Un ensayo para la línea lateral de regeneración en adultos de pez cebra

Summary

Debido a que muchos modelos de pez cebra de enfermedades neurológicas y no neurológicas se estudian en los peces adultos en lugar de el embrión / larvas, hemos desarrollado un ensayo cuantitativo regenerativa línea lateral que se puede aplicar a modelos de enfermedad de pez cebra adultos. El ensayo implicó resolución en el neuromast 1) y 2) los niveles de células cabello individual.

Abstract

Debido a la importancia clínica de la audición y trastornos del equilibrio en el ser humano, los organismos modelo, como el pez cebra se han utilizado para estudiar el desarrollo de la línea lateral y la regeneración. El pez cebra es particularmente atractivo para estos estudios debido a su tiempo de desarrollo rápido y su alta capacidad de regeneración. Hasta la fecha, los estudios de pez cebra de la regeneración de la línea lateral se han utilizado principalmente pescado de las etapas embrionarias y larvarias debido al menor número de neuromastos en estas etapas. Esto ha hecho que el análisis cuantitativo de la línea de la regeneración y / o el desarrollo más fácil en las etapas anteriores del desarrollo lateral. Debido a que muchos modelos de pez cebra de las enfermedades neurológicas y no neurológicas se estudian en los peces adultos y no en el embrión / larvas, nos centramos en el desarrollo de un ensayo de regeneración de la línea lateral cuantitativa en adultos de pez cebra para que un ensayo estaba disponible que podría ser aplicado a la corriente modelos de enfermedad de pez cebra adultos. Sobre la base de estudios previos de Van Trump et al ^17. que describe los procedimientos para la ablación de las células ciliadas en peces adultos mexicana ciega cueva y el pez cebra (Danio rerio), nuestro ensayo fue diseñado para permitir la comparación cuantitativa entre el control y los grupos experimentales. Esto se logró mediante el desarrollo de una curva estándar neuromast regenerativa basado en el porcentaje de reaparición neuromast durante un período de tiempo de 24 horas después de la necrosis inducida por la gentamicina de las células ciliadas en una región definida de la línea lateral. El ensayo también fue diseñado para permitir la extensión del análisis a nivel de la célula individual del pelo cuando se requiere un mayor nivel de resolución.

Introduction

La línea lateral del sistema (SD) es un órgano mecanosensorial encontrado en ambos peces y anfibios que se encarga de la audición, el equilibrio, rheotaxis y conductas mediadoras como la escolarización y la evitación de depredadores ^1-5. Se compone de grupos de células de pelo rodeado de células de soporte, ambos de los cuales están situados en estructuras llamadas neuromastos ^6. Estos neuromastos están organizados típicamente en líneas verticales (llamado puntos) a lo largo del eje longitudinal del cuerpo y la cola con algunos puntos de sutura horizontales observados en la cabeza del pescado. En el adulto, neuromastos son significativamente mayores en número dentro de los puntos de sutura en comparación con los peces de embriones o larvas ^6. Estudios biomédicos en el pez cebra se han centrado en el efecto del tratamiento antibiótico, el trauma a causa del ruido, la infección crónica, etc. en células ciliadas ^7,8 en un intento de comprender mejor sus efectos en los seres humanos.

A diferencia de la mayoría de los vertebrados, TEleosts, como el pez cebra (Danio rerio), tienen la capacidad de regenerar las células pilosas perdidas. El pez cebra son particularmente útiles debido a su tiempo de desarrollo rápido y de alta capacidad de regeneración. Hasta la fecha, sin embargo; estudios sobre el desarrollo de pez cebra de la línea lateral y / o regeneración han utilizado principalmente el pescado etapa embrionario y larval debido a la reducción del número de neuromastos la línea lateral que permite para el recuento más fácil y análisis ^6,9,10.

