Summary
細胞表面タンパク質は、生物学的に重要かつ広範にグリコシル化されている。我々は、可溶化豊かに、そして容易なLC-MSベースのプロテオミクス解析のための脱グリコシル化は、これらのタンパク質には、ここグリコペプチド捕捉アプローチをご紹介します。
Abstract
細胞外マトリックスタンパク質を含む細胞表面タンパク質は、例えば、増殖、分化、および増殖などの全ての主要な細胞プロセスおよび機能に関与する。これらのタンパク質の総合的特徴付けは、バイオマーカー探索、細胞型の識別、および薬剤ターゲットの選択だけでなく、細胞生物学や生理学の我々の理解を進めるために支援するための豊富な情報を提供します。表面タンパク質は、しかし、本質的に低いため、その存在量、高い疎水性、及び重翻訳後修飾のため、有意な分析的な課題を提起する。表面タンパク質に普及してグリコシル化を利用して、我々はここでいくつかの既存のN-グライコ手段の利点を統合し、高スループット糖ペプチド捕獲アプローチをご紹介します。本手法は、表面タンパク質由来の糖ペプチドを豊かにし、LC-MSを用いて容易なプロテオミクスのために彼らのグリカンを削除することができます。解決のN-glycoproteomeはINFと、タンパク質の同一性および量だけでなく、糖鎖付加の自分のサイトのormation。この方法は、癌、幹細胞、および薬物毒性を含む領域における一連の研究に適用されている。この方法の限界は、試料の比較的多量のサイトゾルタンパク質を中心に研究と比較してこの分析のために必要とされるように、表面膜タンパク質、低存在量である。
Introduction
細胞表面タンパク質は、細胞外環境と相互作用し、細胞の外側から内側への信号を中継する。従って、細胞外マトリックスタンパク質を含む、これらのタンパク質は、増殖、成長、移動、分化などから老化及び範囲細胞生物学及び生理学の全ての局面において重要な役割を果たす。表面タンパク質は、他の細胞、タンパク質および小分子3と相互作用することによって機能する。薬物の60％以上が細胞表面タンパク質4を標的とするような細胞表面タンパク質の分子特徴付けは、生物学者のためだけでなく、製薬会社のためだけでなく、非常に興味深い。
タンデム質量分析（MS）は、その優れた感度、精度、およびタンパク質およびペプチドの同定のためのスループットで、グローバルプロテオミクス研究5,6のための強力なツールとなっている。しかし、表面タンパク質として、MSに基づくプロテオミクスの重要な課題を提起ほとんどの表面タンパク質は、低量で重い変形が存在する。表面タンパク質の膜貫通領域は、それらを疎水性;これは、特にマルチパス膜貫通タンパク質の場合である。これは、界面活性剤の助けを借りずに、水溶液中の膜タンパク質を溶解することが困難である;しかし界面活性剤の使用は一般的にタンパク質の同定において、HPLCとMS 1,7,8の性能を抑制します。したがって、膜タンパク質が不十分直接LC-MSベースのプロテオミクスに特徴付けられている。
グリコシル化は、細胞表面タンパク質9で行われている最も重要かつ豊富な翻訳後修飾の一つである。グリカンの膨大な複雑さと不均一性は、ペプチドのMSシグナル10を妨げる。それにもかかわらず、いくつかのプロテオミクスの方法は、表面タンパク質を濃縮する前LC-MS分析にタンパク質から糖部分を除去するために、このユニークな変形例を使用している。これらの方法Sは、レクチンベースの親和性捕捉11とヒドラジド系、ホウ酸系化成キャプチャ12と同様に親水性クロマトグラフィー分離8,13が含まれています。グリカンの除去は、通常のタンパク質に膜タンパク質を変換し、劇的に、MSの特性評価を簡素化します。グリコシル化はまた、膜タンパク質とは対照的に、高い溶解性を有する分泌タンパク質で起こるので、多くのglycoproteomic方法は、可溶性タンパク質用に最適化され、膜タンパク質8,14に配備されたときに低い糖ペプチドの選択性および感度を有する傾向がある。他の方法も豊かにするために存在し、特に、超遠心分離15および標識戦略16を用いたものなどの細胞表面タンパク質。膜タンパク質を特徴付けるための手法や他の既存の方法の間の詳細な比較は最近17を実施し 、その結果は我々の手法は、同様に良好に実行できることが示され、もしされませんでしたすべて比べ膜プロテオミクス方法よりも、より良い、より高いシンプルさ。
