Un test per Lateral Rigenerazione Line in Zebrafish adulti

Summary

Poiché molti modelli di zebrafish di malattie neurologiche e non neurologiche sono studiate nei pesci adulti piuttosto che l'embrione / larve, abbiamo sviluppato una linea laterale rigenerativo dosaggio quantitativo che può essere applicato a modelli di malattia di zebrafish adulto. Il saggio coinvolto risoluzione al neuromast 1) e 2) livelli di cellule singolo capello.

Abstract

Data l'importanza clinica dell'udito e disturbi dell'equilibrio nell'uomo, organismi modello come zebrafish sono stati utilizzati per studiare lo sviluppo linea laterale e rigenerazione. Il zebrafish è particolarmente attraente per tali studi a causa del suo tempo di sviluppo rapido e la sua elevata capacità rigenerativa. Ad oggi, gli studi di zebrafish della linea di rigenerazione laterali sono principalmente utilizzati pesci delle fasi embrionali e larvali a causa del numero inferiore di neuromasti in queste fasi. Ciò ha reso analisi quantitativa della linea rigenerazione e / o sviluppo più semplice negli stadi precoci di sviluppo laterale. Poiché molti modelli di zebrafish di malattie neurologiche e non neurologiche sono studiate nei pesci adulti e non nell'embrione / larve, ci siamo concentrati sullo sviluppo di un laterale dosaggio linea rigenerativa quantitativa in zebrafish adulto in modo che un test era disponibile che potrebbe essere applicato a corrente modelli di malattia di zebrafish adulto. Basandosi su studi precedenti di Van Trump et al. ¹⁷ che descrive le procedure per l'ablazione delle cellule ciliate adulto messicano pesci ciechi grotta e zebrafish (Danio rerio), il nostro test è stato progettato per permettere il confronto quantitativo fra controllo e gruppi sperimentali. Ciò è stato realizzato attraverso lo sviluppo di una curva standard neuromast rigenerativa basata sulla percentuale di ricomparsa neuromast su un periodo di tempo di 24 ore seguente gentamicina indotta necrosi delle cellule ciliate in una regione definita della linea laterale. Il dosaggio è stato inoltre progettato per consentire estensione dell'analisi a livello di cella capelli individuo quando è richiesto un livello di risoluzione.

Introduction

Il sistema (LL) linea laterale è un organo mechanosensory trovato in entrambi i pesci e anfibi che è responsabile per l'udito, l'equilibrio, rheotaxis e comportamenti di mediazione, come la scuola e il predatore evasione ^1-5. Si compone di gruppi di cellule capelli circondate da cellule di supporto, entrambi i quali sono disposti in strutture chiamate neuromasti ^6. Questi neuromasti sono tipicamente organizzati in linee verticali (chiamato punti) lungo l'asse longitudinale del corpo e la coda con alcuni punti orizzontali osservati nella testa del pesce. Nell'adulto, neuromasti sono significativamente più numerosi nei punti rispetto ai pesci embrionale o larvale ^6. Studi biomedici in zebrafish si sono concentrati sugli effetti del trattamento antibiotico, trauma indotta dal rumore, infezione cronica, ecc. su cellule ciliate ^7,8 nel tentativo di capire meglio i loro effetti sugli esseri umani.

Diversamente dalla maggior parte dei vertebrati, TEleosts, come il pesce zebra (Danio rerio), hanno la capacità di rigenerare le cellule dei capelli perduti. Zebrafish sono particolarmente utili perché del loro tempo rapido sviluppo e ad alta capacità rigenerativa. Ad oggi, tuttavia, studi sullo sviluppo di zebrafish linea laterale e / o rigenerazione sono principalmente utilizzati il pesce stadio embrionale e larvale causa del numero ridotto di neuromasti linea laterale che agevola conteggio e analisi ^6,9,10.

