Summary
Zelloberflächen-Proteine sind biologisch wichtige und weithin glykosyliert. Wir stellen hier eine Glykopeptid-Capture-Ansatz für einfache LC-MS basierte Proteomanalysen löslich zu machen, zu bereichern, und deglycosylieren diese Proteine.
Abstract
Zelloberflächenproteine, einschließlich extrazellulären Matrixproteinen, sich an allen wichtigen zellulären Prozessen und Funktionen, wie Wachstum, Differenzierung und Proliferation. Eine umfassende Charakterisierung dieser Proteine bietet reichhaltige Informationen zur Entdeckung von Biomarkern, Zelltyp-Identifikation und Drogenzielauswahl, als auch helfen, unser Verständnis der Zellbiologie und Physiologie voraus. Oberflächenproteine stellen jedoch erhebliche analytische Herausforderungen, die aufgrund ihrer inhärent niedrigen Fluss, hohe Hydrophobie und schwere post-translationale Modifikationen. Unter Ausnutzung der vorherrschenden Glykosylierung auf Oberflächenproteine, führen wir hier ein Hochdurchsatz-Glycopeptid-Capture-Ansatz, der die Vorteile von mehreren vorhandenen N-Glycoproteomikstrategie Mittel integriert. Unsere Methode kann die Glykopeptide von Oberflächenproteinen abgeleitet bereichern und entfernen ihre Glykane für einfache Proteomik mittels LC-MS. Die beschlossene N-glycoproteome umfasst die informationen von Protein Identität und Quantität sowie ihre Websites der Glykosylierung. Dieses Verfahren hat zu einer Reihe von Studien in Bereichen wie Krebs, Stammzellen und Arzneimitteltoxizität angewendet. Die Beschränkung des Verfahrens liegt in der geringen Häufigkeit von Oberflächenmembranproteinen, so dass eine relativ große Menge von Proben für die Analyse erforderlich im Vergleich zu Studien am cytosolischen Proteine zentriert.
Introduction
Zelloberflächen-Proteine interagieren mit der extrazellulären Umgebung und leiten Signale von der Außenseite zur Innenseite der Zelle. Somit sind diese Proteine, einschließlich extrazellulären Matrixproteinen, spielen wichtige Rollen in allen Aspekten der Zellbiologie und der Physiologie von Proliferation, Wachstum, Migration, Differenzierung Alterung und so weiter. Oberflächenproteine funktionieren durch die Interaktion mit anderen Zellen, Proteinen und kleinen Molekülen 03.01. Molekulare Charakterisierung von Zelloberflächenproteinen ist von großem Interesse, nicht nur für Biologen, sondern auch für die pharmazeutische Industrie, da mehr als 60% der Medikamente, Zelloberflächenproteine 4 ausgerichtet.
Tandem-Massenspektrometrie (MS), mit seiner überlegenen Sensitivität, Genauigkeit und Durchsatz für die Identifizierung von Proteinen und Peptiden, wurde ein leistungsfähiges Werkzeug für die globale proteomische Studien 5,6. Doch stellen Oberflächenproteine erhebliche Herausforderungen zu MS-basierte Proteomik, wiedie meisten Oberflächenproteine gibt es in geringen Mengen und mit schweren Veränderungen. Die Membran-überspannenden Regionen der Oberflächenproteine machen sie hydrophob ist; Dies ist insbesondere der Fall bei Multitransmembranproteine. Es ist daher schwierig, Membranproteine in wässrigen Lösungen ohne Zuhilfenahme eines Detergens zu lösen; Jedoch ist die Verwendung von Waschmitteln in der Regel unterdrückt die Leistung der HPLC und MS 1,7,8 Proteinidentifikation. Daher Membranproteine wurden schlecht in direkten LC-MS basierte Proteomik gekennzeichnet.
