En analyse for Lateral Linje Regeneration i voksen sebrafisk

Summary

Fordi mange sebrafisk modeller av nevrologiske og ikke-nevrologiske sykdommer er studert i voksen fisk snarere enn embryo / larver, har vi utviklet en kvantitativ lateral linje regenerativ assay som kan brukes til voksne sebrafisk sykdomsmodeller. Analysen involvert oppløsning på 1) neuromast og 2) individuelle hår cellenivå.

Abstract

På grunn av den kliniske betydningen av hørsel og balanse lidelser i mennesket, har modellorganismer som sebrafisk blitt brukt til å studere lateral linje utvikling og fornyelse. Sebrafisk er spesielt attraktivt for slike studier på grunn av sin raske utvikling tid og høy evne til reproduksjon. Hittil har sebrafisk studier av sidelinje regenerering hovedsak benyttes fisk av embryonale og larvestadiet på grunn av lavere antall neuromasts på disse stadiene. Dette har gjort kvantitativ analyse av lateral linje regenerering og / eller utvikling lettere i de tidligere utviklingsstadier. Fordi mange sebrafisk modeller av nevrologiske og ikke-nevrologiske sykdommer er studert i voksen fisk og ikke i embryoet / larver, fokuserte vi på å utvikle en kvantitativ sidelinje regenerativ analysen i voksen sebrafisk, slik at en analyse var tilgjengelig som kan brukes på strøm voksen sebrafisk sykdom modeller. Bygger på tidligere studier av Van Trump et al. ¹⁷ som beskrevet prosedyrer for ablasjon av hårcellene i voksen meksikanske blind hulefisk og sebrafisk (Danio rerio), ble analysen vår utviklet for å tillate kvantitativ sammenligning mellom kontroll og eksperimentelle grupper. Dette ble oppnådd ved å utvikle en regenerativ neuromast standard kurve basert på prosenten av neuromast tilbakekomst over en 24 timers periode etter gentamicin-indusert nekrose av hår celler i et definert område av den laterale linje. Analysen ble også konstruert for å tillate forlengelse av analysen til den enkelte hår cellespenning når en høyere oppløsning er nødvendig.

Introduction

Sidelinjen (LL) system er en mechanosensory organ finnes i både fisk og amfibier som er ansvarlig for hørsel, balanse, rheotaxis og medier atferd som for eksempel skolegang og predator unngåelse ^1-5. Det er sammensatt av klynger av hårceller omgitt av støttelegemer, som begge er plassert i konstruksjoner kalles neuromasts ^6. Disse neuromasts er vanligvis ordnet i vertikale linjer (kalt masker) langs lengdeaksen av legemet og hale med noen små hull ble observert i hodet av fisken. I den voksne, neuromasts er betydelig større i antall i løpet av de masker som i forhold til embryonale eller larve fisk ^seks. Biomedisinske studier i sebrafisk har fokusert på effekten av antibiotikabehandling, støy-indusert trauma, kronisk infeksjon, etc. på hårcellene ^7,8 i et forsøk på å bedre forstå sine effekter hos mennesker.

I motsetning til de fleste virveldyr, teleosts, for eksempel sebrafisk (Danio rerio), har evnen til å regenerere tapte hårcellene. Sebrafisk er spesielt nyttige på grunn av deres raske utvikling tid og høy evne til reproduksjon. Til dags dato, men; sebrafisk studier på sidelinjen utvikling og / eller regenerering har hovedsakelig benyttet den embryonale og larvestadiet fisk på grunn av redusert antall lateral linje neuromasts som gjør det lettere å telle og analyse ^6,9,10.

Men er så mange sebrafisk modeller av nevrologiske og ikke-nevrologiske sykdommer ^11-16 studert i voksen fisk og ikke larvene, fokuserte vi på å utvikle en sidelinje regenerativ analysen i voksen sebrafisk ved hjelp av gentamicin (et aminoglykosid tidligere brukt i sebrafisk larver og Mer nylig brukt sammen med voksen fisk ^17), slik at en analyse var tilgjengelige som kunne anvendes på aktuelle voksne sebrafisk sykdomsmodeller. Mens tidligere utgitt prosedyrer ved Van Trump et al. ¹⁷ etablerte betingelsene for hårcelle ablasjon i voksen fisk, gjorde de ikke etablere en standardkurve for neuromast regenerering som er nødvendig for kvantitativ sammenligning mellom kontroll og eksperimentelle grupper som ved bruk av transgene sebrafisk linjer eller farmakologisk indusert sykdomstilstander i sebrafisk ^18. Vi har derfor fulgt prosedyrene for Van Trump et al. ¹⁷ for hårcelle ablasjon, men bygget på deres arbeid for å etablere en standardkurve for neuromast regenerering slik at etterforskerne å bruke våre data når man sammenligner kontroll og eksperimentelle grupper som med voksne sebrafisk sykdom modeller . Analysen ble også konstruert for å tillate forlengelse av analysen til den enkelte hår cellen når en høyere oppløsning er nødvendig.

