Summary
Потому что многие данио модели неврологических и не неврологических заболеваний изучаются в взрослых рыб, а не у эмбриона / личинок, мы разработали количественный боковой линии регенеративной анализа, который можно применять взрослым моделей данио заболеваний. Анализ участие разрешение на 1) neuromast и 2) уровнях индивидуальный волосковых клеток.
Abstract
В связи с клинической значимости слуха и нарушения баланса в человеке, модельные организмы, такие как данио были использованы для изучения развития боковой линии и регенерацию. Данио является особенно привлекательным для таких исследований из-за его быстрого времени разработки и высокой регенеративной способностью. На сегодняшний день, данио исследования боковой рекуперации в основном используется рыба из эмбриональных и личиночной стадии из-за меньшего числа невромастов на этих этапах. Это сделало количественный анализ боковой линии регенерации / и или развития легче в более ранних стадиях развития. Потому что многие данио модели неврологических и не неврологических заболеваний изучаются в взрослых рыб, а не в эмбриона / личинок, мы сосредоточены на разработке количественную боковой линии регенеративной анализа в взрослых данио, чтобы анализ был доступен, которые могут быть применены к току взрослые данио модели заболевания. Основываясь на предыдущих исследованиях Ван Trumр и др.. 17, описанной процедуры абляции волосковых клеток во взрослой мексиканской слепой пещерной рыбы и рыбок данио (Danio рерио), наш анализ был разработан, чтобы позволить количественное сравнение между контрольной и экспериментальной групп. Это было достигнуто путем разработки регенеративную neuromast стандартную кривую на основе процента neuromast повторному течение периода с 24 часами времени после некроз гентамицина-индуцированной волосковых клеток в определенной области боковой линии. Анализ также была разработана, чтобы позволить расширение анализа на индивидуальном уровне волосковых клеток, когда более высокий уровень разрешения не требуется.
Introduction
Боковая линия (LL) система является механосенсорных орган нашел в обоих рыб и амфибий, который отвечает за слуха, равновесия, rheotaxis и посреднических поведения, таких как школы и избежании хищника 1-5. Он состоит из кластеров волосковых клеток, окруженных поддерживающих клеток, оба из которых расположены в структурах, называемых невромасты 6. Эти невромасты обычно организованы в вертикальных линий (так называемый стежки) вдоль продольной оси тела и хвоста с некоторыми горизонтальными стежками, наблюдаемых в голове рыбы. У взрослых, невромасты значительно больше, в количестве в пределах стежками по сравнению с эмбриональной или личинок рыб 6. Биомедицинские исследования на рыбках данио уделено влиянию лечения антибиотиками, вызванного шумом травмы, хронической инфекции и др. на волосковых клеток 7,8 в попытке лучше понять их воздействие на человека.
В отличие от большинства позвоночных, т. е.leosts, такие как данио (Danio рерио), имеют способность к регенерации утраченных волосковых клеток. Данио рерио особенно полезны из-за их быстрого времени разработки и высокой регенеративной способностью. Однако на сегодняшний день; данио исследования по разработке боковой линии и / или регенерации в основном использовали эмбриональных и личиночной стадии рыбы в связи с уменьшением числа боковых невромастами линии что облегчает подсчета и анализа 6,9,10.
Однако, как многие данио модели неврологических и не неврологических заболеваний 11-16 изучаются в взрослых рыб, а не личинок, мы сосредоточились на разработке боковой линии регенеративной анализа у взрослых данио, используя гентамицин (аминогликозиды ранее использовались в данио личинок и в последнее время используются с взрослых рыб 17), так что анализ был доступен, которые могут быть применены к текущей взрослых данио моделей заболеваний. В то время как ранее опубликована процедуры Ван Трамп ет др.. 17 создало условия для волосковых клеток абляции в взрослых рыб, они не установить стандартную кривую для neuromast регенерации, который требуется для количественного сравнения между контрольной и экспериментальной групп, таких как при использовании трансгенных линий данио или фармакологически индуцированные болезненных состояний у рыбок данио 18. Поэтому мы последовали процедуры Ван Трамп и др. 17. Для волосковых клеток абляции, но построен на их работу в целях создания стандартного кривую neuromast регенерации, позволяющих исследователям использовать наш данных при сравнении контрольных и экспериментальных групп, таких, как со взрослыми моделями данио болезни . Анализ также была разработана, чтобы позволить расширение анализа в отдельной ячейке волос, когда более высокий уровень разрешения не требуется.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры проводятся в соответствии с руководящими принципами, описанными в «Принципах лабораторных животных" (Национальные институты здравоохранения Ежегодный нет. 85-23, пересмотренная 1985) и утвержденного протокола животных Розалинд Франклин университет Комитет Уходу за животными и использование 08-19.
