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Neuroscience

नवजात शिशु कृंतक के उदर खोपड़ी पर एक कपाल - उच्छेदन करने के लिए एक विधि

Published: May 22, 2014 doi: 10.3791/51350
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Biology, The City University of New York, City College, 2Department of Biomedical Engineering, The City University of New York, City College

Summary

एक शल्य चिकित्सा पद्धति नवजात शिशु चूहों में उदर खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए वर्णित है. इस दृष्टिकोण का प्रयोग यह anesthetized पिल्ले की brainstem में तीव्र इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और दो photon माइक्रोस्कोपी प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए एक कपाल - उच्छेदन को खोलने के लिए संभव है.

Abstract

vivo में प्रयोगों के लिए एक कपाल - उच्छेदन के उपयोग वयस्कता में स्तनधारी मस्तिष्क में और विकास के दौरान विविध सेलुलर प्रक्रियाओं की गतिशीलता की जांच के लिए एक अवसर प्रदान करता है. अधिकांश में विवो दृष्टिकोण पृष्ठीय पक्ष पर स्थित मस्तिष्क क्षेत्रों का अध्ययन करने के लिए एक कपाल - उच्छेदन उपयोग हालांकि, इस तरह के उदर पक्ष पर स्थित पोंस के रूप में brainstem क्षेत्रों अपेक्षाकृत understudied रहते हैं. इस प्रोटोकॉल का मुख्य लक्ष्य वे electrophysiological और इमेजिंग तरीकों का उपयोग vivo में अध्ययन किया जा सकता है, ताकि उदर brainstem संरचनाओं के लिए उपयोग की सुविधा है. इस दृष्टिकोण की अनुमति देता है संरचनात्मक लंबी दूरी axons में परिवर्तन, एकल में बिजली की गतिविधि के पैटर्न और कोशिकाओं की टुकड़ियों, और नवजात शिशु जानवरों में रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता में परिवर्तन का अध्ययन. इस प्रोटोकॉल नवजात शिशु चूहों में श्रवण brainstem अध्ययन करने के लिए ज्यादातर इस्तेमाल किया गया है, यह आसानी से ऐसे नवजात शिशु चूहों, वयस्क Roden के रूप में अन्य कृंतक प्रजातियों में पढ़ाई के लिए अनुकूलित किया जा सकताटीएस और अन्य brainstem क्षेत्रों के.

Introduction

प्रतिदीप्ति इमेजिंग और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तकनीक के साथ संयोजन में एक कपाल - उच्छेदन के उपयोग की अनुमति देता निगरानी रक्त प्रवाह, रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता और जीवित पशुओं 1-3 में न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं की गतिविधि को मापने. कई प्रयोगशालाओं स्वस्थ और बीमारी की स्थिति में मस्तिष्क शरीर क्रिया विज्ञान में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है, लेकिन अंतराल इन प्रक्रियाओं के विकास के दौरान पैदा की हमारी समझ में रहते हैं. इसके अलावा, सबसे अध्ययन विविध शारीरिक भूमिकाओं के साथ उदर brainstem संरचनाओं पूर्व vivo दृष्टिकोण का उपयोग ज्यादातर अध्ययन किया गया है, ऐसी है कि आसानी से खोपड़ी के पृष्ठीय सतह से सुलभ हैं कि मस्तिष्क क्षेत्रों पर ध्यान केंद्रित किया है.

इस प्रोटोकॉल का मुख्य लक्ष्य कृन्तकों के उदर खोपड़ी पर एक कपाल - उच्छेदन खोलने के लिए एक विधि प्रदान करना है. यह दृष्टिकोण इस तरह के संवेदी तंत्रिका तंत्र का शरीर सिफारिश के लिए कुत्तों और बिल्लियों के रूप में बड़ा स्तनधारियों में प्रदर्शन क्लासिक पढ़ाई से लिया गया थाश्रवण brainstem 4-7 की rdings. इस प्रोटोकॉल में हालांकि, नवजात शिशु जानवरों में प्रक्रिया के प्रदर्शन के उपन्यास चुनौती है. Vasculature स्थलों का उपयोग करना, इस अनुकूलित प्रोटोकॉल नवजात शिशु चूहों, वयस्क चूहों और अवर जैतून 8-11 (चित्रा 1) जैसे अन्य brainstem क्षेत्रों के श्रवण brainstem अध्ययन करने के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया है.

उदर brainstem नाभिक अध्ययन करने के लिए मौजूदा तरीकों पर एक उदर कपाल - उच्छेदन का मुख्य लाभ यह है कि जानवरों में रहने वाले ब्याज की संरचनाओं के लिए सीधी पहुँच प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, बेहतर वर्तुलिका परिसर का श्रवण कोशिकाओं जांच की लक्षित प्लेसमेंट के लिए और इमेजिंग गहराई से 0.5 मिमी तक सीमित किया जा सकता है, जिसमें दो photon इमेजिंग तरीकों का उपयोग कर के लिए महत्वपूर्ण है जो मस्तिष्क की सतह से micrometers के कुछ दसियों स्थानीयकृत हैं प्रकाश ऊतक बिखरने और अवशोषण. एक उदर कपाल - उच्छेदन यह भी क, अपेक्षाकृत बरकरार तंत्रिका कनेक्शन के साथ एक तैयारी प्रदान करता हैआईसीएच तीव्र और organotypic टुकड़ा तैयारी 12 में बाधित कर रहे हैं. Vivo में Neurophysiology प्रयोगों 13 के लिए अन्य प्रोटोकॉल के विपरीत, एक उदर दृष्टिकोण बहु इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग और सेलुलर टुकड़ियों के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं कि इमेजिंग तरीकों के साथ जोड़ा जा सकता है (6 आंकड़े और 7). अन्त में, इस प्रोटोकॉल के साथ संयोजन में एक fluorescently लेबल घुला हुआ पदार्थ घुला हुआ पदार्थ के लिए रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता में परिवर्तन (8 चित्रा) को मापने के लिए vasculature में इंजेक्ट किया जा सकता है.

Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल न्यूयॉर्क के सिटी कॉलेज में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा स्थापित जानवरों की देखभाल दिशा निर्देशों के बाद.

