성인 Zebrafish의의 측면 라인 재생을위한 분석

Summary

신경 및 비 신경 질환의 많은 지브라 피쉬의 모델 성어보다는 배아 / 유생으로 연구되어 있기 때문에, 우리는 성인 zebrafish의 질병 모델에 적용 할 수있는 양적 측면 라인 회생 분석법을 개발 하였다. 분석은 1) neuromast 2) 개별 머리 세포 수준의 해상도를하고있었습니다.

Abstract

때문에 사람의 청각과 균형 장애의 임상 적 중요성에, 같은 제브라 피쉬와 같은 모델 생물은 옆 선 개발과 재생을 연구하는 데 사용되었습니다. 제브라 피쉬는 그것의 빠른 개발 시간과 높은 재생 능력의 이러한 연구에 특히 매력적이다. 지금까지, 옆 선 중생의 제브라 피쉬의 연구는 주로하기 때문에이 단계에서 neuromasts의 낮은 숫자의 배아와 유생 단계의 물고기를 활용했다. 이 측선 재생 /과 또는 이전 개발 단계에서보다 쉽게​​ 개발의 정량 분석​​을했다. 신경과 비 신경 질환의 많은 제브라 피쉬 모델은 어른 물고기가 아닌 배아 / 유충에서 공부하고 있기 때문에 분석이 가능했던, 그래서 우리는 현재에 적용 할 수있는 성인 제브라 피쉬의 양적 측면 라인 회생 분석 개발에 집중 성인 zebrafish의 질병 모델. 반 TRUM에 의해 이전의 연구에 구축P 등. ¹⁷ 성인 멕시코 장님 동굴 물고기와 제브라 피쉬 (다니오 rerio)에있는 유모 세포의 제거를위한 절차를 기술 한, 우리의 분석은 제어 및 실험 그룹 사이의 정량적 인 비교를 할 수 있도록 설계되었습니다. 이것은 측선의 규정 된 영역에 모발 세포의 겐타 마이신 유도 된 괴사를 다음 24 시간 기간 동안 neuromast 재현의 퍼센트에 근거 회생 neuromast 표준 곡선을 개발함으로써 달성되었다. 분석은 또한 해상도의 높은 수준이 요구되는 개별 모발 세포 레벨의 분석을 확장 할 수 있도록 설계되었다.

Introduction

옆 선 (LL) 시스템은 청각, 균형, rheotaxis하고 학교와 포식자 회피 ^1-5으로 중재 행동에 대한 책임이 모두 물고기와 양서류에서 발견 mechanosensory 기관이다. 이는지지 세포에 의해 둘러싸여 유모 세포의 클러스터로 구성되며, 둘 모두는 neuromasts ⁶ 불리는 구조에 배치된다. 이 neuromasts는 일반적으로 물고기의 머리에서 관찰 된 일부 수평 바늘 몸과 꼬리의 길이 방향 축을 따라 (바늘라고 함)의 수직 라인으로 구성되어 있습니다. 성인에서 neuromasts는 배아 또는 애벌레 물고기 ^6에 비해 바늘 내 번호 상당히 크다. 제브라 피쉬의 생물 의학 연구는 항생제 치료, 소음에 의한 외상, 만성 감염 등의 효과에 초점을 맞추고있다. 유모 세포에 시도에서 ^7,8 더 ^나은 인간에 미치는 영향을 이해합니다.

대부분의 척추 동물과는 달리, 테이러한 제브라 피쉬 (다니오 rerio) 등 leosts는 손실 유모 세포를 재생하는 기능이 있습니다. 제브라 피쉬 때문에 자신의 빠른 개발 시간과 높은 재생 능력으로 특히 유용하다. 그러나 현재; 옆 선 개발 및 / 또는 재생에 제브라 피쉬의 연구는 주로 쉽게 계산 및 분석 ^6,9,10 수 있습니다 옆 선 neuromasts의 감소 번호로 배아 및 애벌레 단계의 물고기를 활용했다.