Tuttavia, come molti modelli di zebrafish di malattie neurologiche e non neurologiche ^11-16 sono studiate nei pesci adulti e non le larve, ci siamo concentrati sullo sviluppo di un test rigenerativa linea laterale in zebrafish adulto con gentamicina (un aminoglicoside precedentemente utilizzato in larve di zebrafish e più recentemente utilizzato con pesci adulti ¹⁷⁾ in modo che un saggio era disponibile che potrebbe essere applicato a modelli di malattia di zebrafish adulto attuali. Mentre in precedenza pubblicati procedure di Van Trump et al. ¹⁷ ha stabilito le condizioni per l'ablazione delle cellule dei capelli nel pesce adulto, che non hanno stabilito una curva standard per la rigenerazione neuromast che è necessario per il confronto quantitativo tra controllo e gruppi sperimentali come quando si utilizzano linee di zebrafish transgenici o stati di malattia farmacologicamente indotti in zebrafish ^18. Abbiamo quindi seguito le procedure di Van Trump et al. ¹⁷ per l'ablazione delle cellule dei capelli, ma costruito sul loro lavoro per stabilire una curva standard di rigenerazione neuromast per consentire ai ricercatori di utilizzare i nostri dati quando si confrontano controllo e gruppi sperimentali come ad esempio con modelli di malattia di zebrafish adulto . Il dosaggio è stato inoltre progettato per consentire estensione dell'analisi alla cella capelli individuo quando è richiesto un livello di risoluzione.

Protocol

Tutte le procedure vengono eseguite seguendo le linee guida descritte in "Principi di cura degli animali da laboratorio" (National Institutes of pubblicazione della Sanità n. 85-23, riveduta 1985) e il protocollo di animali Rosalind Franklin dell'Università Institutional Animal Care ed uso commissione ha approvato 08-19.

1. Gentamicina-induzione di capelli necrosi cellulare

1. Preparare gentamicina solfato in soluzione fisiologica ad una concentrazione finale di 0,004% (4,32 mM).
2. Mettere pesci adulti (D. rerio, 4-6 mesi di età) in un recipiente contenente il 0,004% (4.32 mM) soluzione gentamicina. Ogni contenitore può essere utilizzato, ma si usa un contenitore pesce da un sistema acquatico Pharmacal che è in larga 7, 6 in alto, e 7 a lungo. Mettere il recipiente con il pesce in un incubatore a 28 ° C per 24 ore. Impostare il volume totale del fluido nel serbatoio ad un livello sufficiente a mantenere il pesce in uno Stato idoneo per il periodo di 24 ore. Nota: L'aerazione del fluido gentamicina non è necessario se viene utilizzato un volume sufficiente per il numero di pesci in trattamento.

2. Colorazione vitale delle cellule ciliate

1. Preparare una concentrazione 0,08% (in soluzione fisiologica) del colorante vitale fluorescente [4-4-diethylaminostyryl)-N-metilpiridinio ioduro (485 nm di eccitazione e 603 nm λ λ emissione in metanolo) a partire da una soluzione madre di lavoro di 15 mg / ml in etanolo.
2. Per determinare se il trattamento è stato efficace gentamicina un sottoinsieme di controllo e gentamicina pesci trattati sono macchiati immediatamente posizionando pesce nel pozzetto di una piastra di coltura 6 pozzetti contenenti il ​​colorante vitale. Utilizzare un numero sufficiente di pesci (e piastre di coltura come richiesto per la significatività statistica da raggiungere. Basato sulla velocità dell'esaminatore del conteggio neuromast, mettere il pesce nei piatti in modo sfalsato nel tempo in modo che i pesci non sono macchiati per oltre 75 min come descritto al punto 2.3.
3. Posizionare le piastre dal punto 2.2 in un cassetto panchina dal microscopio a fluorescenza peressere utilizzato per l'esame di neuromasti macchiati. Spegnere le luci della stanza per evitare tempra del colorante vitale nel periodo colorazione 1 ora a temperatura ambiente.
4. Preparare sia dye wash-out e serbatoi d'acqua anestetici. Dye acqua wash-out è l'acqua del pesce normale e per l'acqua anestetico, aggiungere sufficienti 2-fenossietanolo in modo che una diluizione 1:1000 in acqua il pesce normale è raggiunto.
5. Disporre il pesce in acqua i pesci normali eccesso di sciacquare eccesso di colorante vitale e passare al punto 3.1 per osservazione di colorante vitale macchiato di pesce.
6. Per esaminare la rigenerazione di neuromasti, trasferire pesce gentamicina trattati che sono stati lavati in acqua pesce normale tra un incubatore per 8-16 ore a 28 ° C.
7. In tempi diversi tra 8-16 h, pesce vengono rimossi dal termostato, lavate e colorate come indicato nei passaggi 2.1-2.4. Passare al punto 3.1 per osservazione di colorante vitale macchiato di pesce.