Protocol

Alle prosedyrer er utført i henhold til retningslinjene som er beskrevet i "Principles of Laboratory Animal Care" (National Institutes of Health publikasjon ingen. 85-23, revidert 1985) og den godkjente Rosalind Franklin Institutional Animal Care og bruk komité dyr protokollen 08-19.

En. Gentamicin-induksjon av Hair cellenekrose

1. Forbered gentamicin sulfat i normal saltoppløsning ved en endelig konsentrasjon på 0,004% (4,32 mM).
2. Plasser voksen fisk (D. rerio, 4-6 måneders alder) i en beholder som inneholder 0,004% (4,32 mm) gentamicin løsning. Enhver beholder kan anvendes, men vi bruke en fiskebeholder fra en Pharmacal Aquatic system som er 7 i bred, 6 i høy og 7 i lang tid. Plasser beholderen med fisk i en inkubator innstilt ved 28 ° C i 24 timer. Sett det totale volum av fluidet i tanken ved et tilstrekkelig nivå for å opprettholde fisken i en levedyktig tilstand i den 24-timers periode. Merk: Lufting av gentamicin væske er ikke nøssary hvis tilstrekkelig volum er brukt for antall fisk som behandles.

2. Vital Farging av hårceller

1. Tilbered en 0,08% konsentrasjon (i fysiologisk saltvann) av den fluorescerende vitale fargestoff [4-4-diethylaminostyryl)-N-metylpyridiniumjodid (485 nm eksitasjon λ og 603 nm emisjon λ i metanol) fra et arbeidsstamløsning av 15 mg / ml i etanol.
2. For å bestemme om gentamicin behandlingen var effektiv en undergruppe av kontroll og gentamicin behandlede fisk er farget straks ved å plassere fisken i en brønn i en 6 brønners dyrkings-plate inneholdende det vitale fargestoff. Bruk et tilstrekkelig antall fisk (og kulturplater som kreves for statistisk signifikans som skal oppnås. Basert på sensors hastighet neuromast telling, plassere fisken i platene på en forskjøvet måte over tid, slik at fisken ikke er farget i over 75 min som beskrevet i trinn 2.3.
3. Plasser platene fra trinn 2,2 i en benk skuff av det fluorescerende mikroskop for åbrukes til undersøkelse av farget neuromasts. Slå av lyset i rommet for å hindre slukke av vital fargestoff over 1 hr flekker periode ved romtemperatur.
4. Forbered både dye wash-out og anestesivanntanker. Dye utvasking vann er normalt vann og fisk for bedøvelse vann, tilsett tilstrekkelig 2-fenoksyetanol, slik at en 1:1.000 fortynning i normalt fiskevann oppnås.
5. Plasser fisken i overkant normal fisk vann for å skylle overflødig vital fargestoff og fortsett til trinn 3.1 for observasjon av vital fargestoff farget fisk.
6. For å undersøke regenereringen av neuromasts, overfører gentamicin-behandlet fisk som ble vasket på vanlig fiskevann til en inkubator for mellom 8 til 16 timer ved 28 ° C.
7. Til forskjellige tider mellom 8-16 timer, blir fisken fjernet fra inkubatoren, vasket og farget som beskrevet i trinn 2.1 til 2.4. Gå videre til trinn 3.1 for observasjon av vital fargestoff farget fisk.

