Summary
Celoppervlakeiwitten biologisch belangrijke en sterk geglycosyleerd. We introduceren hier een glycopeptide-capture benadering oplosbaar te maken, te verrijken, en deglycosylate deze eiwitten voor facile LC-MS gebaseerde proteomics analyses.
Abstract
Celoppervlakeiwitten, waaronder extracellulaire matrixeiwitten, aan alle belangrijke cellulaire processen en functies, zoals groei, differentiatie en proliferatie. Een uitvoerige karakterisatie van deze eiwitten biedt rijke informatie voor de ontdekking van biomarkers, celtype-identificatie, en drug-target selectie, evenals het helpen om ons begrip van cellulaire biologie en fysiologie te bevorderen. Oppervlakte-eiwitten, echter, vormen belangrijke analytische uitdagingen, vanwege hun inherent lage overvloed, hoge hydrofobiciteit, en zware post-translationele modificaties. Profiterend van de heersende glycosylering op oppervlakte-eiwitten, introduceren we hier een high-throughput glycopeptideresistente capture benadering die de voordelen van een aantal bestaande N-glycoproteoomanalyses middelen integreert. Onze methode kan de glycopeptides afgeleid van oppervlakte-eiwitten te verrijken en te verwijderen van hun glycanen voor facile proteomics via LC-MS. De opgeloste N-glycoproteome omvat de informatie eiwit identiteit en kwantiteit als hun sites van glycosylering. Deze methode is toegepast op een reeks studies in gebieden zoals kanker, stamcellen en druggiftigheid. De beperking van de werkwijze ligt in de geringe hoeveelheden oppervlakte-membraaneiwitten, zodat een relatief grote hoeveelheid monsters is vereist voor deze analyse werden studies gericht op cytosolische eiwitten.
Introduction
Celoppervlakte-eiwitten interageren met de omgeving en relais signalen van buiten naar de binnenkant van een cel. Aldus zijn deze eiwitten, waaronder extracellulaire matrixeiwitten, spelen kritieke rollen in alle aspecten van cellulaire biologie en fysiologie variërend van proliferatie, groei, migratie, differentiatie veroudering enzovoort. Oppervlakte-eiwitten functioneren door interactie met andere cellen, eiwitten en kleine moleculen 1-3. Moleculaire karakterisering van cel-oppervlakte-eiwitten van groot belang, niet alleen voor biologen, maar ook voor farmaceutische bedrijven, aangezien meer dan 60% van geneesmiddelen gericht op het celoppervlak eiwitten 4.
Tandem massaspectrometrie (MS), met zijn superieure gevoeligheid, nauwkeurigheid en doorvoer voor de identificatie van eiwitten en peptiden, is een krachtig hulpmiddel voor globale proteomics studies 5,6. Toch, oppervlakte-eiwitten vormen belangrijke uitdagingen voor MS-gebaseerde proteomics, alsde meeste oppervlakte-eiwitten bestaan in kleine hoeveelheden en met zware modificaties. De membraanoverspannende gebieden van de oppervlakte-eiwitten hen hydrofoob te maken; dit is vooral het geval voor multipass transmembraaneiwitten. Het is dus moeilijk om membraaneiwitten in waterige oplossingen oplossen zonder de hulp van een detergens; echter het gebruik van reinigingsmiddelen onderdrukt het algemeen van de HPLC en MS 1,7,8 in proteïne-identificatie. Daarom membraaneiwitten zijn slecht gekenmerkt directe LC-MS gebaseerde proteomics.
Glycosylatie is een van de belangrijkste en meest voorkomende post-translationele modificaties die in cel-oppervlakte-eiwitten 9. De enorme complexiteit en de heterogeniteit van glycanen belemmeren peptiden 'MS signaal 10. Niettemin hebben verscheidene proteomics methoden deze unieke modificatie gebruikt om oppervlakte-eiwitten te verrijken en de suiker-resten van eiwitten voorafgaand aan LC-MS analyse te verwijderen. Deze methodes onder-lectine gebaseerde affiniteit capture 11 en-hydrazide gebaseerde of boorzuur gebaseerde chemische capture 12 evenals hydrofiele chromatografie scheidingen 8,13. De verwijdering van glycanen transformeert membraaneiwitten om regelmatig eiwitten en vereenvoudigt de MS karakterisering drastisch. Omdat glycosylering vindt ook plaats in uitgescheiden eiwitten die een hoge oplosbaarheid in tegenstelling tot eiwitten membraan, zijn veel glycoproteoomanalyse werkwijzen geoptimaliseerd voor oplosbare eiwitten en gewoonlijk minder glycopeptide selectiviteit en gevoeligheid wanneer ingezet eiwitten 8,14 membraan hebben. Andere methoden bestaan ook te verrijken met name cel-oppervlakte-eiwitten, zoals die met ultracentrifuge 15 en labeling strategieën 16. Een gedetailleerde vergelijking van onze werkwijze en andere bestaande methodes voor het karakteriseren membraaneiwitten werd uitgevoerd onlangs 17 en de resultaten gaven aan dat onze werkwijze evengoed presteren, zonietbeter dan alle vergeleken membraan proteomics methoden, maar met hogere eenvoud.