1. पशु इंटुबैषेण (10-20 मिनट)

  1. सर्जरी से पहले, स्तनधारी घंटी समाधान तैयार करें. शल्य चिकित्सा उपकरण, हीटिंग पैड, और बेंच पर छोटे जानवर वेंटीलेटर (चित्रा 2) को इकट्ठा करो.
    1. रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता की माप के लिए घंटी में 1% गोजातीय सीरम albumin (BSA) समाधान के 10 मिलीलीटर और 1% BSA समाधान, 25 मिमी सिरिंज फिल्टर (0.2 माइक्रोन के साथ फिल्टर समाधान में 8 मिलीग्राम / एमएल पर TRITC-dextran 155 केडी भंग ताकना आकार) और अंधेरे में एक पन्नी से ढके सिरिंज में दुकान.
  2. Isoflurane का उपयोग पशु anesthetize. रखरखाव के लिए प्रेरण और 1.5-3.0% के लिए 5.0% का प्रयोग करें. वैकल्पिक रूप से ketamine (41.7 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (2.5 मिलीग्राम / किग्रा शरीर) के मिश्रण का इस्तेमाल किया जा सकता है. संज्ञाहरण की गहराई पैर के अंगूठे चुटकी पलटा के द्वारा जाँच की जा सकतीऊपरी और निचले extremities.
    1. Ketamine के बाद खुराक (41.7 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) और xylazine (2.3 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) overdosing से बचने के लिए अधिकतम खुराक के ⅓ की वेतन वृद्धि में प्रशासित किया जाना चाहिए. एक कृंतक वेंटीलेटर का प्रयोग xylazine प्रेरित श्वसन अवसाद प्रतिक्रिया करने के लिए सिफारिश की है.
  3. इसके पृष्ठीय पक्ष पर झूठ बोल anesthetized पिल्ला प्लेस और संवेदनाहारी (चित्रा 3 ए) देने के लिए इस्तेमाल प्लास्टिक शंकु के साथ अपने सिर को सुरक्षित.
    1. अगले पैरों और पूंछ (चित्रा 3 ए) पर चिपकने वाला टेप के साथ पशु सुरक्षित.
    2. पिल्ला का सिर सुरक्षित करने के लिए एक विकल्प के एक धातु पट्टी से जुड़ी एक सिर प्लेट का उपयोग करने के लिए है.
      नोट: हीटिंग पैड हाइपोथर्मिया (चित्रा 3 ए) से बचने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट है सुनिश्चित करें.
  4. एक अनुदैर्ध्य बनाने के लिए कैंची (चित्रा 2 बी) का प्रयोग करें और त्वचा पर चार पार्श्व चीरों (गर्दन overlyingचित्रा 3 बी). कुंद तकनीक का उपयोग करना, त्वचा काटना और संदंश का उपयोग कर यह अलग जगह (आंकड़े -2 सी और -3 सी).
    1. चिपकने वाला टेप का उपयोग त्वचा को दबाए रखें. एक क्षैतिज स्थिति (चित्रा -3 सी) में सिर को स्थिर.
  5. श्वासनली (चित्रा -3 सी) का पर्दाफाश करने के लिए अलग वसंत कैंची (चित्रा 2 डी) और कुंद तकनीक, धक्का ग्रंथियों और वसा परतों का उपयोग करना. मन्या धमनियों के स्थान की पहचान.
    1. दूर श्वासनली से मन्या धमनियों रखें.
      नोट: carotids puncturing पिल्ला का भारी खून की कमी और मौत में परिणाम कर सकते हैं.
  6. वसंत कैंची का प्रयोग (चित्रा 2 डी) ट्रेकिआ कवर अनुदैर्ध्य मांसपेशियों काटना. श्वासनली (चित्रा 3 डी) के अंतर्गत स्थित अनुदैर्ध्य मांसपेशियों को काटें.
    नोट: सांस की नली के छल्ले (चित्रा 3E) स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए.
    1. का प्रयोगसंदंश (चित्रा 2C), श्वासनली के आसपास सीवन के दो टुकड़े टाई. सिवनी का एक टुकड़ा वेंटिलेशन ट्यूब सुरक्षित होगा और दूसरा मुद्दा वेंटिलेशन ट्यूब सम्मिलन बिंदु (चित्रा -4 ए) के लिए ट्रेकिआ विजय - स्तम्भ को बंद करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
      नोट: गीला निर्जलीकरण को रोकने के लिए घंटी समाधान के साथ नियमित रूप से ऊतक अवगत कराया.
  7. वसंत कैंची का प्रयोग (चित्रा 2 डी) कदम 1.6.1 (चित्रा 4C) में रखा दो धागे के बीच स्थित सांस की नली के छल्ले में से एक पर एक चीरा बनाते हैं.
    नोट: कोई तरल पदार्थ खुले श्वासनली में प्रवेश करती है कि सुनिश्चित करें. श्वासनली में द्रव asphyxiation कारण होगा.
  8. श्वासनली में इंटुबैषेण ट्यूब (चित्रा 4 बी) डालें और यह सुरक्षित करने के लिए कम धागा कस लें. संदंश का प्रयोग (चित्रा 2C), इंटुबैषेण ट्यूब के सम्मिलन बिंदु को ट्रेकिआ पीछे बंद करने के लिए ऊपरी धागा कस लें.
    1. Tighteएन और दो ​​धागे (चित्रा 4D एफ) के सिरों ट्रिम.
      नोट: इंटुबैषेण ट्यूब के अंदर भाप airflow के नियंत्रण के लिए एक अच्छा संकेत है.
  9. तुरंत वेंटीलेटर को isoflurane आपूर्ति स्विच. जानवर के वजन के हिसाब से स्ट्रोक की मात्रा और वेंटिलेशन दर को समायोजित करें.
    1. Elastomer के साथ संपर्क में आसपास के ऊतकों (चित्रा 5A) सील. सतह सिक्त और स्वच्छ रखें.