그러나, 신경과 비 신경 질환 ^11-16의 많은 제브라 피쉬 모델은 어른 물고기가 아닌 유충에서 공부, 우리는 겐타 마이신을 사용하여 성인 제브라 피쉬의 옆 선 회생 분석 (이전에 zebrafish의 유충에 사용되는 아미노 글리코 사이드 개발에 초점을 맞추고 분석이 가능했던 있도록 최근에) 성인 물고기 ^(17)에 사용되는 현재의 성인 zebrafish의 질병 모델에 적용 할 수 있습니다. 이전에 반 트럼프 전자에 의해 절차를 발표하면서t AL. ¹⁷ 성어 헤어 셀 절제를위한 조건을 확립, 그들은 제어와 같은 형질 전환 지브라 피쉬 라인 또는 약리학 적으로 유도 된 질병 상태를 사용할 때와 같은 실험 그룹 간의 정량적 비교를 위해 필요한 neuromast 재생을위한 표준 곡선을 확립하지 않았다 제브라 피쉬 ^18. 따라서 우리는 제어 및 실험 그룹을 비교할 때 같은 성인 zebrafish의 질병 모델과 마찬가지로 우리의 데이터를 사용할 수 수사관을 가능하게 neuromast 재생의 표준 곡선을 설정하는 머리 세포 제거에 대한 반 트럼프 등. ^17의 절차를 따랐지만 자신의 작품에 구축 . 분석은 또한 해상도가 높은 레벨이 요구 될 때 개별 머리카락 세포로 분석의 확장을 허용하도록 설계되었다.

Protocol

모든 절차는 "실험 동물 관리의 원칙"에 설명 된 지침에 따라 수행된다 (건강 간행물의 국립 연구소 없음. 85-23, 1985 년 개정) 및 승인 로잘린 프랭클린 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 동물 프로토콜은 08-19.

머리 세포 괴사의 1. 겐타 마이신 유도

1. 0.004 %의 최종 농도 (4.32 ㎜)에 생리 식염수에 황산 젠타 마이신을 준비한다.
2. 0.004 % (4.32 ㎜) 겐타 마이신 용액이 들어있는 용기에 어른 물고기 (D. rerio, 연령 4 ~ 6 개월) 놓습니다. 모든 컨테이너를 사용할 수 있습니다,하지만 우리는 폭 7, 고 6, 긴 7 인 Pharmacal 물 시스템에서 물고기 컨테이너를 사용합니다. 24 시간 동안 28 ° C에서 설정 인큐베이터에서 물고기와 컨테이너를 배치합니다. 24 시간 동안 실행 가능한 상태로 물고기를 유지하기에 충분한 수준으로 탱크 내의 유체의 총 체적을 설정한다. 참고 : 겐타 마이신 유체의 통기가 nece하지 않습니다ssary 충분한 볼륨이 치료되는 어류의 번호를 사용하는 경우.

머리 세포의 2. 생명 염색

1. 15 ㎎ / ㎖ 작업 스톡 용액으로부터 형광 중요한 염료 [4-4 - 디 에틸 아미노)-N-메틸 피리 디늄 요오다 이드 (485 nm의 여기 λ 및 메탄올 603 nm의 발광 λ)의 (정상 식염수) 0.08 % 농도를 준비 에탄올.
2. 젠타 마이신 치료가 치료 물고기가 중요한 염료를 포함하는 6 웰 배양 플레이트의 우물에서 물고기를 배치하여 즉시 얼룩 져 제어 및 겐타 마이신의 일부 효과가 있는지 확인하십시오. 그 물고기는 75 분 동안 염색되지 않도록 통계적 유의성이 달성 될 때까지 필요에 따라 충분한 물고기의 수 (및 배양 플레이트를 사용합니다. neuromast 계산의 심사관의 속도에 따라, 시간이 지남에 따라 지그재그 방식으로 접시에 물고기를 배치 단계 2.3에 기재된대로.
3. 형광 현미경에 의해 벤치 서랍 단계 2.2에서 접시를 놓습니다스테인드 neuromasts의 검사에 사용. 실온에서 1 시간 염색에 걸쳐 중요한 염료의 냉각을 방지하기 위해 실내 조명을 끄십시오.
4. 염료 세척 아웃 마취 물 탱크를 모두 준비합니다. 염료 씻어 ​​아웃 물은 일반 물 물고기이며, 보통 물고기 물에 1:1,000 희석이 달성되도록 마취 물, 충분한 2 - 페녹시 에탄올을 추가합니다.
5. 초과 중요한 염료를 씻어 중요한 염료 염색 물고기의 관찰 3.1 단계로 진행하기 위해 여분의 일반적인 물고기 물에서 물고기를 놓습니다.
6. 28 ℃에서 8-16 사이의 시간 동안 인큐베이터에 일반 물고기 물에 세척 겐타 마이신 처리 된 생선을 전송, neuromasts의 재생을 검사하려면
7. 8-16 시간 사이에 여러 번, 물고기, 인큐베이터에서 제거 세척 단계 2.1-2.4에 표시된 스테인드됩니다. 중요한 염료 염색 물고기의 관찰 3.1 단계로 진행합니다.

