Um ensaio para a lateral de Regeneração de Linha em Zebrafish Adulto

Summary

Porque muitos modelos de peixe-zebra de doenças neurológicas e não neurológicas são estudadas no peixe adulto, em vez de o embrião / larvas, foi desenvolvido um ensaio quantitativo regenerativa linha lateral, que pode ser aplicada aos modelos de doenças de peixes-zebra adultos. O ensaio envolveu a resolução neuromasto 1) e 2) os níveis de células de cabelo individuais.

Abstract

Devido à importância clínica da audição e no equilíbrio do homem, de organismos-modelo, como o peixe-zebra foram usados ​​para estudar o desenvolvimento da linha lateral e regeneração. O peixe-zebra é particularmente atraente para tais estudos por causa de seu tempo de desenvolvimento rápido e sua alta capacidade de regeneração. Até o momento, os estudos de peixe-zebra de regeneração da linha lateral têm utilizado principalmente peixes dos estágios embrionários e larvais por causa do menor número de neuromastos nestes estágios. Isso fez com que a análise quantitativa da linha de regeneração e / ou mais fácil o desenvolvimento nas fases de desenvolvimento anteriores lateral. Porque muitos modelos de peixe-zebra de doenças neurológicas e não neurológicas são estudados os peixes adultos e não no embrião / larvas, que focada no desenvolvimento de um ensaio quantitativo linha regenerativa lateral, no peixe-zebra adultos de modo que um ensaio estava disponível que poderia ser aplicada a corrente modelos de doenças zebrafish adultos. Construir em estudos anteriores por Van Trump et al. ^17, que descreve os procedimentos de ablação de células ciliadas adulto mexicano peixes cegos da caverna e peixe-zebra (Danio rerio), nosso ensaio foi concebido para permitir a comparação quantitativa entre os grupos controle e experimentais. Isto foi conseguido através do desenvolvimento de uma curva padrão neuromasto regenerativo com base na percentagem de reaparecimento neuromasto ao longo de um período de tempo de 24 horas a seguir a necrose induzida por gentamicina de células ciliadas em uma região definida da linha lateral. O ensaio também foi concebida para permitir a extensão da análise ao nível da célula individual do cabelo quando é necessário um elevado nível de resolução.

Introduction

A linha lateral sistema (LL) é um órgão mecanosensorial encontrado em ambos os peixes e anfíbios que é responsável pela audição, equilíbrio, reotaxia e comportamentos de mediação, tais como escolaridade e evitar predadores ^1-5. É composta de agregados de células ciliadas rodeadas por células de suporte, os quais estão posicionados em estruturas chamadas neuromastos ^6. Estes neuromastos são normalmente organizados em linhas verticais (chamados pontos) ao longo do eixo longitudinal do corpo e cauda com alguns pontos horizontais observados na cabeça do peixe. No adulto, neuromastos são significativamente maiores em número dentro dos pontos em comparação com as de peixes embrionários ou larvar ^6. Estudos biomédicos no peixe-zebra têm-se centrado sobre o efeito do tratamento com antibióticos, trauma induzida por ruído, infecção crônica, etc. em células ciliadas ^7,8, numa tentativa de compreender melhor os seus efeitos nos seres humanos.

Diferentemente da maioria dos vertebrados, teleosts, tais como peixe-zebra (Danio rerio), têm a capacidade de regenerar células capilares perdidas. Peixe-zebra são particularmente úteis por causa do seu tempo de desenvolvimento rápido e elevada capacidade regeneradora. Até o momento, no entanto; estudos sobre o desenvolvimento de peixe zebra linha lateral e / ou regeneração têm utilizado principalmente o peixe estágio embrionário e larval, devido ao número reduzido de neuromastos linha lateral que facilita a contagem e análise ^6,9,10.