2. ट्रेकिआ और स्नायु निकालना Cranium बेनकाब करने के लिए (5-10 मिनट)

  1. वेंटिलेशन ट्यूब से सटे श्वासनली में कटौती करने के लिए वसंत कैंची (चित्रा 2 डी) का प्रयोग करें. तालु की दुम का अंत बेनकाब करने के लिए मुख गुहा की मांसपेशियों की दीवार के साथ दो कटौती प्रदर्शन करना (चित्रा 5 ब).
    नोट: यदि आवश्यक हो, रक्तस्राव को रोकने के लिए एक cauterizer का उपयोग करें. अनियंत्रित खून बह रहा पशु की मौत का कारण बन जाएगा.
  2. साफक्षेत्र घंटी समाधान (चित्रा 5C) की प्रचुर मात्रा का उपयोग. पिछले कशेरुकाओं और basi पश्चकपाल हड्डी (चित्रा 5D) के बीच के अंतर को पहचानें.
    नोट: हड्डियों के बीच की खाई brainstem संरचनाओं का पता लगाने के लिए एक उपयोगी खोपड़ी मील का पत्थर है. अवर जैतून इस अंतर के नीचे स्थित है. श्रवण बेहतर वर्तुलिका परिसर (1 आंकड़ा भी देखें) इस अंतर से विजय - स्तम्भ दिशा में बसी पश्चकपाल हड्डी के नीचे स्थित है.
  3. संदंश (चित्रा 2C) और वसंत कैंची (चित्रा 2 डी) का उपयोग कर क्षेत्र को साफ. रक्त वाहिकाओं पंचर न करें.
    नोट: यदि आवश्यक हो, रक्तस्राव को रोकने के लिए दाग़ना.
    1. उजागर क्षेत्र वसा और मांसपेशियों के ऊतकों की साफ होने के बाद, बसी पश्चकपाल हड्डी और अंतिम बांस को अलग अंतरिक्ष से दिखाई (चित्रा 5D) होना चाहिए.

3. कपाल - उच्छेदन (15-30 मिनट)

  1. एक microdrill या एक अति प्रयोग करेंध्वनि क्लेंसेर. बुल्ला की औसत दर्जे का दीवार जानें.
    1. अंतर्निहित धमनियों (चित्रा 5e) दिखाई दे रहे हैं जब तक एक औंधा डी आकृति बनाकर पतली खोपड़ी.
      नोट: आधारी धमनी (बास) brainstem midline के शीर्ष पर चलता है. पूर्वकाल अवर अनुमस्तिष्क धमनी (Aica) शाखाओं द्विपक्षीय और यह विभिन्न जानवरों में एक स्थिर स्थिति है के रूप में एक मील का पत्थर के रूप में मज़बूती से इस्तेमाल किया जा सकता है.
    2. खोपड़ी पतला किया जाता है, धीरे से एक विदारक छेनी (चित्रा 2 ई) का उपयोग करते हुए इसे तोड़ने. संदंश के साथ हड्डी टुकड़ा (चित्रा 2C) निकालें. वैकल्पिक रूप से, लिफ्ट और एक तुला सुई का उपयोग खोपड़ी टूट गया.
      नोट: कपाल - उच्छेदन के आकार और आकृति की योजना बनाई प्रयोग के लिए उपयुक्त है जब तक इस प्रक्रिया को दोहराएँ. बस और Aica ड्यूरा झिल्ली (चित्रा 5F) के माध्यम से दिखाई जानी चाहिए.
  2. क्षेत्र ताजा घंटी समाधान के साथ कई बार साफ करें. शोषक देहात का प्रयोगडी एस ड्यूरा झिल्ली की सतह सूखी.
    1. यदि आवश्यक हो, मील का पत्थर धमनियों बस और Aica विस्थापित या तोड़ने के बिना ड्यूरा झिल्ली को दूर करने के लिए एक सीवन सुई का उपयोग करें.
      नोट: मस्तिष्कमेरु द्रव puncturing ड्यूरा बाहर प्रवाह होगा पर. घंटी समाधान के साथ क्षेत्र को साफ और प्रयोग के दौरान सिक्त रखना.

4. इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोग

  1. प्रयोग डिजाइन (चित्रा 7A) के अनुसार polytrode का चयन करें. कोट करने के लिए DiI साथ polytrode एक ठीक तूलिका का प्रयोग करें. एक 1 एमएल microcentrifuge ट्यूब में DiI समाधान स्थानांतरण समाधान में तूलिका डुबकी और धीरे (यानी एक त्रिविमेक्ष का उपयोग) दृश्य मार्गदर्शन में polytrode हड़ताल. जांच की नोक पर शुरू और सभी इलेक्ट्रोड समान रूप से लेपित हैं जब तक ध्यान से जारी है.
    1. मौखिक गुहा के अंदर जमीन इलेक्ट्रोड रखें. इलेक्ट्रोड धारक (चित्रा 7b में polytrode लोड
    2. पर एम्पलीफायर मुड़ें और सभी कनेक्शनों कि काम अच्छी तरह जांच करें.
  2. Aica (स्थिति शून्य) की शाखा बिंदु पर बस के ऊपर बिजली के तार का स्थान है. उपयुक्त विजय - स्तम्भ पार्श्व समन्वय (चित्रा 7C) का उपयोग करके वांछित लक्ष्य मुद्दे पर इलेक्ट्रोड ले जाएँ.
    1. मस्तिष्क की सतह पर इलेक्ट्रोड रखें और 5-10 माइक्रोन के चरणों में वांछित गहराई तक ले जाने के.
  3. प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार रिकॉर्डिंग प्रदर्शन. आगे के विश्लेषण के लिए डेटा को बचाओ.

