Ein Test für Laterallinie Regeneration im erwachsenen Zebrafisch

Summary

Da viele Zebrafisch-Modellen der neurologischen und nicht-neurologischen Erkrankungen sind in der erwachsenen Fischen nicht der Embryo / Larven untersucht, entwickelten wir eine quantitative Seitenlinie regenerative Assay, die erwachsenen Zebrafisch Krankheitsmodelle angewendet werden können. Der Test beteiligt Beschluss der 1) Neuromasten und 2) einzelne Haarzelle Ebenen.

Abstract

Aufgrund der klinischen Bedeutung von Hör-und Gleichgewichtsstörungen bei Menschen, Modellorganismen wie Zebrafisch wurden zur Seitenlinie Entwicklung und Regeneration zu studieren. Der Zebrafisch ist wegen seiner schnellen Entwicklungszeit und die hohe Regenerationsfähigkeit für solche Untersuchungen besonders attraktiv. Bisher wurden Zebrafisch-Studien Seitenlinie Regeneration vor allem wegen der geringeren Anzahl von Neuromasten in diesen Phasen genutzt Fische der Embryonal-und Larvenstadien. Dies hat quantitative Analyse der Seitenlinie Regeneration und / oder der Entwicklung leichter in den früheren Entwicklungsstadien gemacht. Da viele Zebrafisch Modelle von neurologischen und nicht-neurologischen Krankheiten im erwachsenen Fisch und nicht im Embryo / Larven untersucht, auf die Entwicklung eines quantitativen Seitenlinie regenerative Assay in erwachsenen Zebrafisch konzentrierten wir uns damit wurde ein Assay zur Verfügung, um Strom angelegt werden kann erwachsenen Zebrafisch Krankheitsmodelle. Aufbauend auf früheren Studien von Van TrumS. et al ^17, dass die Verfahren zur Ablation von Haarzellen im erwachsenen mexikanischen blinde Höhlenfische und Zebrafisch (Danio rerio) beschrieben. wurde unser Test zur quantitativen Vergleich zwischen Kontroll-und Versuchsgruppen zu ermöglichen. Dies wurde durch die Entwicklung eines regenerativen Neuromasten Standardkurve, basierend auf dem Prozentsatz der Neuromasten Wieder über einen 24 Stunden Zeitraum nach Gentamicin-induzierte Nekrose von Haarzellen in einem definierten Bereich der Seitenlinie erreicht. Der Assay wurde auch entworfen, um Erweiterung der Analyse auf die einzelnen Haarzellebene, wenn eine höhere Auflösung erforderlich ist, zu ermöglichen.

Introduction

Die Seitenlinie (LL)-System ist ein mechanosensorischen Orgel in beiden Fische und Amphibien, die für Gehör, Gleichgewicht, rheotaxis und vermittelnde Verhaltensweisen wie Schul-und Raubvermeidung ^5.1 verantwortlich ist gefunden. Es wird der Cluster von Haarzellen von Stützzellen umgeben sind, sind die beide in Strukturen genannt Neuromasten ⁶ angeordnet. Diese Neuromasten sind in der Regel in vertikalen Linien entlang der Längsachse des Körpers und der Schwanz mit einigen im Kopf der Fische beobachtet horizontale Stiche organisiert (genannt Stiche). Beim Erwachsenen sind Neuromasten in der Anzahl deutlich größer innerhalb der Stiche im Vergleich zu embryonalen oder Fischlarven ^6. Biomedizinische Studien haben in Zebrafisch über die Wirkung der Behandlung mit Antibiotika, lärmbedingtem Trauma, chronische Infektion, usw. konzentriert. Haarzellen auf ^7,8 in einem Versuch, besser ihre Wirkung beim Menschen zu verstehen.

Anders als die meisten Wirbeltiere, teleosts wie Zebrafisch (Danio rerio), haben die Fähigkeit, verlorene Haarzellen zu regenerieren. Zebrafische sind wegen ihrer schnellen Entwicklungszeit und hohe Regenerationsfähigkeit besonders geeignet. Bis heute ist jedoch; Zebrafisch-Studien an der Seitenlinie Entwicklung und / oder der Regeneration haben vor allem die Embryonal-und Larvenstadium Fisch aufgrund der reduzierten Anzahl der Seitenlinie Neuromasten, die für einfachere Zählung und Analyse ermöglicht ^6,9,10 genutzt.