1. Гентамицин-индукция волосковых клеток некроза
- Подготовка сульфата гентамицина в нормальном солевом растворе до конечной концентрации 0,004% (4,32 мм).
- Наведите взрослых рыб (Д. рерио, 4-6 месячного возраста) в контейнере, содержащем 0,004% (4,32 мм) гентамицин решение. Любой контейнер может быть использован, но мы используем рыбы контейнера из Pharmacal водной системы, которая 7 в ширину, 6 в высокой, и 7 в длину. Поместите контейнер с рыбой в инкубатор при 28 ° С в течение 24 часов. Установить общий объем жидкости в резервуаре на достаточном уровне, чтобы для ч период 24 поддерживать рыбу в жизнеспособном состоянии. Примечание: Аэрация гентамицин жидкости не neceмируется необходимый если достаточный объем используется для количества рыбы, подлежащего лечению.
2. Vital Окрашивание клеток волос
- Подготовка концентрацию 0,08% (в нормальном физиологическом растворе) флуоресцентного витальным красителем [4-4-diethylaminostyryl)-N-метилпиридини (485 нм λ возбуждения 603 нм и λ эмиссии в метаноле) из рабочей исходного раствора 15 мг / мл в этаноле.
- Чтобы определить, гентамицину лечение было эффективным подмножество контроля и гентамицин обработанные рыбы окрашивают сразу же, поместив рыбу в лунку 6-луночного планшета культуры, содержащей витальным красителем. Используйте достаточное количество рыбы (и культуру, живущую в соответствии с требованиями для статистической значимости должны быть достигнуты. Основываясь на скорости экзаменатора из neuromast подсчета, поместите рыбу в пластинах в шахматном порядке в течение долгого времени так, чтобы рыба не окрашивают в течение более 75 мин как описано на стадии 2.3.
- Место пластин с шага 2.2 в скамейке ящик флуоресцентным микроскопом вбыть использованы для изучения окрашенных невромастами. Выключите свет в комнате, чтобы предотвратить тушение жизненной красителя на 1 час окрашивания период при комнатной температуре.
- Подготовить как краситель вымывания и обезболивающий емкостей для воды. Краска вымывания водой нормально рыбы вода и для анестезии воды, добавьте достаточное 2-феноксиэтанол, чтобы разведение 1:1000 в нормальном рыбы воды достигается.
- Поместите рыбу в избытке нормальной рыбы воды, чтобы ополоснуть избыток жизненно красителя и перейдите к шагу 3.1 для наблюдения рыб жизненно красителя окрашивают.
- Чтобы исследовать регенерацию невромастами, передача гентамицина обработке рыбы, которые были промыты в нормальном рыбы воды в инкубаторе для между 8-16 ч при 28 ° С.
- В разное время между 8-16 ч, рыба вынимали из инкубатора, промывали и окрашивали, как указано в пунктах 2.1-2.4. Перейдите к шагу 3.1 для наблюдения рыб жизненно красителя окрашивают.
3. Обезболивающий Рыба и флуоресцентная Подсчет невромастов
- Поместите крышку на сцене флуоресцентной стерео микроскоп для получения цифрового изображения жизненно важных красителей окрашенных невромастов середине стежков тела.
- С помощью цифровой камеры размещен на флуоресцентного стереомикроскопа установить увеличении 2X для захвата изображения для последующего количественного анализа. Примечание: Установка увеличение из стереомикроскопом может зависеть от марки микроскопа, используемого, но обстановка должна позволить легко просматривать и подсчета отдельных невромастами в середине стежков тела.