5. दो photon इमेजिंग प्रयोग

  1. खुर्दबीन पर मुड़ें. उत्तेजना तरंगदैर्ध्य सेट और एक उपयुक्त उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग करें. 800 एनएम पर उत्तेजना और TRITC-dextran इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से एक 607 ± 45 एनएम बैंड पास फिल्टर उत्सर्जन काम.
  2. सही है या छोड़ दिया मन्या धमनी को पहचानें. कुंद तकनीक का प्रयोग आसन्न संयोजी ऊतक या नसों से मन्या धमनी काटना.
    1. मन्या उठाओ और पकड़एक hemostat के साथ धमनी. मन्या धमनी के आसपास सीवन के तीन टुकड़े बाँधो.
    2. रक्त के प्रवाह को रोकने के लिए और ढीली अन्य दो धागे छोड़ने के लिए करीब दिल पक्ष को मुद्दा कसो.
    3. बंधा धागा और अगले ढीला धागा के बीच मन्या धमनी पर एक 45 डिग्री के कोण पर एक छोटे से कटौती करने के लिए ठीक कैंची का प्रयोग करें.
      नोट: शोषक कागज के साथ खून साफ.
  3. मन्या धमनी cannulate. के बारे में 5 मिमी गहरी पिल्ला के सिर की ओर उन्मुख मन्या धमनी पर कटौती में TRITC-dextran समाधान के साथ भरा टयूबिंग डालें.
    1. एक साथ ट्यूबिंग और धमनी पकड़ करने के लिए धमनी के आसपास अन्य दो धागे कसो. , धागे कस ट्रिम और आगे स्थिर करने के लिए इलास्टोमेर जोड़ें.
      नोट: ट्यूबिंग के दूसरे पक्ष (1.1 चरण में तैयार) TRITC-dextran समाधान युक्त सिरिंज के साथ जुड़ा हुआ है.
  4. सिरिंज पंप पर सिरिंज को ठीक करें.
    1. समूहपिल्ला की मन्या धमनी रक्त प्रवाह की दर में गति. कुछ सेकंड के लिए सिरिंज पंप पर बारी और डाई समाधान मन्या धमनी में इंजेक्ट किया जा सकता है कि मैन्युअल रूप से जाँच करें. नोट: वयस्क चूहों के मन्या धमनी में है कि रक्त के प्रवाह की दर (240-280 ग्राम) मानते हुए लगभग 3 मिलीग्राम / 14 मिनट, एक चूहा पिल्ला के लिए रक्त प्रवाह की दर (जैसे P10 पिल्ला 15-25 ग्राम वजन) के लिए गणना की जा सकती है 0.16-0.3 मिलीग्राम / मिनट से लेकर.
  5. खुर्दबीन उद्देश्य के तहत पशु रखें. खून में फ्लोरोसेंट dextran इंजेक्षन.
    1. एक 5X हवा उद्देश्य के साथ उदर brainstem पर ब्याज के क्षेत्रों की पहचान. एक 20X या 40X उद्देश्य के लिए स्विच ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र ध्यान केंद्रित करने के लिए (पानी विसर्जन, एनए क्रमशः 0.5 या 0.8, =).
    2. इमेजिंग आरंभ और रॉय के vasculature में प्रतिदीप्ति तीव्रता तक छवि अधिग्रहण मापदंडों (जैसे जोखिम समय, लेजर बिजली, डिटेक्टर लाभ) को समायोजित अनुकूलित है (यानी) भी कम नहीं लेकिन संतृप्त करने के लिए नहीं.
    3. मन्या धमनी में डाई समाधान इंजेक्षन और एक निश्चित फोकल हवाई जहाज़ पर एक समय श्रृंखला के अधिग्रहण के लिए सिरिंज पंप पर बारी.

6. पशु की देखभाल निम्न प्रक्रिया

  1. यह एक टर्मिनल प्रक्रिया है. एक प्रयोग जानवरों के अंत में Pentobarbital की जरूरत से ज्यादा (100 मिलीग्राम / किग्रा, intraperitoneal इंजेक्शन) या पशु चिकित्सा अमेरिकन मेडिकल एसोसिएशन इच्छामृत्यु दिशानिर्देश द्वारा अनुमोदित इच्छामृत्यु के किसी अन्य विधि के साथ euthanized किया जाना चाहिए.
    नोट: छिड़काव घंटी समाधान के साथ दिल के माध्यम से एक लगानेवाला समाधान के साथ पीछा किया और आगे ऊतकीय विश्लेषण के लिए सिफारिश की है.

Representative Results

तंत्रिका tracers के electroporation

चतुर्भुज शरीर (MNTB) की औसत दर्जे का नाभिक इस प्रोटोकॉल का उपयोग पहले से अध्ययन किया गया है कि बेहतर वर्तुलिका परिसर में कोशिकाओं का एक समूह है. उदाहरण के लिए, पैच दबाना pipettes (चित्रा 6) 9 तंत्रिका tracers electroporate करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 6A रूप में दिखाया गया pipettes midline के पास रखा जाता है, तो परिणाम decussating अभिवाही axons चिह्नित कर रहे हैं कि है. एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर पानी विसर्जन उद्देश्य से लैस दो photon माइक्रोस्कोप बहुत ठीक जमानत के शाखाओं सहित MNTB तक पहुँचने फाइबर, छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्रा में तीर 6b). चित्रा 6C के रूप में दिखाया तंत्रिका tracers भी, सीधे MNTB के लिए दिया जा सकता है. एक कम संख्यात्मक एपर्चर पानी विसर्जन उद्देश्य (चित्रा 6D) के साथ इमेजिंग द्वारा सराहना की जा सकती रूप में परिणाम, MNTB कोशिकाओं और अभिवाही axons की लेबलिंग है. एमकम बढ़ाई उद्देश्य का उपयोग करने के ऐन लाभ देखने का एक व्यापक क्षेत्र की जांच की जा सकती है, और इस वजह से कम उद्देश्य संख्यात्मक एपर्चर के लिए स्थानिक संकल्प में कमी में यह परिणाम हालांकि, व्यक्तिगत MNTB कोशिकाओं अच्छी तरह से (चित्रा 6D में तीर) discerned किया जा सकता है . उम्र P1-P5 के लिए इन प्रयोगों की औसत अवधि 3.1 ± 1.4 घंटा (एन = 22 पिल्ले) है.

इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग

सहज फट फायरिंग 11,13 सुनवाई के शुरू होने से पहले ही MNTB कोशिकाओं में मनाया विकास विद्युतीय गतिविधि का एक रूप है. इस शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल का प्रयोग यह MNTB (चित्रा 7A-B) को multielectrode सरणियों (polytrodes) को लक्षित करने के लिए भी संभव है. परिणाम MNTB कोशिकाओं की एक टुकड़ी में सहज गतिविधि की रिकॉर्डिंग है. चित्रा 7E एक P6 चूहे से एक प्रतिनिधि polytrode रिकॉर्डिंग से पता चलता है. इस प्रयोग में, polytrode का उपयोग lipophylic डाई DiI साथ लेपित किया गया थाएक पतली तूलिका (4.1 कदम देखें). रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के बाद मस्तिष्क ऊतकीय विश्लेषण के लिए संसाधित किया गया था और DiI लेबल polytrode ट्रैक का स्थान MNTB (चित्रा 7 दिन) को लक्षित कर उचित पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. उम्र P1-P6 के लिए प्रयोगों की औसत अवधि 2.0 ± 0.7 घंटा (एन = 33 पिल्ले) है.

