アダルトゼブラフィッシュ側線再生のためのアッセイ

Summary

神経学的および非神経疾患の多くのゼブラフィッシュモデルは成魚ではなく、胚/幼虫で研究されているため、我々は大人のゼブラフィッシュの疾患モデルに適用することができ、定量的側線再生アッセイを開発しました。アッセイは、1）感丘および2）個々の有毛細胞レベルでの解像度を含んだ。

Abstract

原因人間に聴覚や平衡障害の臨床的重要性、そのようなゼブラフィッシュなどのモデル生物は側線の開発と再生を研究するために使用されてきた。ゼブラフィッシュは、その急速な開発時間と高い再生能力のような研究のために特に魅力的である。現在までに、側線再生のゼブラフィッシュの研究では、主な理由は、これらの段階でneuromasts数の減少の胚および幼虫期の魚を利用してきた。これは横方向のラインの再生/および以前の発達段階での容易な開発の定量分析を行いました。神経学的および非神経疾患の多くのゼブラフィッシュモデルは成魚ではなく、胚/幼虫で研究されているため、アッセイが利用可能になるように、我々はそれが現在にも適用することができる大人のゼブラフィッシュでは、定量的側線回生アッセイの開発に焦点を当て大人のゼブラフィッシュ疾患モデル。ヴァンスペクトラムによるこれまでの研究を踏まえP ら ¹⁷アダルトメキシコブラインド洞窟魚やゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）内有毛細胞の切除のための手順を説明した、私たちのアッセイは、対照群と実験群間の定量的な比較を可能にするために設計されました。これは、横方向のラインの定義された領域内の有毛細胞のゲンタマイシン誘発性壊死を次の24時間の期間にわたって感丘再現の割合（％）に基づいて、回生感丘標準曲線を開発することによって達成された。アッセイはまた、解像度の高いレベルが必要とされる個々の有毛細胞レベルの分析の拡張を可能にするように設計された。

Introduction

側線（LL）システムは、聴覚、バランス、走流性や、学校教育や捕食の回避^1-5として仲介行動する責任があり、両方の魚や両生類に見られる機械刺激器官である。これは、支持細胞によって取り囲ま有毛細胞のクラスターで構成され、両方ともがneuromasts ⁶と呼ばれる構造に配置されている。これらneuromastsは、一般的に魚の頭の中で観察されたいくつかの横のステッチと身体と尾の長軸に沿って垂直線（ステッチと呼ばれる）に編成されています。成人では、neuromastsは、胚や仔魚⁶と比較して、ステッチ内の数値が有意に大きい。ゼブラフィッシュにおける生物医学の研究では、抗生物質治療、ノイズによる外傷、慢性感染症などの影響に焦点を当てている。より良い人間にその効果を理解するための試みで、有毛細胞に^7,8。

ほとんどの脊椎動物とは異なり、TEこのようなゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）などleostsは、失われた有毛細胞を再生する能力を持っている。ゼブラフィッシュは、それらの迅速な開発時間と高い再生能力が特に有用である。今日まで、しかし;側線の開発および/ ​​または再生にゼブラフィッシュの研究では、主に簡単にカウントおよび分析^6,9,10を可能にし、横のラインneuromasts数の減少に胚および幼虫期の魚を利用している。

しかし、神経学的および非神経疾患^11-16のような多くのゼブラフィッシュモデルは成魚としない幼虫で研究されて、我々はゲンタマイシンを使用して大人のゼブラフィッシュの横のラインに回生アッセイ（以前にゼブラフィッシュ幼生で使用されるアミノ配糖体の開発に焦点を当て、さらに最近では成魚¹⁷で使用される）ように、アッセイは、現在の大 ​​人のゼブラフィッシュの疾患モデルに適用することができるよう利用可能であった。ヴァントランプeだけしばらく以前に公開された手順Tら^17は、成魚での有毛細胞の切除のための条件を確立し、それらはコントロールとそのようなトランスジェニックゼブラフィッシュ系統または薬理学的に誘発される疾患状態を使用している場合などの実験グループ間の定量的な比較のために必要とされる感丘再生のための標準曲線を確立できませんでしたゼブラフィッシュ^18。したがって、我々は、対照群と実験群を比較した場合、そのような大人のゼブラフィッシュ疾患モデルと同じように我々のデータを使用するために研究者を可能にするため感丘再生の標準曲線を確立するために、有毛細胞の切除のためのヴァントランプら ¹⁷の手順に従ったが、自分の仕事上に構築された。アッセイはまた、解像度の高いレベルが要求される場合、個々の有毛細胞への分析の拡張を可能にするように設計された。