Allerdings sind viele Zebrafisch-Modelle von neurologischen und nicht-neurologischen Erkrankungen ^11-16 in der erwachsenen Fische und nicht die Larven untersucht, konzentrierten wir uns auf die Entwicklung einer Seitenlinie regenerative Test bei erwachsenen Zebrafisch mit Gentamicin (ein Aminoglykosid zuvor in Zebrafisch-Larven und neuerdings mit ¹⁷ erwachsenen Fischen verwendet wird), so dass ein Test zur Verfügung, dass den aktuellen erwachsenen Zebrafisch-Krankheitsmodelle angewandt werden könnten. Während früher durch Van Trump e veröffentlichten Verfahrent al. ^17. wurden die Bedingungen für die Haarzell Ablation in der erwachsenen Fische, haben sie nicht eine Standardkurve für Neuromasten, die Regeneration für die quantitative Vergleich zwischen Kontroll-und Versuchsgruppen wie bei der Verwendung von transgenen Zebrafischlinien oder pharmakologisch induzierten Krankheitszuständen erforderlich ist, zu etablieren ¹⁸ im Zebrafisch. Wir haben daher die Verfahren, gefolgt von Van Trump et al. Für ¹⁷ Haarzelle Ablation, aber auf ihre Arbeit gebaut, um eine Standardkurve von Neuromasten Regeneration Ermittlern ermöglichen, unsere Daten, wie mit erwachsenen Zebrafisch Krankheitsmodelle beim Vergleich Kontroll-und Versuchsgruppen einsetzen . Der Assay wurde auch entworfen, um Erweiterung der Analyse auf die einzelnen Haarzelle zu ermöglichen, wenn eine höhere Auflösung erforderlich ist.

Protocol

Alle Verfahren werden nach den in "Principles of Laboratory Animal Care" beschriebenen Richtlinien durchgeführt (National Institutes of Health Veröffentlichung nicht. 85-23, überarbeitet 1985) und der genehmigte Rosalind Franklin Universität Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss Tier Protokoll 08-19.

1. Gentamicin-Induktion von Haarzell Nekrose

1. Vorbereitung Gentamicinsulfat in normaler Salzlösung in einer Endkonzentration von 0,004% (4,32 mM).
2. Zeigen erwachsenen Fischen (D. rerio, 4-6 Monate alt) in einem Behälter, der die 0,004% (4,32 mM), Gentamicin-Lösung. Einem Behälter verwendet werden, aber wir von einem Pharmacal Wasser-System, das in 7 breit, 6 in hohen und lang ist in 7 mit einem Fischbehälter. Stellen Sie den Behälter mit Fisch in einem Brutschrank bei 28 ° C für 24 h eingestellt. Stellen Sie das gesamte Fluidvolumen in dem Tank auf einem ausreichenden Niveau, um Fische in einem lebensfähigen Zustand für den Zeitraum von 24 Std. erhalten. Hinweis: Die Belüftung des Gentamicin-Flüssigkeit nicht necessar Falls genügend Volumen für die Anzahl der zu behandelnden Fisch verwendet.

2. Vital Färbung der Haarzellen

1. Vorbereitung einer 0,08% Konzentration (in normaler Kochsalzlösung) des Fluoreszenzvitalfarbstoff [4-4-Diethylaminostyryl)-N-methylpyridiniumiodid (485 nm Anregung und 603 nm, λ Emission λ in Methanol) von einer Arbeitsstammlösung von 15 mg / ml in Ethanol.
2. Um festzustellen, ob die Behandlung wirksam war Gentamicin eine Teilmenge der Kontrolle und Gentamicin behandelten Fische werden sofort, indem sie Fische in der Vertiefung einer 6-Well-Kulturplatte, die den Vitalfarbstoff angefärbt. Verwenden Sie eine ausreichende Anzahl von Fischen (und Kulturplatten für statistische Signifikanz erreicht werden benötigt. Basierend auf der Prüferin Geschwindigkeit von Neuromasten zählen, den Fisch in den Platten gestaffelt im Laufe der Zeit, so dass die Fische nicht mehr als 75 min angefärbt wie in Schritt 2.3 beschrieben.
3. Legen Sie die Platten aus Schritt 2.2 in einer Tischschublade von dem Fluoreszenzmikroskopzur Untersuchung von gefärbten Neuromasten verwendet werden. Schalten Sie die Raumbeleuchtung auf Löschung der Vitalfarbstoff über die 1 Stunde Färbung Zeitraum bei Raumtemperatur zu verhindern.
4. Bereiten Sie sowohl Farbstoff Wash-out-und Anästhesiewassertanks. Dye Wash-out-Wasser ist normal, Wasser und Fisch für Narkose Wasser, fügen Sie genügend 2-Phenoxyethanol, so dass eine 1:1000 Verdünnung in normalen Fischwasser erreicht.
5. Zeigen Fisch über normale Fische, um überschüssiges Wasser spülen Vitalfarbstoff, und fahren Sie zur Beobachtung der Vitalfarbstoff angefärbt Fisch Schritt 3.1.
6. Um die Regeneration der Neuromasten zu untersuchen, zu übertragen Gentamicin-behandelte Fische, die in normalen Fischwasser in einen Inkubator für zwischen 8-16 h bei 28 ° C gewaschen
7. Zu verschiedenen Zeitpunkten zwischen 8-16 h werden die Fische aus dem Inkubator entfernt, gewaschen und gefärbt, wie in den Schritten 2.1-2.4 angegeben. Gehen Sie zur Beobachtung der Vitalfarbstoff angefärbt Fisch Schritt 3.1.