- Определить количество регенерации путем подсчета количества видимых невромастами в четырех обозначенных швов на нижнем наиболее вентральной стороне рыбы просто проксимального в нужное грудного плавника (см. рисунок 1). Для статистического анализа использовать соответствующую проверку таких как ANOVA Oг Т-критерий Стьюдента. Эксперименты следует использовать, как минимум, 5 особей на момент времени, и все эксперименты должны быть повторены, как минимум, в 3 раза.
- Исходя из кривой времени регенерации neuromast (см. рисунок 3), рассчитывать невромасты между 8-16 ч после гентамицин вымывания быть в пределах линейного фазы кривой регенерации. Примечание: Использование линейной фазы времени позволяет для правильного количественного анализа между контрольной и экспериментальной групп.
4. Люминесцентная Подсчет клеток отдельного волоса для получения высшего Постановление количественного анализа, если Neuromast Анализ не является статистически значимым
- Если количественный анализ на уровне невромастов не является существенным, анализ на уровне отдельной клетки волос также может быть использован, чтобы получить более высокую степень разрешения. Выберите рыбу в определенной временной точке сообщению гентамицин вымывания (момент времени на основе предыдущих исследований neuromast), жизненно красителя-гоайн рыбу, как описано в Протоколе 2, а затем усыпить рыбу, используя 2-феноксиэтанол в разведении 1:500 для 1-5 минут.
- В приглушенном свете, чтобы предотвратить тушение, сделать четыре разрезы так, что квадратный подготовка лоскут кожи производится следующим образом. Сделайте надрез вдоль верхних ребер рыбы пока не приведен в соответствие с анального плавников, а затем сделать надрез через живот, и наконец, сделать две вертикальные разрезы на каждой стороне этих разрезов так квадрат кожный лоскут создается. Примечание: Этот препарат кожа будет включать средние стежки тела, используемые в neuromast экспериментов.
- Поместите образец кожи на предметное стекло, а затем поместить круглую покровным стеклом над подакцизным образца кожи, чтобы помочь с якоря и сгладить ткани для последующей цифровой обработки изображений.
- Используя образцы кожи от шаге 4.3, получить цифровые изображения волосковых клеток внутри каждого neuromast середины стежков тела. Съемку при увеличении крайней мере 60X, а затем подсчитывают волос CELLS пределах отдельных невромастами для сравнительного количественного анализа контрольных и экспериментальных групп (см. рисунок 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оптимизация процедур количественного neuromast регенерацию боковой линии в взрослых данио.
Невромасты из личинок рыбок данио легко поддаются количественной оценке; Однако, боковая линия из взрослых данио имеет гораздо большее число невромастами в стежка делает количественный анализ сложнее 6,17,19,20. Как видно на рисунке 1а, глава имеет значительно большее количество невромастами по сравнению с любой средней части или хвоста; с хвостом область, имеющая наименьшее количество невромастами как показано на рисунке 1D. Поскольку образец стежков в головке является сложным и значительно больше в количестве невромастами, это не поддается как область для количественного анализа. Кроме того, независимо от гентамицин концентрации мы тестировали, в комплекте абляция невромастов всей голове редко достижима; оставляя пятна невромастами наблюдаемые после лечения гентамицина, как сообщалось ранее Ван Трамп и соавт. 17 Напротив, хвост имеет слишком мало невромасты, и как таковой, мы выбрали область середины тела (рис. 1b), чтобы количественно анализируют neuromast регенерации у взрослых. В этой области, мы определили четыре строчки просто кзади от латерального грудного плавника, которые были последовательны в число neuromast среди всех взрослых [61.45 (п = 95)] (рис. 1В и 1E). Важно отметить, что мы были в состоянии последовательно и полностью удалять невромастов этом регионе с 24 часами 0,004% лечения гентамицин (как сообщалось ранее в Ван Трамп и др.. 17), что позволяет для последующего точного определения регенерации neuromast (сравните рисунки 1B и 1E и вставка с рис 2, 0 ч).
p_upload/51343/51343fig1highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 1. Флуоресцентный образец neuromast в стежков взрослых данио показано вдоль продольной оси. Панель это голова область, панель В представляет собой область середины тела с четырех стежков, используемых для количественного анализа, описанной с коробкой. Панель С регион Задняя тела. Панель D является хвостовой плавник область. Лупы с большим увеличением из 4 стежков региона Среднего тела, используемого для количественного анализа показан на панели E. Увеличение мощности от 1X и 2X.