Die Glykosylierung ist eine der wichtigsten und reichlich post-translationale Modifikationen, die sich in Zelloberflächenproteine 9. Die enorme Komplexität und Heterogenität der Glykane behindern Peptide 'MS-Signal 10. Dennoch haben mehrere proteomische Methoden dieses einzigartige Modifikation verwendet werden, um Oberflächenproteine zu bereichern und die Zuckerreste von Proteinen vor der LC-MS-Analyse zu entfernen. Diese Methodes sind Lektin-basierte Affinitätseinfang 11 und Hydrazid-basierten oder Borsäure Chemie Capture 12 sowie hydrophile Trennungen 8,13. Die Entfernung der Glykane verwandelt Membranproteine, regelmäßige Proteine und vereinfacht die MS Charakterisierung drastisch. Da Glykosylierung in sezernierte Proteine, die eine hohe Löslichkeit im Gegensatz zu Membranproteine erfolgt auch, viele glycoproteomische Methoden für lösliche Proteine optimiert und tendenziell niedrigere Glycopeptid Selektivität und Empfindlichkeit, wenn sie eingesetzt werden, um Proteine 8,14 Membran haben. Andere Verfahren bestehen auch zu bereichern, insbesondere Zelloberflächenproteine, wie z. B. jene, die Ultrazentrifugation 15 und Markierungsstrategien 16. Ein detaillierter Vergleich zwischen unserem Verfahren und anderen bestehenden Methoden zur Charakterisierung von Membranproteinen durchgeführt wurde kürzlich 17, und die Ergebnisse zeigten, daß unser Verfahren ebenso gut ausführen kann, wenn nichtbesser, als alle gegen Membran Proteomics Methoden, aber mit höheren Einfachheit.
Um Forscher mit dieser Methode, die wir hier ausführlich ein allgemeines Protokoll. Diese Methode integriert mehrere Vorteile der bestehenden Glycoproteomikstrategie Strategien und ist speziell für Membran-Glykoproteine entwickelt, doch die Methode funktioniert genauso gut für sekretierte Proteine. Die Merkmale dieses Verfahrens sind: 1) eine vollständige Solubilisierung von Membranproteinen, 2) eine Anreicherung von Glycopeptiden anstelle von Glykoproteinen, die potentielle sterische Behinderung zu vermeiden, wenn unter Verwendung eines festen Erfassungs Substrat, 3) die Verwendung von Hydrazid-Chemie, um kovalente Bindungen zwischen Form Glycopeptide und die Erfassung Substrat, so dass das gebundene Glycopeptide können stringente Waschungen für Hoch glycoselectivity tolerieren, und 4) die Fähigkeit, die gesamte Aufnahmevorgang in einem Rohr zur Probenverlust reduziert und verkürzt die Dauer Verfahren durchzuführen. Nach Durchführung dieses Verfahrens, um das Studium eine variableety von biologischen Proben, einschließlich Zellen und Geweben beobachteten wir eine hohe Selektivität (> 90%) an Glycoproteine 8,17,18.
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Protocol
Ein. Ernte-Membranen
- Hinzufügen hypotonischen Puffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, pH 8,0) mit Proteaseinhibitorcocktail auf einen Zellpellet (~ 10 8 Zellen) und Inkubation für 15-30 min auf Eis. Lyse der Zellen, indem die Probe durch Spritzennadeln (5-10 Durchläufe) oder Homogenisieren der Probe von einem Dounce Homogenisator (15-30 Schläge). Verwenden Sie eine Zählkammer und Trypanblaufärbung um die Effizienz der Lyse zu überprüfen.
- Erhalten Sie die mikrosomale Fraktion durch eine differenzielle Zentrifugation des Lysats bei 3.000 gx 15 min und dann bei 100.000 gx 2 Stunden. Die erste Zentrifugation erhält man ein Pellet, das die Kernfraktion und die anschließende Zentrifugation des Überstandes erzeugt ein zweites Pellet, welches die Mikrosomenfraktion, die die Plasmamembran als auch membrangebundene Organellen 8 enthält. Die endgültige Überstand ist die cytosolische Fraktion. Bewahren Sie die mikrosomalen Fraktionen in -80 ° C-Gefrierschrank für weitere analysist wie nachstehend angegeben.