3. 마취 생선 Neuromasts의 형광 계수

1. 중앙 신체 바늘의 중요한 염료 염색 neuromasts의 디지털 이미지를 얻기 위해 형광 실체 현미경의 무대에 뚜껑을 놓습니다.
2. 사용하는 형광 실체 현미경에 배치 된 디지털 카메라는 이후의 정량 분석​​을위한 이미지를 캡처하는 배의 배율을 설정합니다. 실체 현미경의 배율 설정이 사용되는 현미경의 브랜드에 따라 달라질 수 있지만, 설정은 중앙 신체 바늘에서 쉽게 볼 수 있도록 개별 neuromasts의 계산을 허용해야합니다.
3. (그림 1 참조) 오른쪽 가슴 지느러미에 바로 인접 물고기의 가장 아래 복부 측면에있는 4 개의 지정 바늘에서 볼 수 neuromasts의 수를 계산하여 재생의 양을 결정합니다. 통계 분석을 위해 같은 ANOVA 오 같은 적절한 테스트를 사용연구 학생의 T-테스트. 실험 시점 당 5 물고기의 최소값을 활용해야하고 모든 실험은 3 배의 최소 반복되어야한다.
4. neuromast 재생 시간 곡선을 바탕으로 (그림 3 참조), 재생 곡선의 선형 위상 내에 8-16 시간 포스트 겐타 마이신 씻어 아웃 사이 neuromasts을 계산합니다. 참고 : 선형 시간 단계의 사용은 제어 및 실험 그룹간에 적절한 정량 분석​​을 할 수 있습니다.

Neuromast 분석은 통계적으로 유의하지 않은 경우 정량 분석​​의 높은 해상도를 얻기 위해 개별 모발 세포의 4. 형광 계수

1. neuromasts의 레벨에서 정량적 분석이 중요하지 않은 경우에, 개별 모발 세포 수준에서의 분석은 또한 해상도가 높은 수준을 얻기 위해 이용 될 수있다. 특정 시점 포스트 겐타 마이신 씻어 아웃 (시점을 이전 neuromast 연구 기준), 생명 색소 성에서 물고기를 선택이 프로토콜에 설명 된 물고기를 아인 후 1-5 분 동안 1:500 희석액에 2 - 페녹시 에탄올을 사용하여 물고기를 안락사.
2. 다음과 같이 사각형 피변 준비가 이루어 지도록 담금질 않도록 부드러운 조명에서, 네 개의 절개를 만든다. 이 뒷 지느러미와 정렬 될 때까지 물고기의 상부 늑골을 따라 절개를 한 후 배에서 절개를하고, 마지막으로, 그래서 광장 피부 플랩이 만들어 이러한 절개의 양쪽에있는 두 개의 수직 절개를합니다. 참고 :이 피부 준비 neuromast 실험에 사용 된 중간 바디 스티치를 통합 할 것입니다.
3. 유리 슬라이드에 피부 표본을 놓고 다음 앵커를하는 데 도움이 이후의 디지털 이미징을위한 조직을 평평하게 절제 피부 표본을 통해 원형 유리 커버 슬립을 배치합니다.
4. 단계 8.6에서 피부 표본을 사용하여, 중간 품 스티치 각각 neuromast 내의 유모 세포의 디지털 이미지를 얻는다. 적어도 60 배의 배율로 이미지를 가져온 후 머리 CE를 계산제어 및 실험 그룹의 비교 정량 분석에 대한 개별 neuromasts 내 LLS (그림 4 참조).