Сообщалось, что лечение сульфат меди является эффективным химическим методом, чтобы вызвать быстрый некроз клеток волос в эмбрионов и личинок 21. Здесь мы тестировали медный лечение сульфата с надеждой, что это могло бы сократить время, чтобы побудить neuromast абляции. Концентрации сульфат меди, начиная от5-50 мМ течение различных периодов времени экспозиции до 48 ч, были использованы как сообщалось ранее Liang и соавт. 21 Было найдено, что сульфат меди была смертельна при более высоких концентрациях и не эффективны при более низких концентрациях у взрослых рыб (данные не показаны) . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Параметры, используемые для флуоресцентного анализа бокового рекуперации в взрослых данио.
Регенерация контролировали ведь невромасты пределах четырех стежков середины тела были абляции следующие 24 часами гентамицин обращения (рис. 2, сравнить 0 час с управлением) и положительный регенерации определяли по появлению минимума трех невромастами внутри шва. (Рис. 2, 0 ч). К 8 HPG, примерно треть рыбы было немного признаков восстановления (N = 34); хотя интенсивность невромастов был слабым в регенерирующих стежков (рис. 2, 8 часов, слабые швы, изложенные коробками). Количество невромастами и их интенсивность продолжали расти по линейному закону до регенерации не достигало плато при 16 HPG (сравните рисунке 2, 16 ч с фиг.2, 8 часов). Он не был по крайней мере до 24 HPG, что все рыбы, обработанные гентамицин был полностью восстановился с обеих равном количестве и интенсивности невромастов в пределах боковых швов линии по сравнению с контрольной группой (рис. 2, 24 часа в сутки). Тайм-линия для регенерации neuromast следующие гентамицин вывода показана на рисунке 3, который показывает линейные и плато фазы кривой восстановления. Отметим, что в менее чем 5% случаев, регенерирующие стежки не появляются как отдельных предприятий, но вместо этого появился как мазок флуоресценции.
Рисунок 3. График, показывающий зависимость регенерации невромасты после ухода с 24 ч лечения взрослых данио с 0,004% гентамицин. Как показано, восстановление начинается в момент времени 8 Hpg и достигли плато в момент времени 16 HPG. Это определяется фаза лайнер регенерации neuromast между 8-16 ч и временных точках в пределах этой линейной фазы должны быть использованы для количественного сравнения контролем и опытом группы.
Neuromast токсичность индуцируется длительном воздействии флуоресцентной окраски красителей.
По нашей оценке идеальный способ для выполнения этих экспериментов будет испачкать рыбу с флуоресцентным красителем до лечения, пятна снова при 0 ч, затем окрасить вновьмоменты времени регенерации т. Тем не менее, мы столкнулись с осложнением в этих исследованиях, который является тот факт, что волосы клеток флуоресцентной окраски красители, такие как 4-ди-2-Asp, а также может быть в случае с другими митохондриальных пятен 22 может оказывать токсическое влияние на волосковых клеток 23. Этот факт требует, чтобы мы использовали отдельные группы рыб с повторным окрашиванием той же рыбы не могли быть использованы. Во всех случаях экспериментальные рыбы включая контроль обрабатывали параллельно, чтобы устранить экспериментальные изменчивость.
Конфокальной анализ на уровне отдельных клеток волос.