No entanto, como muitos modelos de peixe-zebra de doenças neurológicas e não neurológicas ^11-16 são estudadas no peixes adultos e as larvas não, nós nos concentramos no desenvolvimento de um ensaio de regeneração da linha lateral no peixe-zebra adulto usando gentamicina (um aminoglicosídeo usado anteriormente em larvas do peixe e mais recentemente usado com peixe adulto ^17), de modo que um ensaio estava disponível que poderia ser aplicada para adultos modelos actuais de doenças de peixes-zebra. Embora os procedimentos publicados anteriormente por Van Trump et al. ¹⁷ estabeleceu as condições para a ablação de células ciliadas no peixe adulto, eles não estabelecer uma curva padrão para a regeneração neuromasto que é necessário para comparação quantitativa entre os grupos controle e experimentais, como a utilização de linhas de zebrafish transgênicos ou estados patológicos induzidos farmacologicamente em peixes-zebra ^18. Por isso, seguiu os procedimentos de Van Trump et al. ¹⁷ para ablação de células ciliadas, mas construída sobre o seu trabalho para estabelecer uma curva padrão de regeneração neuromasto para permitir aos investigadores usar os nossos dados ao comparar os grupos controle e experimentais, tais como modelos de doenças com peixe-zebra adulto . O ensaio também foi concebida para permitir a extensão da análise para a célula de cabelo individual, quando é necessário um elevado nível de resolução.

Protocol

Todos os procedimentos são realizados seguindo as diretrizes descritas em "Princípios de Laboratório Animal Care" (Institutos Nacionais de Saúde não publicação. 85-23, revisado em 1985) e do protocolo de animais Comitê Institucional Animal Care e Use Rosalind Franklin University aprovado 08-19.

1. Gentamicina-indução de necrose das células do cabelo

1. Prepare de sulfato de gentamicina em solução salina normal com uma concentração final de 0,004% (4,32 mM).
2. Coloque o peixe adulto (D. rerio, 4-6 meses de idade) em um recipiente que contém a 0,004% (4,32 mM) solução de gentamicina. Qualquer recipiente pode ser usado, mas utiliza um recipiente de peixe a partir de um sistema aquático Pharmacal que é 7, em largura, 6 de alta, e em 7 de comprimento. Colocar o recipiente com o peixe numa incubadora a 28 ° C durante 24 hr. Definir o volume total de fluido no tanque a um nível suficiente para manter os peixes num estado viável para o período de 24 horas. Nota: O arejamento do fluido de gentamicina não é necessary se volume suficiente é usado para o número de peixes a serem tratados.

2. Coloração Vital das células ciliadas

1. Prepara-se uma concentração de 0,08% (em solução salina normal) do corante vital fluorescente [4-4-diethylaminostyryl iodeto)-N-metilpiridínio (485 nm de excitação e 603 nm λ λ emissão em metanol) a partir de uma solução de estoque de trabalho de 15 mg / ml em etanol.
2. Para determinar se o tratamento foi eficaz gentamicina um subconjunto de controlo e gentamicina peixes tratados são corados imediatamente através da colocação de peixe no poço de uma placa de 6 poços de cultura que contém o corante vital. Use um número suficiente de peixe (e placas de cultura, conforme exigido para significância estatística a ser alcançado. Baseado na velocidade do examinador de contagem neuromasto, coloque o peixe nas placas de forma escalonada ao longo do tempo para que os peixes não estão manchadas por mais de 75 min tal como descrito na etapa 2.3.
3. Coloque as placas a partir do passo 2.2 em uma gaveta banco pelo microscópio de fluorescência paraser utilizados para exame de neuromastos coradas. Desligue as luzes da sala para evitar a extinção do corante vital durante o período de coloração 1 hora em temperatura ambiente.
4. Prepare tanto corante wash-out e tanques de água anestésicos. Dye lavar-out água é água peixe normal e para água anestésico, adicione suficiente 2-fenoxietanol para que uma diluição 1:1.000 em peixes de água normal é alcançado.
5. Coloque o peixe na água em excesso peixes normais para enxaguar corante vital excesso e avançar para o passo 3.1 para observação de corante vital manchado peixes.
6. Para examinar a regeneração de neuromastos, transferir tratados pela gentamicina peixe que foram lavados em água de peixe normal de uma incubadora para entre 8-16 horas a 28 ° C.
7. Em diversos momentos entre 8-16 horas, os peixes são removidos da incubadora, lavado e corados tal como indicado nos passos 2,1-2,4. Avance para o passo 3.1 para observação de corante vital manchado peixes.