Sin embargo, se estudian como muchos modelos de pez cebra de las enfermedades neurológicas y no neurológicas ^11-16 en el pez adulto y no las larvas, que se centró en el desarrollo de un ensayo de regeneración de la línea lateral en el pez cebra adultos usando gentamicina (un aminoglucósido utilizado anteriormente en larvas de pez cebra y más recientemente utilizado con peces adultos ¹⁷⁾ de manera que un ensayo estaba disponible que podría aplicarse a modelos de enfermedad de pez cebra adultos actuales. Mientras que previamente publicado procedimientos de Van Trump et al. ¹⁷ establece las condiciones para la ablación de las células ciliadas en los peces adultos, no establecieron una curva estándar para la regeneración neuromast que se requiere para la comparación cuantitativa entre el control y los grupos experimentales, como al utilizar líneas de pez cebra transgénico o estados de enfermedad inducidos farmacológicamente- en el pez cebra ^18. Por lo tanto, seguimos los procedimientos de Van Trump et al. ¹⁷ para la ablación de las células ciliadas, pero construido sobre sus actividades para crear una curva estándar de la regeneración neuromast para permitir a los investigadores a utilizar nuestros datos cuando se comparan grupos de control y experimentales, como con modelos de enfermedades de pez cebra adultos . El ensayo también fue diseñado para permitir la extensión del análisis a la célula individual del pelo cuando se requiere un mayor nivel de resolución.

Protocol

Todos los procedimientos se llevaron a cabo siguiendo las directrices que se describen en "Principles of Laboratory Animal Care" (Institutos Nacionales de la Salud de la publicación no. 85-23, revisado 1985) y el protocolo de los animales Animal Comité Institucional de Cuidado y Uso de Rosalind Franklin University aprobada 08-19.

1. Gentamicina-inducción de la necrosis de las células de pelo

1. Preparar sulfato de gentamicina en solución salina normal a una concentración final de 0,004% (4,32 mM).
2. Coloque el pescado adulto (D. rerio, de 4-6 meses de edad) en un recipiente que contiene el 0,004% (4,32 mM) solución de gentamicina. Cualquier recipiente puede ser utilizado, pero se utiliza un recipiente de pescado a partir de un sistema acuático Pharmacal que es 7 de ancho, 6 de alto y 7 de largo. Coloque el recipiente con los peces en una incubadora a 28 º C durante 24 horas. Ajuste el volumen total de fluido en el depósito a un nivel suficiente para mantener los peces en un estado viable para el período de 24 horas. Nota: La aireación del fluido de gentamicina no es necesario Si hay volumen suficiente se utiliza para el número de peces que se está tratando.

2. Tinción vital de las células ciliadas

1. Preparar una concentración de 0,08% (en solución salina normal) del colorante vital fluorescente [4-4-diethylaminostyryl yoduro)-N-metilpiridinio (485 nm λ de excitación y 603 nm de emisión λ en metanol) a partir de una solución madre de trabajo de 15 mg / ml en etanol.
2. Para determinar si el tratamiento gentamicina fue eficaz un subconjunto de control y gentamicina peces tratados se tiñeron inmediatamente mediante la colocación de los peces en el pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos que contiene el colorante vital. Utilice un número suficiente de peces (y placas de cultivo como se requiere para la significación estadística que deben alcanzarse. Sobre la base de la velocidad del examinador de contar neuromast, coloque el pescado en los platos de forma escalonada en el tiempo para que los peces no se tiñen durante más de 75 min como se describe en el paso 2.3.
3. Coloque las placas desde el paso 2.2 en un cajón banco por el microscopio de fluorescencia paraser utilizado para el examen de neuromastos manchados. Apagar las luces de la habitación para evitar la extinción del colorante vital durante el periodo de tinción de 1 hora a temperatura ambiente.
4. Preparar tanto tinte de lavado y depósitos de agua anestésicos. Tinte de agua de lavado de agua normal de los peces y de agua anestésico, agregue suficiente 2-fenoxietanol manera que se consigue una dilución 1:1000 en agua normal de los peces.
5. Coloque el pescado en exceso de agua normal de los peces para enjuagar el exceso de colorante vital y vaya al paso 3.1 para la observación de tinte manchado pescados vital.
6. Para examinar la regeneración de neuromastos, transferir peces gentamicina tratados que fueron lavados en agua normal de los peces a una incubadora de entre 8 a 16 horas a 28 ° C.
7. En diversos momentos entre 8-16 hr, pescado se retiran de la incubadora, se lavaron y se tiñeron como se indica en los pasos 2.1 a 2.4. Continúe en el paso 3.1 para la observación de tinte manchado pescados vital.