3. Anestetizzante Fish and Counting fluorescente di neuromasti

1. Mettere il coperchio sul palco di uno stereo microscopio a fluorescenza per ottenere un'immagine digitale del colorante vitale neuromasti macchiati dei punti del corpo metà.
2. Utilizzare una fotocamera digitale posto sulla stereo microscopio a fluorescenza impostato un ingrandimento di 2X per acquisire immagini per la successiva analisi quantitativa. Nota: L'impostazione di ingrandimento del microscopio stereo può dipendere dalla marca di microscopio utilizzato, ma l'impostazione dovrebbe consentire una facile visualizzazione e il conteggio dei singoli neuromasti all'interno della metà dei punti del corpo.
3. Determinare la quantità di rigenerazione contando il numero di neuromasti visibili nei quattro punti designati sul lato più in basso ventrale del pesce appena prossimale verso destra pinna pettorale (vedi Figura 1). Per l'analisi statistica utilizzare un test adeguato, come ANOVA or T-test di Student. Gli esperimenti dovrebbero utilizzare un minimo di 5 pesci al punto di tempo e di tutti gli esperimenti devono essere ripetute un minimo di 3x.
4. Sulla base della curva rigenerazione neuromast (vedere Figura 3), contare neuromasti tra 8-16 hr alberino gentamicina wash-out di essere all'interno della fase lineare della curva di rigenerazione. Nota: L'uso della fase di tempo lineare permette per una corretta analisi quantitativa tra il controllo e gruppi sperimentali.

4. Conteggio fluorescente delle cellule ciliate individuale per ottenere una maggiore risoluzione delle analisi quantitativa se l'analisi Neuromast non è statisticamente significativo

1. Se l'analisi quantitativa a livello di neuromasti non è significativo, analisi a livello della cellula capelli individuo può essere utilizzato anche per ottenere un grado di risoluzione più elevata. Selezionare il pesce in un punto particolare tempo di post gentamicina wash-out (punto nel tempo in base agli studi neuromast precedenti), colorante vitale stain il pesce come descritto nel protocollo 2, e quindi eutanasia il pesce con 2-fenossietanolo a una diluizione 1:500 per 1-5 min.
2. Nella luce soffusa per evitare tempra, fare quattro incisioni in modo che un preparato lembo cutaneo quadrata è composto come segue. Effettuare un'incisione lungo le costole superiori del pesce fino a quando non è allineato con le pinne anali, quindi fare un'incisione attraverso la pancia, e, infine, fare due incisioni verticali su ciascun lato di queste incisioni così si crea il lembo cutaneo piazza. Nota: Questa preparazione pelle integrare i punti del corpo metà utilizzati negli esperimenti neuromast.
3. Porre il campione di pelle su un vetrino e poi posto un coperchio circolare vetro scivolare sul campione di pelle asportati per aiutare ancoraggio e appiattire il tessuto per il successivo immagini digitali.
4. Utilizzando i campioni di pelle dal punto 4.3, di ottenere immagini digitali delle cellule ciliate all'interno di ogni neuromast dei punti del corpo metà. Prendete le immagini ad un ingrandimento di almeno 60X e poi contare il ce capellills all'interno dei singoli neuromasti di analisi quantitativa comparativa del controllo e gruppi sperimentali (vedi Figura 4).