3. Anestesiar Fish and Counting fluorescente de neuromastos

1. Colocar a tampa sobre a plataforma de um microscópio estéreo fluorescente para obter uma imagem digital das corante neuromastos coradas vitais dos pontos do corpo médio.
2. Use uma câmera digital colocada no microscópio estéreo fluorescente definir uma ampliação de 2X para capturar imagens para análise quantitativa posterior. Nota: A configuração de ampliação do microscópio estéreo pode depender da marca do microscópio usado, mas a definição deve permitir uma fácil visualização e contagem de neuromastos individuais dentro de meados dos pontos do corpo.
3. Determinar a quantidade de regeneração através da contagem do número de neuromastos visíveis dentro dos quatro pontos designados no lado inferior mais ventral do peixe apenas proximal à barbatana peitoral direita (ver figura 1). Para a análise estatística utilizar um ensaio apropriado, tal como o ANOVAr T-teste de Student. Experimentos deve utilizar um mínimo de 5 peixes por ponto de tempo e todos os experimentos devem ser repetidos um mínimo de 3x.
4. Com base na curva de tempo de regeneração neuromasto (ver Figura 3), a contagem de neuromastos entre 8-16 horas pós gentamicina lava--se na fase linear da curva de regeneração. Nota: O uso da fase de tempo linear permite a análise quantitativa adequada entre os grupos controle e experimentais.

4. Counting fluorescentes das células ciliadas individual para obtenção de maior resolução da Análise Quantitativa Se a análise neuromasto não é estatisticamente significativa

1. Se a análise quantitativa no nível de neuromastos não é significativa, a análise ao nível da célula individual do cabelo também pode ser utilizada para obter um elevado grau de resolução. Selecione peixe num determinado ponto de tempo pós gentamicina wash-out (ponto de tempo com base nos estudos anteriores neuromasto), corante vital ruaain o peixe, conforme descrito no Protocolo 2, e depois sacrificá o peixe usando 2-fenoxietanol na diluição de 1:500 por 1-5 min.
2. Na luz suave para evitar extinção, fazer quatro incisões para que uma preparação retalho de pele quadrado é feita da seguinte forma. Faça uma incisão ao longo das costelas superiores do peixe até que esteja alinhado com as barbatanas anais, em seguida, fazer uma incisão em toda a barriga e, finalmente, fazer duas incisões verticais de cada lado dessas incisões para que o retalho de pele quadrado é criado. Nota: Esta preparação da pele irá incorporar os pontos do corpo meados utilizados nos experimentos neuromasto.
3. Coloque a amostra de pele numa lâmina de vidro e, em seguida, coloque uma circular lamínula de vidro sobre a amostra de pele excisadas para ajudar a ancorar e achatar o tecido de imagem digital subseqüente.
4. Utilizando as amostras de pele a partir do passo 4.3, obter imagens digitais de células ciliadas em cada neuromasto dos pontos do corpo médio. Tire fotos com uma ampliação de pelo menos 60X e depois contar o ce cabelolls dentro neuromastos individuais para análise quantitativa comparativa dos grupos controle e experimental (ver Figura 4).

Representative Results

Otimização dos procedimentos para quantificar a regeneração neuromasto da linha lateral no peixe-zebra adulto.

Os neuromastos de zebrafish larval são facilmente quantificáveis; no entanto, a linha lateral do peixe-zebra adulto tem um número muito maior de neuromastos por ponto fazendo análises quantitativas mais difícil ^6,17,19,20. Como visto na Figura 1A, a cabeça tem um número significativamente maior de neuromastos comparação com qualquer seção média ou cauda; com a região da cauda com o menor número de neuromastos como mostrado na Figura 1D. Porque o padrão de pontos na cabeça é complicado e significativamente maior no número de neuromastos, não se presta como uma região para análise quantitativa. Além disso, independentemente da concentração de gentamicina testadas, ablação completa da neuromastos toda a cabeça era raramente atingível; deixando manchas de neuromastos observados após tratamento de gentamicina como descrito anteriormente por van Trump et al. ¹⁷ Em contraste, a cauda tem poucas neuromastos, e como tal, foram selecionados região do meio-corpo (Figura 1B) analisar quantitativamente a regeneração neuromasto no adulto. Nesta região, foram identificados quatro pontos apenas posterior à barbatana peitoral lateral, que foram consistentes em número neuromasto entre todos os adultos [61,45 (n = 95)] (Figuras 1B e 1E). É importante ressaltar que nós fomos capazes de forma consistente e completamente extirpar os neuromastos desta região por um 24 horas 0,004% Tratamento de gentamicina (como já relatado na Van Trump et al. ¹⁷⁾ que permite uma determinação precisa posterior de regeneração neuromasto (comparar Figuras 1B e 1E e inserida com a Figura 2, 0 h).

