Summary
מכיוון שרבי דגמי דג הזברה של מחלות נוירולוגיות ושאינן נוירולוגיות נלמדים בדגים הבוגרים ולא את העובר / זחלים, פיתחנו assay כמותיים לרוחב שורת משובי שניתן ליישם מודלים מחלה דג הזברה מבוגרים. Assay מעורב רזולוציה בneuromast 1) ו 2) רמות תא שיער בודד.
Abstract
בשל החשיבות הקלינית של שמיעה והפרעות במאזן באדם, אורגניזמים מודל כגון דג הזברה היו בשימוש ללמוד פיתוח קו לרוחב והתחדשות. דג הזברה היא אטרקטיבי במיוחד עבור מחקרים כאלה, כי הזמן המהיר שלה לפיתוח ויכולת ההתחדשות הגבוהה שלה. עד כה, מחקרי דג הזברה של התחדשות קו לרוחב יש בעיקר מנוצלים דגים של השלבים העובריים וזחל בגלל המספר נמוך יותר של neuromasts בשלבים אלה. זה הפך את ניתוח הכמותי של קו התחדשות / או פיתוח וקל יותר בשלבי ההתפתחות המוקדמים יותר לרוחב. מכיוון שרבי דגמי דג הזברה של מחלות נוירולוגיות ושאינן נוירולוגיות נלמדים בדגים הבוגרים ולא בעובר / הזחלים, אנו מתמקדים בפיתוח assay משובי קו לרוחב כמוני בדג זברה מבוגר, כך שassay היה זמין שיכול להיות מיושם על נוכחית מודלים מחלה דג הזברה מבוגרים. בונה על מחקרים קודמים על ידי ואן מוסטרוםעמ ואח'. 17 שתוארו נהלים לאבלציה של תאי שיער בדגים בוגרים מקסיקנים עיוורים המערה ודג זברה (Danio rerio), assay שלנו נועד לאפשר השוואת כמותית בין שליטה וקבוצות ניסוי. הדבר זה הושג על ידי פיתוח עקומת סטנדרט neuromast משובי המבוססת על אחוזים מהופעתו neuromast על פני תקופה זמן 24 שעות הבאות נמק המושרה גנטמיצין של תאי שיער באזור מוגדר של קו הרוחב. Assay נועד גם כדי לאפשר הרחבה של הניתוח לרמת התא הבודד שיער כאשר רמה גבוהה יותר של רזולוציה נדרשת.
Introduction
הקו לרוחב המערכת (LL) הוא איבר mechanosensory נמצא בשני דגים ודו חיים, כי הוא אחראי לשמיעה, שיווי משקל, rheotaxis והתנהגויות מתווכות כגון השכלה והימנעות טורף 1-5. הוא מורכב מהאשכולות של תאי שיער מוקפים בתאים תומכים, אשר שניהם ממוקמים במבנים הנקראים neuromasts 6. neuromasts אלה מאורגנים בדרך כלל בקווים אנכיים (שנקרא תפרים) לאורך ציר האורך של הגוף והזנב עם כמה תפרים אופקיים נצפו בראש של הדג. במבוגרים, neuromasts הם גדול יותר באופן משמעותי במספר בתוך התפרים, בהשוואה לדגים עובריים או זחל 6. מחקרים ביו בדג הזברה התמקדו בהשפעה של טיפול אנטיביוטי, טראומה כתוצאה מרעש, זיהום כרוני, וכו '. בתאי שיער 7,8 בניסיון להבין טוב יותר את ההשפעות שלהם בבני אדם.
שלא כמו רוב בעלי חוליות, teleosts, כגון דג הזברה (Danio rerio), יש את היכולת לחדש את תאי שיער שאבדו. דג הזברה הן שימושי במיוחד משום שזמנם לפיתוח המהיר ויכולת התחדשות גבוהה. עד כה, עם זאת; מחקרי דג הזברה בפיתוח קו לרוחב ו / או התחדשות שבעיקר ניצלו את הדגים בשלב העובריים וזחל בשל המספר המופחת של neuromasts קו לרוחב המאפשר לספירה קלה ו6,9,10 ניתוח.