3. Anästhesie Fisch und Fluorescent Auszählung der Neuromasten

1. Setzen Sie den Deckel auf der Bühne eines Fluoreszenzstereomikroskop, um ein digitales Bild der Vitalfarbstoff gefärbten Neuromasten der Mitte der Körper Stiche erhalten.
2. Verwenden Sie eine Digitalkamera auf dem Fluoreszenzstereomikroskop gelegt gesetzt eine Vergrößerung von 2X, um Bilder für die anschließende quantitative Analyse zu erfassen. Hinweis: Die Vergrößerungseinstellung des Stereomikroskops kann auf die Marke von Mikroskop verwendet werden, hängen, aber die Einstellung ist die einfache Anzeige und Zählung der einzelnen Neuromasten in der Mitte der Körper Stiche zu ermöglichen.
3. Bestimmung der Regenerationsmenge durch Zählen der Anzahl sichtbarer Neuromasten in den vier benannten Maschen auf der untersten Bauchseite des Fisches proximal der rechten Brustflosse (siehe Abbildung 1). Für die statistische Analyse verwenden Sie eine geeignete Test wie ANOVA or des Student-T-Test. Experimente sollte ein Minimum von 5 Fische pro Zeitpunkt nutzen und alle Experimente sollte mindestens 3x wiederholt werden.
4. Basierend auf der Neuromasten Regenerationszeit-Kurve (siehe Abbildung 3), zählen Neuromasten zwischen 8-16 Stunden nach Gentamicin-wash-out innerhalb der linearen Phase der Regeneration Kurve. Hinweis: Die Verwendung der linearen Zeitphase ermöglicht die richtige quantitative Analyse zwischen der Kontroll-und Versuchsgruppen.

4. Fluorescent Zählen einzelner Haarzellen zur Gewinnung Höhere Auflösung des Quantitative Analyse, wenn die Neuromasten Analyse statistisch nicht signifikant

1. Wenn die quantitative Analyse auf der Ebene der Neuromasten nicht signifikant ist, kann die Analyse auf der Ebene der einzelnen Haarzellen auch verwendet werden, um eine höhere Auflösung zu erhalten. Wählen Fisch zu einem bestimmten Zeitpunkt nach Gentamicin-wash-out (Zeitpunkt auf der Basis der früheren Studien Neuromasten), Vitalfarbstoff stain den Fisch in Protokoll 2 beschrieben, und einschläfern den Fisch mit 2-Phenoxyethanol in einer Verdünnung von 1:500 für 1-5 min dann.
2. In gedämpftem Licht zu Abschrecken zu vermeiden, stellen vier Einschnitte, so dass ein Quadrat Hautlappen Zubereitung wird wie folgt hergestellt. Einen Einschnitt entlang der oberen Rippen der Fische, bis es mit den Afterflossen ausgerichtet ist, dann machen Sie einen Schnitt über den Bauch und schließlich, stellen zwei vertikale Schnitte auf jeder Seite dieser Einschnitte, so das Quadrat Hautlappen wird erstellt. Hinweis: Diese Vorbereitung der Haut wird die Mitte Körper Stiche in den Neuromasten Experimente verwendet zu integrieren.
3. Legen Sie die Hautprobe auf einem Objektträger und legen Sie dann einen kreisförmigen Deckglas über die Haut ausgeschnitten Probe Anker helfen und glätten das Gewebe für die anschließende digitale Bildbearbeitung.
4. Mit den Hautproben von Schritt 4.3, erhalten digitale Bilder von den Haarzellen in jedem Neuromasten der Mitte der Körper Stiche. Nehmen Sie Bilder mit einer Vergrößerung von mindestens 60X und dann zählen die Haare cells innerhalb einzelner Neuromasten für vergleichende quantitative Analyse der Kontroll-und Versuchsgruppen (siehe Abbildung 4).