3. Anestesiar Fish and Counting fluorescente de neuromastos

1. Coloque la tapa en la etapa de un microscopio estereoscópico de fluorescencia para obtener una imagen digital del colorante vital neuromastos manchadas de los puntos de sutura del cuerpo mediados.
2. Utilizar una cámara digital se coloca en el microscopio fluorescente estéreo establece un aumento de 2X para capturar imágenes para el análisis cuantitativo posterior. Nota: La configuración de la ampliación del microscopio estereoscópico puede depender de la marca del microscopio usado, pero el ajuste debe permitir una fácil visualización y recuento de neuromastos individuales dentro de los puntos a mediados del cuerpo.
3. Determinar la cantidad de regeneración mediante el recuento del número de neuromastos visibles dentro de los cuatro puntos de sutura designadas en el lado inferior más ventral de los peces justo proximal a la aleta pectoral derecha (véase la Figura 1). Para el análisis estadístico usar una prueba adecuada, como ANOVA or T-test de Student. Los experimentos deberían utilizar un mínimo de 5 peces por punto de tiempo y todos los experimentos deben repetirse un mínimo de 3 aumentos.
4. Sobre la base de la curva de tiempo de regeneración neuromast (véase la Figura 3), contar neuromastos entre 8-16 h después de gentamicina lavar de salida para estar dentro de la fase lineal de la curva de la regeneración. Nota: El uso de la fase de tiempo lineal permite el análisis cuantitativo adecuado entre el control y los grupos experimentales.

4. Conteo fluorescente de las células ciliadas individual para la obtención de mayor resolución del Análisis Cuantitativo si el análisis neuromast no es estadísticamente significativo

1. Si el análisis cuantitativo en el nivel de neuromastos no es significativa, el análisis a nivel de la célula individual del pelo también se puede utilizar para obtener un mayor grado de resolución. Seleccione peces en un momento posterior gentamicina en particular lavar Salida (punto en el tiempo sobre la base de los estudios neuromast anteriores), colorante vital stain el pescado tal como se describe en el Protocolo 2 y, a continuación, la eutanasia a los peces utilizando 2-fenoxietanol a una dilución 1:500 de 1-5 min.
2. A la luz tenue para evitar enfriamiento rápido, hacer cuatro incisiones para que una preparación de colgajo de piel cuadrado se hace de la siguiente manera. Hacer una incisión a lo largo de las costillas superiores del pescado hasta que esté alineado con las aletas anales, a continuación, hacer una incisión en el vientre, y, finalmente, hacer dos incisiones verticales a cada lado de estas incisiones por lo que se crea el colgajo de piel cuadrado. Nota: Esta preparación de la piel incorporará los puntos de sutura del cuerpo mediados utilizados en los experimentos neuromast.
3. Coloque la muestra de la piel en un portaobjetos de vidrio y luego se coloca una hoja de cubierta de vidrio circular sobre la muestra de piel extirpadas para ayudar ancla y aplanar el tejido para la imagen digital posterior.
4. El uso de las muestras de piel desde el paso 4.3, obtener imágenes digitales de las células ciliadas dentro de cada neuromast de los puntos de sutura del cuerpo mediados. Tome imágenes con un aumento de por lo menos 60X y luego contar el ce pelolls dentro neuromastos individuales para el análisis cuantitativo comparativo de los grupos control y experimentales (ver Figura 4).