עם זאת, כפי שרבי דגמי דג הזברה של מחלות נוירולוגיות ושאינן נוירולוגיות 11-16 נלמדים בדגים הבוגרים ולא הזחלים, אנו מתמקדים בפיתוח assay קו לרוחב משובי בדג זברה מבוגר באמצעות גנטמיצין (aminoglycoside השתמש בעבר בזחלי דג הזברה ו משמש יותר לאחרונה עם דגים בוגרים 17) כך שassay היה זמין שיכול להיות מיושם על מודלים מחלה הנוכחיים למבוגרים דג הזברה. אמנם פורסם בעבר על ידי נהלים ואן טראמפ דוארt אל. 17 הקימו את התנאים לאבלציה של תאי שיער בדגים הבוגרים, הם לא הקימו עקומת סטנדרט להתחדשות neuromast אשר נדרש להשוואת כמותית בין שליטה וקבוצות ניסוי כגון בעת שימוש בקווי דג הזברה מהונדסים או מצבי מחלה פרמקולוגית-induced בדג הזברה 18. לפיכך, אנו פעלנו בהתאם להליכים של ואן טראמפ et al. 17 לאבלציה של תאי שיער, אך בנויים על העבודה שלהם להקים עקומת סטנדרט של התחדשות neuromast כדי לאפשר לחוקרים להשתמש בנתונים שלנו כאשר משווים שליטה וקבוצות ניסוי כגון עם מודלים מחלה דג הזברה מבוגרים . Assay נועד גם כדי לאפשר הרחבה של הניתוח לתא השיער הבודד, כאשר ברמה גבוהה יותר של רזולוציה נדרשת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים מתבצעים בעקבות ההנחיות מתוארות ב" עקרונות של מעבדה טיפול בבעלי חיים "(המכונים הלאומיים לבריאות אין פרסום. 85-23, מתוקן 1985) ופרוטוקול ועדת בעלי החיים מוסדי טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת פרנקלין רוזלינד אושר 08-19.
1. גנטמיצין אינדוקציה של נימק תא שיער
- הכן סולפט גנטמיצין במלח רגיל בריכוז סופי של 0.004% (4.32 מ"מ).
- הנח דגים בוגרים (ד rerio, 4-6 חודשים של גיל) במכל המכיל את 0.004% (4.32 מ"מ) פתרון גנטמיצין. ניתן להשתמש בכל מיכל, אבל אנחנו משתמשים במכל דגים ממערכת Aquatic Pharmacal שהיא 7 ברחב, 6 בגבוהים, ו -7 בארוכים. מניחים את המכל עם דגים בחממה נקבעה על C ° 28 ל24 שעות. הגדר את הנפח הכולל של נוזל במכל ברמה מספיק כדי לשמור על דגים במדינה בת קיימא לתקופה hr 24. הערה: אוורור של נוזל גנטמיצין אינו necessary אם נפח מספיק משמש למספר הדגים שטופלו.
2. מכתים חיוני של תאי שיער
- הכן ריכוז 0.08% (במלח רגיל) של הצבע החיוני הניאון [יודיד 4-4 diethylaminostyryl-)-N-methylpyridinium (λ עירור 485 ננומטר ו603 λ פליטת ננומטר במתנול) מפתרון מניות חוזרת בסך של 15 מ"ג / מיליליטר באתנול.
- כדי לקבוע אם הטיפול היה יעיל גנטמיצין משנה של שליטה וגנטמיצין דגים טופלו מוכתמים מייד על ידי הצבת דגים בבאר של צלחת תרבות גם 6 המכילה את הצבע החיוני. השתמש במספר מספק של דגים (וצלחות תרבות כפי שנדרש למובהקות סטטיסטיות להיות מושגת. בהתבסס על מהירותו של הבוחן של ספירת neuromast, הנח את הדגים בצלחות באופן מדורג על פני זמן ולכן הדגים שאינם מוכתמים עבור מעל 75 דקות כמתואר בשלב 2.3.
- מקם את הצלחות מהשלב 2.2 במגירת ספסל על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדילשמש לבחינת neuromasts המוכתמת. כבה את האורות בחדר, כדי למנוע מרווה של הצבע החיוני על פני התקופה מכתים 1 שעות בטמפרטורת חדר.
- הכן שני לצבוע לשטוף החוצה ומיכלי מים הרדמה. מים לשטוף החוצה דאי הוא מים דגים רגילים ולמי הרדמה, להוסיף 2-phenoxyethanol מספיק כך שדילול 1:1,000 במי דגים רגילים מושגת.
- הנח דג במי דגים רגילים עודפים לשטוף חיוני לצבוע עודף והמשך לשלב 3.1 לתצפית של דגי צבע מוכתם חיוניים.
- כדי לבחון התחדשות של neuromasts, להעביר דגים שטופלו גנטמיצין שנשטפו במי דגים רגילים לחממה לבין 8-16 שעות ב28 ° C.
- בזמנים שונים בין 8-16 שעה, דגים יוסרו מן החממה, שטפו ומוכתם, כמצוין בצעדים 2.1-2.4. המשך לשלב 3.1 לתצפית של דגי צבע מוכתם חיוניים.
3. הרדמת דגים וספירה של פלורסנט Neuromasts
- מניחים את המכסה על הבמה של מיקרוסקופ סטריאו ניאון כדי לקבל תמונה דיגיטלית של neuromasts המוכתם הצבע החיוני של התפרים גוף הבינוניים.