Om u te helpen onderzoekers gebruiken deze methode, we detail hier een algemeen protocol. Deze methode integreert verschillende voordelen van het bestaande glycoproteoomanalyses strategieën en is speciaal ontworpen voor membraanglycoproteïnen, maar de methode werkt net zo goed voor uitgescheiden eiwitten. De kenmerken van deze methode zijn: 1) een volledige solubilisering van membraaneiwitten, 2) een verrijking van glycopeptiden plaats van glycoproteïnen aan de potentiële sterische hindering te verwijderen bij gebruik van een vast substraat vastleggen, 3) het gebruik van hydrazide chemie covalente bindingen te vormen tussen glycopeptiden en vastleggen substraat, zodat de gebonden glycopeptiden stringente wasbehandelingen voor hoge glycoselectivity kan tolereren, en 4) de mogelijkheid om de gehele vastlegprocedure voeren in een buis voor verminderd monster en verkorte procedure duur. Na de implementatie van deze methode om het bestuderen van een varischappij van biologische monsters zoals cellen en weefsels, observeerden we een hoge selectiviteit (> 90%) aan glycoproteïnen 8,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Harvest Membranen
- Voeg hypotonische buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, pH 8,0) met proteaseremmer cocktail op een celpellet (~ 10 8 cellen) en incubeer gedurende 15-30 min. op ijs. Lyseren van de cellen door het monster door injectienaalden (5-10 passages) of homogeniseren van het monster door een Dounce homogenisator (15-30 slagen). Gebruik een hemocytometer en trypan blauw kleuring om de efficiëntie van lysis controleren.
- Het verkrijgen van de microsomale fractie door een differentiële centrifugatie van het lysaat op 3000 gx 15 min en vervolgens bij 100.000 gx 2 uur. De eerste centrifugatie verkrijgt een pellet die de nucleaire fractie en de daaropvolgende centrifugatie van het supernatant genereert een tweede pellet, die de microsomale fractie die het plasmamembraan en membraangebonden organellen 8 bevat. De uiteindelijke supernatant is de cytosolische fractie. Bewaar de microsomale fracties in -80 ° C vriezer voor verdere analyszoals hieronder aangegeven.
2. Los, Denatureren en Digest membraaneiwitten
- Los de microsomale fractie van de denaturatie buffer (40 mM Tris, 10 mM EDTA, 10 mM TCEP, 0,5% Rapigest, pH 8) en incubeer de oplossing bij 100 ° C gedurende 10 minuten.
- Koel de oplossing verwarmd tot kamertemperatuur, voeg ultrazuivere ureum poeder in de oplossing van 8 M eindconcentratie en incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Voeg iodoacetamide voorraadoplossing van het monster naar 15 mM eindconcentratie en incubeer de oplossing in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de vrije thiolen alkyleren in het monster. Voeg DTT voorraadoplossing van het monster naar 10 mM eindconcentratie en incubeer de oplossing gedurende nog 10 minuten bij kamertemperatuur om het buitensporige joodacetamide blussen.
- Verdun de verkregen oplossing 10x met 40 mM Tris-buffer bij pH 8 en vervolgens trypsine toe te voegen aan het monster bij een 01:20 verhouding van trypsin totale eiwit. Handhaaf de spijsvertering reactie in een 37 ° C oven gedurende de nacht te waarborgen van de reactie af.
- Beëindig de spijsvertering door het aanzuren van het monster tot pH 1 met HCl, een aandoening die ook breekt het wasmiddel, dwz Rapigest. Degraderen de Rapigest bij 37 ° C gedurende 1 uur, en verwijder de ontwikkelde neerslaan door centrifugeren.
- Reinig het supernatant dat monster peptiden bevat door een C-18 vaste-fase-extractie (SPE) cartridge en droog het verkregen monster door speedvac.
