illustré à la figure 3 qui montre les linéaires et plateau phases de la courbe de récupération. Nous notons que dans moins de 5% des cas, les points de régénération ne pas apparaissent comme des entités individuelles mais sont apparues comme un test de fluorescence.

Figure 2. Des images fluorescentes de neuromastes. poissons de contrôle, 0 Hr poissons (immédiatement après 24 h de 0,004% du traitement de gentamicine), poissons de 8 heures (8 HPG) avec quelque faible coloration de neuromastes dans les 4 points utilisés pour l'analyse quantitative (seulement 30% de tous les poissons a montré que ce modèle de coloration à 8 HPG, 70% ne présentaient aucune coloration neuromastes à ce point de temps, les cases blanches indiquent les neuromastes faiblement colorés qui ont été vus dans le 30% des poissons qui a montré un certain degré de régénération à 8 HPG), 16 Hr poissons, et 24 poissons Hr. Régénération complète de neuromastes dans les 4 points de suture à l'égard de 1) le nombre de neuromastes et 2) intensité de la coloration de neuromastes a été observée par 24 HPG. S'il vous plaît cliquer ici pourvoir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Graphique montrant l'évolution dans le temps de neuromastes régénération après le retrait de 24 traitement h de poisson zèbre adulte avec 0,004% de la gentamicine. Comme le montre, la reprise commence à l'instant 8 HPG et atteint un plateau au point de temps de 16 HPG. Cette définition de la phase de revêtement de neuromastes régénération entre 8-16 h et temps des points dans cette phase linéaire doit être utilisée pour comparer quantitativement les groupes de contrôle et expérience.

Toxicité neuromastes est induite par une exposition prolongée à des colorants fluorescents de coloration.

Dans notre estimation un moyen idéal pour effectuer ces expériences serait de colorer le poisson avec le colorant fluorescent avant le traitement, la tache de nouveau à 0 heure, puis à nouveau une tachepoints de temps t de régénération. Cependant, nous avons rencontré une complication de ces études, qui est le fait que la cellule de cheveux colorants fluorescents de coloration tels que le 4-di-2-Asp, comme peuvent aussi être le cas avec d'autres taches mitochondriales ²² peut avoir un toxique effet sur ​​les cellules ciliées ^23. Ce fait nous a obligés à utiliser des groupes distincts de poissons depuis coloration répétée des mêmes poissons ne pouvaient pas être utilisés. Dans tous les cas, le poisson, y compris les contrôles expérimentaux ont été traités en parallèle pour éliminer la variabilité expérimentale.

Analyse confocale au niveau des cellules ciliées individuels.

Si les résultats obtenus à partir de l'analyse des neuromastes ne sont pas statistiquement significative entre les groupes témoin et expérimental, on peut étendre ces études au niveau des cellules de grêle individuels pour obtenir un degré de résolution plus élevée pour des comparaisons quantitatives. Comme indiqué sur la figure 4, neuromastes provenant d'un groupe témoin (unEuromast à 12 heures de régénération est représentée sur cette figure) peut être visualisé par microscopie confocale de préparations pour la peau de la région du milieu du corps. À 8 h, 10 h et 12 h de temps de récupération, nous avons constaté que les groupes de contrôle (7 animaux / groupe) avaient une portée de 0-4 cheveux cellules / neuromastes. Comme on s'y attendait pour les groupes de contrôle, lorsque analysé quantitativement, aucune différence statistique entre neuromastes a été détecté en termes de nombre de cellules ciliées par neuromastes aux points de temps indiqués ci-dessus (P-valeurs variaient 0,230 à 0,472). Une telle approche peut être prise entre un groupe témoin et expérience en cas de besoin de prolonger ou de confirmer les données obtenues à partir de la première phase d'études neuromasts.

Figure 4. Analyse des cheveux régénération cellulaire / neuromastes en utilisant des préparations de peau de la région définie de la ligne latérale décrite in protocole étape 3.3. image confocale de fluorescence de cellules ciliées dans un neuromastes obtenu à partir d'une préparation de la peau de poisson zèbre. Deux cellules de cheveux colorés vitaux de colorants sont présentés dans un neuromastes d'un poisson de contrôle (Figure 4). Cette image a été obtenue 12 heures après l'enlèvement de la gentamicine (phase de régénération linéaire). Le symbole du support blanc () indique une neuromastes individu tandis que la flèche blanche indique une cellule de support qui entoure les cellules ciliées. Cellules de soutien ne se colorent pas dans ces conditions et apparaissent comme des espaces noirs. Grossissement, 60X.

1	1. Le traitement de gentamicine [0,004% (4,32 mM)] de contrôle et de poissons expérimental pendant 24 heures à 28 ° C en utilisant un incubateur.
2	2. Laver la gentamicine pour amorcer la régénération des cellules ciliées. Poissons Retour à l'incubateur à 28 ° C pour des périodes déterminées de l'enquêteur entre 8-16 heures.
2	3. Colorant tache Vital [0,08% 4-4-diethylaminostyryl-N-méthylpyridinium (4-di-2-Asp)] contrôle et poissons expérimental pendant 1 heure à température ambiante puis lavent tache avec de l'eau du poisson pour l'imagerie de fluorescence.
1 ou 2	4. Si nécessaire en raison des résultats non significatifs de l'analyse des neuromastes, répéter Protocoles 1-3 avec un groupe distinct de contrôle et de poissons expérimentale, mais d'obtenir une préparation de la peau pour l'analyse confocale de cellules ciliées individuels.