Protocol

すべての手順は、「実験動物管理の原則」で説明したガイドラインに従って実施された（厚生掲載の国民の協会がない。85から23、1985年改訂）し、承認されたロザリンド·フランクリン大学機関動物実験委員会の動物プロトコルは、8月19日。

有毛細胞壊死の1。ゲンタマイシン誘導

1. 0.004％（4.32ミリモル）の最終濃度で通常の生理食塩水に硫酸ゲンタマイシンを準備します。
2. 0.004％（4.32 mM）のゲンタマイシン溶液の入った容器に成魚（D.フィッシュ 、生後4〜6ヶ月）を配置します。すべてのコンテナを使用することができますが、我々は広い7、高における6、長期での7ですファーマ水生システムからの魚のコンテナを使用しています。 24時間28℃に設定したインキュベーター中で魚と容器を置きます。 24時間の期間の間生存可能な状態で魚を維持するのに十分なレベルで、タンク内の流体の総体積を設定する。注意：ゲンタマイシン流体の通気はNECEではありませんssary十分な量、治療される魚の数が使用される場合。

有毛細胞の2。生体染色

1. 15 mg / mlとワーキングストック溶液からの蛍光生体色素[4-4 - ジエチルアミノスチリル）-N-メチルピリジニウムヨージド（485 nm励起λ、メタノール中で603 nm放射λ）（生理食塩水）で0.08％の濃度を準備しますエタノール中。
2. ゲンタマイシン治療が有効であったかどうかを判断するために、制御およびゲンタマイシン処理魚のサブセットは、生体色素を含む6ウェル培養プレートのウェルに魚を置くことで、すぐに染色される。達成すべき統計的有意性のために必要とされる十分な魚の数（および培養プレートを使用してください。感丘カウントの検者速度に基づいて、魚は75オーバー分間染色されないように、時間をかけて、時間差をおいて、プレートに魚を置く工程2.3に記載のように。
3. 、蛍光顕微鏡でベンチの引き出しにステップ2.2からプレートを配置染色neuromastsの検査に使用される。室温で1時間染色にわたって生体色素の消光を防止するために、部屋の照明をオフにします。
4. 色素ウォッシュアウトし、麻酔水タンクの両方を準備します。染料は水は通常の魚の水である、洗い流し、麻酔薬水のため、通常の魚の水中での1:1,000の希釈が達成されるよう、十分な2 - フェノキシエタノールを追加します。
5. 過剰生体色素をすすぎ、生体色素染色した魚の観察3.1に進み、過剰な通常の魚の水の中の魚を置きます。
6. 28℃で8月16日の間に時間インキュベーターに通常の魚の水で洗浄し、ゲンタマイシン処理魚を移す、neuromastsの再生を検討するために、
7. 8月16日時間の間に様々な時間で、魚が、培養器から取り出し、洗浄して、ステップ2.1から2.4に示したように染色する。生体染色色素で染色魚の観察3.1に進みます。

3。麻酔魚とNeuromastsの蛍光カウント

1. ミッドボディステッチの生体色素染色neuromastsのデジタル画像を得るために、蛍光実体顕微鏡のステージ上にふたをする。
2. 使用する蛍光実体顕微鏡上に配置されたデジタルカメラは後続の定量分析のために画像を取り込むように2Xの倍率を設定する。実体顕微鏡の倍率設定が使用顕微鏡のブランドに依存してもよいが、設定はミッドボディのステッチ内で簡単に表示し、個々のneuromastsのカウントを許可する必要があります。注意して​​ください。
3. （ 図1を参照）の右胸鰭のすぐ近くの魚の一番下の腹側の4指定された縫い目の中に見えるneuromastsの数を数えることによって回生量を決定します。統計分析のために、このような分散分析Oのような適切なテストを使用するRスチューデントのt検定。実験は、時点当たり5魚の最小値を利用するべきであり、全ての実験は最低3回繰り返されるべきである。
4. 感丘再生時間曲線に基づいて、（ 図3参照）、再生曲線の線形位相内であることが8〜16時間後ゲンタマイシンウォッシュアウトの間neuromastsを数える。注：線形時相の使用は、対照群と実験群との間の適切な定量分析を可能にする。