- Voer een SDS-PAGE analyse van monsters voor en na trypsine digestie om de destructie efficiëntie bevestigen.
3. Glycopeptide Capture
- Los het gereinigde peptiden in de koppeling buffer (100 mM natriumacetaat, pH 5,5). Voeg natriumperjodaat in de peptide oplossing bij een eindconcentratie van 10 mM gedurende 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Hierdoor wordt de cis-diolgroepen in de glycanen te oxideren tot aldehyden, Die de glycanen te koppelen aan de hars door hydrazide chemie staan. Doof het buitensporige perjodaat met natriumsulfiet in een 20 mM eindconcentratie en pH 5 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Invoering-hydrazide gederivatiseerd hars in de peptide oplossing bij een verhouding van 1:4 (hars oplossing) te koppelen glycopeptiden aan het hars. Incubeer de reactie bij 37 ° C gedurende 1-2 dagen met end-to-end rotatie voor complete koppeling.
- Verwijder ongebonden peptiden door het wassen van de hars tweemaal met 1 ml van elk van de volgende: gedeïoniseerd water, 1,5 M NaCl, methanol en 80% acetonitril. Tenslotte was de hars 3x met 1 ml 100 mM NH 4 HCO 3 bij pH 8 bij de buffer van het uitwisselingssysteem 100 mM NH 4 HCO 3.
- Verzamel de bovenstaande vloeistof en wassen voor de analyse van ongebonden peptiden (optioneel).
- Laat de N-glycopeptiden van de hars door PNGase F per nacht incubatie bij 37 ° C met eenn end-to-end rotatie. Verzamel de vrijgegeven peptiden door centrifugeren en een 80% acetonitril wassen. Droog de verkregen oplossing in de speedvac van LC-MS analyse.
4. Verdere fractionering (optioneel)
Verder te vereenvoudigen complexiteit monster, fractioneren de verkregen N-glycopeptiden. Bijvoorbeeld, los het gedroogde peptiden in 10 mM ammonium formate, pH 3 met 20% acetonitril en gebruik sterke kationenwisselaar (SCX) chromatografie om de peptiden fractioneren. Droog de verkregen eluens en vervolgens analyseren van de verkregen peptide fracties door omgekeerde-fase LC-MS 8,17,18.
Reinigen 5. Van de Uitgebracht N-glycopeptiden (optioneel)
Als bezorgdheid rijzen potentiële vervuiling van de peptiden, los het gedroogde peptiden in 0,1% mierenzuur en gebruik een kolom MCX SPE verder reinigen peptiden voor omgekeerde fase LC-MS analyse.
Tijdens de selectieve splitsing van N-glycopeptiden uit het hars, PNGase F zet de N-glycaan asparagine gebonden aan een asparaginezuur. Daarom is er een 0,9840 Da massaverschuiving het vrijgemaakte N-glycopeptiden. Om deze peptiden nauwkeurig te identificeren, deze wijziging moet worden toegevoegd aan de zoekparameters alsmede gemeenschappelijke modificaties zoals de carbamidomethylation van cysteïne en oxidatie van methionine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een representatief stroomschema van de experimentele procedure wordt samengevat in figuur 1. De etikettering en verdere fractionering stappen zijn optioneel en details zijn beschreven in een recente publicatie 18. Een andere optie is om de ongewijzigde peptiden, die niet reageren met de hars te analyseren. De voordelen van het analyseren van de ongewijzigde peptiden zijn de mogelijke identificatie van niet-geglycosyleerde peptiden en proteïnen, zoals Claudins in tight junctions; Een bijkomend voordeel is nauwkeuriger kwantificering. Op basis van deze voordelen, we noemen deze methode g lycocapture-een ssisted-g lobal q uantitative p roteomics (gagQP), en gedetailleerd de analyse in een recente publicaties 18.
Een typische glycopeptide spectrum genomen na de werkwijze van verrijking wordt getoond in figuur 2. In het glycopeptide verkregen, de N-glycaan werd verwijderd en de glycaan-ingeschreven asparagine (N) womgerekend een asparaginezuur (D) van PNGase F; daarom kan het spectrum gemakkelijk worden doorzocht met behulp van een proteomics zoekmachine tegen veel voorkomende eiwit sequentie databanken.