Representative Results

Optimización de los procedimientos para cuantificar neuromast regeneración de la línea lateral en el pez cebra adulto.

Los neuromastos de larvas de pez cebra son fácilmente cuantificables; Sin embargo, la línea lateral del pez cebra adulto tiene un número mucho mayor de neuromastos por puntadas que hacen análisis cuantitativos más difícil ^6,17,19,20. Como se ve en la Figura 1A, la cabeza tiene un número significativamente mayor de neuromastos en comparación con ya sea la mitad de la sección o de la cola; con la región de la cola que tiene el menor número de neuromastos como se muestra en la Figura 1D. Debido a que el patrón de puntos de sutura en la cabeza es complicado y significativamente mayor en el número de neuromastos, que no se presta a sí misma como una región para el análisis cuantitativo. Además, independientemente de la concentración de gentamicina hemos probado, la ablación completa de neuromastos largo de la cabeza era rara vez alcanzable; manchas que salen de neuromastos observadas después de tratamiento con gentamicina como se informó anteriormente por Van Trump et al. ¹⁷ Por el contrario, la cola tiene muy pocos neuromastos, y como tal, hemos seleccionado la región media del cuerpo (Figura 1B) analizar cuantitativamente la regeneración neuromast en el adulto. En esta región, se identificaron cuatro puntos de sutura justo por detrás de la aleta pectoral lateral que fueron consistentes en número neuromast entre todos los adultos [61,45 (n = 95)] (Figuras 1B y 1E). Es importante destacar que, hemos sido capaces de realizar la ablación de manera consistente y completamente los neuromastos de esta región por un 24 hr 0,004% de tratamiento de gentamicina (como se informó anteriormente en Van Trump et al. ¹⁷⁾ lo que permite una determinación precisa de la regeneración posterior neuromast (compárense las Figuras 1B y 1E y la inserción de la figura 2, 0 h).

p_upload/51343/51343fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figura 1. El patrón de fluorescencia de neuromast dentro de puntos de sutura de la pez cebra adultos se muestra a lo largo del eje longitudinal. El panel A es la región de la cabeza, el panel B es la región del cuerpo con los cuatro puntos de sutura utilizados para el análisis cuantitativo se indica con una caja. Panel C es la región posterior del cuerpo. Panel D es la región de la aleta caudal. Un aumento mayor de los 4 puntos de la región del cuerpo se utiliza para el análisis cuantitativo se muestra en el panel de E. Potencia de aumento de 1X y 2X.

Se ha informado de que el tratamiento de sulfato de cobre es un método químico eficaz para inducir la necrosis rápida de las células ciliadas en los embriones y larvas ^21. Aquí hemos probado el tratamiento de sulfato de cobre, con la esperanza de que podría acortar el tiempo para inducir la ablación neuromast. Concentraciones de sulfato de cobre que van desde5-50 mM durante diversos tiempos de exposición de hasta 48 horas se utilizaron como se había informado anteriormente por Liang et al. ²¹ Se encontró que el sulfato de cobre era letal en las concentraciones más altas y no es eficaz a concentraciones más bajas en los peces adultos (datos no mostrados) . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los parámetros utilizados para el análisis de fluorescencia de la regeneración de la línea lateral en el pez cebra adulto.