Microvessel पारगम्यता मापने

इस प्रोटोकॉल भी संवहनी पारगम्यता के दो photon इमेजिंग प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक फ्लोरोसेंट घुला हुआ पदार्थ (TRITC-dextran, मेगावाट 155 केडी, स्टोक्स त्रिज्या ~ 8.5 एनएम) 1% BSA घंटी समाधान में भंग और मन्या धमनी 14 में डाला Canula के माध्यम से मस्तिष्क संचलन में इंजेक्ट किया गया था. पूंछ नस इंजेक्शन के विपरीत, इस प्रक्रिया दिल नजरअंदाज और सीधे मस्तिष्क microcirculation में फ्लोरोसेंट घुला हुआ पदार्थ का परिचय. चित्रा 8A इस प्रक्रिया का उपयोग करने से परिणाम है कि रक्त वाहिका संरचना की लेबलिंग की गुणवत्ता को दिखाता है. सतत बादचित्रा 8b रूप में दिखाया गया रक्त प्रवाह में लेबल विलेय की छिड़काव यह ब्याज की एक क्षेत्र का एक समय चूक अनुक्रम प्राप्त करना संभव है. ब्याज के क्षेत्र में कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता ऑफ़लाइन मापा और एक गणितीय मॉडल fluorescently (चित्रा 8c) 15 विलेय लेबल के लिए रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता निर्धारित किया गया था. उम्र P9-P10 के लिए प्रयोगों की औसत अवधि 2.3 ± 0.8 घंटा (एन = 3 पिल्ले) है.

चित्रा 1
चित्रा 1. नवजात शिशु चूहे में vasculature स्थलों के संबंध में उदर brainstem तंत्रिका संरचनाओं के सापेक्ष स्थान. एक, मस्तिष्क के साइड देखें. ख, मस्तिष्क के उदर देखें. प्रमुख रक्त वाहिकाओं ब्याज की लाल और तंत्रिका संरचनाओं में दिखाया गया है इंड हैंरंग वर्गों द्वारा icated. पैमाने को तैयार नहीं. Aica = पूर्वकाल अवर अनुमस्तिष्क धमनी; बस = आधारी धमनी; आईसीवी = अवर मस्तिष्क की नस; एमसीए = मध्य मस्तिष्क धमनी; = कशेरुका धमनी हरा रंग; विशाखापत्तनम इस्पात संयंत्र = उदर रीढ़ की धमनी. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. सर्जिकल सेटअप. एक, सर्जरी (1) एक स्थिर तालिका का शीर्ष पर आराम कर रही एक छोटी सी रोटी बोर्ड पर किया जा सकता है. एक हीटिंग पैड (2) और एक छोटे पशु वेंटीलेटर (3) जब जरूरत पूरी तैयारी से आगे बढ़ सुविधाजनक बनाने के लिए रोटी बोर्ड को बांधा जा सकता है. छोटे पशु वेंटीलेटर एक बैटरी द्वारा संचालित किया जा सकता है (4). एक चुंबकीय धारक (5) संवेदनाहारी वितरित किया नाक शंकु सुरक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. नाक शंकु कर सकते हैंयह भी एक स्थिर स्थिति में सिर सुरक्षित करने में मदद. पशु दूसरी जगह करने की आवश्यकता नहीं होती है, तो एक micromanipulator (6) इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या तंत्रिका ट्रेसिंग प्रयोगों के लिए स्थिति जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक प्रकाश स्रोत (7) और (चित्र नहीं) एक त्रिविमेक्ष microsurgery. बी दौरान मील का पत्थर संरचनाओं कल्पना करने के लिए आवश्यक हैं, छोटे कैंची 1.4 चरण में इस्तेमाल किया जाता है. सी, संदंश कदम 1.4, 1.6.1, 1.8 और 1.8.1 में उपयोग किया जाता है . डी, वसंत कैंची कदम 1.5, 1.6 और 1.7. ई में उपयोग किया जाता है, विदारक छेनी कदम 3.1.2 में प्रयोग किया जाता है. ई = 1 मिमी में स्केल बार, बी.डी. पर लागू होता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. इंटुबैषेण के लिए ट्रेकिआ उजागर.एक, पशु, anesthetized प्रवण स्थिति में रखा जाता है और नाक शंकु और टेप (धराशायी लाइनों). बी के साथ सुरक्षित है, त्वचा में कटौती और अंतर्निहित मोटी परत. सी, overlying वसा और ग्रंथियों (दिखाया पर्दाफाश करने के लिए एक तरफ रख दिया गया है ग्रे में) ट्रेकिआ बेनकाब करने के लिए एक तरफ धकेल रहे हैं. टेप overlying त्वचा (धराशायी लाइनों). डी को सुरक्षित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, श्वासनली मांसलता से विच्छेदित है. ई, सांस की नली के छल्ले के दृश्य overlying पेशी के सफल हटाने का संकेत है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. पशु intubating. एक, दो सीवन धागे (सफेद तीर) ट्रेकिआ के आसपास बंधे हैं(टी). बी, इंटुबैषेण ट्यूब (यह) कस पशु वेंटीलेटर. सी के y ट्यूब से जुड़ा होना चाहिए, एक Tracheostomy दो सीवन धागे (काला तीर). डी, वेंटिलेशन ट्यूब डाला जाता है और बीच किया जाता है दो सीवन धागे कड़ा कर रहे हैं. धागे के छोर (सफेद और काले तीर द्वारा इंगित) कटा फैशन में फिर से कड़ा कर रहे हैं. ई, सीवन अंत बंधे हैं. च, सीवन अंत छंटनी और इंटुबैषेण पूरा हो गया है कर रहे हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. श्वासनली हटाने और कपाल - उच्छेदन कर रही है. एक, तैयारी elastomer (क्षेत्र insi के साथ स्थिर है डे) हरे लाइनों टकराया. बी, श्वासनली की पहचान की है और फिर कटौती पहले दूर इंटुबैषेण ट्यूब से ट्रेकिआ अलग करने के लिए, और उसके जबड़े की मांसपेशियों (बिंदीदार रेखा). सी में कटौती करने के लिए, कुंद का उपयोग कर खोपड़ी की सतह को साफ बना रहे हैं तकनीक की मांसपेशी को हटाने और वसा और रक्त. डी को दूर करने के शोषक कागज का उपयोग करने के लिए, एक साफ क्षेत्र का उदाहरण पिछले कशेरुकाओं (वी) और basi पश्चकपाल हड्डी (बो) से पता चलता है. दो हड्डियों (काला तीर) के बीच एक प्राकृतिक अंतर है. ई, एक औंधा D आकार (काला तीर) में एक microdrill या अल्ट्रासोनिक क्लेंसेर पतली खोपड़ी का उपयोग करना. धीरे पतला खोपड़ी तोड़ने और हड्डी का टुकड़ा निकाल. मील का पत्थर वाहिका संरचना दिखाई. च, उजागर brainstem सतह पर संवहनी स्थलों के उच्च बढ़ाई देखने होना चाहिए. बास = आधारी धमनी; Aica = पूर्वकाल अवर अनुमस्तिष्क धमनी. बी = 1 मिमी में स्केल बार, CE पर लागू होता है.highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
चित्रा 6. तंत्रिका tracers के electroporation. एक, तंत्रिका ट्रेसर सूक्ष्म रूबी युक्त कांच इलेक्ट्रोड midline (लाल वृत्त) के पास रखा गया था. ट्रेसर 7 सेकंड लंबे -5 μA दालों 15 मिनट के लिए हर 14 सेकंड वितरित का उपयोग electroporated गया था. वसूली समय से 1 घंटे के बाद बॉक्सिंग क्षेत्र एक दो photon माइक्रोस्कोप के साथ उतारी थी. P1 चूहे पिल्ला. बी, MNTB में अभिवाही अक्षतंतु लेबलिंग की कापी z ढेर छवि. तीर व्यक्ति जमानत के शाखाओं को इंगित. सी, सूक्ष्म रूबी के साथ भरा एक गिलास इलेक्ट्रोड MNTB (लाल वृत्त) के शीर्ष पर तैनात किया गया था. ट्रेसर एक में वर्णित एक ही सेटिंग्स का उपयोग electroporated गया था. वसूली समय से 1 घंटे के बाद बॉक्सिंग क्षेत्र थाएक दो photon माइक्रोस्कोप के साथ imaged. पी -5 चूहे पिल्ला. डी, MNTB में लेबल कोशिकाओं और axons की कापी z ढेर छवि. तीर एकल MNTB कोशिकाओं से संकेत मिलता है. बी और सी में लेबल उद्देश्य बढ़ाई और संख्यात्मक एपर्चर से संकेत मिलता है, क्रमशः. ; में एक और ग = 300 माइक्रोन स्केल बार = 45 माइक्रोन बी में पैमाने पर पट्टी; डी = 90 माइक्रोन में पैमाने पर पट्टी. Aica = पूर्वकाल अवर अनुमस्तिष्क धमनी; बस = आधारी धमनी; आर = व्याख्यान चबूतरे वाला; एल = पार्श्व. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 7
चित्रा 7. Polytrode रिकॉर्डिंग लक्षित. एक, Polytrode टांग प्रति 4 इलेक्ट्रोड (काले हलकों) के साथ 4 टांगों के होते हैं. इलेक्ट्रोड के बीच अंतर और अंतर - टांग दूरी संकेत कर रहे हैं. बी, सी, polytrode को निशाना बनाने के लिए इस्तेमाल किया vasculature स्थलों के उच्च बढ़ाई देखें. polytrode (polytrode ट्रैक लाल रंग में दिखाया गया है) चतुर्भुज शरीर (लाल बॉक्स). डी, posthoc ऊतकीय विश्लेषण DiI लेपित polytrode की सही लक्ष्यीकरण दर्शाता है की औसत दर्जे का नाभिक को लक्षित करने के लिए व्याख्यान चबूतरे वाला पार्श्व निर्देशांक का उपयोग तैनात है. ई, कापी बहु इकाई रिकॉर्डिंग. ट्रेस आदेश पैनल एक में इलेक्ट्रोड आदेश के रूप में ही है. टांग रिकॉर्डिंग के भीतर एक ही रंग है. ई में स्केल बार = 5 सेकंड. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