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Figura 1. O padrão fluorescente de neuromasto dentro de pontos do peixe-zebra adulto é mostrado ao longo do eixo longitudinal. Painel A é a região da cabeça, Painel B é a região do Mid-corpo com os quatro pontos utilizados para a análise quantitativa delineado com uma caixa. Painel C é a região posterior do corpo. Painel D é a região da nadadeira caudal. A maior ampliação dos 4 pontos da região Centro-corpo usado para a análise quantitativa é mostrado no painel de E. Ampliação Poder de 1X e 2X.

Tem sido relatado que o tratamento com sulfato de cobre é um método químico eficaz para induzir a necrose rápida de células ciliadas em embriões e larvas ^21. Aqui nós testamos tratamento de sulfato de cobre, com a esperança de que poderia encurtar o tempo para induzir ablação neuromasto. As concentrações de sulfato de cobre que vão desde5-50 mM durante vários tempos de exposição até 48 horas foram utilizados como foi descrito anteriormente por ²¹ Liang et al. Verificou-se que o sulfato de cobre foi letal para as concentrações mais elevadas e não é eficaz em concentrações mais baixas em peixes adultos (dados não mostrados) . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Parâmetros utilizados para análise de fluorescência de regeneração da linha lateral no peixe-zebra adulto.

A regeneração foi monitorizada após todos neuromastos dentro dos quatro pontos de corpo média foram ablacionadas seguinte 24 hr gentamicina-tratamento (Figura 2, comparar 0 h, com controlo) e regeneração positiva foi determinada pelo aparecimento de um mínimo de três neuromastos dentro de um ponto de costura. (Figura 2, 0 h). Até 8 de hpg, aproximadamente um terço do peixe tinha algum sinal de recuperação (n = 34); embora a intensidade de neuromastos foi fraco nos pontos de regeneração (Figura 2, 8 horas, pontos fracos delineados por caixas). O número de neuromastos e sua intensidade continuou a aumentar de uma forma linear até regeneração atingiu um planalto a 16 HPG (comparar com a figura 2, 16 horas, com a Figura 2, 8 horas). Não foi até pelo menos 24 hpg que todos os peixes tratados com gentamicina tinha totalmente recuperado com os dois números iguais e intensidades das neuromastos dentro dos pontos da linha lateral, em comparação com os controles (Figura 2, 24 h). A linha de tempo para a regeneração neuromasto seguinte retirada gentamicina é mostrado na Figura 3, que mostra as fases lineares e de patamar da curva de recuperação. Fazemos notar que, em menos de 5% dos casos, os pontos de regeneração não aparecem como entidades individuais, mas, em vez apareceu como uma mancha de fluorescência.

Figura 2. Imagens fluorescentes de neuromastos. Peixes de controle, 0 Hr peixe (imediatamente após 24 horas de tratamento de 0,004% de gentamicina), peixe 8 Hr (8 hpg) com alguma coloração fraco do neuromastos dentro das quatro pontos utilizados para a análise quantitativa (apenas 30% de todos os peixes apresentaram este padrão de manchando a 8 hpg, 70% não apresentaram coloração neuromasto neste ponto do tempo, as caixas brancas delinear os neuromastos levemente manchadas que foram vistas em 30% dos peixes que apresentaram algum grau de regeneração em 8 HPG), 16 peixe Hr e 24 peixe Hr. Regeneração completa de neuromastos dentro dos 4 pontos em relação a 1) o número de neuromastos e 2) a intensidade da coloração das neuromastos foi observada por 24 hpg. Clique aqui paraver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Gráfico mostrando a evolução temporal do neuromastos regeneração após a retirada do tratamento com 24 horas de peixe-zebra adulto com 0,004% de gentamicina. Conforme mostrado, a recuperação começa no ponto de tempo 8 hpg e atingiu um platô no ponto de tempo de 16 hpg. Este definiu a fase de revestimento de regeneração neuromasto entre 8-16 hr e hora pontos dentro desta fase linear deve ser usado para comparar quantitativamente os grupos controle e experimental.