Если результаты, полученные на основе анализа neuromast не являются статистически значимыми между контрольной и экспериментальной групп, можно расширить эти исследования до уровня отдельных града клеток, чтобы получить более высокую степень разрешения для количественных сравнений. Как показано на рисунке 4, невромасты из контрольной группы (Euromast на 12 часов регенерации показано на этом рисунке) можно рассматривать с помощью конфокальной микроскопии препаратов кожи от середины области тела. В 8 часов, 10 час и 12 часов времени регенерации, мы обнаружили, что контрольные группы (7 животных / группа) был диапазон 0-4 волосковых клеток / neuromast. Как и ожидалось для контрольных группах, когда количественно анализируют, статистической разницы между невромастами не был обнаружен в терминах числа волосковых клеток в neuromast на временных точках, указанных выше (значения P колебалась от 0.230-0.472). Такой подход может быть принято любое между контрольной и экспериментальной группы при необходимости, чтобы расширить или подтвердить данные, полученные от первого этапа исследований neuromast данных.
Рисунок 4. Анализ волос клеток / neuromast регенерации с использованием препаратов коже определенной боковой области линии описано Iшаг протокол н 3.3. Люминесцентная конфокальной образ волосковых клеток в пределах neuromast полученной из данио подготовки кожи. Два жизненно важных красителей окрашенных волосковые клетки показаны в neuromast контрольной рыбы (рис. 4). Это изображение было получено 12 ч после удаления гентамицин (фаза линейного регенерации). Белая Панель пиктограмм () указывает индивидуальный neuromast в то время как белая стрелка указывает вспомогательную ячейку, окружающую клетки волос. Поддерживающие клетки не окрашиваются в этих условиях и отображаться в виде черных пространств. Увеличение, 60X.
| 1 | 1. Лечение Гентамицин [0.004% (4,32 мМ)] из контрольной и экспериментальной рыбы в течение 24 ч при 28 ° С с использованием инкубатор. |
| 2 | 2. Промойте гентамицина инициировать регенерацию волосковых клеток. Вернуться рыбу в инкубатор 28 ° C для следователя выбранные периоды времени между 8-16 часов. |
| 2 | 3. Пятно витальным красителем [0.08% йодид 4-4-diethylaminostyryl-N-метилпиридин (4-ди-2-Asp)] контрольной и экспериментальной рыба течение 1 часа при комнатной температуре и затем промыть пятно с рыбой воды для флуоресцентных изображений. |
| 1 или 2 | 4. Если необходимо в связи с незначащих результатов анализа невромастов, повторите Протоколы 1-3 с отдельной группе контроля и подопытных рыб, но потом получить препарат кожи для конфокальной анализа отдельных волосковых клеток. |
Таблица 1. Резюме протокола указано выше.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
На основе обширного объема литературы, которая была создана для анализа боковой линии (LL) регенерации в эмбриональном и личинок рыбок данио 8,24,25, цель нашего исследования состояла в разработке количественного анализа для боковой рекуперации у рыбок данио, которые могли бы быть применены к модели заболеваний, которые наиболее изученных в взрослых рыб. Мы обнаружили, что определенные критические моменты важны при применении процедур, разработанных для эмбрионального / личинок рыб в взрослых рыб. Наиболее важным из этих точек рассматривается: 1) число боковой линии невромасты вдоль продольной оси рыбы, 2), 3) концентрация и длительность лечения аминогликозидами, 4) продолжительность окрашивания neuromast волосковых клеток сроки боковой рекуперацией следующие аминогликозидов лечения. Эти точки будут рассмотрены в последующем обсуждении.
В отношении числа невромастов вдоль боковой линии данио, Эмбриональных и личинок данио имеют определенное преимущество, что невромасты имеют простую картину из-за их более низкой числа в пределах данного шва по сравнению с взрослых рыб. Это низкое число позволило исследователям четко идентифицировать каждую neuromast и назначить имя в ней 6. Таким образом, исследования регенерации может количественно повторного возникновения конкретного neuromast по имени в любое время после выхода из аминогликозиды агента. Чем больше число невромастов в стежка у взрослых представляет значительную трудность в точной подсчета и определения количества во время повторного появления регенерации невромасты когда по сравнению с эмбрионов или личинок. Как показано, мы оценили картину боковых невромастами связи в пределах стежков взрослого и определил, что в середине тела (Figures. 1 и 2) при условии, что оптимальную область стежков для анализа.