8 चित्रा मस्तिष्क microvessels का आंकड़ा 8. में vivo दो photon इमेजिंग. मन्या धमनी में TRITC-dextran 155 केडी के छिड़काव के बाद मस्तिष्क vasculature की एक, 2 डी छवि (ढह Z-ढेर). imaged क्षेत्र चित्रा 7C में दिखाया गया है कि के समान है. 20x/0.5 पानी विसर्जन उद्देश्य. P10 चूहे पिल्ला. बी, ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र प्रतिदीप्ति तीव्रता (लाल फ्रेम संलग्न क्षेत्र) को मापने के लिए इस्तेमाल किया. microvessel ~ 14.2 माइक्रोन की एक व्यास था और. सी, प्रतिदीप्ति तीव्रता (सामान्यीकृत मूल्य) की विशिष्ट वक्र समय के एक समारोह के रूप में 182 माइक्रोन brainstem सतह के नीचे स्थित था. Fluoresence समाधान सिर्फ पोत लुमेन भरता है जब मैं 0 आरओआई में प्रतिदीप्ति तीव्रता में कदम वृद्धि हुई है. (डि / डीटी) 0 और मैं 0 घुला हुआ पदार्थ को microvessel पारगम्यता निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है. TRITC-dextran 155 केडी को पारगम्यता 1.5 x 10 -7 सेमी / सेक होने की गणना की थी.बी = 100 माइक्रोन में स्केल बार, एक करने के लिए लागू होता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

समय महत्वपूर्ण है. एक अनुभवी शोधकर्ता (1-3 कदम) 1 घंटे में इस प्रोटोकॉल को पूरा करने में सक्षम होना चाहिए. विभिन्न चरणों के लिए कहा गया है बार विशेषज्ञता का एक उच्च स्तर के लिए एक माध्यम मान. गरीब वेंटिलेशन नियंत्रण जानवर की asphyxiation और मौत का कारण हो सकता है के बाद से उचित और समय पर ट्रेकिआटमी और इंटुबैषेण, महत्वपूर्ण हैं. गलतियों जानवर की अनियंत्रित खून बह रहा है और मौत का कारण हो सकता है क्योंकि मांसपेशियों और वसा ऊतकों की सावधानी से मंजूरी भी बहुत महत्वपूर्ण है. Canula प्रविष्टि के लिए मन्या धमनी की तैयारी इसी प्रकार, जब एक धागा गाँठ ढीला हो जाता है अगर अनियंत्रित रक्तस्राव जगह ले जाएगा, ध्यान से धमनी कसने और कटौती की जरूरत है. अन्त में, कपाल - उच्छेदन vasculature स्थलों में खलल न डालें बिना, सावधानी से किया जाना चाहिए. बाहरी तानिका संबंधी परत (ड्यूरा) के लापरवाह हटाने गंभीर खून बह रहा है और धमनियों की आपूर्ति का नुकसान हो सकता है.