研究者はこのメソッドを使用しやすくするため、ここでは詳細に一般的なプロトコル。この方法は、既存のグライコ戦略のいくつかの利点を統合し、膜糖タンパク質のために特別に考案されて、まだ方法は、分泌タンパク質についても同様に動作します。この方法の特徴は、1）膜タンパク質の完全な可溶化は、2）の代わりに固体撮像基板を用いた場合、潜在的な立体障害を排除する糖タンパク質の糖ペプチドの濃縮は、3）ヒドラジド化学の使用は、共有結合との間を形成すること結合したグリコペプチドは、高glycoselectivityためのストリンジェントの洗浄に耐えることができ、4）能力が減少したサンプルの損失短縮手順の持続時間のために一本のチューブにキャプチャ全体の手順を実施するように、糖ペプチドおよび撮像基板。変数を研究するためにこのメソッドを実装した後細胞及び組織を含む生物学的試料のETY、我々は、糖タンパク質8,17,18に対して高い選択性（> 90％）を観察した。
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Protocol
1。収穫膜
- 細胞ペレット（〜10 8細胞）にプロテアーゼ阻害剤カクテル低張緩衝液（10mMトリス-HCl、10mMのKCl、1.5mMのMgCl 2、pH8.0）に加え、氷上で15-30分間インキュベートする。溶解注射針（5月10日パス）に試料を通すか、ダウンスホモジナイザー（15〜30ストローク）することにより、試料を均質化することにより、細胞。溶解の効率性をチェックするために、血球計数器およびトリパンブルー染色を使用してください。
- 3000 GX 15分で溶解液の微分遠心分離によってミクロソーム画分を取得し、100,000 GX 2時間。最初の遠心分離は、核画分でペレットを取得し、上清のその後の遠心分離は、細胞膜ならびに膜結合オルガネラ8を含有するミクロソーム画分である第二のペレットを生成する。最終的な上清を細胞質画分である。さらにanalysために-80℃の冷凍庫にミクロソーム画分を保存以下に示すとおりである。
2。、変性を溶かし、ダイジェスト膜タンパク質
- 変性緩衝液（40mMトリス、10mMのEDTA、10mMのTCEP、0.5％Rapigest、pH8）中でミクロソーム画分を溶解し、次いで、10分間100℃で溶液をインキュベートする。
- 室温に加熱し、溶液を冷却し、8 Mの最終濃度に溶液に超高純度尿素粉末を添加し、30分間37℃でサンプルをインキュベートする。
- 15mMの最終濃度まで試料にヨードアセトアミドストック溶液を追加し、サンプル中の遊離チオールをアルキル化するのに室温で30分間、暗所で溶液をインキュベートする。 10mMの最終濃度まで試料にDTTストック溶液を追加し、過剰のヨードアセトアミドをクエンチし、室温でさらに10分間溶液をインキュベートする。
- pH8の40mMトリス緩衝液で得られた溶液を10倍希釈し、続いてtrypsi 1:20の比率で試料にトリプシンを加える総蛋白のN。反応が完了したことを確認するために37℃のオーブンで一晩中消化反応を維持する。
- HClでpH1に試料溶液、また洗剤を分解条件、 すなわち Rapigestを酸性化することによって消化を終了します。 1時間37℃でRapigestを低下させ、遠心分離によって開発された降水量を削除します。
- C-18固相抽出（SPE）カートリッジにより、サンプルのペプチドが含まれており、スピードバックで得られた試料を乾燥上清を清掃してください。
- 前および消化効率を確認するために、トリプシン消化後の試料のSDS-PAGE分析を実行する。
3。糖ペプチドキャプチャ