Representative Results

Optimierung der Verfahren zur Quantifizierung von Neuromasten Regeneration der Seitenlinie bei erwachsenen Zebrafisch.

Die Neuromasten von Zebrafisch-Larven sind leicht quantifizierbar; jedoch hat die Seitenlinie des erwachsenen Zebrafisch eine viel größere Anzahl von Neuromasten pro Stich Herstellung quantitative Analysen schwieriger ^6,17,19,20. Wie in 1A zu sehen ist, hat der Kopf eine deutlich höhere Anzahl von Neuromasten im Vergleich zu entweder dem Mittelabschnitt oder Schwanz; mit der Heckbereich mit der geringsten Anzahl von Neuromasten wie in Fig. 1D gezeigt. Da das Muster der Stiche im Kopf ist kompliziert und in der Anzahl der Neuromasten deutlich größer, es hat sich nicht als eine Region für die quantitative Analyse zu verleihen. Zusätzlich, unabhängig von der Gentamicin-Konzentration, die wir getestet, komplett Ablation von Neuromasten in der gesamten Kopf war nur selten erreichbar; Verlassen Flecken der Neuromasten beobachtet nach Gentamicin-Behandlung, wie zuvor von ¹⁷ Im Gegensatz Van Trump et al. berichtet, hat der Schwanz zu wenige Neuromasten, und als solche, die Mitte der Körperbereich (Abbildung 1B) haben wir uns für die quantitative Analyse von Neuromasten Regeneration beim Erwachsenen. In dieser Region, die wir identifiziert vier Stiche nur an der seitlichen Brustflosse, die konsistent in Neuromasten Zahl unter allen Erwachsenen [61.45 (n = 95)] (1B und 1E) waren posterior. Wichtig ist, dass wir in der Lage, um die Neuromasten dieser Region einheitlich und vollständig abzutragen von 24 h 0,004% Gentamicin-Behandlung (wie zuvor in Van Trump et al. Berichteten ¹⁷⁾ so dass für eine genaue Bestimmung der anschließenden Regeneration Neuromasten (vergleiche Fig. 1B und 1E und Abbildung 2, 0 Std.) eingelassen.

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Abbildung 1. Das Fluoreszenzmuster der Neuromasten in Maschen des erwachsenen Zebrafisch ist entlang der Längsachse gezeigt. Panel A ist der Kopfbereich ist das Feld B Mid-Body-Region mit den vier Stiche für die quantitative Analyse mit einem Feld beschrieben verwendet. Steuerung C ist die Hintere Körperbereich. Feld D ist die Schwanzflosse Region. Eine höhere Vergrößerung der 4 Maschen des mittleren Körperbereich für die quantitative Analyse verwendet wird, in E-Panel. Vergrößerungsleistung von 1X und 2X gezeigt.

Es wurde berichtet, daß Kupfersulfat Behandlung ist ein wirksames Verfahren, um eine schnelle chemische Nekrose von Haarzellen in Embryonen und Larven ²¹ induzieren. Hier haben wir getestet, Kupfersulfat-Behandlung mit der Hoffnung, dass es vielleicht die Zeit zu verkürzen, um Neuromasten Ablation zu induzieren. Kupfersulfat-Konzentrationen im Bereich von5-50 mM für verschiedene Belichtungszeiten von bis zu 48 h verwendet wurden, wie zuvor von Liang et al. ²¹ gemeldet Es wurde festgestellt, daß Kupfersulfat letal war bei den höheren Konzentrationen und nicht wirksam bei niedrigeren Konzentrationen bei erwachsenen Fisch (Daten nicht gezeigt) . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Parameter für die Fluoreszenzanalyse der Seitenlinie Regeneration im erwachsenen Zebrafisch verwendet.