De methode capture kan worden geëvalueerd door de handel verkrijgbare model glycoproteïnen voorafgaand aan de toepassing ervan met complexe en waardevolle biologische monsters. Een aantal veel gebruikte model glycoproteïnen bevatten avidine (kip), ovalbumine (kip), invertase (gist), α-1-antitrypsine (mens), conalbumine (kip), en ribonuclease B (runderen) (alles kan worden verkregen van Sigma). De vaak geïdentificeerd glycopeptides van deze eiwitten kan worden gevonden in een eerdere publicatie 8. Een aangepaste eiwit-sequentie FASTA database die geschikt is voor automatisch zoeken van LC-MS resultaten gegenereerd uit deze modeleiwitten kan gedownload worden via onderstaande link (http://www.sfu.ca/chemistry/groups/bingyun_sun/tools.html ), waarin de hierboven vermelde modeleiwitten en een rev omvat ersed gist-sequentie databank voorkomende contaminanten en PNGase F.
Een typische LC-MS resultaten van de gevangen N-glycopeptiden wordt getoond in figuur 3, waarbij meer dan 100 glycoproteïnen kunnen worden geïdentificeerd van een LC-MS run van een cel microsomale fractie. De verrijking selectiviteit zowel glycoproteïnen en glycopeptiden het algemeen meer dan 90%. Een succesvolle analyse kan een verrijking selectiviteit van 95%. Met behulp van een SCX-kolom en stapgradiënt verder fractioneren de monsters voorafgaande aan LC-MS-analyses zal meestal het dubbele van het aantal glycoproteïne identificaties 17. Soms, wanneer de hoeveelheid van de verkregen glycopeptiden laag, de onzuiverheid verzameld uit de flacons kan worden waargenomen in het eindmonster. Deze verontreinigingen kunnen worden verwijderd door de in stap 5 werkwijze.
. Jpg "src =" / files/ftp_upload/51349/51349fig1.jpg "width =" 350 "/>
Figuur 1. Stroomdiagram van de experimentele procedure. Rechthoeken nodig stappen en diamanten zijn optionele stappen.
Figuur 2. Botsing geïnduceerde dissociatie (CID) spectrum van AEPIL N ISNAGPWSR van bakkersgist dan de glycopeptide-opnamemethode. Het onderstreepte asparagine (N) omgezet in de asparaginezuur (D) in rood in de peptidesequentie in de figuur .
Figuur 3. 2D plot van de LC-MS resultaten van de N-glycopeptides verkregen van muis embryonale stamcellen (E14.Tg2a). De stippen zijn de gedetecteerde peptiden, en de kleur van de stip staat voor de statistisch verkregen identificatie vertrouwen (dwz peptide waarschijnlijkheid).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier introduceren we een glycopeptide-capture strategie voor het profileren van cel-oppervlakte-eiwitten. De werkwijze kan worden toegepast voor uitgescheiden eiwitten, zoals in bloed, en in andere lichaamsvloeistoffen of celkweek media.
Het succes van de werkwijze berust op het volledige digestie van monsters; Daarom, een SDS-PAGE karakterisatie van de spijsvertering efficiëntie noodzakelijk, vooral voor de eerste keer analyse van een monster. Een volledige digestie kan een uitdaging voor membraaneiwitten en kan alleen mogelijk na grondig solubilisatie van de membraanfractie. De solubilisatie proces begint wanneer het detergens wordt ingebracht en eindigt na incubatie van ureum. Daarom, als troebeling geeft in het monster vóór de toevoeging van ureum maar verdwijnt na incubatie ureum, het oplosbaar voldoende. Als het membraan fractie is moeilijk op te lossen, verhoging van de hoeveelheid wasmiddel gebruikt. Voor membraan-rijke weefselmonsterszoals hersenen en vetweefsel, kan 5% Rapigest worden gebruikt. Soms kan neerslag verschijnen tijdens de verdunning van de monsters voorafgaande aan het trypsine digestie, die vaker wordt waargenomen voor humane serummonsters. De oorzaak van deze precipitatie is vooral de verlaagde concentraties van ureum en wasmiddel. Deze precipitatie algemeen door trypsine worden verwijderd tijdens de vertering en is geen probleem. Wanneer de neerslag vormen, is het belangrijk om het monsterbuisje te draaien tijdens het oplossen stap om een goede menging te verzekeren. De pH van de glycocapture stap is belangrijk omdat de primaire amines in eiwitten, zoals die van N-uiteinden en lysines, reageert met de nieuw gevormde aldehyden na perjodaatoxidatie. Het is dus belangrijk om deze amines protoneren door de pH van de oplossing tot onder vastleggen 6,0 met acetaatbuffer, om te voorkomen dat interfereert met de opname.