感丘分析が統計的に有意でない場合は定量分析より高い解像度を得るための個々の有毛細胞の4。蛍光カウント

1. neuromastsのレベルの定量分析が有意でない場合、個々の有毛細胞のレベルでの分析は、より高い解像度を得るために利用することができる。特定の時点ポストゲンタマイシンウォッシュアウト（時点を以前感丘の研究に基づいて）、生体色素STで魚を選択するプロトコール2に記載し、その後1-5分間、1:500希釈で、2 - フェノキシエタノールを使用して、魚を安楽死させるように魚アイン。
2. 次のように正方形の皮膚弁の準備が行われているように、急冷を防ぐために、落ち着いた光の中で、4切開を行います。それは肛門フィンと整列するまで、魚の上部肋骨に沿って切開すると、腹全体で切開を行い、正方形の皮膚弁を作成したので、最後に、これらの切開の両側に二つの垂直切開を行う。注：この肌の準備が感丘の実験で使用したミッドボディステッチを組み込む予定。
3. スライドガラス上の皮膚片を配置し、アンカーを助け、その後のデジタルイメージングのための組織をフラット化するために切除された皮膚試料上円形ガラスカバースリップを配置。
4. ステップ4.3から皮膚片を使用して、ミッドボディーステッチの各感丘内有毛細胞のデジタル画像を取得する。少なくとも60Xの倍率で画像を撮影した後、髪のCEを数える対照群と実験群との比較定量分析のための個々のneuromasts以内LLS（ 図4参照）。

Representative Results

大人のゼブラフィッシュの横のラインの感丘再生を定量化するための手順の最適化。

幼虫のゼブラフィッシュのneuromastsは容易に定量化され;しかし、大人のゼブラフィッシュの側線は^6,17,19,20定量分析をより困難ステッチごとneuromastsのはるかに大きい数を持っています。 図1Aに見られるように、ヘッドは、中間部又は尾部のいずれかと比較neuromastsの有意に高い数値を有し; 図1Dに示すように、尾部領域がneuromastsの最小数を有する。頭の中でステッチのパターンが複雑でneuromastsの数が有意に大きいので、定量分析のための領域としては適していませんでした。また、関係なく、我々がテストゲンタマイシン濃度の、頭部全体neuromastsの完全な除去はほとんど達成可能だった。観察neuromastsのスポットを残してゲンタマイシン治療後に、以前ヴァントランプらによって報告された。対照的に^17、尾が少なすぎneuromastsを持っており、このように、我々は、定量的に、成人で感丘再生を分析するために、中間ボディ領域（ 図1B）を選択した。この領域では、4ステッチがちょうどすべての成人感丘数が一致していた横胸鰭[61.45（N = 95）]（ 図1Bおよび1E）に後方同定した。重要なのは、我々は感丘再生のその後の正確な判定が可能に（以前はヴァントランプら ¹⁷で報告されているように）一貫して完全に24時間0.004％ゲンタマイシン処理によって、この領域のneuromastsを切除することができました（ 図1Bおよび1Eを比較図2、0時間）とインセットです。

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図1。大人のゼブラフィッシュの編目内感丘の蛍光パターンを縦軸に沿って表示されます。パネルAは、頭部領域で、 パネルBは、ボックスで概説され、定量分析のために使用される4つのステッチとミッドボディ領域である。 パネルCは、ナジオン-ボディ領域である。 パネルDは尾鰭の領域である。定量分析に使用ミッドボディ領域の4編目の高倍率は、 パネルEに示されている。1Xと2Xの倍率電源をオンにします。

なお、硫酸銅処理は胚および幼虫²¹内有毛細胞の急速な壊死を誘導するのに有効な化学的な方法であることが報告されている。ここでは、それは感丘アブレーションを誘導する時間を短縮するかもしれないことを期待して硫酸銅治療を試験した。に至るまでの硫酸銅濃度予めLiang らによって報告されたように48時間までの種々の露光時間を利用したために、5〜50 mMの²¹これは、硫酸銅（データは示さず）成魚における低い濃度で効果的な高濃度で致死的ではないことが分かった。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