- שימוש במצלמה דיגיטלית מונחת על מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו להגדיר הגדלה של 2X ללכוד תמונות לניתוח כמותי שלאחר מכן. הערה: הגדרת ההגדלה של מיקרוסקופ סטריאו יכולה להיות תלויה במותג של מיקרוסקופ המשמש, אבל ההגדרה צריכה לאפשר צפייה נוחה וספירה של neuromasts הבודד בתוך התפרים הגוף בינוני.
- לקבוע את הסכום של התחדשות על ידי ספירת מספר neuromasts הגלוי בתוך ארבעה התפרים מיועדים בצד התחתון ביותר הגחון של הדג רק הפרוקסימלי לסנפיר החזה הימני (ראה תרשים 1). לניתוח סטטיסטי להשתמש בדיקה מתאימה כגון o אנובהr T-הבדיקה של הסטודנט. ניסויים צריכים לנצל מינימום של 5 דגים לכל נקודת זמן ויש לחזור על כל הניסויים מינימליים של פי 3.
- בהתבסס על עקומת זמן התחדשות neuromast (ראה איור 3), לספור neuromasts בין 8-16 ההודעה hr גנטמיצין לשטוף החוצה כדי להיות במסגרת השלב ליניארי של עקומת ההתחדשות. שים לב: השימוש בשלב הזמן ליניארי מאפשר ניתוח כמוני ראוי בין השליטה וקבוצות ניסוי.
4. ספירת פלורסנט של תאים בודדים שיער לקבלת רזולוציה גבוהה יותר של ניתוח כמותי אם ניתוח Neuromast אינו מובהק סטטיסטי
- אם הניתוח כמוני ברמה של neuromasts אינו משמעותי, ניתוח ברמה של תא שיער האדם יכול גם להיות מנוצל כדי להשיג רמה גבוהה יותר של רזולוציה. בחרו דגים בהודעה גנטמיצין נקודת זמן מסוים, צבע חיוני לשטוף החוצה (נקודת זמן המבוסס על מחקרי neuromast קודם לכן) stעין הדג כפי שמתואר בפרוטוקול 2, ולאחר מכן להרדים את הדגים באמצעות 2-phenoxyethanol בדילול 1:500 ל1-5 דקות.
- באור עמום כדי למנוע מרווה, לעשות ארבעה חתכים כך שהכנת דש עור מרובעת מורכבת כדלקמן. עושה חתך לאורך הצלעות העליונות של הדג עד שהוא מיושר עם הסנפירים אנאליים, ואז עושה חתך לרוחב הבטן, ובסופו, לעשות שני חתכים אנכיים בכל צד של החתכים האלה כל כך את יריעת העור המרובע שנוצרה. הערה: הכנת עור זה תהיה לשלב את התפרים גוף האמצע משמשים בניסויים neuromast.
- הנח את דגימת העור בשקופית זכוכית ולאחר מכן במקום להחליק כיסוי זכוכית עגול מעל הדגימה העור נכרת כדי לעזור עוגן ולשטח את הרקמה להדמיה דיגיטלית שלאחר מכן.
- שימוש בדגימות העור משלב 4.3, להשיג תמונות דיגיטליות של תאי השיער בתוך כל neuromast של התפרים גוף הבינוניים. קח את התמונות בהגדלה של לפחות 60x ולאחר מכן לספור את הספירה השיערLLS בתוך neuromasts פרט לניתוח כמוני השוואתי של השליטה וקבוצות ניסוי (ראה איור 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אופטימיזציה של התהליכים לכימות התחדשות neuromast של קו הרוחב בדג זברה מבוגר.
Neuromasts של דג הזברה זחל הוא לכימות; לעומת זאת, בקו הרוחב של דג הזברה המבוגר יש מספר גדול הרבה יותר של neuromasts לתפר ביצוע ניתוחים כמותיים קשים 6,17,19,20 יותר. כפי שניתן לראות באיור 1 א ', יש לו את הראש מספר גבוה יותר באופן משמעותי של neuromasts בהשוואה לשני באמצע הקטע או זנב; עם אזור הזנב שיש את המספר הנמוך ביותר של neuromasts כפי שמוצג באיור 1D. מכיוון שהדפוס של תפרים בראשו הוא מורכב וגדול יותר באופן משמעותי במספר neuromasts, זה לא להשאיל את עצמה כאזור לניתוח כמוני. בנוסף, ללא קשר לריכוז גנטמיצין שבדקנו, אבלציה המלאה של neuromasts לאורך כל הראש הייתה רק לעתים נדירות להשגה; כתמים משאירים של neuromasts נצפו לאחר טיפול גנטמיצין כפי שדווחו בעבר על ידי ואן טראמפ et al. 17 לעומת זאת, יש לו את הזנב מעט מדי neuromasts, ובתור שכזה, בחרנו באזור אמצע הגוף (איור 1) לנתח כמותית התחדשות neuromast במבוגרים. באזור זה, זיהינו ארבעה תפרים רק אחוריים לסנפיר חזה לרוחב שהיו עקביים במספר neuromast בין כל המבוגרים [61.45 (n = 95)] (האיורים 1B ו 1E). חשוב לציין, שהצלחנו באופן עקבי ובאופן מוחלט לכרות neuromasts של אזור זה על ידי טיפול בגנטמיצין 0.004% 24 שעות (כפי שדווח בעבר באן טראמפ et al. 17) המאפשר קביעה מדויקת הבאה של התחדשות neuromast (השווה איורים 1B ו 1E ומשובץ איור 2, 0 שעות).