Representative Results

성인 제브라 피쉬의 측면 라인의 neuromast 재생을 정량화하기위한 절차의 최적화.

애벌레 제브라 피쉬의 neuromasts 쉽게 가늠할 수있다; 그러나, 성인 제브라 피쉬의 측면 라인은 ^6,17,19,20 정량적 분석을 더욱 어렵게 만드는 스티치 당 neuromasts 훨씬 더 많은 수 있습니다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, 헤드는 중앙부 또는 꼬리 하나에 비해 neuromasts의 현저하게 더 높은 번호를 가지고; 도 1d에 도시 된 바와 같이 꼬리 영역 neuromasts의 최소 개수를 갖는. 헤드 스티치 패턴이 복잡하고 neuromasts의 수가 상당히 큰이므로, 정량 분석​​을위한 영역으로서 적합하지 않았다. 또한,에 관계없이 우리가 테스트 겐타 마이신 농도, 머리 전체에 neuromasts의 완전한 제거는 거의 달성 할 수 없었다; 관찰 neuromasts의 떠나는 명소 이전에 대조적으로 반 트럼프 등. ^(17)에 의해보고 된 겐타 마이신 치료 후, 꼬리는 너무 적은 neuromasts을 가지고 있으며, 이에 따라 정량적으로 성인에 neuromast 재생을 분석 중반 바디 영역 (그림 1B)를 선택했다. 이 지역에서, 우리는 네 개의 바늘 그냥 모든 성인 [61.45 (N = 95)] (그림 1B와 1E) 사이 neuromast 번호에 일치했다 측면 가슴 지느러미 후방에 확인했다. 중요한 사실은, 우리는 (이전에 반 트럼프 등. ^17에보고 된) 지속적으로 완전히 (그림 1B와 1E을 비교 neuromast 재생의 후속 정확한 결정을 허용 24 시간 0.004 %의 겐타 마이신 처리에 의해이 지역의 neuromasts을 브레이션 할 수 있었다 그림 2, 0 시간)과 삽입물.

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그림 1. 성인 제브라 피쉬의 바늘 내 neuromast의 형광 패턴이 세로 축에 표시됩니다. 패널은 머리 지역이며, 패널 B는 상자 설명 정량 분석에 사용되는 네 개의 바늘 중간 바디의 영역이다. 패널 C는 후방 몸의 영역이다. 패널 D는 꼬리 지느러미 지역이다. 정량 분석에 사용되는 중간 몸 지역의 4 바늘의 높은 배율은 1 배에서 2 배의 패널 E. 확대 전원에 표시됩니다.

그것은 황산구리 치료 배아와 유충 ^(21)에 머리카락 세포의 급속한 괴사를 유도하기 위해 효과적인 화학적 방법 인 것으로보고되었다. 여기에서 우리는 neuromast 절제를 유도하는 시간을 단축 할 수 있다는 희망을 황산구리 치료를 시험했다. 이르기 황산구리 농도5-50 MM은 이전에 그것은 황산구리 성인 물고기 낮은 농도에서 효과가 없습니다 더 높은 농도에서 치명적이었다 것으로 나타났습니다 리앙 등. ^(21)에 의해보고 된로 최대 48 시간이 사용되었다 다양한 노출 시간을 위해 (데이터가 표시되지 않음)에게 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

성인 제브라 피쉬의 옆 선 중생의 형광 분석에 사용되는 매개 변수.

