Summary
수술 방법은 신생아 쥐의 복부 두개골을 노출 설명되어 있습니다. 이 방법을 사용하면 마취 새끼 뇌간 급성 전기 생리학 및 이광자 현미경 실험을 수행하기 개두술을 열 수있다.
Abstract
생체 실험을위한 개두술의 사용은 성인의 포유 동물 뇌의 개발 기간 동안 다양한 세포 과정의 역학을 조사 할 수있는 기회를 제공합니다. 대부분의 생체 방법은 등쪽에있는 뇌 영역을 연구하는 개두술을 사용하지만, 이러한 복부 측면에있는 뇌교, 같은 뇌간 영역은 상대적으로 understudied 아르 남아있다. 이 프로토콜의 주요 목표는 그들이 전기 생리학 및 촬상 방법을 사용하여 생체 내에서 연구 될 수 있도록 복부 뇌간 구조에 대한 액세스를 용이하게하는 것이다. 이 방법은 수 구조 장거리 축삭의 변화, 하나의 전기 활동의 패턴과 세포의 앙상블, 그리고 신생아 동물의 혈액 뇌 장벽의 투과성의 변화를 연구. 이 프로토콜은 신생아 래트의 청각 뇌간을 연구하기 위해 주로 사용되었지만, 그것은 쉽게 그러한 신생아 생쥐, 성숙한 로덴 같은 다른 설치류의 연구에 적용 할 수있다TS 및 기타 뇌간 지역.
Introduction
형광 이미징 및 전기 생리학 기법과 조합 개두의 사용은 허용 모니터링 혈류량, 혈액 뇌 장벽의 투과성 및 살아있는 동물 1-3의 뉴런 및 신경교 세포의 활성을 측정. 여러 연구소는 건강과 질병 상태에서 뇌 생리학에 대한 통찰력을 제공하기 위해이 방법을 사용했지만, 격차는 이러한 프로세스 개발하는 동안 발생하는 방법에 대한 우리의 이해에 남아 있습니다. 또한, 대부분의 연구는 다양한 생리 학적 역할과 복부 뇌간 구조 생체 방법을 사용하여 주로 연구되고있다 있도록, 쉽게 두개골의 등면에서 액세스 할 수있는 뇌 영역에 초점을 맞추고있다.
이 프로토콜의 주요 목표는 설치류의 복부 두개골 개두술을 개방하기위한 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 같은 감각 신경 생리학의 RECO에 대한 개와 고양이와 같은 큰 포유 동물에서 수행 고전적인 연구에서 적응했다청각 뇌간 4-7 rdings. 이 프로토콜에서는 그러나, 신생아 동물의 절차를 수행하는 새로운 도전이있다. 혈관의 랜드 마크를 사용하여,이 적응 프로토콜은 신생아 쥐, 성인 마우스 및 하부 올리브 8-11 (그림 1)과 같은 다른 뇌간 영역의 청각 뇌간을 연구하기 위해 이전에 사용되었습니다.
복부 뇌간 핵을 연구하는 기존의 방법에 비해 복부 개두술의 주요 장점은 살아있는 동물에 대한 관심의 구조에 대한 직접 액세스를 제공하는 것입니다. 예를 들어, 우수한 olivary 착체의 청각 세포는 프로브의 표적 위치 및 촬상 깊이는 0.5 mm로 제한 될 수있는 이광자 촬상 방식을 사용하기위한 중요한 뇌 표면으로부터 마이크로 미터의 수십를 지역화 빛 조직의 산란 및 흡수. 복부 개두술은 뭐, 상대적으로 그대로 신경 연결과 준비를 제공합니다무형 문화 유산은 급성 및 Organotypic 슬라이스 준비 12에서 중단됩니다. 생체 내 신경 생리학 실험 13을 위해 다른 프로토콜과 달리 복부 접근법은 다중 전극 기록 및 셀룰러 앙상블에 대한 정보를 제공하는 촬상 방법과 조합 될 수있다 (6 및도 7). 마지막으로,이 프로토콜과 결합하여 형광 표지 된 용질은 용질 혈액 뇌 장벽의 투과성의 변화 (도 13)를 측정하기 위해 혈관에 주입 할 수있다.
Protocol
다음 프로토콜은 뉴욕의 도시 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 설립 된 동물 보호 지침을 다음과 같습니다.
1. 동물 삽관 (10 ~ 20 분)
- 수술 전, 포유류 링거 용액을 제조. 수술 도구, 전기 패드, 그리고 벤치에 작은 동물 인공 호흡기 (그림 2)를 조립합니다.