Окрашивание невромастов с волосковых клеток красители, такие как 2 - [4 - (диметиламино) стирил]-N-ethylpyridiурана йодид (DASPEI) или 4-ди-2-Asp позволяет визуализировать невромастов боковой линии с использованием флуоресцентного стереомикроскопия 26,27 в личинок и молоди рыбы. Эти же пятна, также эффективны в взрослой рыбы и наш количественный анализ показал, что существенной разницы в количестве невромастов в регионе среднего тела не наблюдалось среди нормальной рыбок данио управления (в среднем 61,45 невромастами в нормальном контроль взрослых рыб).
Было сообщено, что волосковых клеток красители, такие как 2 - [4 - (диметиламино) стирил]-N-этилпиридини иодид (DASPEI) или 4-Di-2-Asp сами могут быть токсичными для neuromast элементы 24, и рыба не может быть повторно окрашивали этих флуоресцентных агентов, если мы хотим контролировать Аминогликозиды индуцированных регенерацию. Повторное окрашивание той же рыбы вводит несколько событий токсичности (по как пятна и аминогликозиду), что делает эксперимент не-интерпретации 23. Соответственно, все экспериментыВ нашем исследовании требуется параллельный 4-Ди-2-Asp окрашивание несколькими наборами рыбы, чтобы показать, что невромасты были: 1) присутствует в обработанном гентамицина состоянии управления, 2) полностью удалена сразу же после воздействия гентамицина и 3) регенерации на некоторые час после гентамицин обращение после ухода и вымывания этого аминогликозидом. Таким образом, все рыбы окрашивали только один раз с neuromast красителя.
Следует отметить, что в то время как процедуры Ван Трамп и др. 17. Создать условия для волосковых клеток абляции в взрослых рыб, они не устанавливают стандартную кривую для neuromast регенерации, который требуется для количественного сравнения между контрольной и экспериментальной групп. Поэтому мы последовали процедуры Ван Трамп и др. 17. Для волосковых клеток абляции (концентрация гентамицин 0,004% с использованием время экспозиции 24 часами, см. рисунок 2 за результаты волосковых клеток абляции при 24ч), но расширили свою работу по созданию стандартной кривой регенерации neuromast. Это позволяет для сравнительного анализа регенерации LL в взрослых данио с помощью четырех петель середины области тела, что мы установили для наших условиях анализа (см. рисунки 1 и 2). Для того чтобы определить если более короткий период для удаления волос клеток может быть получена, мы также проверили эффект сульфата меди, который был эффективно использован в личинок рыб в течение периодов настолько коротким, насколько 2 часов. Наши исследования показали, что сульфат меди (5-50 мм для различных временах экспозиции до 48 ч, как это было ранее сообщено Liang и соавт. 21 личинок) не был признан эффективным у взрослых рыб в качестве агента для волосковых клеток абляции. Это подчеркивает тот факт, что условия, используемые для абляции волосковых клеток у эмбрионов и личинок не всегда может быть непосредственно передан для использования с взрослой рыбы.
Как относящийся к боковой линиирегенерации у взрослых, мы нашли подобные сроки для регенерации невромастов между у эмбриона / личинок и взрослых рыб. Как сообщалось ранее другими, эмбрионов данио рерио и личинки шоу регенерации neuromast на 12-24 ч после аминогликозидом вымывания 8. Мы наблюдали линейную фазу регенерации neuromast появляющейся в 8-12 сроки (не видел в качестве полноправных стежков для временной точке 8 ч, как показано на рисунке 2) с плато, достигнутой на 16 HPG. Полный контроль, как внешний вид невромастов пределах стежков не наблюдалось до 24 HPG как сообщалось для эмбрионов и личинок. Полный контроль, как внешний вид обозначает как количество и интенсивность невромастами течение всех четырех стежков региона середины тела в взрослых данио. Кроме того, если количественные результаты, полученные на уровне невромастов не являются статистически значимыми, следователь может расширить свои исследования до уровня отдельных волосковых клеток в невромастовс помощью конфокальной микроскопии, как описано нашими процедурами.