Tre. Anesthetizing Fisk og Fluorescent telling av Neuromasts

1. Sett lokket på scenen av en fluorescerende stereo mikroskop for å få et digitalt bilde av de vitale fargestoff farget neuromasts på midten av kroppen masker.
2. Bruk et digitalt kamera plassert på fluorescerende stereo mikroskop satt en forstørrelse på 2X å ta bilder for påfølgende kvantitativ analyse. Merk: Forstørrelsen innstilling av stereomikroskop kan avhenge av den helt av mikroskop, men innstillingen bør tillate enkel visning og telling av enkelt neuromasts innen midten av masker kroppen.
3. Bestemme mengden av regenerering ved å telle antallet av synlige neuromasts innenfor de fire utpekte masker på den nederste ventrale side av fisken proksimalt til høyre brystfinnen (se figur 1). For statistisk analyse bruke en passende test som ANOVA or en Student T-test. Eksperimenter bør benytte et minimum av 5 fisk per tidspunkt og alle eksperimenter bør gjentas minst 3x.
4. Basert på neuromast regenerering tidskurven (se figur 3), telle neuromasts mellom 8-16 timer post gentamicin utvasking for å være innenfor den lineære fase av regenereringen kurve. Merk: Anvendelse av den lineære tidsfasen muliggjør riktig kvantitativ analyse mellom kontrollen og eksperimentelle grupper.

4. Fluorescent Opptelling av Individuell hårceller for Innhenting Høyere oppløsning av Quantitative Analysis hvis Neuromast Analysis er ikke statistisk signifikant

1. Ved den kvantitative analyse på nivå med neuromasts ikke er vesentlig, kan analysen på nivået av den enkelte hår cellen også benyttes til å oppnå en høyere grad av oppløsning. Velg fisk på et bestemt tidspunkt etter gentamicin utvasking (tidspunkt basert på de tidligere neuromast studier), vital fargestoff stain fisken som beskrevet i protokoll 2, og deretter avlive fisken ved anvendelse av 2-fenoksyetanol ved en 1:500 fortynning i 1 til 5 min.
2. I dempet lys for å unngå bråkjøling, blir fire snitt, slik at en kvadratisk hudbunt preparat ble fremstilt som følger. Lag et snitt langs de øvre ribbe av fisken til den er på linje med analfinnene, og deretter gjøre et snitt på tvers av buken, og til slutt, må to vertikale snitt på hver side av disse snittene slik at den firkantede huden klaff er opprettet. Merk: Denne huden forberedelse vil innlemme midten kroppen masker som brukes i neuromast eksperimenter.
3. Plasser hudprøve på et glass lysbilde og deretter plassere en sirkulær glass dekkglass over uttatt hudprøve å hjelpe anker og flat vevet for etterfølgende digital bildebehandling.
4. Bruke hud prøvene fra trinn 4.3, få digitale bilder av hårcellene innenfor hver neuromast på midten av kroppen masker. Ta bilde med en forstørrelse på minst 60X, og deretter telle håret cells innenfor individuelle neuromasts for sammenlignende kvantitativ analyse av kontrollen og eksperimentelle grupper (se figur 4).

Representative Results

Optimalisering av prosedyrene for å kvantifisere neuromast regenerering av sidelinjen i voksen sebrafisk.

De neuromasts av larvesebrafisk er lett kvantifiserbare; har imidlertid den laterale linje av den voksne sebrafisk et mye større antall neuromasts pr søm gjør kvantitative analyser vanskeligere ^6,17,19,20. Som vist i figur 1A, har hodet en betydelig høyere antall neuromasts i forhold til enten den midtre del eller hale; med hale område som har det minste antall neuromasts som vist i figur 1D. Fordi mønsteret av masker i hodet er komplisert og betydelig større i antall neuromasts, gjorde det ikke egner seg som et område for kvantitativ analyse. Videre, uavhengig av gentamicin konsentrasjon vi testet, fullstendig ablasjon av neuromasts hele hodet var sjelden oppnåelige; etterlot flekker av neuromasts observert etter gentamicin behandling som tidligere rapportert av Van Trump et al. ¹⁷ I kontrast, har halen for få neuromasts, og som sådan, vi valgte den mid-kroppsregion (Figur 1B) til kvantitativt analysere neuromast regenerering i den voksne. I denne regionen har vi identifisert fire sting bare posterior til den laterale brystfinnen som var konsistente i neuromast antall blant alle voksne [61.45 (n = 95)] (Tall 1B og 1E). Viktigere, var vi i stand til å konsekvent og helt avsmelte neuromasts i denne regionen av en 24 timers 0,004% gentamicin behandling (som tidligere rapportert i Van Trump et al. ¹⁷⁾ åpner for en påfølgende nøyaktig bestemmelse av neuromast regenerering (sammenlign figur 1B og 1E og innfelt med figur 2, 0 hr).