Toxicidade neuromasto é induzida pela exposição prolongada a corantes fluorescentes de coloração.

Na nossa estimativa de uma maneira ideal para realizar estas experiências irão ser a manchar o peixe com o corante fluorescente, antes do tratamento, a mancha de novo a 0 horas e depois de novo uma manchamomentos t regeneração. Contudo, encontramos uma complicação para estes estudos, que é o facto de que células do cabelo corantes de fluorescência, tais como 4-Di-2-Asp, como também pode ser o caso com outras manchas mitocondriais ²² pode ter um efeito sobre tóxico células ciliadas ^23. Este fato nos obrigou a usar grupos separados de peixes desde coloração repetida do mesmo peixe não poderia ser empregada. Em todos os casos, os peixes experimental incluindo controlos foram tratados em paralelo para eliminar a variabilidade experimental.

Análise confocal ao nível das células individuais do cabelo.

Se os resultados obtidos a partir da análise neuromasto não são estatisticamente significativas entre os grupos de controlo e experimentais, pode-se estender estes estudos para o nível das células de granizo individuais para obter um elevado grau de resolução para comparações quantitativas. Tal como indicado na Figura 4, neuromastos de um grupo de controlo (umeuromast em 12 horas de regeneração é mostrado nesta figura) podem ser visualizados por microscopia confocal de preparações para a pele da região do corpo médio. Às 8 horas, 10 horas e 12 horas de tempo de regeneração, descobrimos que os grupos de controle (7 animais / grupo) tinha um alcance de 0-4 cabelo células / neuromasto. Tal como esperado para os grupos de controlo, quando analisados ​​quantitativamente, não houve diferença estatística entre neuromastos foi detectada em termos do número de células capilares por neuromasto nos pontos de tempo indicados acima (os valores de p variou 0,230-0,472). Tal abordagem pode ser feita entre um grupo de controlo e experimental, quando necessário para ampliar ou para confirmar os dados obtidos a partir da primeira fase de estudos neuromasto.

Figura 4. Análise de cabelo regeneração celular / neuromasto usando preparações para a pele da região da linha lateral definido descrito in protocolo passo 3.3. imagem confocal fluorescentes das células ciliadas dentro de um neuromasto obtido a partir de uma preparação da pele do peixe-zebra. Dois corantes de células ciliadas coradas vitais são mostrados dentro de uma neuromasto de peixes de controlo (Figura 4). Esta imagem foi obtida 12 horas após a remoção de gentamicina (fase de regeneração linear). O símbolo faixa branca () indica uma neuromasto indivíduo, enquanto a seta branca indica uma célula de apoio em torno das células ciliadas. Células de suporte não mancham sob estas condições e aparecem como espaços negros. Ampliação, 60X.

1	1. Tratamento gentamicina [0,004% (4,32 mM)] de controlo e peixes experimental durante 24 horas a 28 ° C por meio de uma incubadora.
2	2. Lave de gentamicina para iniciar a regeneração das células ciliadas. Retornar peixe para a incubadora de 28 ° C durante períodos de tempo seleccionados investigador entre 8-16 horas.
2	3. Corante corante vital [0,08% de iodeto de 4-4-diethylaminostyryl-N-metilpiridínio (4-Di-2-Asp)] controle e peixes experimental durante 1 hora à temperatura ambiente e depois lavar a mancha com água de peixe para imagiologia fluorescente.
1 ou 2	4. Caso seja necessário devido a resultados não significativos a partir da análise de neuromastos, repita Protocolos 1-3 com um grupo separado de controle e peixe experimental, mas, em seguida, obter uma preparação da pele para análise confocal de células ciliadas individuais.

Tabela 1. Um resumo do protocolo descrito acima.

Discussion

Com base no extenso corpo de literatura que foi estabelecido para a análise da linha lateral (LL) em regeneração embrionário e larval do peixe-zebra ^8,24,25, o objetivo de nosso estudo foi o desenvolvimento de um ensaio quantitativo para a regeneração da linha lateral em peixes-zebra que poderia ser aplicada aos modelos de doenças que são mais bem estudados no peixe adulto. Descobrimos que certos pontos críticos são importantes quando se aplica procedimentos desenvolvidos para peixes embrionário / larval do peixe adulto. O mais importante destes pontos de vista: 1) o número de linha lateral neuromasts ao longo do eixo longitudinal do peixe, 2) a duração da coloração de células ciliadas neuromasto, 3) a concentração e a duração do tratamento do aminoglicósido, e 4) o tempo de regeneração da linha lateral após o tratamento com aminoglicosídeos. Estes pontos serão abordados na discussão a seguir.