La regeneración se controló después de todos neuromastos dentro de los cuatro puntos de sutura de mitad de cuerpo se realiza la ablación siguiente 24 horas gentamicina-tratamiento (Figura 2, comparar 0 h con el control) y la regeneración positiva se determinó por la aparición de un mínimo de tres neuromastos dentro de una puntada. (Figura 2, 0 h). Para el 8 de hpg, aproximadamente un tercio de los peces tenía algún signo de recuperación (n = 34); aunque la intensidad de neuromastos era débil en los puntos de regeneración (Figura 2, 8 hr, puntos débiles señalados por las cajas). El número de neuromastos y su intensidad continuaron aumentando de forma lineal hasta la regeneración alcanzó una meseta a 16 HPG (comparar Figura 2, 16 h con la Figura 2, 8 h). No fue sino hasta al menos 24 hpg que todos los peces tratados con gentamicina se habían recuperado plenamente con ambos el mismo número e intensidad de los neuromastos dentro de los puntos de sutura en la línea lateral, en comparación con los controles (Figura 2, 24 h). Una línea de tiempo para la regeneración neuromast después de la retirada de gentamicina se muestra en la Figura 3 que muestra las fases lineales y de meseta de la curva de recuperación. Observamos que en menos de 5% de los casos, los puntos de sutura de regeneración no aparecieron como entidades individuales, sino en lugar apareció como una mancha de fluorescencia.

Figura 2. Imágenes fluorescentes de neuromastos. Peces de control, 0 Hr pescado (inmediatamente después de 24 h de tratamiento con gentamicina 0,004%), pescado 8 Hr (8 hpg) con algunas manchas débiles de neuromastos dentro de los 4 puntos de sutura para el análisis cuantitativo (sólo el 30% de todos los peces mostraron este patrón de manchados 8 hpg; 70% no mostró tinción neuromast en este punto del tiempo; las cajas blancas describen los neuromastos débilmente teñidas que se observaron en el 30% del pescado que mostró cierto grado de regeneración a las 8 hpg), 16 Hr peces, y 24 peces Hr. La regeneración completa de neuromastos dentro de los 4 puntos de sutura en cuanto a 1) el número de neuromastos y 2) la intensidad de la tinción de neuromastos se observó en un 24 hpg. Haga clic aquí paraver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Gráfico que muestra el curso temporal de neuromastos la regeneración después de la retirada de 24 h de tratamiento de adultos de pez cebra con 0,004% de gentamicina. Como se muestra, la recuperación comienza en el punto de tiempo de 8 HPG y alcanzó una meseta en el punto de tiempo de 16 HPG. Esto define la fase de revestimiento de la regeneración neuromast entre 8-16 hr y puntos de tiempo dentro de esta fase lineal se debe utilizar para comparar cuantitativamente los grupos de control y experimentales.

Toxicidad neuromast es inducida por la exposición prolongada a los tintes fluorescentes de tinción.

En nuestra opinión una forma ideal para llevar a cabo estos experimentos sería manchar el pescado con el colorante fluorescente antes del tratamiento, la mancha de nuevo a 0 horas y luego se mancha de nuevo unpuntos de tiempo t de regeneración. Sin embargo, nos encontramos con una complicación de estos estudios, que es el hecho de que los teléfonos pelo colorantes de tinción fluorescentes tales como 4-Di-2-Asp, como también puede ser el caso con otras manchas mitocondriales ²² puede tener un efecto tóxico sobre las células de pelo ^23. Este hecho nos requiere el uso de grupos separados de peces desde tinción repetida de la misma pescado no podría ser empleado. En todos los casos los peces experimentales, incluyendo controles fueron tratados en paralelo para eliminar la variabilidad experimental.

Confocal análisis a nivel de células individuales del cabello.

Si los resultados obtenidos del análisis neuromast no son estadísticamente significativas entre el control y los grupos experimentales, se puede extender estos estudios para el nivel de las células individuales de granizo para obtener un mayor grado de resolución para comparaciones cuantitativas. Como se indica en la Figura 4, neuromastos de un grupo de control (uneuromast a las 12 h de regeneración se muestra en esta figura) puede ser visto por microscopía confocal de preparaciones para la piel de la región del cuerpo mediados. A las 8 h, 10 h, y 12 h de tiempo de regeneración, encontramos que los grupos de control (7 animales / grupo) tuvieron un rango de 0-4 células de pelo / neuromast. Como era de esperar para los grupos de control, cuando se analiza cuantitativamente, no se detectó ninguna diferencia estadística entre neuromastos en términos del número de células ciliadas por neuromast en los puntos de tiempo indicados más arriba (valores de P variaron desde 0,230 hasta 0,472). Tal enfoque puede ser tomada entre cualquier grupo de control y el experimento cuando sea necesario para extender o confirmar los datos obtenidos a partir de la primera fase de los estudios neuromast.