Регенерация клеток анализ невромасты / волос описано в этой статье могут быть применены к болезненных состояний, которые лучше всего проявляются в взрослых данио, а не в начале личинок / эмбриональных стадиях. Ограничение анализа относится аффект экспериментальных услови х будь то 1) трансгенный штамм, который имитирует конкретного болезненного состояния или 2) фармакологически индуцированную болезненное состояние] на стволовые клетки внутри системы боковой линии взрослых данио. В этом отношении особое состояние заболевание взрослых данио могут или не могут влиять на стволовые клетки клеточной линии волос, и это важно отметить, что регенерация neuromast полностью зависит от этих пролиферации стволовых клеток / дифференциации процессов 8,24,25 .
В качестве примера это ограничение, мы опишем эксперименты, выполненные на взрослого данио модели типа I диабета. Это particulмодель болезни ар был разработан в взрослых данио с целью изучения долгосрочную вторичный осложнение, вызванное гипергликемией 28. По ряду причин, описанных ранее 28,29, эти исследования могут быть выполнены только с помощью взрослых данио. Потому что периферические нервы вместе с специализированных клеточных структур они иннервируют оказывают неблагоприятное влияние на пациентов с сахарным диабетом, мы хотели, чтобы определить, боковая регенерации линия невромастов / клеток волос также нарушается при диабетической рыбок данио. Использование боковой регенерации линия анализа не статистически значительная задержка была обнаружена в neuromast регенерации. Для подтверждения этого отрицательный результат, эксперименты были повторены в более утонченной уровне отдельной клетки волос. Опять же, никаких статистически значимых различий не наблюдалось в регенерации волосковых клеток между контролем и диабетических групп. Таким образом, данные не соответствуют предположению, что гипергликемия препятствует регенерации neuromast / волосковых клеток; рossibly из-за сопротивления стволовых клеток волос клеточной линии к гипергликемических условиях. С этого ограничения в виду, регенерации клеток анализ невромасты / волос описано в этой статье не предусматривает средства для проверки того, включает ли какой-либо конкретной взрослых данио модель болезни дисфункции у регенеративного процесса волосковых клеток, как контролировать с помощью системы боковой линии. Положительные результаты подразумевает участие стволовых клеток и, следовательно, дальнейшие исследования будут гарантированы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml) | Sigma Aldrich | G1397 | |
| 2 Phenoxyethanol | Sigma Aldrich | P1126 | |
| 4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol | Aldrich | D-3418 | 485 nm excitation λ and 603 nm emission λ |
| 6-well Plates | Mid Sci | TP92006 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Matek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | TMZ-1500 | Any dissecting microscope is fine. |
| Camera for Imaging | Nikon | Q imaging | Any camera is suitable. |
| ImageJ software | National Institutes of Health | NIH Image | |
| NIS Elements | Nikon | Any imaging software is suitable. | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | Any high resolution fluorescent microscope is suitable |
| Aquatic System | KG Aquatics ZFS Rack System | Any aquatic system can be used |
References
- Dambly-Chaudire, C., Sapde, D., Soubiran, F., Decorde, K., Gompel, N., Ghysen, A. The Lateral Line of Zebrafish: a Model System for the Analysis of Morphogenesis and Neural Development in Vertebrates. Biol. Cell. 95 (9), 579-587 (2003).
- Montgomery, J., Carton, G., Voigt, R., Baker, C., Diebel, C. Sensory Processing of Water Currents by Fishes. Phil. Trans. Royal Soc. London B Biol. Sci. 355 (1401), 1325-1327 (2000).
- Buck, L. M., Winter, M. J., Redfern, W., Whitfield, T. T. Ototoxin-Induced Cellular Damage in Neuromasts Disrupts Lateral Line Function in Larval Zebrafish. Hearing Res. 284 (1-2), 1-2 (2012).
- Engelmann, J., Hanke, W., Mogdans, J., Bleckmann, H. Hydrodynamic Stimuli and the Fish Lateral Line. Nature. 408 (6808), 51-52 (2000).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguch, M., Liao, J. C. Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line. PloS One. 7 (5), e36661 (2012).