네 중간 바디 스티치 내의 모든 neuromasts가 24 시간 겐타 마이신 치료 (그림 2, 제어 0 시간 비교)과 긍정적 인 재생이 스티치 내에있는 3 neuromasts의 최소한의 모양에 의해 결정되었다 다음 절제 한 후 재생을 모니터링 하였다. (그림 2, 0 시간). 8 HPG으로, 물고기의 약 삼분의 복구의 일부 기호 (N = 3을했다4); neuromasts의 강도는 회생 스티치 (그림 2, 8 시간, 상자에 의해 설명 희미한 글자)을 희미한 이었더라. 재생 16 HPG의 고원 (그림 2, 8 시간에 그림 2, 16 시간을 비교)에 도달 할 때까지 neuromasts의 수와 강도는 선형으로 증가하는 것을 계속했다. 이 겐타 마이신으로 치료 모든 물고기가 완전히 컨트롤에 비해 옆 라인 스티치 내 neuromasts 같은 수와 강도 (그림 2, 24 시간)를 모두 회수했다 최소 24 HPG까지되지 않았습니다. 겐타 마이신 철수 다음 neuromast 재생을위한 시간 라인은 복구 곡선의 선형 및 고원 단계를 보여주는 그림 3에서 볼 수 있습니다. 우리는 경우의 5 % 미만에서, 재생 바늘 개별 요소로 표시하지 않은 대신 형광 얼룩으로 나타나 있습니다.

그림 2. neuromasts의 형광 이미지. 제어 물고기 (즉시 0.004 %의 겐타 마이신 치료 24 시간을 다음) 0 시간 물고기, 정량 분석에 사용되는 4 바늘 내 neuromasts의 일부 희미한 얼룩과 8 시간의 물고기 (8 HPG)는 (모든 물고기의 30 %가이 패턴을 보여 주었다 8 HPG에서 염색, 70 %가이 시점에서 더 neuromast 염색을 보여 주었다, 흰색 상자 8 HPG의 재생을 어느 정도 보여 주었다 물고기의 30 %에서 관찰되었다 희미 스테인드 neuromasts 개요), 16 시간 물고기, 24 시간 물고기. neuromasts의 수와 neuromasts의 염색 2) 강도는 24 HPG에 의해 관찰 된 1 점에서 4 바늘) 내 neuromasts의 완벽한 재생은. 하려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

도 3. 그래프 0.004 % 젠타 마이신 성인 지브라 피쉬의 24 시간 처리 금단 다음 neuromasts 재생의 시간 경과를 나타내는. 도시 된 바와 같이, 복구는 8 HPG 시점에서 시작하여 16 HPG 시점에서 정체기에 도달. 이것은이 선형 위상 내에서 8-16 시간 및 시간 지점 사이 neuromast 재생의 라이너 단계 정량적으로 제어 및 실험 그룹을 비교하는 데 사용되어야합니다 정의.

Neuromast 독성은 형광 염색 염료에 장기간 노출에 의해 유도된다.

우리의 추정​​에서 이러한 실험을 수행 할 수있는 이상적인 방법은 0 시간에 다시 사전 처리, 얼룩에 형광 염료로 물고기를 염색하는 것입니다 다시 얼룩t 재생 시간을 가리 킵니다. 그러나, 우리는 4 - 디 -2 - ASP를 같은 헤어 세포 형광 염색 염료도 ^(22)는 독성이 유모 세포 ^(23)에 영향을 미칠 수있는 다른 미토콘드리아 얼룩의 경우가 될 수 있다는 사실이다 이러한 연구에 합병증이 발생했습니다. 이 사실은 같은 물고기를 고용 할 수없는 반복 염색 때문에 물고기의 별도의 그룹을 사용하기 위해 우리가 필요했다. 모든 경우에 컨트롤을 포함하여 실험 물고기는 실험적인 변화를 제거하기 위해 병렬로 처리 하였다.

각각의 머리 세포의 수준에서 공 촛점 분석.

neuromast 분석에서 얻어진 결과가 통계적으로 제어 및 실험 군 사이에 유의하지 않은 경우에, 하나의 양적 비교를위한 해상도의 높은 수준을 얻기 위해 개별 우박 세포의 수준이 연구를 연장 할 수있다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군은 neuromasts (재생의 12 시간에서 유로 마스트)가이 그림에 표시된 중간 몸 지역에서 피부 준비의 공 초점 현미경으로 볼 수 있습니다. 8 시간, 10 시간, 및 재생 시간이 12 시간에서, 우리는 통제 그룹 (7 동물 / 그룹) 0-4 유모 세포 / neuromast의 범위를하였습니다. 대조군에 대해 예상 한 바와 같이 정량 할 때, neuromasts 간의 통계적 차이 (P 값은 0.230-0.472 원거리) 위에 표시된 시점에서 neuromast 당 유모 세포의 개수로 검출되지 않았다. neuromast 연구의 첫 번째 단계에서 얻어진 데이터를 확장하거나 확인하기 위하여 필요할 때 이러한 접근법은 임의의 컨트롤과 실험 군 사이에 취해질 수있다.