Figura 4. Análisis de cabello regeneración celular / neuromast usando productos para la piel de la región de la línea lateral definido describió in paso protocolo 3.3. imagen confocal fluorescente de las células ciliadas dentro de un neuromast obtenido a partir de una preparación de la piel del pez cebra. Dos células ciliadas manchadas colorante vital se muestran dentro de un neuromast de un peces de control (Figura 4). Esta imagen fue obtenida 12 horas después de la eliminación de la gentamicina (fase de regeneración lineal). El símbolo de corchete blanco () indica una neuromast individuo mientras que la flecha blanca indica una célula de apoyo en torno a las células ciliadas. Células de soporte no se tiñen en estas condiciones y aparecen como espacios en blanco. Ampliación, 60X.

1	1. Tratamiento con gentamicina [0,004% (4,32 mM)] de control y peces experimentales durante 24 horas a 28 ° C utilizando una incubadora.
2	2. Lave de gentamicina para iniciar la regeneración de las células ciliadas. Peces Volver a la incubadora de 28 ° C para el investigador determinados periodos de tiempo entre 8-16 horas.
2	De control 3. Vital tinte mancha [0,08% de yoduro de 4-4-diethylaminostyryl-N-metilpiridinio (4-Di-2-Asp)] y peces experimentales durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se lavan a cabo mancha con agua para peces de imagen fluorescente.
1 o 2	4. Si es necesario debido a resultados no significativos de análisis de neuromastos, repetir Protocolos 1-3 con un grupo de control separado y peces experimentales, pero a continuación, obtener una preparación de la piel para el análisis confocal de células de pelo individuales.

Tabla 1. Un resumen del protocolo descrito anteriormente.

Discussion

Basado en el extenso cuerpo de literatura que se ha establecido para el análisis de la línea lateral de regeneración (LL) en embriones y larvas de pez cebra ^8,24,25, el objetivo de nuestro estudio fue desarrollar un ensayo cuantitativo para la regeneración de la línea lateral en el pez cebra que podrían ser aplicada a modelos de enfermedades que se estudian mejor en los peces adultos. Hemos encontrado que ciertos puntos críticos son importantes en la aplicación de los procedimientos desarrollados para los peces de embriones / larvas de los peces adultos. El más importante de estos puntos considerarse: 1) el número de la línea lateral neuromasts lo largo del eje longitudinal del pescado, 2) la duración de la tinción de las células ciliadas neuromast, 3) la concentración y la duración de tratamiento de la aminoglucósido, y 4) el momento de la regeneración de la línea lateral después del tratamiento aminoglucósido. Estos puntos se abordarán en la siguiente discusión.

En lo que se refiere al número de neuromastos lo largo de la línea lateral del pez cebra, El pez cebra embrionario y larval tiene la ventaja de que los neuromastos tienen un patrón sencillo debido a su número más bajo en un punto dado en comparación con los peces adultos. Este bajo número ha permitido a los investigadores a identificar claramente cada neuromast y asignar un nombre a la misma ^6. De esta manera, los estudios de regeneración pueden cuantificar la reaparición de una neuromast particular, por su nombre en cualquier momento después de la retirada de un agente aminoglucósido. El mayor número de neuromastos por puntada en el adulto introduce dificultad significativa en el recuento preciso y cuantificación durante la reaparición de regenerar neuromastos cuando se compara a la de embriones o larvas. Como se muestra, se evaluó el patrón de neuromastos línea lateral dentro de las puntadas de los adultos y se determinó que la mitad del cuerpo (figs. 1 y 2), siempre que la región óptima de los puntos de sutura para su análisis.