Regeneration wurde überwacht, nachdem alle Neuromasten in den vier mittleren Körper Stiche wurden nach 24 h Gentamicin-Behandlung (Fig. 2, zu vergleichen, 0 h mit Kontrolle) und positive Regeneration wurde durch das Auftreten von mindestens drei Neuromasten in einer Masche bestimmt abgetragen. (Fig. 2, 0 h). Mit 8 HPG, etwa ein Drittel der Fische hatte einige Zeichen der Erholung (n = 34); obwohl die Intensität der Neuromasten war schwach in den Regenerations Maschen (Abb. 2, 8 Stunden, schwach Stiche durch Kästen beschrieben). Die Zahl der Neuromasten und ihre Intensität weiter in einer linearen Weise zu erhöhen, bis die Regeneration erreicht ein Plateau bei 16 HPG (vgl. Abbildung 2, Abbildung 16 Stunden mit 2, 8 h). Es war nicht bis mindestens 24 HPG, dass alle mit Gentamicin behandelten Fische hatte voll sowohl mit gleicher Anzahl und Intensitäten der Neuromasten innerhalb der Seitenlinie Stiche im Vergleich zu Kontrollen (Abb. 2, 24 h) gewonnen. Eine Zeitlinie für die Neuromasten Regeneration nach Gentamicin Entnahme ist in Fig. 3 gezeigt, die lineare und Plateauphasen der Erholungskurve zeigt. Wir stellen fest, dass in weniger als 5% der Fälle, die regenerierenden Stiche nicht als einzelne Einheiten erscheinen, sondern erschien als ein Abstrich der Fluoreszenz.

Abbildung 2. Fluoreszenzbilder der Neuromasten. Steuer Fisch, 0 Hr Fisch (sofort nach 24 Stunden von 0,004% Gentamicin-Behandlung), 8 Hr Fisch (8 HPG) mit etwas schwache Färbung des Neuromasten innerhalb der 4 Maschen für die quantitative Analyse verwendet (nur 30% aller Fisch zeigte dieses Muster der Färbung bei 8 HPG, 70% zeigten keine Färbung Neuromasten zu diesem Zeitpunkt, die weißen Felder skizzieren die schwach gefärbte Neuromasten, die in der 30% der Fische, die ein gewisses Maß an Regeneration bei 8 HPG zeigte sehen waren), 16 Hr Fisch, und 24 Hr Fisch. Vollständige Regeneration von Neuromasten innerhalb der vier Stiche in Bezug auf 1) die Zahl der Neuromasten und 2) Intensität der Färbung des Neuromasten wurde von 24 HPG beobachtet. Bitte klicken Sie hier, umsehen Sie eine größere Version dieser Zahl.

3. Die Grafik zeigt den zeitlichen Verlauf der Neuromasten Regeneration nach Rückzug von 24 Stunden Behandlung von erwachsenen Zebrafisch mit 0,004% Gentamicin. Wie gezeigt, beginnt Erholung an der 8 HPG Zeitpunkt und erreicht ein Plateau bei 16 HPG Zeitpunkt. Dies definiert die Einlage Phase der Neuromasten Regeneration zwischen 16.08 h und Zeitpunkten innerhalb dieser linearen Phase sollte verwendet werden, um quantitativ zu vergleichen Kontrolle und Versuchsgruppen werden.

Neuromasten Toxizität bei längerer Exposition zu Fluoreszenzfärbung Farbstoffe induziert.

Nach unserer Einschätzung ein idealer Weg, um diese Experimente durchführen würde, um die Fische mit dem Fluoreszenzfarbstoff vor der Behandlung, Flecken wieder bei 0 h Fleck Fleck dann wieder eint Regenerationszeitpunkten. Jedoch stießen wir eine Komplikation dieser Untersuchungen, die die Tatsache, daß der Haarzellen Fluoreszenzfärbungsfarbstoffe wie 4-Di-2-Asp, wie auch bei anderen Mitochondrien-Flecken ²² können eine toxische Wirkung auf Haarzellen ²³ sein wird. Diese Tatsache mussten wir verschiedene Fischgruppen, da wiederholt Färbung der gleiche Fisch konnte nicht verwendet werden, zu verwenden. In allen Fällen wurden parallel die experimentelle Fischen, einschließlich Kontrollen behandelt, um experimentelle Variabilität zu beseitigen.

Die konfokale Analyse auf der Ebene der einzelnen Haarzellen.

Wenn die bei der Neuromasten Analyse erhaltenen Ergebnisse sind statistisch nicht signifikant zwischen der Kontroll-und Versuchsgruppen kann man diese Untersuchungen auf der Ebene der einzelnen Hagelzellen erstrecken, um eine höhere Auflösung für quantitative Vergleiche zu erhalten. Wie in Fig. 4 angedeutet, Neuromasten aus einer Kontrollgruppe (eineMast 12 h Regeneration ist in dieser Figur dargestellt) kann durch konfokale Mikroskopie von Hautpräparaten von der Mitte des Körperbereichs betrachtet werden. Um 8 h, 10 h und 12 h Regenerationszeit, fanden wir, dass Kontrollgruppen (7 Tiere / Gruppe) hatte eine Reichweite von 0-4 Haarzellen / Neuromasten. Wie bei der Kontrollgruppe erwartet, wenn quantitativ analysiert, kein statistischer Unterschied zwischen Neuromasten in Bezug auf die Anzahl von Haarzellen pro Neuromasten bei den oben angegebenen (P-Werte von 0,230 bis 0,472 lag) Zeitpunkten erfasst. Ein solches Konzept kann zwischen einer Steuerung und Experiment-Gruppe bei Bedarf zu erweitern oder zu bestätigen, die von der ersten Phase der Neuromasten Studien gewonnenen Daten berücksichtigt werden.