p_upload/51343/51343fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. Den fluorescerende mønster av neuromast innenfor masker av den voksne sebrafisk er vist langs den langsgående aksen. Panel A er leder-regionen, er Panel B den midtkroppsregion med de fire masker som brukes for kvantitativ analyse skissert med en boks. Panel C er posterior-kroppsregion. Panel D er halefinnen regionen. En høyere forstørrelse av de fire masker av Midt-kroppsregion brukes for kvantitativ analyse er vist i Panel E. Forstørrelse Power of 1X og 2X.

Det har blitt rapportert at kobbersulfat behandling er en effektiv kjemisk metode for å indusere hurtig nekrose av hårceller i befruktede egg og larver ^21.. Her har vi testet kobber sulfate behandling med håp om at det kan forkorte tiden til å indusere neuromast ablasjon. Kobber sulfat konsentrasjoner fra5 til 50 mM for forskjellige eksponeringstider opp til 48 timer ble benyttet slik det ble tidligere rapportert av Liang et al. ^21. Det ble funnet at kobber var dødelig ved høyere konsentrasjoner, og ikke effektiv ved lavere konsentrasjoner i voksen fisk (data ikke vist) . Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Parametrene som brukes for fluorescerende analyse av sidelinje regenerering i voksen sebrafisk.

Regeneration ble overvåket etter alle neuromasts innenfor de fire mid-body masker ble ablateres etter 24 timers gentamicin-behandling (Figur 2, sammenligne 0 hr med kontroll) og positiv regenerering ble bestemt av utseendet til et minimum av tre neuromasts innenfor et sting. (Fig. 2, 0 time). Av åtte HPG, omtrent en tredjedel av fisken hadde noen tegn på bedring (n = 34); selv om intensiteten av neuromasts var svak i de regenererende masker (figur 2, 8 timer, svake masker skissert av boksene). Antallet neuromasts og deres intensitet fortsatte å øke på en lineær måte til regenerering nådde et platå ved 16 hpg (sammenlign figur 2, i 16 timer med figur 2, 8 timer). Det var ikke før minst 24 hpg at all fisk som ble behandlet med gentamicin var fullstendig restituert med både like tall og intensiteter av neuromasts innenfor den laterale linje masker som sammenlignet med kontroller (figur 2, 24 t). En tidslinje for neuromast regenerering etter gentamicin uttak er vist i figur 3, som viser de lineære og platåfasen av utvinningskurve. Vi merker oss at i mindre enn 5% av tilfellene, klarte de regenererende masker ikke fremstå som individuelle enheter, men i stedet fremstått som en smøre av fluorescens.

Figur 2. Fluorescent bilder av neuromasts. Kontrollfisken, 0 Hr fisk (umiddelbart etter 24 timer på 0,004% gentamicin behandling), 8 Hr fisk (8 hpg) med noen svak farging av neuromasts innenfor de fire masker som brukes for kvantitativ analyse (kun 30% av all fisk viste dette mønsteret av flekker på 8 hpg, 70% viste ingen neuromast flekker på dette tidspunkt, de hvite boksene skissere svakt farget neuromasts som ble sett i 30% av fisken som viste noen grad av regenerering på 8 HPG), 16 Hr fisk, og 24 Hr fisk. Komplett regenerering av neuromasts innenfor de fire masker i forhold til en) antall neuromasts og 2) intensiteten av farging av neuromasts ble observert ved 24 hpg. Vennligst klikk her for åse en større versjon av dette tallet.

Fig. 3. Graf som viser tidsforløpet av neuromasts regenerering etter tilbaketrekning fra 24 timers behandling av voksne sebrafisk med 0,004% gentamicin. Som vist, begynner utvinning ved 8 hpg tidspunkt og nådde et platå ved 16 hpg tidspunkt. Dette definert duken fase av neuromast regenerering mellom 8-16 t og tidspunkter innenfor denne lineær fase bør brukes til å kvantitativt sammenligne kontroll-og eksperimentgrupper.

Neuromast toksisitet er indusert av langvarig eksponering for fluorescerende fargestoffer.