No que diz respeito ao número de neuromastos ao longo da linha lateral do peixe-zebra, Peixe-zebra embrionários e larval tem a distinta vantagem de que os neuromastos têm um padrão simples devido ao seu número menor dentro de um determinado ponto, em comparação com peixe adulto. Este número baixo permitiu aos investigadores identificar claramente cada neuromasto e atribuir um nome a ela ^6. Desta forma, estudos de regeneração pode quantificar o reaparecimento de um neuromasto especial pelo nome, em qualquer momento após a retirada de um agente aminoglicosídeos. O maior número de pontos por neuromastos no adulto apresenta dificuldades significativas na contagem precisa e quantificação durante o reaparecimento de regenerar neuromastos quando comparada com a de embriões ou larvas. Como mostrado, avaliou o padrão de neuromastos linha lateral dentro pontos do adulto e determinou que o meio-corpo (Figures. 1 e 2) desde que a região ótima de pontos para análise.

Coloração de células capilares com neuromastos corantes, tais como 2 - [4 - (dimetilamino) estiril]-N-ethylpyridiiodeto de titânio (DASPEI) ou 4-Di-2-Asp permite visualizar neuromastos da linha lateral utilizando lupa estereoscópica fluorescente ^26,27 em peixes larval e juvenil. Essas mesmas manchas também são eficazes no peixe adulto e nossa análise quantitativa indicou que não houve diferença significativa no número de neuromastos na região do meio-corpo foi observada entre zebrafish controle normal (com uma média de 61,45 neuromastos em peixes normais de controle de adultos).

Tem sido relatado que os corantes das células ciliadas, tais como 2 - [4 - (dimetilamino) estiril] iodeto de N-etilpiridínio (DASPEI) ou 4-di-2--Asp podem eles próprios ser tóxicos para neuromasto células ^24, e os peixes não podem ser repetidamente corados com esses agentes fluorescentes, se um é para monitorar a regeneração induzida por aminoglicosídeos. Coloração repetida do mesmo peixe introduz vários eventos de toxicidade (tanto pela mancha ea aminoglicosídeo) que faz com que o experimento não-interpretável ^23. Consequentemente, todas as experiênciasno nosso estudo paralelo de coloração 4-Di-2-Asp de vários conjuntos de peixe, a fim de mostrar que neuromastos foram 1) presente no estado não tratado de controlo de gentamicina, 2) completamente excisada imediatamente após a exposição a gentamicina, e 3) a regeneração de alguns pós-tratamento gentamicina hora após a retirada e lavagem fora deste aminoglicosídeo. Desta forma, todos os peixes foram coradas apenas uma vez com o corante neuromasto.

Deve-se salientar que, embora os procedimentos de Van Trump et al. ¹⁷ estabelecem as condições para a ablação de células ciliadas no peixe adulto, eles não estabelecer uma curva padrão para a regeneração neuromasto que é necessário para comparação quantitativa entre os grupos controle e experimentais. Por isso, seguiu os procedimentos de Van Trump et al. ¹⁷ para ablação de células ciliadas (concentração de gentamicina 0,004%, utilizando um tempo de exposição de 24 horas, veja a Figura 2 para os resultados de ablação de células ciliadas em 24hr), mas estendeu seu trabalho para estabelecer uma curva padrão de regeneração neuromasto. Isto permite uma análise comparativa de regeneração LL no peixe-zebra adultos usando os quatro pontos de malha da região do corpo médio que estabelecemos para nossas condições de ensaio (ver Figuras 1 e 2). A fim de determinar se um período mais curto para a ablação de células ciliadas poderia ser obtida, também testaram o efeito de sulfato de cobre, que tem sido utilizado em larvas de peixes, por períodos tão curtos como 2 hr. Os nossos estudos indicaram que o sulfato de cobre (5-50 mM durante vários tempos de exposição até 48 horas, como foi descrito anteriormente por ²¹ Liang et al. De larvas), não foi encontrado para ser eficaz em peixes adultos como um agente para a ablação de células ciliadas. Isso ressalta o fato de que as condições utilizadas para a ablação de células ciliadas em embriões e larvas nem sempre pode ser transferido diretamente para o uso com o peixe adulto.