2. Auflösen, denaturieren und Digest Membranproteine
- Löse den mikrosomalen Fraktion im Denaturierungspuffer (40 mM Tris, 10 mM EDTA, 10 mM TCEP, 0,5% Rapigest, pH 8) und dann inkubieren der Lösung auf 100 ° C für 10 min.
- Kühlen der erhitzten Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt, ultrahochreinen Harnstoffpulver in der Lösung auf 8 M Endkonzentration und Inkubation der Probe bei 37 ° C für 30 min.
- Hinzufügen Iodacetamid Stammlösung zu der Probe auf 15 mM Endkonzentration, und Inkubieren der Lösung in der Dunkelheit für 30 min bei Raumtemperatur, um die freien Thiole in der Probe zu alkylieren. Hinzufügen DTT-Stammlösung zu der Probe auf 10 mM Endkonzentration der Lösung und Inkubation für weitere 10 min bei Raumtemperatur, um das überschüssige Iodacetamid stillen.
- Verdünnt die erhaltene Lösung 10-fach mit 40 mM Tris-Puffer bei pH 8, und anschließend Trypsin hinzufügen, um die Probe bei einer 1:20-Verhältnis von trypsin zum Gesamtprotein. Aufrechterhaltung der Aufschlussreaktion in einem 37 ° C Ofen über Nacht, um sicherzustellen, wird die Reaktion beendet.
- Beenden Sie die Verdauung durch Ansäuern der Probenlösung mit HCl, ein Zustand, bricht auch das Reinigungsmittel, dh Rapigest pH 1. Verschlechtern die Rapigest bei 37 ° C für 1 h, und entfernen Sie die entstandene Niederschlag durch Zentrifugieren.
- Reinigen Sie den Überstand, die Probe-Peptide enthält, die von einem C-18-Festphasenextraktion (SPE) Patrone und trocknen Sie die erhaltene Probe durch Speedvac.
- Durchführen einer SDS-PAGE-Analyse von Proben vor und nach der Trypsin-Verdau, um die Effizienz der Verdauung zu bestätigen.
3. Glycopeptid-Capture-
- Man löst die gereinigten Peptide im Kopplungspuffer (100 mM Natriumacetat, pH 5,5). Hinzufügen Natriumperiodat in die Peptidlösung in einer Endkonzentration von 10 mM für 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. Dadurch werden die cis-Diol-Gruppen in den Glycanen zu Aldehyden oxidieren, Welche die Glykane zu koppeln Harzes durch Hydrazid Chemie ermöglichen. Quenche die übermäßige Periodat durch Natriumsulfit bei einer Endkonzentration von 20 mM und pH 5 für 10 min bei Raumtemperatur.
- Einführung Hydrazid-derivatisierten Harzes in die Peptidlösung in einem Verhältnis von 1:4 (Harz-Lösung) zu koppeln Glycopeptide zu dem Harz. Inkubieren der Reaktion bei 37 ° C für 1-2 Tage mit End-zu-End-Rotation für eine vollständige Kopplung.
- Entfernen der nicht gebundenen Peptide durch Waschen des Harzes zweimal mit 1 ml von jeder der folgenden: DI-Wasser, 1,5 M NaCl, Methanol und 80% Acetonitril. Schließlich 3x Waschen des Harzes mit 1 ml 100 mM NH 4 HCO 3 bei pH 8, um den Puffer des Systems austauschen zu 100 mM NH 4 HCO 3.
- Sammle den Überstand und die Waschschritte für die Analyse von ungebundenen Peptiden (optional).
- Lösen der N-Glycopeptide vom Harz durch PNGase F in einer Inkubation über Nacht bei 37 ° C mitN-Ende-zu-Ende-Rotation. Sammeln Sie die freigesetzten Peptide durch Zentrifugation und einer 80% Acetonitril waschen. Trocknen Sie die erhaltene Lösung in der Speedvac für LC-MS-Analyse.