I vår estimering en ideell måte for å utføre disse eksperimentene vil være å sette flekker på fisk med det fluorescerende fargestoff før behandling, beis på nytt ved 0 timer og deretter sette flekker på nytt ent regenerering tidspunkter. Imidlertid fant vi en komplikasjon til disse studiene som er det faktum at håret celle fluorescerende farvestoffer som for eksempel 4-di-2-Asp, som også kan være tilfelle med andre mitokondrielle flekker ²² kan ha en toksisk virkning på hårceller ^23. Dette faktum nødt til å bruke separate grupper av fisk, siden gjentatt farging av den samme fisken ikke kunne anvendes. I alle tilfeller ble behandlet forsøksfisken inklusive kontroller i parallell for å eliminere eksperimentell variabilitet.

Konfokalmikroskoper analyse på nivå med enkelte hårcellene.

Hvis resultatene oppnådd fra neuromast analysen er ikke statistisk signifikante mellom kontrollen og eksperimentelle grupper, kan man forlenge disse studiene til nivået av de enkelte hagl cellene for å oppnå en høyere grad av oppløsning for kvantitative sammenligninger. Som antydet i figur 4, neuromasts fra en kontrollgruppe (enEuromast på 12 hr av regenerering er vist i denne figuren) kan bli sett av konfokalmikroskopi av hud preparater fra midten av kroppsregion. Ved 8 timers, 10 timers, og 12 timer av regenerering tid, fant vi at kontrollgrupper (7 dyr / gruppe) hadde en rekkevidde på 0-4 hår celler / neuromast. Som forventet for kontrollgruppene, når kvantitativt analysert, ble ingen statistisk forskjell mellom neuromasts oppdaget i form av antall hårceller per neuromast på tidspunkter som er angitt ovenfor (P-verdiene varierte 0,230 til 0,472). En slik tilnærming kan tas mellom en kontroll-og eksperimentgruppen når det er nødvendig å forlenge eller bekrefte dataene som oppnås fra den første fase av neuromast studier.

Figur 4. Analyse av hår celle / neuromast regenerering bruke hud preparater av den definerte sidelinjeområdet beskrevet in protokoll trinn 3.3. Fluorescent confocal bilde av hårceller innenfor en neuromast hentet fra en sebrafisk hud forberedelse. To vitale fargestoff farget hår celler er vist innenfor en neuromast av en kontrollfisk (Fig. 4). Dette bilde ble oppnådd 12 timer etter fjerning av gentamicin (lineær regenerering fase). Den hvite braketten symbolet () indikerer et individ neuromast mens den hvite pilen indikerer en støtte celle rundt hårcellene. Støtte celler ikke flekker under disse forholdene og vises som svarte områder. Forstørrelse, 60x.

1	1.. Gentamicin behandling [0,004% (4,32 mM)] fra kontroll-og forsøksfisk i 24 timer ved 28 ° C ved hjelp av en kuvøse.
2	To. Vask ut av gentamicin å starte regenerering av hårceller. Returner fisk til 28 ° C inkubator for etterforsker utvalgte tidsperioder mellom 8-16 timer.
2	3.. Vital fargestoff flekken [0,08% 4-4-diethylaminostyryl-N-metylpyridiniumjodid (4-di-2-Asp)]-kontroll og forsøksfisk i 1 time ved romtemperatur og deretter vaske flekk med fisk vann for fluoriserende billeddiagnostikk.
1 eller 2.	4.. Hvis det er nødvendig på grunn av ikke-signifikant resultat av analysen av neuromasts, gjenta Protocols 1-3 med en separat gruppe av kontroll-og forsøksfisk, men da får en hud preparat for konfokal analyse av enkelt hårcellene.

Tabell 1. Et sammendrag av protokollen skissert ovenfor.

Discussion

Basert på den omfattende mengde litteratur som har blitt etablert for analyse av sidelinje (LL) regenerering i embryo-og larvesebrafisk ^8,24,25, målet med vår studie var å utvikle en kvantitativ analyse for sidelinje regenerering i sebrafisk som kunne påføres sykdom modeller som er best studert i voksen fisk. Vi fant ut at visse kritiske punkter er viktig når du søker prosedyrer utviklet for embryo / larve fisk til voksen fisk. Den viktigste av disse punkter betraktes: 1) antall laterale linje neuromasts langs lengdeaksen av fisk, 2) varigheten av farging av neuromast hårceller, 3) konsentrasjonen og varigheten av behandlingen av aminoglykosid, og 4) tidspunktet for lateral linje regenerering etter aminoglykosid behandling. Disse punktene vil bli behandlet i den følgende diskusjonen.