Abbildung 4. Analyse der Haarzelle / Neuromasten Regeneration mit Vorbereitung der Haut des definierten Seitenlinie Region beschrieben in Protokollschritt 3.3. Fluorescent konfokales Bild von Haarzellen innerhalb eines Neuromasten von einer Zebrafisch-Vorbereitung der Haut erhalten. Zwei Vitalfarbstoff gefärbten Haarzellen sind in einem Neuromasten eines Steuer Fisch (Abbildung 4). Dieses Bild wurde 12 Stunden nach der Entfernung von Gentamicin (linear Regenerationsphase) erhalten. Der weiße Klammersymbol () zeigt einen einzelnen Neuromasten während der weiße Pfeil zeigt eine tragende Zelle rund um die Haarzellen. Stützzellen nicht unter diesen Bedingungen zu färben und als schwarze Bereiche angezeigt. Vergrößerung, 60X.

1	1. Gentamicin-Behandlung [0,004% (4,32 mM)] der Kontroll-und Versuchsfische für 24 Stunden bei 28 ° C unter Verwendung eines Inkubators.
2	2. Auswaschen von Gentamicin, um die Regeneration von Haarzellen zu initiieren. Zurück zu der Fisch 28 ° C Inkubator für Ermittler ausgewählten Zeiträumen zwischen 8-16 Stunden.
2	3. Vital Farbschleier [0,08% 4-4-Diethylaminostyryl-N-methylpyridiniumiodid (4-Di-2-Asp)] Kontroll-und Versuchsfische für 1 h bei Raumtemperatur und anschließend auswaschen Fleck mit Fisch Wasser für Fluoreszenz-Bildgebung.
1 oder 2	4. Falls notwendig, da nicht signifikante Ergebnisse aus der Analyse der Neuromasten, wiederholen Protokolle 3.1 mit einer separaten Gruppe von Kontroll-und Versuchs Fisch, aber dann einen Hautpräparation für die konfokale Analyse einzelner Haarzellen.

Tabelle 1. Eine Zusammenfassung des oben beschriebenen Protokolls.

Discussion

Basierend auf den umfangreichen Bestand an Literatur, die für die Analyse der Seitenlinie (LL) Regeneration in embryonalen und larvalen Zebrafisch ^8,24,25 festgestellt wurde, das Ziel unserer Studie war es, einen quantitativen Test zur Seitenlinie Regeneration im Zebrafisch zu entwickeln, könnte Krankheitsmodelle, die am besten in der erwachsenen Fische untersucht werden angewendet werden. Wir haben festgestellt, dass bestimmte kritische Punkte sind wichtig, wenn Anwendung von Verfahren für die embryonale / Fischlarven entwickelt, um der erwachsenen Fische. Die wichtigste dieser Punkte angesehen: 1) die Anzahl der Seitenlinie Neuromasten entlang der Längsachse des Fisches, 2) die Dauer der Färbung von Neuromasten Haarzellen, 3) die Konzentration und die Dauer der Behandlung der Aminoglykosid und 4) der Zeitpunkt der Seitenlinie Regeneration nach Aminoglykosid-Behandlung. Diese Punkte werden in der folgenden Beschreibung behandelt werden.

In Bezug auf die Anzahl der Neuromasten entlang der Seitenlinie des Zebrafisches, Embryonalen und Zebrafisch-Larven haben den entscheidenden Vorteil, dass die Neuromasten haben ein einfaches Muster aufgrund ihrer geringeren Zahl innerhalb eines bestimmten Stich im Vergleich zu erwachsenen Fischen. Diese niedrige Zahl hat es die Ermittler, um jeden Neuromasten eindeutig identifizieren und vergeben Sie einen Namen, um es ^sechs. Auf diese Weise kann die Regeneration Studien das Wiedererscheinen eines bestimmten Neuromasten von Namen jederzeit zu quantifizieren folgenden Rückzug aus einem Aminoglykosid Mittel. Die größere Anzahl von Neuromasten pro Stich in der Erwachsenen führt wesentliche Schwierigkeit bei der genauen Zählen und Quantifizierung während der Wiedererscheinen der Regeneration Neuromasten im Vergleich zu der von Embryonen oder Larven. Wie gezeigt, untersuchten wir das Muster der Seitenlinie Neuromasten in Maschen der Erwachsenen-und festgestellt, dass die Körpermitte (Figures. 1 und 2), sofern die optimale Region der Stiche für die Analyse.