La tinción de neuromastos con células ciliadas colorantes tales como 2 - [4 - (dimetilamino) estiril]-N-ethylpyridiyoduro Milenio (DASPEI) o 4-Di-2-Asp permite visualizar neuromastos de la línea lateral utilizando microscopía estereoscópica fluorescente ^26,27 en larvas y peces juveniles. Estas mismas manchas también son eficaces en los peces adultos y nuestro análisis cuantitativo indican que no se observó ninguna diferencia significativa en el número de neuromastos dentro de la región media del cuerpo entre el pez cebra normal de control (con un promedio de 61,45 neuromastos en peces de control normal de adulto).

Se ha informado de que los tintes de células del cabello, tales como 2 - [4 - (dimetilamino) estiril] yoduro-N-etilpiridinio (DASPEI) o 4-Di-2-Asp pueden ellos mismos ser tóxico para neuromast células ^24, y el pescado no puede ser repetidamente manchado con estos agentes fluorescentes si uno va a monitorear la regeneración inducida por aminoglucósidos. Tinción repetida de la misma peces introduce múltiples eventos de toxicidad (por tanto la mancha y el aminoglucósido) que hace que el experimento de las Naciones Unidas-interpretables ^23. Por consiguiente, todos los experimentosen nuestro estudio paralelo de tinción 4-Di-2-Asp requerido de múltiples conjuntos de peces con el fin de mostrar que neuromastos eran 1) presente en la condición de control no tratado gentamicina, 2) completamente ablacionada inmediatamente después de la exposición de gentamicina, y 3) la regeneración en algún hora después de la gentamicina tratos después de la retirada y el lavado fuera de este aminoglucósido. De esta manera, todos los peces se tiñó una sola vez con el tinte neuromast.

Cabe señalar que, si bien los procedimientos de Van Trump et al. ¹⁷ establecen las condiciones para la ablación de las células ciliadas en los peces adultos, que no establecen una curva estándar para la regeneración neuromast que se requiere para la comparación cuantitativa entre el control y los grupos experimentales. Por lo tanto, seguimos los procedimientos de Van Trump et al. ¹⁷ para la ablación de las células ciliadas (concentración de gentamicina al 0,004% con un tiempo de exposición de 24 h, véase la figura 2 para los resultados de ablación de las células pilosas en el 24hr), pero amplió sus actividades para crear una curva estándar de la regeneración neuromast. Esto permite el análisis comparativo de la regeneración LL en el pez cebra adultos usando los cuatro puntos de sutura de la región del cuerpo mediados que hemos establecido para nuestras condiciones de ensayo (véanse las Figuras 1 y 2). Con el fin de determinar si podría obtenerse un período más corto para la ablación de células de cabello, también a prueba el efecto de sulfato de cobre que se ha utilizado con eficacia en las larvas de peces durante períodos tan cortos como 2 horas. Nuestros estudios indican que el sulfato de cobre (5-50 mM durante diversos tiempos de exposición de hasta 48 horas como se había informado anteriormente por Liang et al. ²¹ para las larvas) no se ha encontrado para ser eficaz en peces adultos como un agente para la ablación de células de cabello. Esto pone de relieve el hecho de que las condiciones utilizadas para la ablación de células ciliadas en los embriones y larvas no siempre pueden ser transferidos directamente para su uso con los peces adultos.