정의 옆 선 영역의 피부 준비를 사용하여 머리 세포 / neuromast 재생의 그림 4. 분석 내가 설명N 프로토콜 단계 3.3. 제브라 피쉬 피부 준비에서 얻은 neuromast 내의 유모 세포의 형광 공 초점 이미지. 두 개의 중요한 염료 염색 머리 세포는 제어 물고기의 neuromast (그림 4)에서 표시됩니다. 이 이미지는 겐타 마이신의 12 시간 후 제거 (선형 재생 단계)를 얻었다. 흰색 화살표가 유모 세포를 둘러싸는 지원 셀을 나타내는 반면 흰색 브라켓 기호 ()는 개별 neuromast을 나타냅니다. 지원 세포는 이러한 조건에서 얼룩과 검은 색 공간으로 표시되지 않습니다. 확대, 60X.

1	인큐베이터를 사용하여 28 ° C에서 24 시간 동안 제어 및 실험 물고기의 1. 겐타 마이신 치료 [0.004 % (4.32 ㎜)].
2	2. 유모 세포의 재생을 시작하기 위해 겐타 마이신의 세척 할 것. 8-16 시간 사이에 조사 선택한 기간에 대한 28 ° C 배양기에 물고기를 반환합니다.
2	다음 3. 중요한 염료 염색 [0.08 % 4 -4 - 디 에틸 아미노-N-메틸 피리오다 이드 (4 - 디 -2 - ASP)] 제어 및 실온에서 1 시간 동안 실험 물고기와 형광 이미징 물고기 물 얼룩을 세척 할 것.
1 또는 2	4. 필요에 의한 neuromasts의 분석에서 의미없는 결과를, 제어 및 실험 물고기의 별도의 그룹으로 프로토콜 1-3를 반복,하지만 각각의 유모 세포의 공 촛점 분석을위한 피부 준비를 얻을 수 있습니다.

표 1. 프로토콜의 개요는 위에서 설명한.

Discussion

배아와 애벌레 zebrafish의 ^8,24,25의 옆 선 (LL) 중생의 분석을 위해 설립 된 문학의 광대 한 몸을 바탕으로, 우리의 연구의 목표는 제브라 피쉬의 옆 선 재생을위한 정량적 분석을 개발하는 것이라고 할 수 최고의 성인 물고기에서 공부하는 질병 모델에 적용 할 수. 우리는 성인 물고기 배아 / 애벌레 물고기를 위해 개발 절차를 적용 할 때 특정 중요한 포인트가 중요하다는 것을 발견했다. 이러한 점의 가장 중요한 여겨진다 : 1) 측선의 수는 2) neuromast 유모 세포의 염색 기간, 3)의 농도 및 기간 아미노 글리코 사이드의 치료, 및 4), 물고기의 종축을 따라 neuromasts 아미노 글리코 시드 치료 다음 옆 선 재생의 타이밍. 이 점은 다음의 논의에서 다루어 질 것입니다.

제브라 피쉬의 측면 라인을 따라 neuromasts의 수에 관하여배아 및 유충의 제브라 피쉬 때문에 성인 물고기에 비해 주어진 스티치 내에서의 낮은 숫자의 neuromasts 간단한 패턴을 가지고있는 뚜렷한 장점이있다. 이 낮은 숫자는 조사가 명확하게 각 neuromast를 확인하고 ^6에 이름을 할당 할 수있다. 이러한 방식으로, 재생 연구는 아미노 글리코 사이드 에이전트로부터 철수 다음 언제든지 이름으로 특정 neuromast의 재현성을 정량화 할 수있다. 성인의 스티치 당 neuromasts의 더 많은 수의 배아 또는 유충의에 비해 neuromasts 재생의 재현 동안 정확한 계산과 정량화에 상당한 어려움을 소개합니다. 도시 된 바와 같이, 우리는 어른의 바늘 내 옆 선 neuromasts의 패턴을 평가하고 중앙 신체 (그림 선택 1과 2) 분석을 위해 바늘의 최적의 영역을 제공하는 것을 결정했다.