Med hensyn til antall neuromasts langs sidelinjen av sebrafisk, Embryo-og larvesebrafisk har den klare fordelen at de neuromasts har et enkelt mønster på grunn av det lave antallet innen et gitt sting i forhold til voksen fisk. Dette lave tallet har lov etterforskerne å identifisere hver neuromast og tilordne et navn til det ^seks. På denne måten, kan regenerering studier kvantifisere tilsynekomsten av en bestemt neuromast ved navn til enhver tid etter tilbaketrekning fra et aminoglykosid middel. Jo større antall neuromasts per sting i den voksne introduserer betydelige problemer med nøyaktig telling og kvantifisering under tilbakekomst av regenererende neuromasts i forhold til at av embryoer eller larver. Som vist, vurderte vi mønster av tverrgående linjer neuromasts i masker av den voksne, og har fastslått at mellomlegemet (Figures. 1 og 2) følger den optimale region av masker for analyse.

Farging av neuromasts med hårceller fargestoffer som for eksempel 2 - [4 - (dimetylamino) styryl]-N-ethylpyridinium jodid (DASPEI) eller 4-Di-2-Asp gjør det mulig å visualisere neuromasts av sidelinjen ved hjelp av fluorescerende stereomikros ^26,27 i larve og ungfisk. Disse samme flekker er også effektive i voksen fisk og vår kvantitativ analyse indikerte at ingen signifikant forskjell i antall neuromasts i midten av kroppen region ble observert hos normale kontrollsebrafisk (med et gjennomsnitt på 61,45 neuromasts i normal kontroll voksen fisk).

Det har blitt rapportert at håret cellefargestoffer som for eksempel 2 - [4 - (dimetylamino) styryl]-N-ethylpyridinium jodid (DASPEI) eller 4-di-2-Asp kan i seg selv være giftig for neuromast celler ^24, og fisken kan ikke være gjentatte farget med disse fluorescerende stoffer dersom man skal overvåke aminoglykosid-indusert regenerering. Gjentatt farging av den samme fisken introduserer flere toksisitet hendelser (både flekken og aminoglykosid) som gjør eksperimentet un-interpretable ^23. Følgelig, alle eksperimenteri vårt studium parallelt 4-di-2-Asp farging av flere sett av fisk for å vise at neuromasts var 1) til stede i nontreated gentamicin styre tilstand, 2) helt ablated umiddelbart etter gentamicin eksponering, og 3) regenerering av på et eller annet time etter gentamicin-behandling etter uttak og vaske ut av denne aminoglykosid. På denne måte ble all fisk farget bare én gang med neuromast fargestoff.

Det bør påpekes at mens prosedyrene for Van Trump et al. ¹⁷ etablere betingelsene for hårcelle ablasjon i voksen fisk, har de ikke etablere en standardkurve for neuromast regenerering som er nødvendig for kvantitativ sammenligning mellom kontroll og eksperimentelle grupper. Vi har derfor fulgt prosedyrene for Van Trump et al. ¹⁷ for hårcelle ablasjon (gentamicin konsentrasjon på 0,004% ved bruk av en 24 timers eksponeringstid, se Figur 2 for hårcelle ablasjon resultater på 24hr), men utvidet sitt arbeid for å etablere en standardkurve for neuromast gjenfødelse. Dette gjør det mulig for sammenlignende analyse av LL regenerering i den voksne sebrafisk ved hjelp av de fire masker på midten av kroppsregion som vi etablert for våre analysebetingelser (se figurene 1 og 2). For å kunne fastslå om et kortere tidsrom for hårcelle ablasjon kan oppnås, har vi også testet effekten av kobbersulfat, som har blitt effektivt brukt i larvefisk etter perioder så korte som 2 timer. Våre studier indikerte at kobber-sulfat (5-50 mM for forskjellige eksponeringstider opp til 48 timer som tidligere rapportert av Liang et al. ²¹ for larver) ble ikke funnet å være effektive i voksen fisk som en agent for hårcelle ablasjon. Dette understreker det faktum at forholdene som brukes for ablasjon av hårceller i embryoer og larver kan ikke alltid være direkte overført til bruk sammen med den voksne fisken.