"Width =" p_upload/51343/51343fig1highres.jpg 500 "/>
איור 1. דפוס הניאון של neuromast בתוך תפרים של דג הזברה המבוגר מוצג לאורך ציר האורך. לוח הוא אזור הראש, לוח ב 'הוא אזור אמצע הגוף עם התפרים ארבעה המשמשים לניתוח כמו שמתואר בקופסה. לוח C הוא האזור האחורי של הגוף. לוח D הוא אזור סנפיר הזנב. ההגדלה גבוהה יותר של 4 התפרים של אזור אמצע הגוף המשמש לניתוח הכמותי מוצגת בלוח E. הגדלה כוחה של 1X ו2X.
זה כבר דווח כי טיפול נחושת גופרתי הוא שיטה כימית יעילה כדי לגרום לנימק מהיר של תאי שיער בעוברים וזחלים 21. כאן בדקנו טיפול נחושת גופרתי בתקווה שזה עלול לקצר את הזמן כדי לגרום לאבלציה neuromast. ריכוזי נחושת גופרתי החל5-50 מ"מ לזמני חשיפה שונים עד 48 שעות נוצלו כפי שדווח בעבר על ידי ליאנג et al. 21 נמצא כי נחושת גופרתית היה קטלנית בריכוזים גבוהים יותר, ולא יעיל בריכוזים נמוכים יותר בדגים בוגרים (מידע לא מוצג) . אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
פרמטרים המשמשים לניתוח ניאון של התחדשות קו לרוחב בדג זברה מבוגר.
התחדשות הייתה פיקוח אחרי הכל neuromasts בתוך ארבעה התפרים באמצע הגוף היה ablated הבא 24 שעות גנטמיצין טיפול (איור 2, להשוות 0 שעות עם שליטה) והתחדשות חיובית נקבעה על ידי הופעתו של מינימום של שלוש neuromasts בתוך תפר. (איור 2, 0 שעות). ב -8 HPG, כשליש מהדגים היה איזה סימן של התאוששות (n = 34); למרות עוצמת neuromasts הייתה קלושה בתפרי ההתחדשות (איור 2, 8 שעות, תפרים קלושים שהותוו על ידי תיבות). מספר neuromasts והעוצמה שלהם המשיכו לעלות בצורה לינארית עד ההתחדשות הגיעה לרמה ב16 HPG (השווה איור 2, 16 שעות עם איור 2, 8 שעות). זה לא היה עד לפחות 24 HPG שכל הדגים שטופלו בגנטמיצין התאוששו באופן מלא עם שני מספרים שווים ועוצמות של neuromasts בתוך התפרים קו לרוחב בהשוואה לקבוצת ביקורת (איור 2, 24hr). קו זמן להתחדשות neuromast לאחר נסיגת גנטמיצין מוצג באיור 3 המציג את השלבים ליניארי ורמה של עקומת ההתאוששות. נציין, כי בפחות מ -5% מהמקרים, התפרים ההתחדשות לא הופיעו כישויות נפרדות, אבל במקום הופיעו ככתם של הקרינה.
איור 3. גרף המציג את המהלך של התחדשות neuromasts הזמן לאחר נסיגה מטיפול שעות 24 של דג הזברה מבוגר עם גנטמיצין 0.004%. כפי שניתן לראות, התאוששות מתחילה בנקודת הזמן 8 HPG והגיעה לרמה בנקודת הזמן 16 HPG. זה הגדיר את שלב האונייה של התחדשות neuromast בין 8-16 נקודות שעות וזמן בתוך שלב ליניארי זה אמור לשמש להשוואת כמותית קבוצות ביקורת וניסוי.
רעילות Neuromast היא מושרה על ידי חשיפה ממושכת לצבעים מכתים ניאון.
להערכתנו דרך אידיאלית לבצע ניסויים אלה תהיה להכתים את הדגים עם צבע פלואורסצנטי לפני טיפול, כתם שוב ב0 שעות לאחר מכן להכתים שובנקודות זמן התחדשות t. עם זאת, נתקלנו בסיבוך למחקרים הללו שהוא העובדה שצבעי שיער תא ניאון מכתים כגון 4-Di-2-ASP, כפי שיכולים להיות גם במקרה של כתמי המיטוכונדריה אחרים 22 יכולים להיות רעיל להשפיע על תאי שיער 23. עובדה זו חייבה אותנו להשתמש בקבוצות נפרדות של דגים מאז צביעה חוזרת ונשנית של אותו הדג לא יכול להיות מועסק. בכל המקרים טופלו הדגים הניסיוניים כוללים בקרות במקביל לחסל את השונות ניסוייות.