Representative Results

Ottimizzazione delle procedure per quantificare la rigenerazione neuromast della linea laterale in zebrafish adulto.

Le neuromasti di zebrafish larvale sono facilmente quantificabili; Tuttavia, la linea laterale del zebrafish adulto ha un numero molto maggiore di neuromasti per punto effettuare analisi quantitative più difficile ^6,17,19,20. Come si vede nella Figura 1A, la testa ha un numero significativamente maggiore di neuromasti rispetto sia alla sezione centrale o di coda; con la regione di coda avente il minor numero di neuromasti come mostrato nella Figura 1D. Poiché il modello di punti nella testa è complicato e significativamente maggiore del numero di neuromasti, non si presta come una regione per l'analisi quantitativa. Inoltre, indipendentemente dalla concentrazione di gentamicina abbiamo testato, ablazione completa del neuromasti tutta la testa era raramente raggiungibile; lasciando macchie di neuromasti osservati dopo il trattamento gentamicina come precedentemente riportato da Van Trump et al. ¹⁷ Al contrario, la coda ha troppo pochi neuromasti, e come tale, abbiamo selezionato regione medio-corpo (Figura 1B) analizzare quantitativamente rigenerazione neuromast nell'adulto. In questa regione, abbiamo identificato quattro punti appena posteriore alla pinna pettorale laterale che sono stati coerenti in numero neuromast tra tutti gli adulti [61.45 (n = 95)] (Figure 1B e 1E). È importante sottolineare che siamo stati in grado di asportare in modo coerente e completo i neuromasti di questa regione da una 24 ore 0,004% del trattamento gentamicina (come precedentemente riportato in Van Trump et al. ^17), consentendo una successiva determinazione accurata di rigenerazione neuromast (confronta figure 1B e 1E e inserto alla figura 2, 0 ore).

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Figura 1. Il pattern fluorescente di neuromast all'interno maglie del zebrafish adulto è mostrata lungo l'asse longitudinale. Pannello A è la regione della testa, pannello B è la regione Mid-corpo con i quattro punti utilizzati per l'analisi quantitativa delineato con una scatola. Pannello C è la regione posteriore del corpo. Panel D è la regione pinna caudale. Un maggiore ingrandimento dei 4 punti della regione Mid-corpo utilizzato per l'analisi quantitativa è mostrato in Pannello di E. Potere d'ingrandimento di 1X e 2X.

E 'stato riportato che il trattamento solfato di rame è un metodo chimico efficace per indurre una rapida necrosi delle cellule ciliate in embrioni e larve ^21. Qui abbiamo testato il trattamento solfato di rame con la speranza che potrebbe abbreviare il tempo per indurre l'ablazione neuromast. Concentrazioni di rame solfato vanno da5-50 mM per diversi tempi di esposizione fino a 48 ore sono stati utilizzati come precedentemente riportato da Liang et al. ²¹ Si è constatato che il solfato di rame era letale alle concentrazioni più elevate e non efficace a concentrazioni inferiori a pesci adulti (dati non mostrati) . cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

I parametri utilizzati per l'analisi fluorescente di rigenerazione linea laterale in zebrafish adulto.