大人のゼブラフィッシュの横のライン再生の蛍光分析のために使用するパラメータ。

4中央体ステッチ内のすべてのneuromastsが24時間のゲンタマイシン処理（ 図2、コントロールを0時間と比較）と正再生はステッチ内3 neuromasts最低の出現によって決定された次のアブレーションされた後に再生がモニターした。 （ 図2,0時間）。 8 HPGによって、魚の約3分の1は、いくつかの回復の兆候た（n = 3を有していた4）; neuromastsの強度は再生ステッチで（ 図2、8時間、箱によって概説かすかステッチ）暗かったが。 neuromastsの数とその強度は再生が（ 図2、8時間で、図2、16時間を比較して）16 HPGでプラトーに達するまで直線的に増加し続けた。それはゲンタマイシンで治療すべての魚が完全にコントロールと比較して、横方向のラインステッチ内neuromasts同数と強度（ 図2、24時間）の両方で回復していた少なくとも24 HPGまでではなかった。ゲンタマイシン除去後感丘再生のためのタイムラインは、回復曲線の線形およびプラトー相を示す、図3に示されている。私たちは、例の5％未満では、再生ステッチは、個々のエンティティとして表示されませんでしたが、代わりに蛍光のスメアとして現れたことに注意してください。

図2。neuromastsの蛍光画像。定量分析に使用4ステッチ内neuromastsのあるかすかな染色対照魚、0時間の魚（すぐに0.004％ゲンタマイシン治療の24時間後に続いて）、8時間の魚（8 HPG）は（すべての魚の30％が、このパターンを示した8 HPGで染色; 70％が、この時点で全く感丘染色を示さなかった。白い箱は8 HPGの再生をある程度示した魚の30％に見られた、かすかに染色neuromastsをアウトライン）、16時間の魚、および24人事魚。 neuromastsの数とneuromastsの染色の2）強度は24 HPGで観察した1に関しては4ステッチ）内neuromastsの完全な再生は。 するには、ここをクリックしてください。この図の拡大版を表示します。

図3のグラフは、0.004％のゲンタマイシンを有する成体ゼブラフィッシュの24時間の処理からの離脱以下neuromasts再生の時間経過を示す。示すように、回収率は8 HPG時点で開始し、16 HPGの時点でプラトーに達した。これは、この線形位相内で8-16時間と時間点の間感丘再生のライナー相が定量的に制御し、実験群を比較するために使用されるべきで定義された。

感丘毒性は蛍光染色色素に長時間さらされることで誘導される。

推計では、これらの実験を行うための理想的な方法は、0時間の時点で、再び治療前、染色する蛍光色素で魚を染色することであろうから、再度染色T再生時間を指します。しかし、我々はそのような4 -ジ-2-ASPなどの有毛細胞の蛍光染色色素は、また^、22は有毒で有毛細胞²³に影響を持つことができ、他のミトコンドリアの汚れの場合とされるようにするという事実であるこれらの研究に合併症が発生しました。この事実は、同じ魚を繰り返し染色を採用することができませんでしたので、魚の別々のグループを使用するために私たちを必要としました。全ての場合において、対照を含む実験魚は、実験の変動性を排除するために並行して処理した。

個々の有毛細胞のレベルでの共焦点解析。

感丘分析から得られた結果は、対照群と実験群間で統計的に有意でない場合、人は定量的な比較のためのより高い解像度を得るために、個々のあら細胞のレベルにこれらの研究を拡張することができる。 図4に示すように、対照群のneuromastsは、（再生の12時間でユーロマスト）がこの図に示されている中間ボディ領域からの皮膚製剤の共焦点顕微鏡で観察することができる。 8時間、10時間、再生時間が12時間で、我々はコントロール群（7匹/群）0-4有毛細胞/感丘の範囲を持っていたことが分かった。対照群のために予想されたように定量的に分析した場合、neuromastsの間には統計的な差は（P値が0.230から0.472の範囲であった）上で示した時点で感丘当たりの有毛細胞の数に関して検出されなかった。感丘研究の第一段階から得られたデータを拡張するか、確認するために必要なときにこのようなアプローチは、すべてのコントロールおよび実験群の間に採取されてもよい。

定義された側線領域の皮膚標本を使用して、髪の細胞/感丘再生の図4。分析は、私が説明したNプロトコルステップ3.3。ゼブラフィッシュの皮膚の準備から得感丘内有毛細胞の蛍光共焦点画像。二つの生体色素染色した有毛細胞は、コントロール魚の感丘（ 図4）内に示されている。この画像は、ゲンタマイシン（線形再生段階）の12時間後に除去を得た。白い矢印は、有毛細胞の周囲の支持細胞を示している白いブラケット記号（）は、個々の感丘を示している。支持細胞は、これらの条件下でシミや黒いスペースとして表示されません。倍率60X。