वेंटिलेशन सेटिंग्स जानवर की उम्र के हिसाब से चुना जाता है.अधिकांश व्यावसायिक आपूर्तिकर्ताओं में ऐसी स्थितियों के बारे में उपयोगी जानकारी प्रदान करते हैं. P15 से अधिक उम्र के चूहों में प्रयोगों एक बड़े जानवर वेंटीलेटर के उपयोग की आवश्यकता होगी. वयस्क जानवरों ketamine / xylazine साथ anesthetized अगर वेंटिलेशन की जरूरत नहीं है, लेकिन इंटुबैषेण श्वासनली में प्रवेश तरल पदार्थ से बचने के लिए सिफारिश की है.

इस प्रोटोकॉल का एक मुख्य सीमा प्रयोगों ही तीव्रता से किया जा सकता है. हमारी प्रयोगशाला में हम दो और दस तक के बीच घंटों तक चलने वाले प्रयोगों का प्रदर्शन किया है. एक दूसरी सीमा प्रयोगों संज्ञाहरण के तहत किया जाना है. इसलिए, संवेदनाहारी की पसंद प्रयोगों की योजना और डिजाइन में विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण चर रहा है. एक से संबंधित मुद्दे नवजात शिशु जानवरों overdosing के लिए विशेष रूप से संवेदनशील हो सकता है. उदाहरण के लिए, Ketamine / xylazine मिश्रण को चुन अगर, पिल्ला के वजन के आधार पर खुराक की गणना और अधिकतम मात्रा की ⅓ में दवा प्रशासन. पैर के अंगूठे चुटकी आर से हर 5-10 मिनट जानवर की स्थिति की जाँचesponse. Isoflurane का उपयोग करते हैं, तो सावधानियों भी अन्वेषक (उचित वेंटीलेशन, और एक ठीक से calibrated vaporizer) के लिए एक सुरक्षित वातावरण बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं.

stereomicroscope दो photon माइक्रोस्कोप के लिए इलेक्ट्रोड और जानवर के स्थानांतरण के लिए जगह देखने के कोण समायोजित करने और अंतरिक्ष निकासी की सुविधा के लिए एक लचीला धारक पर रखा जा सकता है. वेंटीलेटर सत्ता में एक बैटरी का प्रयोग जानवर घूम रहा सुविधाजनक बनाने और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों के दौरान बिजली कलाकृतियों को कम कर सकते हैं. इस प्रयोजन के लिए एक छोटा सा breadboard (7.5 x 12 इंच) वेंटीलेटर, हीटिंग पैड और anesthetized जानवर (चित्रा 2A) एक साथ इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस स्थापना के लिए एक उपयोगी और महत्वपूर्ण संशोधन सर्जरी के दौरान महत्वपूर्ण संकेत निगरानी के लिए एक उपकरण के अतिरिक्त है. एक oxymeter या अन्य उपकरणों के अनुरूप प्रयोगशाला बजट के आधार पर किया जा सकता है.

इस प्रोटोकॉल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और मुलाकात इमेजिंग के साथ इस्तेमाल किया गया हैपैच दबाना रिकॉर्डिंग 8,10,11, polytrode रिकॉर्डिंग (चित्रा 7), और दो ​​photon इमेजिंग 9 सहित विभागाध्यक्षों, (आंकड़े 6 और 8). एक संभव भविष्य आवेदन electrophysiological रिकॉर्डिंग 16 के लिए fluorescently लेबल कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए इन तरीकों गठबंधन के लिए किया जाएगा.

नई इमेजिंग आवेदन भी 2 डी या दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग 3 डी समय श्रृंखला शामिल हो सकते हैं. उदाहरण के लिए, brainstem neuronal और glial सेल आबादी की गतिविधि का अध्ययन करने के लिए कैल्शियम संकेतकों की सांस में लदान का उपयोग कर. 8 चित्र में दिखाया गया है, एक डाई समाधान मन्या धमनी के माध्यम से रक्त परिसंचरण में इंजेक्शन मस्तिष्क vasculature की उच्च विपरीत छवियों को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रतिदीप्ति डाई microvessel लुमेन भरता है और आसपास के ऊतकों में फैलता है, यह घुला हुआ पदार्थ प्रसार COEF रक्त मस्तिष्क बाधा के स्पष्ट घुला हुआ पदार्थ पारगम्यता की गणना के लिए, लेकिन यह भी न केवल इस्तेमाल किया जा सकता हैमस्तिष्क के ऊतकों 3 में ficient. मन्या धमनी के माध्यम से fluorescently लेबल विलेय इंजेक्शन लगाने के लिए एक मुख्य कारण डाई समाधान सीधे एक पूंछ नस में इंजेक्शन के रूप में पहली बार दिल के लिए जा रहा बिना मस्तिष्क में microvessels के लिए जा सकते हैं. यह कम से कम दो फायदे लाता है. एक छिड़काव दर केन्युलेशन स्थल पर तय हो गई है microvessel लुमेन में प्रतिदीप्ति डाई एकाग्रता व्यावहारिक रूप से स्थिर किया जा सकता है. यह रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता का सही निर्धारण सुनिश्चित करता है. एक और एक परीक्षण एजेंट perfusate में शामिल है, तो यह सीधे शरीर प्रचलन से अन्य कारकों के साथ पतला या संयुक्त किया जा रहा बिना रक्त मस्तिष्क बाधा के लिए जाना जाएगा.

नए प्रयोगों भी आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ ट्रांसजेनिक जानवरों का लाभ उठा सकते हैं. यह (फ्लोरोसेंट जांच बगल में लोड करने की जरूरत नहीं होगी कि लाभ प्रदान करेगा जब तक प्रयोग के डिजाइनसमय की बचत और संभवतः अधिक बरकरार तैयारी (जैसे कपाल खिड़की 17) की अनुमति के लिए) राज्यों अन्यथा.