La rigenerazione è stata monitorata dopo tutti neuromasti entro i quattro punti metà corpo furono ablazione seguente 24 hr gentamicina-trattamento (Figura 2, confronta 0 h con controllo) e rigenerazione positivo è stato determinato dalla comparsa di un minimo di tre neuromasti all'interno di un punto. (Figura 2, 0 ore). Da 8 HPG, circa un terzo del pesce aveva qualche segno di recupero (n = 34); anche se l'intensità di neuromasti era debole nei punti rigeneranti (Figura 2, 8 ore, deboli i punti delineati da caselle). Il numero di neuromasti e la loro intensità continuato ad aumentare in modo lineare fino rigenerazione raggiunto un plateau a 16 HPG (confronta figura 2, con 16 hr Figura 2, 8 ore). Non è stato almeno fino al 24 hpg che tutti i pesci trattati con gentamicina avevano pienamente recuperato con entrambi i numeri uguali e intensità delle neuromasti all'interno dei punti di sutura linea laterale rispetto ai controlli (Figura 2, 24 hr). Una linea di tempo per la rigenerazione neuromast seguente recesso gentamicina è illustrato nella Figura 3 che mostra le fasi lineari e plateau della curva di recupero. Notiamo che in meno del 5% dei casi, i punti rigenerazione non appaiono come entità individuali ma invece appariva come una macchia di fluorescenza.

Figura 2. Immagini fluorescenti di neuromasti. Pesci di controllo, 0 Hr pesce (immediatamente dopo 24 ore di 0,004% di trattamento gentamicina), pesce 8 Hr (8 HPG) con qualche debole colorazione neuromasti entro i 4 punti utilizzati per l'analisi quantitativa (solo il 30% di tutti i pesci hanno mostrato questo modello di colorazione a 8 hpg; 70% ha mostrato alcuna colorazione neuromast a questo punto di tempo, le caselle bianche delineano i neuromasti debolmente colorato che si vedevano nel 30% dei pesci che ha mostrato un certo grado di rigenerazione a 8 HPG), 16 Hr pesce, e 24 pesce Hr. Completa rigenerazione del neuromasti entro i 4 punti di sutura per quanto riguarda 1) il numero di neuromasti e 2) l'intensità della colorazione di neuromasti è stato osservato da 24 HPG. Cliccare qui pervisualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Grafico mostra l'andamento nel tempo delle neuromasti rigenerazione a seguito del recesso da 24 ore il trattamento di zebrafish adulto con 0,004% gentamicina. Come si vede, la ripresa inizia nel punto di tempo 8 HPG e ha raggiunto un plateau al punto temporale 16 HPG. Questo ha definito la fase di rivestimento della rigenerazione neuromast tra 8-16 hr di tempo e di punti all'interno di questa fase lineare dovrebbe essere utilizzato per confrontare quantitativamente gruppi di controllo e dell'esperimento.

Tossicità Neuromast è indotta da una prolungata esposizione ai coloranti colorazione fluorescente.

Nella nostra stima un modo ideale per eseguire questi esperimenti sarebbe di macchiare il pesce con il colorante fluorescente prima del trattamento, macchia di nuovo a 0 ore poi nuovamente una macchiat rigenerazione punti di tempo. Tuttavia, abbiamo incontrato una complicazione di questi studi, che è il fatto che cellule fluorescenti capelli coloranti colorazione come 4-Di-2-Asp, come può avvenire anche con altre macchie mitocondriali ²² possono avere un effetto tossico sulle cellule ciliate ^23. Questo fatto ci ha richiesto di utilizzare gruppi separati di pesci da ripetute colorazione dello stesso pesce non potendo essere impiegata. In tutti i casi il pesce sperimentale inclusi i controlli sono stati trattati in parallelo per eliminare la variabilità sperimentale.

Analisi confocale a livello delle cellule ciliate individuali.

Se i risultati ottenuti dall'analisi neuromast non sono statisticamente significativa tra il controllo e gruppi sperimentali, si possono estendere gli studi al livello delle singole cellule grandine avere un maggior grado di risoluzione per confronto quantitativo. Come indicato nella Figura 4, neuromasti da un gruppo di controllo (uneuromast a 12 ore di rigenerazione è mostrato in questa figura) può essere visualizzato mediante microscopia confocale dei preparati cutanei della regione corpo a metà. Alle 8 ore, 10 ore e 12 ore di tempo di rigenerazione, abbiamo scoperto che i gruppi di controllo (7 animali / gruppo) ha avuto un intervallo di 0-4 capelli cellule / neuromast. Come previsto per gruppi di controllo, quando quantitativamente analizzato, nessuna differenza statistica tra neuromasti stata rilevata in termini di numero di cellule cigliate per neuromast nei punti temporali sopra indicati (valori di P variavano ,230-0,472). Tale approccio può essere preso tra ogni gruppo di controllo ed esperimento quando necessario estendere o confermare i dati ottenuti dalla prima fase di studi neuromast.