- カップリングバッファー（100 mM酢酸ナトリウム、pH 5.5）中で洗浄さペプチドを溶解する。室温で、暗所で30分間10 mMの最終濃度でペプチド溶液に過ヨウ素酸ナトリウムを追加します。これは、アルデヒドにグリカンシス - ジオール基を酸化する、ヒドラジド化学を介して樹脂に結合するためにグリカンを可能にする。室温で10分間、20mMの最終濃度およびpH 5で亜硫酸ナトリウムによって過度の過ヨウ素酸を消光する。
- 樹脂に結合糖ペプチド1:4の比（溶液への樹脂）でのペプチド溶液にヒドラジド誘導体化樹脂をご紹介します。完全なカップリングのためのエンドツーエンドの回転に1〜2日間、37℃で反応をインキュベートする。
- 以下の各1mlで二回、樹脂を洗浄することにより未結合ペプチドを除去：DI水、1.5 MのNaCl、メタノールおよび80％アセトニトリル。最後に、100mMのNH 4 HCO 3へのシステムのバッファを交換するためにpH8の100mMのNH 4 HCO 3 1mlで3回、樹脂を洗浄する。
- （オプション）未結合のペプチドの分析のための上清および洗浄を収集します。
- 37℃で一晩のインキュベーションでのPNGアーゼFにより、樹脂からのN-グリコペプチドをリリースnはエンドツーエンドで回転。遠心分離し、80％のアセトニトリル洗浄によってリリースペプチドを収集します。 LC-MS分析のためのスピードバックで得られた溶液を乾燥させる。
4。さらに分別（オプション）
さらに、試料の複雑性を簡略化するために、得られたN-グリコペプチドを分画する。例えば10mmアンモニア蟻酸、20％アセトニトリルを用いてpHを3に乾燥したペプチドを再溶解し、ペプチドを分画する強力な陽イオン交換（SCX）クロマトグラフィーを使用しています。得られた溶出液を乾燥し、次いで逆相LC-MS 8,17,18により得られたペプチド画分を分析する。
放出されたN-グリコペプチドの5。クリーニング（オプション）
懸念は、ペプチドの汚染の可能性のために上昇した場合、0.1％ギ酸に乾燥したペプチドを再溶解し、さらに、逆相LC-MS分析の前にペプチドをきれいにするMCX SPEカラムを使用しています。
樹脂オフのN-グリコペプチドの選択的切断時には、PNGアーゼFは、アスパラギン酸とN-グリカンリンクアスパラギンに変換します。そのため、遊離されたN-グリコペプチドの0.9840ダマスシフトがあります。正確にこれらのペプチドを同定するために、この変更は、メチオニンのシステインおよび酸化カルバミドメチル化などの一般的な改変を加えた検索パラメータに追加する必要があります。
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Representative Results
実験手順の代表的なフローチャートを図1に要約されている。標識およびさらなる分画工程は任意であり、詳細は最近の刊行物18に記載されている。別のオプションは、樹脂と反応しない非修飾ペプチドを分析することである。変更されていないペプチドを分析することの利点は、そのようなタイトジャンクションにおけるクローディンのような非グリコシル化ペプチドおよびタンパク質の潜在的な識別を含む。さらなる利点は、より正確な定量化である。これらの利点に基づいて、我々は、このメソッドgのlycocapture-ssisted-GローブQ uantitative P roteomics（gagQP）と呼ばれ、最近の刊行物18で分析を詳述。
濃縮方法後に採取した代表的な糖ペプチドのスペクトルを図2に示す。得られた糖ペプチドにおいて、N-グリカンは、グリカン結合型アスパラギン（N）wを除去し、そしてPNGアーゼFによってアスパラギン酸（D）に変換した通りであり;したがって、スペクトルは、容易に一般的なタンパク質配列データベースに対して任意のプロテオミクス検索エンジンを用いて検索することができる。