Tableau 1. Un résumé du protocole décrit ci-dessus.

Discussion

Basé sur le vaste corpus de littérature qui a été mis en place pour l'analyse de la ligne latérale (LL) de la régénération chez le poisson zèbre embryonnaire et larvaire ^8,24,25, le but de notre étude était de développer un dosage quantitatif pour la régénération de la ligne latérale chez le poisson zèbre qui pourrait être appliquée à des modèles de maladies qui sont les mieux étudiés dans les poissons adultes. Nous avons constaté que certains points critiques sont importantes lors de l'application des procédures développées pour les poissons embryonnaire / larves de poissons adultes. Le plus important de ces points considérés: 1) le nombre de la ligne latérale neuromastes long de l'axe longitudinal du poisson, 2) la durée de la coloration des cellules ciliées neuromastes, 3) la concentration et la durée du traitement de l'aminoglycoside, et 4) le moment de la régénération de la ligne latérale suivant le traitement aminosides. Ces points seront abordés dans la discussion qui suit.

En ce qui concerne le nombre de neuromastes le long de la ligne latérale d'un poisson zèbre, Le poisson-zèbre embryonnaire et larvaire ont l'avantage que les neuromastes ont un modèle simple en raison de leur faible nombre dans un point donné par rapport à des poissons adultes. Ce faible nombre a permis aux enquêteurs d'identifier clairement chaque neuromastes et attribuer un nom à lui ^6. De cette façon, les études de régénération peuvent quantifier la réapparition d'un neuromastes particulier par nom, à tout moment après le retrait d'un agent des aminosides. Le plus grand nombre de neuromastes par point à l'adulte présente des difficultés importantes dans le comptage précis et la quantification lors de la réapparition de la régénération neuromastes par rapport à celle des embryons ou des larves. Comme le montre, nous avons évalué le modèle de neuromastes latéraux de ligne dans les points de l'adulte et déterminé que le milieu du corps (Figures. 1 et 2) à condition que la région optimale des points de suture pour l'analyse.

La coloration des cellules avec neuromastes colorants capillaires tels que le 2 - [4 - (diméthylamino) styryl]-N-ethylpyridinium iodure (DASPEI) ou 4-di-2-Asp permet de visualiser neuromastes de la ligne latérale à l'aide de microscopie stéréoscopique fluorescent ^26,27 dans les poissons larvaires et juvéniles. Ces mêmes taches sont également efficaces pour les poissons adultes et notre analyse quantitative indiqué aucune différence significative dans le nombre de neuromastes dans la région mi-corps a été observée chez le poisson-zèbre de commande normale (avec une moyenne de 61,45 neuromastes dans les poissons contrôle adulte normal).

Il a été rapporté que des colorants cellulaires des cheveux tels que le 2 - [4 - (diméthylamino) styryl]-iodure de N-éthylpyridinium (DASPEI) ou 4-Di-2-Asp peuvent eux-mêmes être toxiques pour neuromastes cellules ^24, et les poissons ne peuvent pas être de façon répétée colorées avec ces agents fluorescents si l'on veut suivre la régénération induite par les aminoglycosides. Coloration répétée de la même poisson introduit plusieurs événements de toxicité (à la fois par la tache et l'aminoglycoside) qui fait l'expérience non-interprétable ^23. En conséquence, toutes les expériencesdans notre étude parallèle nécessaire de coloration 4-di-2-Asp de plusieurs ensembles de poissons afin de montrer que neuromastes étaient 1) présente dans la condition contrôle gentamicine non traité, 2) entièrement ablation immédiatement après l'exposition gentamicine, et 3) la régénération à un heure après la gentamicine traitement après le retrait et le lavage de ce aminosides. De cette façon, tous les poissons a été coloré seule fois avec le colorant neuromastes.

Il convient de souligner que, si les procédures de Van Trump et al. ¹⁷ établissent les conditions pour l'ablation des cellules ciliées dans les poissons adultes, ils ne permettent pas d'établir une courbe standard pour la régénération neuromastes qui est nécessaire pour la comparaison quantitative entre les groupes témoins et expérimentaux. Nous avons donc suivi les procédures de Van Trump et al. ¹⁷ pour l'ablation des cellules ciliées (concentration de gentamicine de 0,004% avec un temps d'exposition de 24 heures, voir Figure 2 pour les résultats d'ablation des cellules ciliées à 24h) mais étendu leur travail pour établir une courbe standard de neuromastes régénération. Cela permet une analyse comparative de LL régénération chez le poisson zèbre adulte en utilisant les quatre points de la zone du corps à mi que nous avons créé pour nos conditions de test (voir les figures 1 et 2). Afin de déterminer si une période plus courte pour l'ablation des cellules ciliées pourrait être obtenue, nous avons également testé l'effet du sulfate de cuivre qui a été effectivement utilisé dans des larves de poisson pendant une période aussi courte que 2 heures. Nos études ont montré que le sulfate de cuivre (5-50 mM pour différents temps d'exposition jusqu'à 48 h comme cela a été rapporté précédemment par Liang et al. ²¹ pour les larves) n'a pas été trouvé pour être efficace dans les poissons adultes comme agent pour l'ablation des cellules ciliées. Cela met en évidence le fait que les conditions utilisées pour l'ablation de cellules ciliées dans les embryons et les larves ne peuvent pas toujours être transférées directement pour une utilisation avec les poissons adultes.