1	1。ゲンタマイシン治療インキュベーターを使用して28℃で24時間の制御および実験魚の[0.004％（4.32ミリモル）]。
2	2。有毛細胞の再生を開始するためにゲンタマイシン洗い流す。 8月16日時間の間に調査員が選択時間の間、28℃のインキュベーターに魚を戻す。
2	それから3。バイタル色素汚染[0.08％4-4-ジエチルアミノスチリル-N-メチルピリジニウムヨージド（4 - ジ-2-ASP）]室温で1時間の制御と実験魚や蛍光イメージングのための魚の水で汚れを洗い流す。
1又は2	4。必要に応じて原因neuromastsの分析から有意な結果を、対照群と実験魚の別々のグループとプロトコル1-3を繰り返しますが、個々の有毛細胞の共焦点分析のための皮膚の準備を取得する。

表1。上記で概説したプロトコルの要約。

Discussion

胚および幼虫ゼブラフィッシュ^8,24,25の横ライン（LL）再生の解析のために確立されている多くの文献に基づいて、我々の研究の目的は、ゼブラフィッシュの横のライン再生のための定量的アッセイを開発することだったことでし最高の成魚で研究された疾患モデルに適用される。私たちは、成魚に胚/仔魚のために開発された手順を適用するときに、ある臨界点が重要であることがわかった。魚の長手方向軸に沿って横方向の線neuromasts 1）番号、感丘有毛細胞の染色、2）持続時間、3）アミノグリコシドの治療の濃度および持続時間、および4）：みなし、これらの点の中で最も重要なアミノグリコシド治療後の側線再生のタイミング。これらの点は、以下の議論で解決される予定です。

ゼブラフィッシュの側線に沿ってneuromastsの数に関しては、胚および幼虫のゼブラフィッシュが原因成魚に比べて、与えられたステッチ内でのそれらの低い数字のneuromastsは単純なパターンを持って明確な利点を持っている。この低い数字は、研究者が明確に感丘を特定し、その⁶に名前を割り当てることができました。このように、再生の研究では、アミノグリコシド系エージェントからの撤退、次のいずれかの時に名前で特定感丘の再出現を定量化することができます。成人ステッチごとneuromastsより多数の胚または幼虫のそれと比較した場合、neuromastsを再生させるの再出現時に正確なカウントおよび定量の大幅な難しさを紹介します。示されているように、私たちは、大人の編目内側線neuromastsのパターンを評価し、中央体（Figures. 1及び2）は、分析のためのステッチの最適領域を提供することを決定した。

例えば、2有毛細胞色素とneuromastsの染色 - [4 - （ジメチルアミノ）スチリル]-N-ethylpyridiニウムヨージド（DASPEI）または4 -ジ-2-ASPは、1が仔稚魚に蛍光実体顕微鏡^26,27を使用して横方向のラインのneuromastsを視覚化することができます。これらの同じ汚れも成魚に有効であると私たちの定量分析は、ミッドボディ領域内neuromastsの数に有意な差は（正常対照成魚における61.45 neuromastsの平均で）正常対照ゼブラフィッシュの間で認められなかったことが示された。

- [4 - （ジメチルアミノ）スチリル]-N-エチルピリジニウムヨージド（DASPEI）又は4 -ジ-2 - Aspで自身がセル^24を感丘に対して毒性であることができ、魚を繰り返すことができない、それは、例えば、2有毛細胞の色素が報告されている1がアミノグリコシド誘発性の再生を監視することである場合は、これらの蛍光剤で染色した。同じ魚を繰り返し染色は実験解釈不能な^23になります（シミやアミノグリコシドの両方で）複数の毒性のイベントを紹介します。従って、すべての実験我々の研究で2）完全ゲンタマイシン露光直後にアブレーション、および3）いくつかを再生する、未処理ゲンタマイシン制御条件に存在する）neuromastsが1であったことを示すために魚の複数のセットの平行4 - ジ-2-Aspの染色を必要とこのアミノグリコシドのうち撤退し、洗浄後時間後にゲンタマイシン治療。このようにして、全ての魚が感丘色素で一度だけ染色した。