Som angår den laterale linjeregenerering i den voksne, fant vi tilsvarende tidsrammer for regenerering av neuromasts mellom at av embryo / larve og voksen fisk. Som rapportert tidligere av andre, sebrafisk embryo og larver viser neuromast regenerering på 12-24 hr innlegg aminoglykosid utvasking ^åtte. Vi observerte den lineære fase av neuromast regenerering vises i 8-12 tidsramme (ikke sett som komplette masker for 8 timers tidspunktet, som vist på figur 2) med et platå nås ved 16 hpg. Full kontroll-lignende utseende neuromasts innenfor masker ble ikke observert før 24 hpg som rapportert for embryoer og larver. Full kontroll-lignende utseende betegner både antall og intensitet av neuromasts innenfor alle fire sting i midten av det kroppsregion i voksen sebrafisk. I tillegg, hvis de kvantitative resultater oppnådd på nivået av de neuromasts ikke er statistisk signifikant, kan undersøkeren strekker studiene til nivået for de enkelte hår celler innenfor neuromastsved hjelp av konfokal mikroskopi som beskrevet av våre fremgangsmåter.

Den neuromasts / hår celle regenerering analysen beskrevet i denne artikkelen kan brukes på sykdomstilstander som er best til uttrykk i den voksne sebrafisk i stedet for i de tidlige larve / embryonale stadier. En begrensning av analysen gjelder innvirkning av den eksperimentelle tilstand, enten det er 1) den transgene belastningen som etterligner en bestemt sykdomstilstand, eller 2) et farmakologisk induserte sykdomstilstand] på stamceller i lateral linjesystem for voksne sebrafisk. I denne forbindelse en spesiell sykdomstilstand av den voksne sebrafisk kan eller kan ikke påvirke stamceller i hårcelle linjen, og det er viktig å merke seg at neuromast regenerering er helt avhengig av disse stem celleproliferasjon / differensieringsprosesser ^8,24,25 .

Som et eksempel på denne begrensning, vil vi beskrive eksperimenter utført på voksne sebrafisk modell av type I diabetes. Dette particular sykdommen modellen ble utviklet i voksen sebrafisk for å studere den langsiktige sekundær komplikasjon indusert av hyperglykemi ^28. For en rekke grunner som er beskrevet tidligere ^28,29, kan disse studiene bare utføres ved hjelp av voksne sebrafisk. Fordi perifere nerver sammen med de spesialiserte cellulære strukturer de innerverer er negativt påvirket hos pasienter med diabetes, ønsket vi å finne ut om sidelinjen regenerering av neuromasts / hårceller ble også svekket i diabetisk sebrafisk. Bruke sidelinjen regenerering analysen ingen statistisk signifikant forsinkelse ble oppdaget i neuromast regenerering. For å bekrefte dette negativt resultat, ble forsøkene gjentatt med de mer raffinerte nivået av den enkelte hår cellen. Igjen var ingen statistisk signifikant forskjell observert i håret celle regenerering mellom kontroll og diabetiske grupper. Derfor dataene var uforenlig med den antakelse at hyperglykemi hindrer neuromast / hår celle gjenfødelse; possibly skyldes motstanden av stamceller i hårcelle linjen for hyperglykemiske tilstander. Med denne begrensningen i tankene, den neuromasts / hår celle regenerering analysen beskrevet i denne artikkelen gir et middel for å teste om en bestemt voksen sebrafisk sykdommen modellen innebærer dysfunksjon i håret celle regenerativ prosess som overvåkes ved hjelp av den laterale linjesystemet. Positive resultater skulle tilsi stamcelle engasjement og videre studier vil derfor være berettiget.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml)	Sigma Aldrich	G1397
2 Phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol	Aldrich	D-3418	485 nm excitation λ and 603 nm emission λ
6-well Plates	Mid Sci	TP92006
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
Glass Bottom Microwell Dishes	Matek Corporation	P35G-1.5-14-C
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting  Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
ImageJ software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.
Confocal microscope	Olympus	FV10i	Any high resolution fluorescent microscope is suitable
Aquatic System	KG Aquatics ZFS Rack System		Any aquatic system can be used