ניתוח confocal ברמה של תאי שיער בודדים.
אם התוצאות שהתקבלו מניתוח neuromast אינן משמעותיות מבחינה סטטיסטית בין קבוצות ניסוי והביקורת, ניתן להרחיב את הלימודים האלה לרמה של התאים הבודדים ברד כדי להשיג רמה גבוהה יותר של רזולוציה להשוואות כמותיות. כפי שצוין באיור 4, neuromasts מקבוצת ביקורת (ניתן לצפות Euromast ב12 שעות של התחדשות מוצג באיור זה) על ידי מיקרוסקופיה confocal של תכשירי עור מאזור הגוף באמצע. בשעת 8 שעות, 10 שעה, ו12 שעות של זמן התחדשות, מצאנו כי קבוצות שליטה (7 חיות / קבוצה) היו לי טווח של 0-4 תאים / neuromast שיער. כצפוי לקבוצות ביקורת, כאשר ניתח כמותית, אין הבדל סטטיסטי בין neuromasts זוהה במונחים של מספר תאי שיער לneuromast בנקודות הזמן שצוינו לעיל (ערכי P נעו .230-0.472). גישה כזו עשויה להילקח בין כל קבוצת ביקורת וניסוי בעת הצורך להרחיב או לאשר את הנתונים המתקבלים בשלב הראשון של מחקרי neuromast.
איור 4. ניתוח של התחדשות התאים / neuromast שיער באמצעות תכשירי עור באזור הקו לרוחב המוגדר תאר iצעד פרוטוקול n 3.3. תמונת confocal פלורסנט של תאי שיער בתוך neuromast מתקבל מהכנת עור דג הזברה. שני תאי שיער חיוניים צבע מוכתמים מוצגים בתוך neuromast של דגי שליטה (איור 4). תמונה זו מתקבלת 12 שעות שלאחר הסרת גנטמיצין (שלב התחדשות ליניארי). סמל הסוגר הלבן () מציין neuromast פרט תוך החץ הלבן מצביע על תא תמיכה המקיף את תאי שיער. תאי תמיכה לא ללכלך בתנאים אלה ויופיעו כחללים שחורים. הגדלה, 60x.
| 1 | 1. טיפול גנטמיצין [0.004% (4.32 מ"מ)] שליטה ודגים ניסיוניים ל24 שעות ב28 מעלות צלזיוס באמצעות חממה. |
| 2 | 2. שטוף מתוך גנטמיצין ליזום התחדשות של תאי שיער. להחזיר דגים לחממת 28 מעלות צלזיוס במשך תקופות זמן שנבחרו חוקר בין 8-16 לשעה. |
| 2 | [יודיד 4-4-diethylaminostyryl-N-methylpyridinium 0.08% (4-Di-2-ASP)] 3. כתם צבע ויטל שליטה ודגים ניסיוניים במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר ולאחר מכן לשטוף את הכתם עם מים דגים לדימות פלואורסצנטי. |
| 1 או 2 | 4. אם יש צורך בשל תוצאות לא משמעותיים מניתוח של neuromasts, חזור פרוטוקולי 1-3 עם קבוצה נפרדת של שליטה ודגים ניסיוניים, אבל אז לקבל הכנת עור לניתוח confocal של תאי שיער בודדים. |
טבלת 1. סיכום של הפרוטוקול שתואר לעיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בהתבסס על ההיקף הנרחב של ספרות שכבר נקבעה לניתוח של קו לרוחב התחדשות (LL) בדג זברה עוברית וזחל 8,24,25, מטרת המחקר שלנו הייתה לפתח assay כמותיים להתחדשות קו לרוחב בדג זברה שיכל להיות מיושם על מודלים מחלה, כי הם למדו הטובים ביותר בדגים הבוגרים. מצאנו כי נקודות קריטיות מסוימות הן חשובות בעת יישום נהלים שפותחו עבור דגי זחל / עובריים לדגים הבוגרים. החשוב ביותר של נקודות אלה נחשבים: 1) מספר הקו לרוחב neuromasts לאורך ציר האורך של הדג, 2) את משך הזמן של צביעת תאי שיער neuromast, 3) הריכוז ומשך הטיפול בaminoglycoside, ו -4) העיתוי של התחדשות קו לרוחב לאחר טיפול aminoglycoside. נקודות אלה תידוננה בדיון הבא.