それは、ヴァン·トランプら ¹⁷の手順は成魚での有毛細胞の切除のための条件を確立しながら、彼らは対照群と実験群間の定量的な比較のために必要とされる感丘再生のための標準曲線を確立していないことを指摘しなければならない。したがって、我々は24で有毛細胞除去（24時間の露出時間を使用して0.004％のゲンタマイシン濃度、有毛細胞の切除の結果については図2を参照してくださいヴァントランプら ¹⁷の手順に従っ時間）が、感丘再生の標準曲線を確立するために自分の仕事を拡張した。これは（ 図1と図2を参照）、我々のアッセイ条件について確立ミッドボディ領域の4ステッチを使用して、大人のゼブラフィッシュのLL再生の比較分析を可能にします。有毛細胞のアブレーションのためのより短い期間を得ることができたかどうかを判定するために、我々はまた、効果的に2時間ほど短時間仔魚で使用されている硫酸銅の効果を試験した。 （以前は幼虫のためLiang ら²¹により報告されたように48時間までの種々の露光時間の間、5〜50 mM）の我々の研究は、その硫酸銅を示したが、有毛細胞除去剤として成魚に有効であることが見出されなかった。これは胚および幼虫に有毛細胞の切除のために使用される条件は、常に直接成魚で使用するために転送することができないという事実を強調しています。

側線に関連するとして成人再生は、我々は、胚/幼虫と成魚のそれとの間neuromastsの再生のための同じような時間枠を見つけました。などの他、ゼブラフィッシュ胚および12月24日時間後アミノグリコシドウォッシュアウト⁸時幼虫を表示感丘再生によって以前に報告された。我々は、16 HPGプラトーに到達して（ 図2に示すように、8時間の時点の完全な編目とはみなされない）8-12時間フレーム中に現れる感丘再生の線形位相を観察した。胚および幼虫のために報告されるようにステッチ内neuromastsの完全な制御のような外観は、24 HPGまで観察されなかった。完全な制御のような外観が大人ゼブラフィッシュで半ばボディ領域の4つのすべてのステッチ内neuromastsの数と強度の両方を意味する。 neuromastsのレベルで得られた定量結果は統計的に有意でない場合はさらに、研究者はneuromasts内の個々の有毛細胞のレベルに彼らの研究を拡張することができます我々の手順で説明したように、共焦点顕微鏡を用いた。

この資料に記載されneuromasts /有毛細胞の再生アッセイは最高の大人のゼブラフィッシュではなく、初期胚/幼虫の段階で明らかにされている疾患状態に適用することができます。成体ゼブラフィッシュの側線システム内の幹細胞アッセイの制限）が1であるか否かの実験条件の影響に関する特定の病状又は2）薬理学的に誘発される疾患状態を模倣するトランスジェニック株]。この点に関して、成体ゼブラフィッシュの特定の疾患状態または有毛細胞系統の幹細胞に影響を与えないことがあり、その感丘再生が^8,24,25を処理するこれらの幹細胞の増殖/分化に完全に依存して注意することが重要である。

この制限の例として、我々は、I型糖尿病の成人のゼブラフィッシュモデルに行った実験について説明します。このparticulAR疾患モデルは、高血糖²⁸によって誘発される長期的な二次的合併症を研究するために、成人のゼブラフィッシュで開発された。先に説明した^28,29いくつかの理由で、これらの研究は、成体ゼブラフィッシュを用いて行うことができる。彼らは神経支配の特殊な細胞構造と一緒に末梢神経に悪影響を糖尿病患者に影響を受けるため、我々はneuromasts /有毛細胞の側線再生はまた、糖尿病、ゼブラフィッシュで損なわれたかどうかを判断したかった。側線リハビリアッセイを使用して統計的に有意な遅延が感丘再生において検出された。この否定的な結果を確認するため、実験を個々の有毛細胞のより洗練されたレベルで繰り返した。再度、統計的に有意な差は対照および糖尿病群との間の有毛細胞再生は観察されなかった。そのため、データは高血糖が感丘/有毛細胞の再生を妨げるという仮定と矛盾た。 Possibly高血糖状態に有毛細胞系統の幹細胞の耐性に起因する。念頭に置いてこの制限により、この資料に記載されneuromasts /毛細胞再生アッセイは、横方向のラインシステムを使用してモニターし、任意の特定の大人のゼブラフィッシュ疾患モデルは、有毛細胞の再生過程で機能障害を伴うかどうかをテストするための手段を提供していますか。肯定的な結果は、幹細胞の関与を暗示する、さらなる研究は従って保証されることになる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml)	Sigma Aldrich	G1397
2 Phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol	Aldrich	D-3418	485 nm excitation λ and 603 nm emission λ
6-well Plates	Mid Sci	TP92006
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
Glass Bottom Microwell Dishes	Matek Corporation	P35G-1.5-14-C
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting  Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
ImageJ software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.
Confocal microscope	Olympus	FV10i	Any high resolution fluorescent microscope is suitable
Aquatic System	KG Aquatics ZFS Rack System		Any aquatic system can be used