अन्त में, प्रयोगों ऐसे अवर जैतून या चेहरे की मोटर नाभिक के रूप में अन्य brainstem क्षेत्रों में किया जा सकता है. किसी दिए गए प्रजातियों में विशिष्ट सेलुलर आबादी की neuroanatomy और विकास के बारे में ज्ञान संरचनात्मक स्थलों जानवरों (चित्रा 1) के बढ़ने के रूप में बदल सकता है, खासकर के रूप में इस अंत की दिशा में महत्वपूर्ण होगा. हम इस प्रोटोकॉल विवो electrophysiological और इमेजिंग तरीकों में उपयोग कर उदर brainstem संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए दूसरों को प्रोत्साहित करने की उम्मीद है.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम एनआईएच / NCRR / RCMI से अनुदान G12-RR003060 द्वारा समर्थित किया गया था, न्यू सिटी विश्वविद्यालय से बाल स्वास्थ्य और मानव विकास, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन CBET 0,754,158 और पीएससी CUNY 62337-00 40 की यूनीसे श्राइवर नेशनल इंस्टीट्यूट से SC1HD068129 अनुदान न्यूयॉर्क.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbant pads Kettenbach Sugi 31603 Other options may be available from different companies
Cautery Braintree Scientific, INC GEM 5917 Other options may be available from different companies
Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran Sigma T1287-500MG Other options may be available from different companies
Dissecting Chisel Fine Science Tools 10095-12 Other options may be available from different companies
DiI Invitrogen V-22885 Other options may be available from different companies
Elastomer World Precision Instruments KWIK-SIL Other options may be available from different companies
Fine Scissors Fine Science Tools 14060-09 Other options may be available from different companies
Forceps Fine Science Tools 11027-12,11617-12, 11616-16 Other options may be available from different companies
Spring Scissors Fine Science Tools 15009-08 Other options may be available from different companies
Heating pad FHC 40-90-2 Other options may be available from different companies
Intubation tubing Braintree Scientific, INC BIO CO-KIT Choose age appropriate size
Light source Spach Optics Schott Ace illuminator Other options may be available from different companies
Micro drill Braintree Scientific, INC MD-1200 120V Other options may be available from different companies
Paper tape Walgreens Generic brand Other options may be available from different companies
Syringe filter VWR 28145-483 Other options may be available from different companies
Syringe pump VWR 52459-008 Other options may be available from different companies
Stereomicroscope Olympus SZ61 Other options may be available from different companies
Suture Ethicon Prolene 86979 6-0 size
Tubing Braintree Scientific, INC Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120 Other options depending on pup’s age
Vaporizer (isoflurane) Vetequip Incorporated 911103 Other options may be available from different companies
Ventilator (minivent) Harvard Apparatus 730043 Use for P0-P12 rats

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References

  1. Kerr, J. N. D., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nat. Rev. Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).
  2. Sigler, A., Murphy, T. H. In vivo 2-photon imaging of fine structure in the rodent brain: before, during, and after stroke. Stroke. 41 (10), 117-123 (2010).
  3. Shi, L., Zeng, M., Sun, Y., Fu, B. M. Quantification of blood-brain barrier solute permeability and brain transport by multiphoton microscopy. ASME J. of Biomech. Eng. 136 (3), 031005-031005 (2014).
  4. Galambos, R., Schwartzkopff, J., Rupert, A. Microelectrode study of superior olivary nuclei. Am. J. Physiol. 197, 527-536 (1959).
  5. Goldberg, J., Brown, P. B. Response of binaural neurons of dog superior olivary complex to dichotic tonal stimuli: some physiological mechanisms of sound localization. J. Neurophysiol. 32 (4), 613-636 (1969).
  6. Guinan, J. J., Guinan, S. S., Norris, B. E. Single auditory units in the superior olivary complex I: responses to sounds and classifications based on physiological properties. Intern. J. Neurosci. 4, 101-120 (1972).
  7. Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons. J. Neurophysiol. 63 (5), 1169-1190 (1990).
  8. Khosrovani, S., Der Giessen, R. S. V. an, De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (40), 15911-15916 (2007).
  9. Rodríguez-Contreras, A., Van Hoeve, J. S., Habets, R. L., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (14), 5603-5608 (2008).
  10. Lorteije, J. A., Rusu, S. I., Kushmerick, C., Borst, J. G. G. Reliability and precision of the mouse calyx of Held synapse. J. Neurosci. 29 (44), 13770-13784 (2009).
  11. Tritsch, N. X., Rodríguez-Contreras, A., Crins, T. T., Wang, H. C., Borst, J. G. G., Bergles, D. E. Calcium action potentials in hair cells pattern auditory neuron activity before hearing onset. Nat. Neurosci. 13 (9), 1050-1052 (2010).
  12. Tong, H., Steinert, J. R., Robinson, S. W., Chernova, T., Read, D. J., Oliver, D. L., Forsythe, I. D. Regulation of Kv channel expression and neuronal excitability in rat medial nucleus of the trapezoid body maintained in organotypic culture. J. Physiol. 588 (9), London. 1451-1468 (2010).
  13. Sonntag, M., Englitz, B., Kopp-Scheinpflug, C., Rübsamen, R. Early postnatal development of spontaneous and acoustically evoked discharge activity of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body: an in vivo study in mice). J. Neurosci. 29 (30), 9510-9520 (2008).
  14. García-Villalón, A. L., Roda, J. M., Alvarez, F., Gómez, B., Diéguez, G. Carotid blood flow in anesthetized rats: effects of carotid ligation and anastomosis. Microsurgery. 13 (5), 258-261 (1992).
  15. Yuan, W., Lv, Y., Zeng, M., Fu, B. M. Non-invasive method for the measurement of solute permeability of rat pial microvessels. Microvasc. Res. 77 (2), 166-173 (2009).
  16. Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Haüsser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
  17. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).

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तंत्रिका विज्ञान अंक 87 श्रवण प्रणाली; रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता; विकास; Neurophysiology; दो photon माइक्रोस्कोपी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी,
नवजात शिशु कृंतक के उदर खोपड़ी पर एक कपाल - उच्छेदन करने के लिए एक विधि
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Rodríguez-Contreras, A., Shi, L., Fu, B. M. A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents. J. Vis. Exp. (87), e51350, doi:10.3791/51350 (2014).

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