Färbung von Neuromasten mit Haarzellen-Farbstoffe, wie 2 - [4 - (Dimethylamino) styryl]-N-ethylpyridiTausends Iodid (DASPEI) oder 4-Di-2-Asp erlaubt es, Neuromasten von der Seitenlinie mit Fluoreszenzstereomikroskopie ^26,27 in Larven-und Jungfisch visualisieren. Diese gleichen Flecken sind auch wirksam bei der erwachsenen Fisch und quantitativen Analyse zeigte, daß kein signifikanter Unterschied in der Anzahl der Neuromasten im mittleren Körperbereich wurde unter normalen Kontrollzebrafisch (mit einem Durchschnitt von 61,45 Neuromasten in normalen Kontroll erwachsenen Fisch) beobachtet.

Es ist berichtet worden, daß Haarzelle Farbstoffe wie 2 - [4 - (Dimethylamino) styryl]-N-Ethylpyridinium-iodid (DASPEI) oder 4-Di-2-Asp können selbst toxisch für Zellen Neuromasten ²⁴ ist, und Fisch nicht wiederholt werden gefärbt mit diesen Fluoreszenzmittel, wenn man zu Aminoglykosid-induzierte Regeneration zu überwachen. Wiederholte Färbung der gleiche Fisch stellt mehrere Toxizität Ereignisse (sowohl vom Fleck und der Aminoglykosid), dass das Experiment nicht-interpretierbaren ²³ macht. Dementsprechend wurden alle Experimentein unserer Studie erforderlich parallel 4-Di-2-Asp-Färbung von mehreren Sätzen von Fisch, um zu zeigen, dass Neuromasten waren 1) in der unbehandelten Kontrolle Gentamicin Zustand vorliegt, 2) vollständig unmittelbar nach Gentamicin-Exposition abgetragen, und 3) Regeneration auf einige Stunde nach Gentamicin-Behandlung nach Absetzen und Waschen aus dieser Aminoglykosid. Auf diese Weise wurden alle Fische nur einmal mit dem Neuromasten Farbstoff gefärbt.

Es sollte darauf hingewiesen werden, dass, während die Verfahren von Van Trump et al. ^17. die Voraussetzungen für die Haarzelle Ablation in der erwachsenen Fische zu etablieren, haben sie nicht eine Standardkurve für Neuromasten, die für die Regeneration quantitativen Vergleich zwischen Kontroll-und Versuchsgruppen erforderlich ist, zu etablieren. Wir haben daher die Verfahren, gefolgt von Van Trump et al. Für ¹⁷ Haarzelle Ablation (Gentamicin-Konzentration von 0,004% mit einem 24-Stunden Belichtungszeit, siehe Abbildung 2 für die Haarzell Ablation Ergebnisse bei 24hr), sondern erweitert ihre Arbeit, um eine Standardkurve von Neuromasten Regeneration zu etablieren. Dies ermöglicht eine vergleichende Analyse der LL Regeneration im erwachsenen Zebrafisch mit den vier Maschen des mittleren Körperbereich, die wir für unsere Testbedingungen festgelegt (siehe 1 und 2). Um festzustellen, ob eine kürzere Frist für die Haarzell Ablation erzielt werden konnten, testeten wir auch die Wirkung von Kupfersulfat, die effektiv in Fischlarven für Zeiten so kurz wie 2 Stunden verwendet wurde. Unsere Studien zeigten, dass Kupfersulfat (5-50 mM für verschiedene Belichtungszeiten bis zu 48 Stunden, wie zuvor von Liang et al. ²¹ Larven berichtet) nicht als wirksam bei erwachsenen Fischen als Mittel zur Haarzelle Ablation sein. Dies unterstreicht die Tatsache, dass die Bedingungen für die Ablation von Haarzellen in Embryonen und Larven verwendet werden können, nicht immer direkt für den Einsatz mit der erwachsenen Fische übertragen werden.