예 2와 머리 셀 염료 neuromasts 염색 - [4 - (디메틸 아미노) 스티 릴]-N-ethylpyridi천년오다 이드 (DASPEI) 또는 4 - 디 -2 - ASP는 하나의 유생 및 치어에 형광 실체 현미경 ^{(26, 27)를} 사용하여 측면 라인의 neuromasts을 시각화 할 수 있습니다. 이 같은 얼룩도 성인 물고기에 효과적이며 우리의 정량 분석​​은 중앙 신체 영역 내에서 neuromasts의 수에 유의 한 차이가 (정상 대조군 성인 물고기 61.45 neuromasts의 평균으로) 정상 제어 제브라 피쉬의 사이에서 관찰되지 않았 음을 지적했다.

- [4 - (디메틸 아미노) 스티 릴]-N-에틸 피리 디늄 요오다 이드 (DASPEI) 또는 4 - 디 -2 - ASP를 스스로 셀 ^24을 neuromast하게 독성이있을 수 있으며, 물고기 반복 될 수없는 그런이 아니라 머리 셀 염료 것으로보고되었다 하나는 아미노 글리코 사이드에 의한 재생을 모니터링하는 경우 이러한 형광 에이전트와 스테인드. 같은 물고기의 반복 염색 ⁽²³⁾ 실험 않은 해석 만드는 (얼룩 및 아미노 글리코 사이드 모두에 의해) 여러 독성 이벤트를 소개합니다. 따라서, 모든 실험neuromasts가 nontreated 겐타 마이신 제어 상태에 존재하는 1) 이었다는 것을 보여주는 연구 위해 물고기의 여러 세트의 요구 병렬 4 - 디 -2 - ASP를 염색에, 2) 완전히 겐타 마이신 노출 된 후 즉시 절제, 3) 일부에서 재생 이 아미노 글리코 사이드의 아웃 철수 세탁 다음 시간 포스트 겐타 마이신 처리. 이러한 방법으로, 모든 물고기는 neuromast 염료로 한 번 염색했다.

그것은 반 트럼프 등. ^17의 절차는 성인 물고기 머리 세포 제거에 대한 조건을 설정하는 동안, 그들은 제어 및 실험 그룹 사이의 정량적 인 비교를 위해 필요합니다 neuromast 재생을위한 표준 곡선을 설정하지 않는 것이 지적되어야한다. 따라서 우리는 24에서 머리 세포 절제 (24 시간 노출 시간을 사용하여 0.004 %의 겐타 마이신 농도, 헤어 셀 절제 결과에 대한 그림 2 참조에 대한 반 트럼프 등. ^(17)의 절차를 따라HR)하지만 neuromast 재생의 표준 곡선을 설정하는 작업을 확장했다. 이것은 우리가 우리의 분석 조건을 확립 중반 신체 영역의 네 개의 바늘을 사용하여 성인 제브라 피쉬의 LL 재생의 비교 분석을 할 수 있습니다 (그림 1 및 2 참조). 머리 셀 절제 짧은 기간이 획득 될 수 있는지를 결정하기 위해, 우리는 효과적으로 2 시간 정도로 짧은 기간 동안 유생 어류에서 사용되고 황산동의 효과를 시험 하였다. (이전에 유충을위한 회담 등. ^(21)에 의해보고 된대로 48 시간까지 다양한 노출 시간에 5 ​​~ 50 ㎜) 우리의 연구는 그 황산구리를 표시 모발 세포의 제거를위한 에이전트로 성인 물고기에 효과를 찾을 수 없습니다. 이렇게 배아 모세포의 절제 및 유충에 사용 조건이 항상 직접 성어 함께 사용 전송 될 수 없다는 사실을 강조한다.