捕獲方法は、従来、複雑な貴重な生物学的サンプルとのそのアプリケーションに市販されているモデル糖タンパク質によって評価することができる。いくつかの頻繁に使用されるモデル糖タンパク質は、アビジン（鶏）、オボアルブミン（ニワトリ）、インベルターゼ（酵母）、α-1アンチトリプシン（ヒト）、コンアルブミン（鶏）、およびリボヌクレアーゼB（ウシ）（いずれもSigmaから入手することができます）があります。これらのタンパク質から頻繁に識別された糖ペプチドは、以前の出版物8に記載されています。これらのモデルタンパク質から生成されたLC-MSの結果を自動検索するのに適してカスタマイズされたタンパク質配列のFASTAデータベースには、次のリンク（http://www.sfu.ca/chemistry/groups/bingyun_sun/tools.htmlからダウンロードすることができます）、上記のモデルタンパク質だけでなく、REVを含む ersed酵母配列データベース、共通の汚染物質およびPNGアーゼFを
捕捉N-グリコペプチドの典型的なLC-MSの結果が100以上の糖タンパク質は、細胞のミクロソーム画分の単LC-MSランから同定することができる、 図3に示されている。糖タンパク質および糖ペプチドの両方に富化選択性は、一般に90％以上である。成功した分析は、95％の濃縮選択性を有することができる。さらに前のLC-MSにサンプルを分画するSCXカラムおよびステップ勾配を使用すると、通常の糖タンパク質の同定17の数が2倍 になります分析します。得られた糖ペプチドの量が低い場合には、時々、バイアルから蓄積された不純物は、最終的な試料において観察することができる。これらの汚染物質は、ステップ5において提供される方法によって除去することができる。
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図1。実験手順のフローチャートを。長方形が必要な手順とダイヤモンドは、オプションのステップである。
図中のペプチド配列に赤で強調されているように、図2。衝突誘起解離（CID）グリコペプチド捕獲方法の後にパン酵母からAEPIL N ISNAGPWSRのスペクトル。下線アスパラギン（N）がアスパラギン酸（D）に変換され、 。
図3 N-GLのLC-MS結果の2Dプロットマウス胚性幹細胞（E14.Tg2a）から得ycopeptides。ドットが検出されたペプチドである、ドットの色は、統計的に取得した識別の信頼度（ すなわち、ペプチド確率）を表す。
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Discussion
ここでは、細胞表面タンパク質のプロファイリングのためのグリコペプチド捕獲戦略をご紹介します。この方法は、血液中、ならびに他の体液中または細胞培養培地中のもののような分泌タンパク質を研究するために適用することができる。
この方法の成功は、サンプルの完全消化に依存しています。従って、消化効率のSDS-PAGEの特徴付けは、特に、試料を初めて分析のために、必要である。完全な消化は、膜タンパク質のために挑戦することができ、唯一の膜画分を完全に可溶化した後に可能とすることができる。可溶化プロセスは、洗浄剤が導入されたときに開始され、尿素のインキュベーション後に終了する。曇りは、尿素を添加する前に、試料中の提示はなく尿素のインキュベーション後に消失するため場合、可溶化が十分である。膜画分が溶解するのが困難である場合、使用される界面活性剤の量を増加させる。膜が豊富な組織サンプル用脳および脂肪組織など、5％Rapigestを利用することができる。時には、降水量は前より頻繁にヒト血清サンプルで観察されるトリプシン消化にサンプルの希釈の際に表示されることがあります。この降水量の原因は、主に尿素と洗剤の減少濃度である。この降水量は、一般的に消化中にトリプシンによって除去し、問題にならないことでしょう。しかし、沈殿形態は、良好な混合を確実にするために消化工程中にサンプルバイアルを回転させることが重要である。例えば、N末端およびリジンからのもののようなペプチドの一次アミンは、過ヨウ素酸酸化後に、新たに形成されたアルデヒドと反応するので、glycocapture工程のpHは重要である。これにより、捕捉に干渉することを防ぐために、酢酸塩緩衝液を用いて6.0未満に捕捉溶液のpHを調整することにより、これらのアミンをプロトン化することが重要である。