בהקשר למספר neuromasts לאורך קו הרוחב של דג הזברהיש דג הזברה, עוברי וזחל היתרון המובהק שיש לי neuromasts דפוס פשוט בגלל המספר הנמוך שלהם בתוך תפר נתון בהשוואה לדגים בוגרים. מספר נמוך זה אפשר לחוקרים לזהות בבירור כל neuromast ולהקצות שם לזה 6. בדרך זו, מחקרי התחדשות יכולים לכמת את הופעתו של neuromast מסוים לפי שם בכל עת לאחר נסיגה מסוכן aminoglycoside. המספר גדול יותר של neuromasts לתפר במבוגר מציג קושי משמעותי בספירה וכימות מדויקים במהלך הופעתו המחודשת של התחדשות neuromasts בהשוואה לזה של עוברים או זחלים. כפי שניתן לראות, אנחנו הערכנו את הדפוס של neuromasts קו לרוחב בתוך תפרים של המבוגר וקבענו כי באמצע הגוף (1 Figures. ו2) סיפק את האזור האופטימלי של תפרים לניתוח.
הכתמה של neuromasts עם צבעי תאי שיער כגון 2 - [4 - (dimethylamino) styryl]-N-ethylpyridiיודיד nium (DASPEI) או 4-Di-2-ASP מאפשר לדמיין neuromasts של הקו לרוחב באמצעות stereomicroscopy ניאון 26,27 בדגי זחל ונוער. אלה אותם הכתמים הם גם יעילים בדגים הבוגרים והניתוח הכמותי שלנו הצביעו על כך שלא נמצא הבדל משמעותי במספר neuromasts בתוך אזור אמצע הגוף נצפה בקרב דג הזברה שליטה רגילה (עם ממוצע של 61.45 neuromasts בדגים בוגרים שליטה רגילות).
זה כבר דווח כי צבעי שיער תא כגון 2 - [4 - (dimethylamino) styryl] יודיד-N-ethylpyridinium (DASPEI) או 4-Di-2-ASP עצמם יכולים להיות רעילים לneuromast תאים 24, ודגים לא יכולים להיות שוב ושוב מוכתם עם סוכני הניאון האלה אם אחד הוא לפקח התחדשות-Induced aminoglycoside. צביעה חוזרת ונשנית של אותו הדג מציגה אירועי רעילות מרובים (על ידי שני הכתם וaminoglycoside) שעושה את הניסוי בלתי לפרש 23. בהתאם לכך, כל הניסוייםבמחקר שלנו מכתים 4-Di-2-ASP מקביל הנדרש מקבוצות מרובות של דגים על מנת להראות שneuromasts היה 1) נמצא במצב שליטת גנטמיצין nontreated, 2) מלוטש באופן מלא מייד לאחר חשיפת גנטמיצין, ו3) כדי ליצור מחדש בכמה הודעה השעה גנטמיצין טיפול לאחר נסיגה וכביסה מחוץ לaminoglycoside זה. בדרך זו, כל הדגים היו מוכתם רק פעם אחת עם צבע neuromast.
יש לציין, כי בעוד שהנהלים של ואן טראמפ et al. 17 לבסס את התנאים לאבלציה של תאי שיער בדגים הבוגרים, הם לא לקבוע עקומת סטנדרט להתחדשות neuromast אשר נדרש להשוואת כמותית בין שליטה וקבוצות ניסוי. לפיכך, אנו פעלנו בהתאם להליכים של ואן טראמפ et al. 17 לאבלציה של תאי שיער (ריכוז גנטמיצין של 0.004% באמצעות זמן חשיפה 24 שעות, ראה איור 2 לתוצאות אבלציה תא שיער ב24שעה), אבל הרחיבה את עבודתם להקים עקומת סטנדרט של התחדשות neuromast. זה מאפשר ניתוח השוואתי של התחדשות LL בדג הזברה המבוגר באמצעות ארבעה התפרים של אזור הגוף באמצע שהקמנו לתנאי assay שלנו (ראה איורים 1 ו -2). על מנת לקבוע אם ניתן הייתה להשיג לתקופה קצרה יותר לאבלציה תא שיער, אנחנו גם בדקנו את ההשפעה של נחושת גופרתית אשר שימוש בו ביעילות בדגי זחל לתקופות קצרות כמו שעה 2. המחקרים שלנו הראו שנחושת גופרתית (5-50 מ"מ לזמני חשיפה שונים עד 48 שעות כפי שדווחו בעבר על ידי ליאנג et al. 21 לזחלים) לא נמצאה כיעיל בדגים בוגרים כסוכן עבור אבלציה תא שיער. זה מדגיש את העובדה שתנאים המשמשים לאבלציה של תאי שיער בעוברים וזחלים לא תמיד יכולים להיות מועברים ישירות לשימוש עם הדגים הבוגרים.