4. Weitere Fraktionierung (Optional)
Zur weiteren Vereinfachung Probenkomplexität, Fraktionierung der N-Glycopeptiden. Beispielsweise abgeblasen, und der getrockneten Peptide in 10 mM Ammoniak-Formiat, 20% Acetonitril pH 3 und mit starken Kationenaustauscher (SCX) gereinigt, um die Peptide zu fraktionieren. Trocknen des erhaltenen Elutionsmittel und dann analysiert die erhaltenen Peptidfraktionen durch Umkehrphasen-LC-MS 8,17,18.
5. Reinigung der frei N-Glycopeptide (Optional)
Wenn Bedenken erheben für die mögliche Kontamination der Peptide, wieder aufzulösen die getrockneten Peptide in 0,1% Ameisensäure und verwenden Sie einen MCX SPE-Säule, um die Peptide weiter zu reinigen, bevor Umkehrphasen-LC-MS-Analyse.
Bei der selektiven Spaltung von N-Glycopeptide aus dem Harz, wandelt die PNGase F-N-Glycan verknüpft Asparagin zu einer Asparaginsäure. Daher besteht ein 0,9840 Da Massenverschiebung der befreiten N-Glycopeptide. Diese Peptide genau zu identifizieren, muss diese Änderung der Suchparameter mit gemeinsamen Abänderungen wie der Carbamidomethylierung des Cystein und Oxidation der Methionin zugesetzt werden.
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Representative Results
Ein repräsentatives Flussdiagramm des experimentellen Verfahrens ist in Fig. 1 zusammengefaßt. Die Etikettierung und weitere Fraktionierung Schritte sind optional und Details sind in einer Veröffentlichung 18 beschrieben. Eine weitere Möglichkeit ist die unveränderten Peptide, die nicht mit dem Harz reagieren zu analysieren. Die Vorteile des Analysierens der unmodifizierten Peptide umfassen die Identifizierung von potentiellen nicht-glykosylierte Peptide und Proteine, wie Claudinen in tight junctions; Ein zusätzlicher Vorteil ist eine genauere Quantifizierung. Auf der Grundlage dieser Vorteile, bezeichnet man diese Methode lycocapture g-a-g ssisted lobal q engen p roteomics (gagQP) und detailliert die Analyse in einer aktuellen Publikationen 18.
Ein typisches Spektrum Glykopeptid nach Anreicherungsverfahren genommen, ist in Fig. 2 gezeigt. In dem erhaltenen Glycopeptid, das N-Glycan wurde entfernt und das Glycan-Attached Asparagin (N) wum eine Asparaginsäure (D) durch PNGase F umgesetzt; daher kann das Spektrum leicht gesucht werden mit jeder Proteomik Suchmaschine gegen Sequenzdatenbanken gemeinsame Protein.
Die Erfassungsmethode kann durch kommerziell erhältliche Modell Glykoproteine vor ihrer Anwendung mit komplexen und wertvollen biologischen Proben ausgewertet werden. Einige häufig verwendete Modell Glykoproteine sind Avidin (Huhn), Ovalbumin (Huhn), Invertase (Hefe), α-1-Antitrypsin (human), Conalbumin (Huhn) und Ribonuklease B (Rind) (alle können von Sigma erhältlich). Die häufigsten genannten Glycopeptide von diesen Proteinen in einer früheren Veröffentlichung 8 gefunden werden. Eine angepasste Protein-Sequenz FASTA-Datenbank, die für die automatische Suche von LC-MS Ergebnisse dieser Modellproteinen erzeugt wird, kann auf den folgenden Link (http://www.sfu.ca/chemistry/groups/bingyun_sun/tools.html heruntergeladen werden ), die die oben aufgeführten Modellproteinen sowie eine Drehzahl beinhaltet ersed Hefe-Sequenzdatenbank, gemeinsame Verunreinigungen und PNGase F.