溶液aを捕捉するために、樹脂の比率を用いて1:4ラウンド1:3捕捉工程の間に十分な混合を確実にします。樹脂の50μLの最小は、我々の経験に基づいて必要である。少ない量で行うことが困難の洗浄、その後の一連をレンダリングすると、樹脂の損失による深刻なサンプルのロスをご紹介します。私たちは、全タンパク質の0.5〜2 mgのための樹脂の100から300μLを用いて良好な結果を得た。しかし、タンパク質と樹脂の量との比率は、試料に依存することができ、我々はあなたがあなたの特定のサンプルおよびアプリケーションのため、この条件を最適化をお勧めします。
ヒドラジド化学反応は、基板上の両方のO-およびN-結合型糖ペプチドを捕捉し;降り続くO-結合型糖ペプチドを解放するために有効な酵素の不足のために、我々は、N-グリコペプチドの研究8,12のためアーゼFを使用していました。糖ペプチドのO型を研究の可能性は、適切な加水分解酵素の発見や生物工学が必要な場合があります。
この方法は、いくつかのPで一時停止することができますひもを含む：1）膜画分を得た後、2）トリプシン消化およびペプチドの洗浄、および3）N-グリコペプチドの放出後た。追加の手順は、これらの間隔の間に導入することができます。 図1に示すように、例えば、消化されたペプチドは、示差的に定量的な分析のために、N-isotagsによって標識することができる。我々は最近の刊行物18に示されているように未修飾のペプチドはグリコペプチドと並行して分析されたgagQPと呼ばれる方法を用いて、定量の精度を大幅に向上させることができる。
グリコペプチド捕捉自体が効果的に試料の複雑さを減少させることができ、それはさらに富化されたN-グリコペプチドを分画する必要はない。例外は、血液タンパク質バイオマーカーの発見のようにサンプルが豊富にあるが、実質的な濃度のダイナミクスであり、目的のタンパク質が少量である状況に適用するか、細胞表面タンパク質の完全な調査のために。これらの状況下では、さらなる分別glycoproteomeの良好な浸透を提供するために、N-グリコペプチド捕捉するために実施することができる。 glycoproteomeの底が分別を通して近づいているように、非特異的結合により導入された非糖ペプチドの同定が増加します。このようにして糖ペプチドの減少と（〜85％）糖タンパク質の選択性は、典型的には、N-グリコペプチド17のさらなる分画後に観察されるであろう。そのため、研究者らは、最適な手順を設計する際の長所と短所を比較検討する必要があります。
N-グリコペプチド捕獲方法を使用したことがない研究者のためには、これまで8記載された糖鎖付加部位が既知のいくつかの純粋なN-糖タンパク質（S）との方法を実施することをお勧めします。この方法は、ロバストであり、N-糖ペプチドへの選択性が高い。この方法の欠点は、シュールの固有の低豊富にあり、顔のN-糖タンパク質;サンプルの包括的な特性評価のために、より高い量は、一般的に細胞質ゾルプロテオミクスよりも必要とされている。培養細胞をインビトロで増殖され得るか、または目的の組織が 豊富な場合は、この欠点は無視できる。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、サイモンフレーザー大学のスタートアップ資金によって支えられてきた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| α-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
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