הכנוגע לקו הרוחבהתחדשות במבוגרים, מצאנו טווחי זמן דומים להתחדשות של neuromasts בין זה של דגי עובר / זחל ומבוגר. כפי שדווח בעבר על ידי התחדשות neuromast מופע זחלים ועוברי דג הזברה, אחרים ב12-24 לאחר שעה aminoglycoside לשטוף החוצה 8. אנו הבחנו השלב ליניארי של התחדשות neuromast המופיעה ב8-12 מסגרת הזמן (לא ראתה כמו תפרים מלאים לנקודת זמן 8 שעות כפי שמוצג באיור 2) עם רמה הגיעה ב16 HPG. הופעה כמו שליטה מלאה של neuromasts בתוך תפרים לא נצפתה עד 24 HPG כפי שדווח לעוברים וזחלים. הופעה מלאה כמו שליטה מציינת הן את המספר ועוצמת neuromasts בתוך כל ארבעת התפרים באזור אמצע הגוף בדג זברה מבוגר. בנוסף, אם תוצאות כמותיות המתקבלות ברמה של neuromasts אינן משמעותיות מבחינה סטטיסטית, החוקר יכול להרחיב את לימודיהם לרמה של תאי שיער הבודדים בתוך neuromastsבאמצעות מיקרוסקופיה confocal כפי שתואר על ידי הנהלים שלנו.
Assay התחדשות תאי neuromasts / השיער מתואר במאמר זה יכול להיות מיושם על מדינות המחלה שבאו לידי ביטוי הכי טוב בדג הזברה המבוגר ולא בשלבי זחל / עובריים המוקדמים. הגבלה של assay נוגעת להשפעה של תנאי הניסוי אם זה יהיה 1) הזן המהונדס המחקה מצב מחלה מסוים או 2) מצב מחלה פרמקולוגית-induced] בתאי גזע בתוך מערכת הקו לרוחב של דג הזברה מבוגר. בהקשר זה, מצב מחלה מסוים של דג הזברה המבוגר עשוי או לא עשוי להשפיע על תאי גזע של שושלת תא שיער, וזה חשוב לציין, כי התחדשות neuromast היא תלויה לחלוטין בהתפשטות תאי גזע / בידול אלה מעבד 8,24,25 .
כדוגמא למגבלה זו, נתאר ניסויים שבוצעו במודל דג הזברה מבוגר מסוג אני סוכרת. particul זהמודל המחלה ar פותח בדג זברה מבוגר כדי ללמוד את הסיבוך משני לטווח הארוך הנגרם על ידי היפרגליקמיה 28. עבור מספר הסיבות שתוארו קודם לכן 28,29, ניתן לבצע מחקרים אלה רק באמצעות דג הזברה מבוגר. בגלל עצבים היקפיים, יחד עם המבנים הסלולר מיוחדים הם innervate מושפעים לרעה בחולים עם סוכרת, אנחנו רוצים לקבוע אם התחדשות קו לרוחב של neuromasts / תאי שיער הייתה נפגעת גם בדג זברה סוכרתית. באמצעות assay התחדשות קו לרוחב עיכוב לא משמעותי מבחינה סטטיסטית התגלה בהתחדשות neuromast. כדי לאשר את התוצאה שלילית זה, הניסויים חוזרים ונשנים ברמה המעודנת יותר של תא השיער הבודד. שוב, אין הבדל משמעותי מבחינה סטטיסטית נצפה בהתחדשות תאי שיער בין שליטה וקבוצות סוכרתית. לפיכך, הנתונים לא היו עקביים עם ההנחה שהיפרגליקמיה מעכבת את התחדשות תאי neuromast / שיער; עמ 'ossibly בשל ההתנגדות של תאי גזע של שושלת תא שיער לתנאי hyperglycemic. במגבלה זו בחשבון, assay התחדשות תאי neuromasts / השיער מתואר במאמר זה מספק אמצעים כדי לבדוק אם כל מודל מחלה מסוים למבוגרים דג הזברה כרוך בבעיות בתהליך ההתחדשות של תאי שיער כמו פיקוח באמצעות מערכת קו הרוחב. תוצאות חיוביות היו לרמוז מעורבות תאי גזע ומחקרים נוספים יהיו מוצדקים ולכן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml) | Sigma Aldrich | G1397 | |
| 2 Phenoxyethanol | Sigma Aldrich | P1126 | |
| 4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol | Aldrich | D-3418 | 485 nm excitation λ and 603 nm emission λ |
| 6-well Plates | Mid Sci | TP92006 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Matek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | TMZ-1500 | Any dissecting microscope is fine. |
| Camera for Imaging | Nikon | Q imaging | Any camera is suitable. |
| ImageJ software | National Institutes of Health | NIH Image | |
| NIS Elements | Nikon | Any imaging software is suitable. | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | Any high resolution fluorescent microscope is suitable |
| Aquatic System | KG Aquatics ZFS Rack System | Any aquatic system can be used |
References
- Dambly-Chaudire, C., Sapde, D., Soubiran, F., Decorde, K., Gompel, N., Ghysen, A. The Lateral Line of Zebrafish: a Model System for the Analysis of Morphogenesis and Neural Development in Vertebrates. Biol. Cell. 95 (9), 579-587 (2003).