Eine typische LC-MS Ergebnis der aufgenommenen N-Glycopeptide ist in Fig. 3 dargestellt, in denen mehr als 100 Glykoproteine können aus einer LC-MS-Durchlauf einer Zelle mikrosomalen Fraktion identifiziert werden. Die Anreicherung Selektivität zu beiden Glycoproteine und Glycopeptide der Regel mehr als 90%. Eine erfolgreiche Analyse kann eine Bereicherung Selektivität von 95% aufweisen. Verwendung einer SCX-Säule und Stufengradienten, um die Proben weitere Fraktionierung vor der LC-MS-Analysen werden in der Regel die doppelte Anzahl von Glykoprotein-Identifikationen 17. Manchmal, wenn die Menge der erhaltenen Glycopeptide gering ist, die aus den Fläschchen akkumulierten Verunreinigung in der letzten Probe beobachtet werden. Diese Verunreinigungen können durch das in Schritt 5 vorgesehen Verfahren entfernt werden.
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Abbildung 1. Ablaufdiagramm des experimentellen Verfahren. Rechtecke Schritte erforderlich sind, und Diamanten sind optionale Schritte.
2. Kollisionsinduzierte Dissoziation (CID)-Spektrum AEPIL N ISNAGPWSR von Bäckerhefe nach dem Glycopeptid-Erfassungsverfahren. Die unterstrichenen Asparagin (N) an die Asparaginsäure (D) umgewandelt, wie in rot in der Peptidsequenz in der Figur hervorgehoben .
Abbildung 3. 2D-Plot der LC-MS Ergebnis der N-glycopeptides aus embryonalen Stammzellen der Maus (E14.Tg2a) erhalten. Die Punkte sind die Peptide detektiert, und die Farbe des Punktes gibt die Identifikations Vertrauen statistisch erhalten (dh Peptid Wahrscheinlichkeit).
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Discussion
Hier stellen wir ein Glycopeptid-Capture-Strategie zur Profilierung Zelloberflächenproteine. Das Verfahren kann angewendet werden, um sekretierte Proteine, wie sie in Blut, wie auch in anderen Körperflüssigkeiten oder Zellkulturmedien zu studieren.
Der Erfolg des Verfahrens beruht auf der vollständigen Verdau von Proben; Daher ist ein SDS-PAGE-Charakterisierung der Effizienz der Verdauung notwendig, insbesondere für die erste Zeitanalyse einer Probe. Eine vollständige Verdauung kann eine Herausforderung sein für Membranproteine und können nur nach gründlicher Solubilisierung der Membranfraktion möglich sein. Die Solubilisierung Prozess beginnt, wenn das Waschmittel eingebracht wird, und endet nach der Inkubation von Harnstoff. Deshalb, wenn Trübung zeigt in der Probe vor der Zugabe von Harnstoff Harnstoff aber verschwindet nach der Inkubation wird die Solubilisierung ausreicht. Wenn die Membranfraktion schwer zu lösen ist, erhöhen Sie die Menge an Waschmittel verwendet wird. Für Membran-reichen Gewebeprobenwie Gehirn und Fettgewebe kann Rapigest 5% verwendet werden. Manchmal kann Ausfällung während der Verdünnung der Proben vor der Trypsin-Verdauung, die häufiger für den menschlichen Serumproben beobachtet wird angezeigt. Die Ursache dieser Niederschlag ist vor allem die verminderte Konzentrationen von Harnstoff und Reinigungsmittel. Dieser Niederschlag wird im allgemeinen durch Trypsin während des Aufschlusses entfernt werden und ist nicht von Belang. Wenn jedoch die Ausfällung bildet, ist es wichtig, die Probenampulle während des Verdauungsschritt zu drehen, um eine gute Durchmischung zu gewährleisten. Der pH-Wert der glycocapture Schritt ist wichtig, weil die primären Amine in Peptide, wie diejenigen, die aus N-Termini und Lysine, mit den neu gebildeten Aldehyde nach der Periodat-Oxidation reagieren. Somit ist es wichtig, diese Amine durch Einstellen des pH der Lösung auf unter Erfassung 6.0 mit Acetatpuffer protonieren, um sie stören die Erfassung zu verhindern.