- Raible, D. W., Kruse, G. J. Organization of the Lateral Line System in Embryonic Zebrafish. J. Comp. Neurol. 421 (2), 189-198 (2000).
- Coffin, A. B., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. Extracellular Divalent Cations Modulate Aminoglycoside-Induced Hair Cell Death in the Zebrafish Lateral. 253 (1-2), 1-2 (2009).
- Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).
- Ma, E. Y., Rubel, E. W., Raible, D. W. Notch Signaling Regulates the Extent of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral Line). J. Neurosci. 28 (9), 2261-2273 (2008).
- Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and Fins: Non-Mammalian Models for Hair Cell Regeneration. Brain Res. 1277, 12-23 (2009).
- Bibliowicz, J., Tittle, R. K., Gross, J. M. Toward a Better Understanding of Human Eye Disease Insights From the Zebrafish, Danio Rerio. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 100, 287-330 (2011).
- Mione, M. C., Trede, N. S. The Zebrafish As a Model for Cancer. Dis. Model. Mech. 3 (9-10), 9-10 (2010).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult Zebrafish As a Model Organism for Behavioural Genetics. BMC. Neurosci. 11, (2010).
- Mathur, P., Guo, S. Use of Zebrafish As a Model to Understand Mechanisms of Addiction and. Complex Neurobehavioral Phenotypes. Neurobiol. Dis. 40 (1), 66-72 (2010).
- Ignatius, M. S., Langenau, D. M. Zebrafish As a Model for Cancer Self-Renewal. Zebrafish. 6 (4), 377-387 (2009).
- Milan, D. J., MacRae, C. A. Zebrafish Genetic Models for Arrhythmia. Prog. Biophys. Mol. Biol. 98 (2-3), 2-3 (2008).
- Van Trump, W. J., Coombs, S., Duncan, K., McHenry, M. J. Gentamicin Is Ototoxic to All Hair Cells in the Fish Lateral Line System. Hear. Res. 261 (1-2), 1-2 (2010).
- Littleton, R. M., Hove, J. R. Zebrafish: a Nontraditional Model of Traditional Medicine. J. Ethnopharmacol. 145 (3), 677-685 (2013).
- Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line). PLoS One. 7 (5), 36661-36 (2012).
- Liang, J., Wang, D., Renaud, G., Wolfsberg, T. G., Wilson, A. F., Burgess, S. M. The Stat3/Socs3a Pathway Is a Key Regulator of Hair Cell Regeneration in Zebrafish [Corrected. J. Neurosci. 32 (31), 10662-10673 (2012).
- Nakae, M., Asaoka, R., Wada, H., Sasaki, K. Fluorescent Dye Staining of Neuromasts in Live Fishes: An Aid to Systematic Studies. Ichthyol Res. , 286-290 (2012).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent Probes That Stain Living Nerve Terminals. The J. Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Owens, K. N., Coffin, A. B., Hong, L. S., Bennett, K. O., Rubel, E. W., Raible, D. W. Response of Mechanosensory Hair Cells of the Zebrafish Lateral Line to Aminoglycosides Reveals Distinct Cell Death Pathways. Hear. Res. 253 (1-2), 1-2 (2009).
- Namdaran, P., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. Identification of Modulators of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral. 32 (10), 3516-3528 (2012).
- Herrera, A. A., Banner, L. R. The Use and Effects of Vital Fluorescent Dyes: Observation of Motor Nerve Terminals and Satellite Cells in Living Frog Muscles. J. Neurocytol. 19 (1), 67-83 (1990).
- Hickey, P. C., Jacobson, D., Read, N. D., Louise Glass,, L, N. Live-Cell Imaging of Vegetative Hyphal Fusion in Neurospora Crassa. Fungal. Genet. Biol. 37 (1), 109-119 (2002).
- Olsen, A. S., Sarras, M. P., Intine, R. V. Limb Regeneration Is Impaired in an Adult Zebrafish Model of Diabetes Mellitus. Wound Repair Regen. 18 (5), 532-542 (2010).
- Olsen, A. S., Sarras, M. P., Leontovich, A., Intine, R. V. Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression. Diabetes. 61 (2), 485-491 (2012).