- Montgomery, J., Carton, G., Voigt, R., Baker, C., Diebel, C. Sensory Processing of Water Currents by Fishes. Phil. Trans. Royal Soc. London B Biol. Sci. 355 (1401), 1325-1327 (2000).
- Buck, L. M., Winter, M. J., Redfern, W., Whitfield, T. T. Ototoxin-Induced Cellular Damage in Neuromasts Disrupts Lateral Line Function in Larval Zebrafish. Hearing Res. 284 (1-2), 1-2 (2012).
- Engelmann, J., Hanke, W., Mogdans, J., Bleckmann, H. Hydrodynamic Stimuli and the Fish Lateral Line. Nature. 408 (6808), 51-52 (2000).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguch, M., Liao, J. C. Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line. PloS One. 7 (5), e36661 (2012).
- Raible, D. W., Kruse, G. J. Organization of the Lateral Line System in Embryonic Zebrafish. J. Comp. Neurol. 421 (2), 189-198 (2000).
- Coffin, A. B., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. Extracellular Divalent Cations Modulate Aminoglycoside-Induced Hair Cell Death in the Zebrafish Lateral. 253 (1-2), 1-2 (2009).
- Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).
- Ma, E. Y., Rubel, E. W., Raible, D. W. Notch Signaling Regulates the Extent of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral Line). J. Neurosci. 28 (9), 2261-2273 (2008).
- Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and Fins: Non-Mammalian Models for Hair Cell Regeneration. Brain Res. 1277, 12-23 (2009).
- Bibliowicz, J., Tittle, R. K., Gross, J. M. Toward a Better Understanding of Human Eye Disease Insights From the Zebrafish, Danio Rerio. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 100, 287-330 (2011).
- Mione, M. C., Trede, N. S. The Zebrafish As a Model for Cancer. Dis. Model. Mech. 3 (9-10), 9-10 (2010).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult Zebrafish As a Model Organism for Behavioural Genetics. BMC. Neurosci. 11, (2010).
- Mathur, P., Guo, S. Use of Zebrafish As a Model to Understand Mechanisms of Addiction and. Complex Neurobehavioral Phenotypes. Neurobiol. Dis. 40 (1), 66-72 (2010).
- Ignatius, M. S., Langenau, D. M. Zebrafish As a Model for Cancer Self-Renewal. Zebrafish. 6 (4), 377-387 (2009).
- Milan, D. J., MacRae, C. A. Zebrafish Genetic Models for Arrhythmia. Prog. Biophys. Mol. Biol. 98 (2-3), 2-3 (2008).
- Van Trump, W. J., Coombs, S., Duncan, K., McHenry, M. J. Gentamicin Is Ototoxic to All Hair Cells in the Fish Lateral Line System. Hear. Res. 261 (1-2), 1-2 (2010).
- Littleton, R. M., Hove, J. R. Zebrafish: a Nontraditional Model of Traditional Medicine. J. Ethnopharmacol. 145 (3), 677-685 (2013).
- Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line). PLoS One. 7 (5), 36661-36 (2012).
- Liang, J., Wang, D., Renaud, G., Wolfsberg, T. G., Wilson, A. F., Burgess, S. M. The Stat3/Socs3a Pathway Is a Key Regulator of Hair Cell Regeneration in Zebrafish [Corrected. J. Neurosci. 32 (31), 10662-10673 (2012).
- Nakae, M., Asaoka, R., Wada, H., Sasaki, K. Fluorescent Dye Staining of Neuromasts in Live Fishes: An Aid to Systematic Studies. Ichthyol Res. , 286-290 (2012).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent Probes That Stain Living Nerve Terminals. The J. Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Owens, K. N., Coffin, A. B., Hong, L. S., Bennett, K. O., Rubel, E. W., Raible, D. W. Response of Mechanosensory Hair Cells of the Zebrafish Lateral Line to Aminoglycosides Reveals Distinct Cell Death Pathways. Hear. Res. 253 (1-2), 1-2 (2009).
- Namdaran, P., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. Identification of Modulators of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral. 32 (10), 3516-3528 (2012).
- Herrera, A. A., Banner, L. R. The Use and Effects of Vital Fluorescent Dyes: Observation of Motor Nerve Terminals and Satellite Cells in Living Frog Muscles. J. Neurocytol. 19 (1), 67-83 (1990).
- Hickey, P. C., Jacobson, D., Read, N. D., Louise Glass,, L, N. Live-Cell Imaging of Vegetative Hyphal Fusion in Neurospora Crassa. Fungal. Genet. Biol. 37 (1), 109-119 (2002).
- Olsen, A. S., Sarras, M. P., Intine, R. V. Limb Regeneration Is Impaired in an Adult Zebrafish Model of Diabetes Mellitus. Wound Repair Regen. 18 (5), 532-542 (2010).
- Olsen, A. S., Sarras, M. P., Leontovich, A., Intine, R. V. Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression. Diabetes. 61 (2), 485-491 (2012).