Como perteneciente a la línea lateralla regeneración en el adulto, hemos encontrado marcos de tiempo similares para la regeneración de neuromastos entre la de embrión / larvas y adultos de pescado. Como se informó anteriormente por otros, embriones de pez cebra y larvas espectáculo regeneración neuromast en 12-24 h después de aminoglucósidos de lavado de ^8. Se observó la fase lineal de la regeneración neuromast que aparece en el marco de tiempo de 8-12 (no visto como puntos de sutura completos para el punto de tiempo de 8 horas, como se muestra en la Figura 2) con una meseta alcanzado en 16 HPG. Apariencia de control como completa de neuromastos dentro puntadas no se observó hasta el 24 de hpg que las indicadas para los embriones y larvas. Apariencia de control como completa denota tanto el número y la intensidad de neuromastos dentro de los cuatro puntos de la región media del cuerpo en adultos de pez cebra. Además, si los resultados cuantitativos obtenidos a nivel de los neuromastos no son estadísticamente significativos, el investigador puede extender sus estudios para el nivel de las células individuales del pelo dentro de los neuromastosutilizando microscopía confocal como se describe por nuestros procedimientos.

El ensayo de regeneración de las células neuromastos / pelo descrito en este artículo se puede aplicar a estados de enfermedad que se manifiesta mejor en el pez cebra adultos en lugar de en las primeras etapas larvales / embrionario. Una limitación del ensayo se refiere a la afecta de las condiciones experimentales ya sea 1) la cepa transgénica que imita un estado de enfermedad particular, o 2) un estado de enfermedad inducida farmacológicamente-] en células madre dentro del sistema de la línea lateral de adultos de pez cebra. En este sentido, un estado de enfermedad particular de la pez cebra adulto puede o puede no afectar a las células madre del linaje de células de cabello, y es importante tener en cuenta que la regeneración neuromast es completamente dependiente de estos proliferación de células madre / diferenciación procesa ^8,24,25 .

Como un ejemplo de esta limitación, vamos a describir los experimentos realizados en un modelo de pez cebra adultos de la diabetes de tipo I. Esta particulmodelo de enfermedad ar se desarrolló en adultos de pez cebra para el estudio a largo plazo complicación secundaria inducida por la hiperglucemia ^28. Por un número de razones descritas anteriormente ^28,29, estos estudios sólo se pueden realizar utilizando el pez cebra adultos. Debido a los nervios periféricos, junto con las estructuras celulares especializadas que inervan se ven afectados de manera adversa en los pacientes con diabetes, quisimos determinar si la regeneración de la línea lateral de neuromastos / células de pelo también estaba alterada en el pez cebra diabética. Usando el ensayo de regeneración de la línea lateral con retraso estadísticamente significativa se detectó en la regeneración neuromast. Para confirmar este resultado negativo, se repitieron los experimentos en el nivel más refinado de la célula de pelo individual. Una vez más, no se observó ninguna diferencia estadísticamente significativa en la regeneración de células ciliadas entre el control y los grupos de diabéticos. Por lo tanto, los datos no fueron consistentes con la hipótesis de que la hiperglucemia impide la regeneración celular neuromast / cabello; posiblemente debido a la resistencia de las células madre del linaje de células de cabello a las condiciones hiperglucémicas. Con esta limitación en mente, el ensayo de regeneración celular neuromastos / pelo descrito en este artículo proporciona un medio para comprobar si cualquier modelo de la enfermedad de pez cebra adulto en particular implica una disfunción en el proceso de regeneración de las células ciliadas monitorizada mediante el sistema de la línea lateral. Los resultados positivos implicarían la participación de células madre y por lo tanto serían garantizados nuevos estudios.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml)	Sigma Aldrich	G1397
2 Phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol	Aldrich	D-3418	485 nm excitation λ and 603 nm emission λ
6-well Plates	Mid Sci	TP92006
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
Glass Bottom Microwell Dishes	Matek Corporation	P35G-1.5-14-C
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting  Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
ImageJ software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.
Confocal microscope	Olympus	FV10i	Any high resolution fluorescent microscope is suitable
Aquatic System	KG Aquatics ZFS Rack System		Any aquatic system can be used