Figura 4. Analisi dei capelli rigenerazione delle cellule / neuromast con preparazioni della pelle della regione linea laterale definita descritto iprotocollo n passo 3.3. immagine confocale a fluorescenza delle cellule ciliate all'interno di un neuromast ottenuto da una preparazione della pelle zebrafish. Due cellule cigliate colorate colorante vitale sono mostrati in un neuromast di un pesce controllo (Figura 4). Questa immagine è stata ottenuta 12 ore dopo la rimozione di gentamicina (fase di rigenerazione lineare). Il simbolo staffa bianca () indica un individuo neuromast mentre la freccia bianca indica una cellula di sostegno che circonda le cellule ciliate. Cellule di sostegno non si colorano in queste condizioni e appaiono come spazi neri. Ingrandimento, 60X.

1	1. Trattamento Gentamicina [0,004% (4.32 mM)] di controllo e pesce sperimentale per 24 ore a 28 ° C utilizzando un incubatore.
2	2. Lavare di gentamicina per avviare la rigenerazione delle cellule ciliate. Pesce Tornare alla incubatore a 28 ° C per investigatori periodi di tempo selezionati tra 8-16 ore.
2	Controllo 3. Macchia colorante vitale [0,08% 4-4-diethylaminostyryl-N-metilpiridinio ioduro (4-Di-2-Asp)] e pesce sperimentale per 1 ora a temperatura ambiente e quindi lavare le macchie con acqua pesce per l'imaging fluorescente.
1 o 2	4. Se necessario a causa di risultati non significativi dall'analisi di neuromasti, ripetere protocolli 1-3 con un gruppo separato di controllo e pesce sperimentale, ma poi ottenere una preparazione pelle per l'analisi confocale di cellule cigliate individuali.

Tabella 1. Una sintesi del protocollo sopra indicato.

Discussion

Basato sulla vasta letteratura che è stato stabilito per l'analisi della linea laterale (LL) rigenerazione embrionale e larvale zebrafish ^8,24,25, l'obiettivo del nostro studio è stato quello di sviluppare un test quantitativo per la linea rigenerazione laterale in zebrafish che potrebbe essere applicato a modelli di malattia che sono meglio studiati nei pesci adulti. Abbiamo scoperto che alcuni punti critici sono importanti quando si applicano le procedure sviluppate per embrionale pesce / larvale ai pesci adulti. Il più importante di questi punti considerati: 1) il numero di linea laterale neuromasti lungo l'asse longitudinale del pesce, 2) la durata della colorazione delle cellule ciliate neuromast, 3) la concentrazione e la durata del trattamento di aminoglicosidi, e 4) i tempi di rigenerazione linea laterale dopo il trattamento aminoglicosidi. Questi punti saranno affrontati nella discussione che segue.

Per quanto riguarda il numero di neuromasti lungo la linea laterale di zebrafish, Zebrafish embrionale e larvale ha il vantaggio che i neuromasti hanno un modello semplice perché in numero inferiore in un determinato punto rispetto ai pesci adulti. Questo numero basso ha permesso agli investigatori di identificare chiaramente ogni neuromast e assegnare un nome ad esso ^6. In questo modo, gli studi di rigenerazione possono quantificare la ricomparsa di un particolare neuromast per nome qualsiasi momento successivo prelievo da un agente aminoglicosidi. Il maggior numero di neuromasti per punto nell'adulto introduce significative difficoltà nel conteggio preciso e quantificazione durante la ricomparsa della rigenerazione neuromasti rispetto a quello degli embrioni o larve. Come si vede, abbiamo valutato il pattern di neuromasti linea laterale all'interno maglie del adulta e determinato che la metà del corpo (Figures. 1 e 2) a condizione che la regione ottimale di punti per l'analisi.