Wie in Bezug auf die SeitenlinieRegeneration im adulten, fanden wir ähnliche Zeitrahmen für die Regeneration des Neuromasten zwischen der von Embryo / Larven und ausgewachsene Fische. Wie bereits von anderen, Zebrafisch-Embryonen und Larven zeigen Neuromasten Regeneration bei 12 bis 24 Stunden nach der Aminoglykoside berichtet ^Wash-out-8. Wir beobachteten die lineare Phase der Regeneration in der Neuromasten 8-12 Zeitrahmen (nicht als volle Stiche für die 8 Stunden Zeitpunkt gesehen, wie in Abbildung 2 dargestellt) erscheint mit einer Hochebene bei 16 HPG erreicht. Vollständige Kontrolle Aussehen der Neuromasten in Maschen wurde erst 24 HPG beobachtet wie für Embryonen und Larven gemeldet. Vollständige Kontrolle Aussehen bezeichnet sowohl die Anzahl und Intensität der Neuromasten in allen vier Maschen der Mitte der Körperbereich bei erwachsenen Zebrafisch. Außerdem, wenn die auf der Ebene der Neuromasten erhaltenen quantitativen Ergebnisse sind statistisch nicht signifikant, die Ermittler können ihr Studium auf der Ebene der einzelnen Haarzellen innerhalb der Neuromasten erweiternmit Hilfe der konfokalen Mikroskopie durch unsere Verfahren beschrieben.

Die in diesem Artikel beschriebenen Neuromasten / Haarzellregeneration Test kann zu Krankheitszuständen, die am besten in der erwachsenen Zebrafisch manifestieren als in den frühen Larven / embryonalen Stadien angewendet werden. Eine Einschränkung des Tests betrifft den Einfluss der experimentellen Bedingungen, ob es 1) die transgene Sorte, die einen bestimmten Krankheitszustand oder 2) eine pharmakologisch induzierte Krankheitszustand] auf Stammzellen innerhalb des Seitenliniensystem von erwachsenen Zebrafisch imitiert werden. In dieser Hinsicht eine besondere Krankheitszustand des erwachsenen Zebrafisch oder nicht beeinflussen Stammzellen der Haarzelllinie, und es ist wichtig zu beachten, dass Neuromasten Regeneration ist völlig abhängig von diesen Stammzellproliferation / Differenzierung verarbeitet ^8,24,25 .

Als ein Beispiel für diese Einschränkung, werden wir Experimente an einem erwachsenen Zebrafischmodell von Diabetes Typ I beschrieben durchgeführt. Diese particular Krankheitsmodell wurde im erwachsenen Zebrafisch, um die langfristige Sekundär Komplikation durch Hyperglykämie induzierte studieren ²⁸ entwickelt. Für eine Anzahl von zuvor ^28,29 beschriebenen Gründen kann diese Studien nur unter Verwendung von erwachsenen Zebrafisch ist. Da peripheren Nerven zusammen mit den spezialisierten Zellstrukturen innervieren sie nachteilig bei Patienten mit Diabetes betroffen sind, wollten wir feststellen, ob Seitenlinie Regeneration von Neuromasten / Haarzellen wurde auch in diabetischen Zebrafisch beeinträchtigt. Mit der Seitenlinie Regeneration Test keine statistisch signifikante Verzögerung wurde in Neuromasten Regeneration nachgewiesen. Um diesen negativen Befund zu bestätigen, wurden die Experimente an der verfeinerten Ebene der einzelnen Haarzelle wiederholt. Wiederum wurde kein statistisch signifikanter Unterschied in der Haarzellregenerations zwischen Kontroll-und diabetischen Gruppen beobachtet. Daher waren die Daten nicht mit der Vermutung, dass Hyperglykämie beeinträchtigt Neuromasten / Haarzellregeneration; possibly aufgrund des Widerstandes von Stammzellen der Haarzelllinie zu hyperglykämischen Bedingungen. Mit dieser Einschränkung im Hinterkopf, die in diesem Artikel beschriebenen Neuromasten / Haarzellregeneration Test macht ein Mittel, um zu testen, ob eine bestimmte Krankheit erwachsenen Zebrafisch-Modell beinhaltet Funktionsstörung in der Haarzelle regenerative Verfahren mit dem Seitenliniensystem überwacht. Positive Ergebnisse würden Stammzellen Beteiligung bedeuten, und weitere Studien wäre daher gerechtfertigt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml)	Sigma Aldrich	G1397
2 Phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol	Aldrich	D-3418	485 nm excitation λ and 603 nm emission λ
6-well Plates	Mid Sci	TP92006
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
Glass Bottom Microwell Dishes	Matek Corporation	P35G-1.5-14-C
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting  Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
ImageJ software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.
Confocal microscope	Olympus	FV10i	Any high resolution fluorescent microscope is suitable
Aquatic System	KG Aquatics ZFS Rack System		Any aquatic system can be used