Como pertencente à linha lateralregeneração no adulto, encontramos prazos semelhantes para regeneração de neuromastos entre a do embrião / larva e adulto peixe. Como relatado anteriormente por outros, embriões de peixes-zebra e larvas espetáculo neuromasto regeneração em 12-24 horas pós aminoglicosídeo lavar-out ^8. Observou-se a fase linear de regeneração neuromasto aparecendo no prazo de 8-12 (não é visto como pontos completos para o ponto de tempo de 8 horas, como mostrado na Figura 2) com um patamar alcançada em 16 HPG. Aparência controle-como completa de neuromastos dentro de pontos não foi observada até 24 hpg como relatado para os embriões e larvas. Aparência controle-como completa denota tanto o número ea intensidade das neuromastos dentro de todos os quatro pontos da região do meio-corpo em peixe-zebra adulto. Além disso, se os resultados quantitativos obtidos no nível dos neuromastos não são estatisticamente significativos, o investigador pode estender os seus estudos para o nível das células individuais do cabelo dentro dos neuromastosusando microscopia confocal, como descrito pelos nossos procedimentos.

O ensaio regeneração celular neuromastos / hair descrito neste artigo podem ser aplicadas a estados de doença que são melhor manifestam no peixe-zebra adulto em vez de nos estágios larvais / embrionária. Uma limitação do ensaio refere-se ao efeito da condição experimental seja 1) a estirpe transgénico que imita um estado de doença particular, ou 2) um estado de doença induzido por farmacologicamente] em células estaminais dentro do sistema da linha lateral do peixe-zebra adultos. A este respeito, um estado de doença particular do peixe-zebra adultos podem ou não afectar as células estaminais da linhagem de células ciliadas, e é importante notar que a regeneração neuromasto é completamente dependente estes proliferação de células estaminais / diferenciação processa ^8,24,25 .

Como um exemplo desta limitação, vamos descrever as experiências realizadas em um modelo de peixe-zebra adultos de diabetes do Tipo I. Este particulmodelo de doença de ar foi desenvolvido no peixe-zebra adulto, a fim de estudar a complicação secundária a longo prazo induzida por hiperglicemia ^28. Por uma série de razões descritas anteriormente ^28,29, estes estudos só pode ser realizada utilizando adulto peixe-zebra. Como os nervos periféricos, juntamente com as estruturas celulares especializadas que inervam são prejudicados em pacientes com diabetes, queríamos determinar se a regeneração da linha lateral de neuromastos / células ciliadas também foi prejudicada em zebrafish diabético. Utilizando o teste de linha lateral, regeneração atraso estatisticamente significativa foi detectada na regeneração neuromasto. Para confirmar este resultado negativo, os experimentos foram repetidos no nível mais refinado da célula cabelo individual. Mais uma vez, não houve diferença estatisticamente significativa foi observada na regeneração das células ciliadas entre os grupos controle e diabéticos. Portanto, os dados eram incompatíveis com a suposição de que a hiperglicemia impede a regeneração celular neuromasto / cabelo; possibly devido à resistência de células-tronco da linhagem de células ciliadas para condições de hiperglicémia. Com esta limitação em mente, o ensaio de regeneração celular neuromastos / hair descrito neste artigo fornece um meio para testar se qualquer modelo de doença peixe-zebra adulto particular envolve disfunção no processo de regeneração das células ciliadas como monitorado usando o sistema de linha lateral. Os resultados positivos implicaria o envolvimento de células-tronco e outros estudos, portanto, ser garantida.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml)	Sigma Aldrich	G1397
2 Phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol	Aldrich	D-3418	485 nm excitation λ and 603 nm emission λ
6-well Plates	Mid Sci	TP92006
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
Glass Bottom Microwell Dishes	Matek Corporation	P35G-1.5-14-C
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting  Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
ImageJ software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.
Confocal microscope	Olympus	FV10i	Any high resolution fluorescent microscope is suitable
Aquatic System	KG Aquatics ZFS Rack System		Any aquatic system can be used