La colorazione di neuromasti con cellule ciliate coloranti come 2 - [4 - (dimetilammino) stirilico]-N-ethylpyridinio ioduro (DASPEI) o 4-Di-2-Asp permette di visualizzare neuromasti della linea laterale utilizzando stereomicroscopia fluorescente ^26,27 nel pesce larvale e giovanile. Queste stesse macchie sono anche efficaci nel pesce adulto e la nostra analisi quantitativa indicato che nessuna differenza significativa nel numero di neuromasti nella regione medio-corpo è stato osservato tra normale zebrafish controllo (con una media di 61.45 neuromasti in normale pesce controllo adulto).

E 'stato riportato che i coloranti cellulari capelli come 2 - [4 - (dimetilammino) styryl] ioduro-N-ethylpyridinium (DASPEI) o 4-Di-2-Asp potranno essere tossico per neuromast celle ^24, e il pesce non può essere ripetutamente macchiato di questi agenti fluorescenti se uno è di monitorare la rigenerazione aminoglicosidi-indotta. Colorazione ripetuta dello stesso pesce introduce più eventi di tossicità (sia la macchia e l'aminoglicoside), che rende l'esperimento non-interpretabile ^23. Di conseguenza, tutti gli esperimentinel nostro studio richiesto parallelo a 4-Di-2-Asp colorazione di più insiemi di pesce al fine di dimostrare che neuromasti erano 1) presenti nella condizione di controllo gentamicina non trattato, 2) completamente asportate immediatamente dopo l'esposizione gentamicina, e 3) rigenerazione ad un certo ore dopo gentamicina-trattamento dopo il ritiro e lavaggio fuori di questo aminoglicosidi. In questo modo, tutti i pesci era macchiato solo una volta con il colorante neuromast.

Va sottolineato che, mentre le procedure di Van Trump et al. ¹⁷ stabiliscono le condizioni per l'ablazione delle cellule capelli al pesce adulto, non viene stabilita una curva standard per la rigenerazione neuromast che è richiesto per confronto quantitativo tra controllo e gruppi sperimentali. Abbiamo quindi seguito le procedure di Van Trump et al. ¹⁷ per l'ablazione delle cellule dei capelli (concentrazione di gentamicina del 0,004% con un tempo di esposizione 24 ore, vedi figura 2 per i risultati di ablazione delle cellule dei capelli a 24hr), ma ha esteso il loro lavoro per stabilire una curva standard di rigenerazione neuromast. Ciò consente un'analisi comparata dei LL rigenerazione nel zebrafish adulto utilizzando i quattro punti della regione di corpo intermedio che abbiamo stabilito per le nostre condizioni di analisi (vedi figure 1 e 2). Al fine di determinare se si poteva ottenere un periodo più breve per l'ablazione delle cellule dei capelli, abbiamo provato anche l'effetto di solfato di rame che è stato efficacemente utilizzato in larve per periodi più brevi 2 hr. I nostri studi hanno indicato che il solfato di rame (5-50 mM per vari tempi di esposizione fino a 48 ore come precedentemente riportato da Liang et al. ²¹ per le larve) non è stato trovato per essere efficace nel pesce adulto come agente per l'ablazione delle cellule capelli. Ciò evidenzia il fatto che le condizioni utilizzate per l'ablazione delle cellule ciliate in embrioni e larve non sempre possono essere trasferiti direttamente per l'utilizzo con il pesce adulto.