Met een verhouding van hars een oplossing vangenrond 1:03-1:04 zorgt voor voldoende menging tijdens de vangst stap. Een minimum van 50 ul van hars nodig is gebaseerd op onze ervaring; lagere hoeveelheden wordt de volgende reeks wassingen moeilijk uitvoerbaar maken en ernstige sample verlies ontstaat door het verlies van hars. Wij hebben goede resultaten verkregen met 100-300 ul hars voor 0,5-2 mg totaal eiwit. Echter, de verhouding tussen de hoeveelheid eiwit en harsmonster afhankelijk zijn, raden wij u aan deze voorwaarde te optimaliseren voor uw specifieke voorbeelden en toepassingen.
De hydrazide chemie legt zowel O-en N-gekoppelde glycopeptiden op het substraat; door het ontbreken van een effectieve enzym aan alle O-gekoppelde glycopeptiden vrijgeven, we gebruikten PNGase F N-glycopeptide studies 8,12. De mogelijkheid van het bestuderen van de O-type glycopeptiden kan het vaststellen of bioengineering passende hydrolasen vereist.
Deze methode kan worden gepauzeerd op verschillende pveters waaronder: 1) na membraanfractie, 2) na trypsine digestie en reiniging van de peptiden, en 3) na afgifte van N-glycopeptiden. Aanvullende procedures kunnen tijdens deze intervallen worden ingevoerd. Bijvoorbeeld kan de verteerde peptiden differentieel gelabeld worden door N-isotags zoals in figuur 1, voor de kwantitatieve analyse. Met behulp van een methode genaamd gagQP, waarbij de ongewijzigde peptiden worden geanalyseerd parallel aan de glycopeptiden, kan de nauwkeurigheid van kwantificering aanzienlijk verbeterd zolas beschreven in een recente publicatie 18.
Glycopeptide capture zelf effectief kan verminderen complexiteit monster en het in het algemeen niet noodzakelijk verdere fractioneren de verrijkte N-glycopeptiden. Uitzonderingen gelden voor situaties waarin de monsters zijn er in overvloed, maar met aanzienlijke concentratie dynamiek, en de eiwitten van belang zijn in geringe hoeveelheden, zoals bij de ontdekking van bloedeiwit biomarkers ofvoor een compleet overzicht van celoppervlak-eiwitten. Onder deze omstandigheden verdere fractionering kan worden uitgevoerd voor de gevangen N-glycopeptiden een betere penetratie van de glycoproteome verschaffen. Aangezien de bodem van de glycoproteome wordt door fractionering bereikt, die de identificatie van niet-glycopeptiden die door niet-specifieke binding te verhogen. Dus een afname van glycopeptiden en glycoproteïne selectiviteit (tot ~ 85%) worden gewoonlijk waargenomen na een verdere fractionering van N-glycopeptiden 17. Daarom moeten de onderzoekers de voors en tegens af te wegen bij het ontwerpen van de meest geschikte procedure.
Voor onderzoekers die nooit een N-glycopeptide-opnamemethode gebruikt, is het het beste de werkwijze oefenen met een enkele zuivere N-glycoproteïne (s) met bekende glycosyleringsplaatsen zoals eerder 8. Deze werkwijze is robuust en de selectiviteit naar N-glycopeptiden hoog. Een nadeel van deze werkwijze ligt in de inherente geringe hoeveelheden surgezicht N-glycoproteïnen; voor een uitgebreide karakterisering van het monster, wordt een hogere hoeveelheid in de regel vereist dan die van cytosolische proteomics. Indien gekweekte cellen kunnen worden geëxpandeerd in vitro of de weefsels van belang zijn overvloedig, dit nadeel te verwaarlozen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit onderzoek is ondersteund door het opstarten fonds van Simon Fraser University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| α-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
- Cho, W., Stahelin, R. V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).
- Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function. The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).
- White, S. H. Biophysical dissection of membrane proteins. Nature. 459, 344-346 (2009).
- Heijne, G. Membrane-protein topology. Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).
- Lamond, A. I., et al. Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS). Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis. Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).
- Sun, B., et al. Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).
- Lowe, J. B. Glycosylation, immunity, and autoimmunity. Cell. 104, 809-812 (2001).
- Dodds, E. D. Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions. Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).
- Kaji, H., et al. Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins. Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).
- Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).
- Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation. J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).
- Bond, M. R., Kohler, J. J. Chemical methods for glycoprotein discovery. Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).
- Pasini, E. M., et al. In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells. Blood. 108, 791-801 (2006).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).
- Sun, B., et al. N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells. PLoS ONE. 8, (2013).
- Sun, B., et al. Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome. J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).