Mit einem Verhältnis von Harz zu einer Lösung einzufangenRunde 1.03 Uhr bis 01.04 Uhr sorgt für eine ausreichende Durchmischung während der Capture-Schritt. Ein Minimum von 50 ul Harz ist notwendig, auf der Grundlage unserer Erfahrung; geringere Mengen führt zum Erlöschen der anschließenden Serie von Waschanlagen schwierig durchzuführen und schwere Probenverlust durch den Verlust von Harz einzuführen. Wir haben gute Ergebnisse erhalten unter Verwendung von 100-300 &mgr; l Harz 0,5-2 mg Gesamtprotein. Allerdings kann das Verhältnis zwischen der Menge an Protein und Harzprobe abhängig sein können, empfehlen wir Ihnen, diesen Zustand zu optimieren, für Ihre spezifischen Proben und Anwendungen.
Das Hydrazid Chemie erfasst beide O-und N-gebundene Glycopeptide auf dem Substrat; aufgrund des Fehlens einer wirksamen Enzym, alle O-verknüpften Glycopeptiden zu lösen, haben wir nur PNGase F-N-Glycopeptid-Studien 8,12. Die Möglichkeit des Studiums der O-Typ von Glycopeptiden kann die Entdeckung oder Bioengineering geeigneter Hydrolasen erfordern.
Dieses Verfahren kann auf mehrere p pausiertSchnürsenkel einschließlich: 1) nach dem Erhalt der Membranfraktion, 2) nach der Trypsin-Verdau und Reinigung der Peptide, und 3) nach Freisetzung der N-Glycopeptide. Zusätzliche Verfahren können während dieser Intervalle eingebracht werden. Zum Beispiel kann die verdauten Peptide differentiell markierten N-isotags wie in Fig. 1 angedeutet ist, zur quantitativen Analyse. Mit der Methode gagQP, in dem die unmodifizierten Peptide sind parallel Glycopeptide analysiert, kann die Genauigkeit der Quantifizierung deutlich verbessert werden, wie wir in einer Veröffentlichung 18 gezeigt.
Glycopeptid-Capture selbst kann Probenkomplexität effektiv zu verringern, und es ist in der Regel nicht erforderlich, die angereicherten N-Glycopeptiden weiter fraktionieren. Ausnahmen gelten für Situationen, in denen die Proben sind reichlich vorhanden, aber mit erheblichen Konzentration Dynamik und die Proteine von Interesse sind in geringer Menge, wie in der Entdeckung von Blut oder Protein-Biomarkernfür eine vollständige Erhebung von Zelloberflächenproteinen. Unter diesen Umständen können weitere Auftrennung für die aufgenommenen N-Glycopeptide, um ein besseres Eindringen des glycoproteome liefern umgesetzt. Da der Boden des glycoproteome wird durch Fraktionierung fahren, wird die Identifikation von nicht-Glycopeptide durch unspezifische Bindung eingeführt zu erhöhen. So ein Rückgang von Glycopeptid und Glycoprotein-Selektivität (auf ~ 85%) wird in der Regel nach einer weiteren Fraktionierung von N-Glycopeptiden 17 beobachtet werden. Daher müssen die Forscher die Vor-und Nachteile bei der Gestaltung der am besten geeignete Verfahren zu wiegen.
Für Forscher, die eine N-Glycopeptid-Capture-Methode noch nie verwendet haben, ist es am besten, um das Verfahren mit ein paar reinen N-Glykoprotein (en) üben mit bekannten Glykosylierungsstellen wie zuvor 8 aufgeführt. Dieses Verfahren ist robust und die Selektivität zu N-Glycopeptide hoch ist. Ein Nachteil dieser Methode liegt in der inhärenten geringen Fülle von surGesicht N-Glykoproteine; einer umfassenden Charakterisierung der Probe höher ist als die Menge in der Regel von zytosolischen Proteomik erforderlich. Wenn kultivierte Zellen in vitro expandiert werden oder in das Gewebe von Interesse sind reichlich vorhanden, jedoch ist dieser Nachteil vernachlässigbar.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von der Startfonds der Simon-Fraser-Universität unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| α-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
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