옆 선에 관련된으로성인의 재생, 우리는 배아 / 애벌레와 어른 물고기의 사이 neuromasts의 재생 비슷한 시간 프레임을 발견했다. 12-24 시간 포스트 아미노 글리코 사이드에서 다른 사람, 제브라 피쉬 배아 및 유충 쇼 neuromast 재생에 의해 이전에보고 된 바와 같이 씻어 아웃 ^8. 우리는 16 HPG에 도달 고원과 (그림 2와 같이 8 시간 시점에 대한 전체 스티치로 볼 수없는) 8-12 시간 프레임에서 나타나는 neuromast 재생의 선형 위상을 관찰했다. 배아 및 유충에보고 된 바늘 내 neuromasts을 완전히 제어와 같은 외관은 24 HPG 때까지 관찰되지 않았다. 완벽한 제어와 같은 모양이 성인 제브라 피쉬의 중간 바디 영역의 네 바늘 내 수와 neuromasts의 강도를 모두 표시한다. neuromasts의 수준에서 얻어진 정량적 결과가 통계적으로 유의하지 않은 경우에 또한, 조사 neuromasts 내의 개별 모발 세포의 수준으로 연구를 확장 할우리의 절차에 설명 된대로 공 초점 현미경을 사용하여.

이 문서에서 설명하는 neuromasts / 헤어 세포 재생의 분석은 가장 오히려 초기 배아 / 애벌레 단계에서보다 성인 제브라 피쉬에서 발현되는 질병 상태에 적용 할 수 있습니다. 분석의 한계가 1) 특정 질환 상태 또는 성인 지브라 피쉬의 측선 시스템 내의 줄기 세포에 대한 2) 약리 유도 질환 상태]를 모방 한 형질 전환 균주 일 수 있는지 여부를 실험 조건의 영향에 관한 것이다. 이와 관련하여, 성인 지브라 피쉬의 특정 질환 상태 나 모발 세포 계보의 줄기 세포에 영향을주지 않을 수 있으며 그 neuromast 재생이 ^{8,24,25 처리} 이들 줄기 세포의 증식 / 분화에 완전히 의존 유의해야 .

이러한 제한의 예로서, 우리는 유형 I 당뇨병의 성인 제브라 피쉬 모델에서 수행 실험을 설명한다. 이 particulAR 질환 모델은 고혈당증 ^(28)에 의해 유도 된 장기 이차 합병증을 연구하기 위해 성인 제브라 피쉬에서 개발되었다. 이전 ^28,29 설명한 이유로, 이러한 연구는 성인 지브라 피쉬를 사용하여 수행 될 수있다. 그들은 정신 자극 전문 세포 구조와 함께 말초 신경에 악영향을 당뇨병 환자에 영향을하기 때문에, 우리는 neuromasts / 유모 세포의 옆 선 재생도 당뇨병 제브라 피쉬의 장애인 경우를 확인하고 싶었다. 옆 선 재생 분석을 사용하여 통계 학적으로 유의 한 지연은 neuromast 재생에서 발견되었다. 이 부정적인 결과를 확인하기 위하여, 실험은 개별 머리 셀의보다 정교한 수준에서 반복 하였다. 또, 통계 학적으로 유의 한 차이는 제어 및 당뇨 군 사이에 머리 세포 재생에 관찰되지 않았다. 따라서, 데이터는 고혈당이 neuromast / 헤어 세포 재생을 방해하는 상상과 일치했다; 피ossibly 고혈당 조건 모발 세포 계보의 줄기 세포의 저항성에 기인. 마음이 한정으로,이 문서에서 설명하는 neuromasts / 헤어 세포 재생의 분석은 옆 선 시스템을 사용하여 모니터로 특정 성인 zebrafish의 질환 모델이 머리 세포 재생 과정에서 장애를 포함하는지 여부를 테스트 할 수있는 방법을 제공한다. 긍정적 인 결과는 줄기 세포의 참여를 의미하는 것이며, 추가 연구는 따라서 보증 할 것입니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml)	Sigma Aldrich	G1397
2 Phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol	Aldrich	D-3418	485 nm excitation λ and 603 nm emission λ
6-well Plates	Mid Sci	TP92006
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
Glass Bottom Microwell Dishes	Matek Corporation	P35G-1.5-14-C
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting  Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
ImageJ software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.
Confocal microscope	Olympus	FV10i	Any high resolution fluorescent microscope is suitable
Aquatic System	KG Aquatics ZFS Rack System		Any aquatic system can be used