Comme appartenant à la ligne latéralerégénération chez l'adulte, nous avons trouvé des délais similaires pour la régénération de neuromastes entre celle de l'embryon / larvaire et adulte poisson. Comme indiqué précédemment par d'autres, embryons de poisson zèbre et les larves spectacle neuromastes régénération à 12-24 heures après aminosides wash-out ^8. Nous avons observé la phase linéaire de neuromastes régénération figurant dans le délai 8-12 (pas vu comme points complets pour le point de temps de 8 heures comme le montre la figure 2) avec un plateau atteint à 16 HPG. Complète l'apparence de contrôle comme des neuromastes dans des points n'a pas été observée jusqu'à 24 HPG tels que déclarés pour les embryons et les larves. Complète l'apparence de contrôle comme désigne à la fois le nombre et l'intensité des neuromastes dans les quatre points de la région mi-corps chez le poisson zèbre adulte. En outre, si les résultats quantitatifs obtenus au niveau des neuromastes ne sont pas statistiquement significative, l'investigateur peut prolonger leurs études au niveau des cellules individuelles à l'intérieur des cheveux neuromastesutilisant la microscopie confocale, comme décrit par nos procédés.

Le dosage de la régénération des cellules neuromastes / cheveux décrit dans cet article peut être appliqué à des états pathologiques qui sont les mieux manifestent chez le poisson zèbre adulte plutôt que dans les stades larvaires / embryonnaire précoce. Une limitation du dosage concerne l'incidence de la condition expérimentale, que ce soit 1) la souche transgénique qui imite un état pathologique particulier ou 2) un état de maladie pharmacologiquement induite] sur les cellules souches au sein du système de la ligne latérale d'un poisson zèbre adulte. À cet égard, un état ​​pathologique particulier du poisson zèbre adulte peut être ou ne pas affecter les cellules souches de la lignée des cellules ciliées, et il est important de noter que neuromastes régénération est totalement dépendante de ces prolifération de cellules souches / différenciation des procédés ^8,24,25 .

A titre d'exemple de cette limitation, nous allons décrire des expériences réalisées sur un modèle de poisson zèbre adulte du diabète de type I. Cette particulmodèle de la maladie ar a été développé chez le poisson zèbre adulte afin d'étudier sur le long terme complication secondaire induite par l'hyperglycémie ^28. Pour un certain nombre de raisons décrites précédemment ^28,29, ces études ne peuvent être effectuées en utilisant le poisson zèbre adulte. Parce que les nerfs périphériques ainsi que les structures cellulaires spécialisées ils de innervent sont affectés chez les patients atteints de diabète, nous avons voulu déterminer si latéral régénération de la ligne de neuromastes cellules / cheveux était également perturbée chez le poisson zèbre diabétique. En utilisant le test latéral de régénération de ligne retard pas statistiquement significative a été détectée dans la régénération neuromastes. Pour confirmer ce résultat négatif, les expériences ont été répétées au niveau plus raffiné de la cellule de cheveu. Là encore, aucune différence statistiquement significative n'a été observée dans les cheveux régénération cellulaire entre le contrôle et les groupes diabétiques. Par conséquent, les données étaient incompatibles avec l'hypothèse que l'hyperglycémie entrave neuromastes / cheveux régénération cellulaire; possibly en raison de la résistance des cellules souches de la lignée de cellules ciliées à des conditions d'hyperglycémie. Avec cette limitation à l'esprit, le dosage de la régénération des cellules neuromastes / cheveux décrit dans cet article fournit un moyen de tester si un modèle de la maladie de poisson zèbre adulte particulier implique un dysfonctionnement dans le processus de régénération des cellules ciliées de surveiller l'utilisation du système de la ligne latérale. Les résultats positifs impliquant une participation de cellules souches et d'autres études seraient donc justifié.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml)	Sigma Aldrich	G1397
2 Phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol	Aldrich	D-3418	485 nm excitation λ and 603 nm emission λ
6-well Plates	Mid Sci	TP92006
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
Glass Bottom Microwell Dishes	Matek Corporation	P35G-1.5-14-C
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting  Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
ImageJ software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.
Confocal microscope	Olympus	FV10i	Any high resolution fluorescent microscope is suitable
Aquatic System	KG Aquatics ZFS Rack System		Any aquatic system can be used