Per quanto di competenza la linea lateralerigenerazione nell'adulto, abbiamo trovato analoghe scadenze per la rigenerazione di neuromasti tra quello di embrione / larvale e adulto di pesce. Come riportato in precedenza da altri, embrioni di zebrafish e larve mostra neuromast rigenerazione a 12-24 ore dopo aminoglicosidi wash-out ^8. Abbiamo osservato la fase lineare di rigenerazione neuromast appare nel lasso di tempo 8-12 (non vista piena punti per il punto di tempo 8 ore come mostrato nella figura 2) con un plateau raggiunto a 16 HPG. Completa l'aspetto di controllo-come neuromasti all'interno di punti non è stata osservata fino al 24 hpg come riportato per gli embrioni e larve. Aspetto controllo-come completo denota sia il numero e l'intensità delle neuromasti entro quattro punti della regione medio-corpo in zebrafish adulto. Inoltre, se i risultati quantitativi ottenuti a livello delle neuromasti non sono statisticamente significativi, il ricercatore può estendere i loro studi al livello delle singole cellule ciliate nei neuromastiutilizzando la microscopia confocale come descritto da nostre procedure.

Il neuromasti / capelli rigenerazione delle cellule saggio descritto in questo articolo può essere applicato a stati di malattia che sono meglio manifestano in zebrafish adulto piuttosto che nelle prime fasi larvali / embrionale. Una limitazione del dosaggio riguarda la influenza della condizione sperimentale sia esso 1) il ceppo transgenico che imita un particolare stato di malattia o 2) uno stato di malattia farmacologicamente indotta] sulle cellule staminali nel sistema linea laterale di zebrafish adulto. A questo proposito, un particolare stato di malattia del zebrafish adulto può o può non influenzare le cellule staminali della linea cellulare capelli, ed è importante notare che la rigenerazione neuromast è completamente dipendente da questi proliferazione delle cellule staminali / differenziazione processi ^8,24,25 .

Come esempio di questa limitazione, descriveremo esperimenti eseguiti su un modello zebrafish adulto del diabete di tipo I. Questo particular modello di malattia è stato sviluppato in zebrafish adulti per studiare la complicazione secondaria lungo termine indotta da iperglicemia ^28. Per una serie di motivi descritti in precedenza ^28,29, questi studi possono essere eseguite solo con zebrafish adulto. Perché nervi periferici insieme con le strutture cellulari specializzate che innervano siano alterate nei pazienti con diabete, abbiamo voluto determinare se la rigenerazione linea laterale del neuromasti / cellule ciliate è stata compromessa anche in zebrafish diabetica. Utilizzando il test laterale rigenerazione linea senza ritardo statisticamente significativo è stato rilevato nella rigenerazione neuromast. Per confermare questo risultato negativo, gli esperimenti sono stati ripetuti a livello più raffinato della cellula singolo pelo. Anche in questo caso, nessuna differenza statisticamente significativa è stata osservata nella rigenerazione delle cellule capelli tra controllo e gruppi diabetici. Pertanto, i dati erano incompatibili con l'ipotesi che l'iperglicemia impedisce la rigenerazione delle cellule neuromast / capelli; possibly dovuto alla resistenza di cellule staminali del lineage cella capelli per condizioni iperglicemici. Con questa limitazione in mente, il neuromasti / capelli rigenerazione delle cellule saggio descritto in questo articolo fornisce un mezzo per verificare se un particolare modello di zebrafish adulto malattia comporta disfunzioni nel processo rigenerativo delle cellule dei capelli come monitorata utilizzando il sistema della linea laterale. Risultati positivi implicano il coinvolgimento delle cellule staminali e ulteriori studi sarebbero quindi giustificata.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml)	Sigma Aldrich	G1397
2 Phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol	Aldrich	D-3418	485 nm excitation λ and 603 nm emission λ
6-well Plates	Mid Sci	TP92006
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
Glass Bottom Microwell Dishes	Matek Corporation	P35G-1.5-14-C
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting  Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
ImageJ software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.
Confocal microscope	Olympus	FV10i	Any high resolution fluorescent microscope is suitable
Aquatic System	KG Aquatics ZFS Rack System		Any aquatic system can be used