- 혈액 뇌 장벽의 투과성의 측정을 위해 링거의 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) 용액 10 ㎖를 확인하고, 1 % BSA 용액, 25mm 주사기 필터 (0.2 ㎛의 여과기 용액에 13 ㎎ / ㎖로 TRITC-덱스 트란 155 kD의 녹여 기공 크기)와 어둠 속에서 박 덮인 주사기에 저장.
- 이소 플루 란을 사용하여 동물을 마취. 유지 보수를위한 유도 및 1.5-3.0 %에 5.0 %를 사용합니다. 대안 케타민 (41.7 ㎎ / kg)과 자일 라진 (2.5 ㎎ / kg 본체)의 혼합물을 사용할 수있다. 마취의 깊이는 발가락 핀치 반사의 확인할 수 있습니다상부 및 하부 사지.
- 케타민의 후속 투여 량 (41.7 ㎎ / kg 체중)과 자일 라진 (2.3 ㎎ / kg 체중)과 투여 피하기 위해 최대 용량의 ⅓ 씩 투여한다. 쥐 인공 호흡기의 사용은 자일 라진 유도 호흡 억제를 방해하는 것이 좋습니다.
- 는 등의 측면에 누워 마취 된 강아지를 놓고 마취 (그림 3a)를 전달하는 데 사용되는 플라스틱 콘 머리를 고정합니다.
- 앞의 사지와 꼬리 (그림 3a)에 접착 테이프로 동물을 고정합니다.
- 강아지의 머리를 고정하기위한 대안은 금속 바아에 부착 된 헤드 판을 사용하는 것이다.
참고 : 가열 패드가 저체온증 (그림 3a)를 방지하기 위해 37 ° C로 설정되어 있는지 확인합니다.
- 하나는 세로 만들기 위해 가위에게 (그림 2b)를 사용하고, 피부에 네 가지 측면 절개 (목을 덮는그림 3B). 평활 기술을 사용하여, 피부를 절개하고 겸자 사용하여 별도로 배치 (도 2C 및 3C).
- 접착 테이프를 사용하여 피부를 누르십시오. 수평 위치 (그림 3C)의 머리를 고정.
- 기관 (도 3c)을 노출 옆에 봄 가위 (그림 2D)과 무딘 기술, 푸시 땀샘과 지방의 레이어를 사용하여. 경동맥의 위치를 확인합니다.
- 멀리 기관에서 경동맥을 유지합니다.
참고 : carotids을 꿰 뚫기는 강아지의 대규모 혈액 손실 및 사망을 초래할 수 있습니다.
- 멀리 기관에서 경동맥을 유지합니다.
- 봄 가위를 사용하면 (그림 2D) 기관을 덮고있는 세로 근육을 해부하다. 기관 (그림 3D) 아래에있는 세로 근육을 잘라.
주 : 기관 반지 (그림 3E) 명확하게 볼 수 있어야합니다.- 사용포셉 (그림 2C), 기관 주위 봉합의 두 조각을 묶어. 봉합 한 조각은 환기 튜브를 확보하고 두 번째 스레드는 환기 튜브 삽입 지점 (그림 4a)에 기관의 주동이을 닫는 데 사용됩니다.
주 : 습은 탈수를 방지하기 위해 링거 용액을 정기적으로 조직을 노출.
- 사용포셉 (그림 2C), 기관 주위 봉합의 두 조각을 묶어. 봉합 한 조각은 환기 튜브를 확보하고 두 번째 스레드는 환기 튜브 삽입 지점 (그림 4a)에 기관의 주동이을 닫는 데 사용됩니다.
- 봄 가위를 사용하면 (그림 2D) 단계 1.6.1 (도 4c)에 배치 된 두 개의 스레드 사이에있는 기관의 고리 중 하나에 절개를합니다.
참고 : 유체가 내 오픈 기관을 입력 없는지 확인합니다. 기관의 유체는 질식의 원인이됩니다. - 기관에 삽관 튜브 (그림 4B)를 삽입하고 고정하는 밑실을 조입니다. 집게를 사용하여 (그림 2C), 삽관 튜브의 삽입 지점에 기관의 후방을 닫습니다 윗실을 조입니다.
- Tighten 및 두 개의 스레드 (도 4D-F)의 단부를 트림.
참고 : 삽관 튜브 내부의 증기가 공기 흐름 제어의 좋은 징조입니다.
- Tighten 및 두 개의 스레드 (도 4D-F)의 단부를 트림.
- 즉시 인공 호흡기에 이소 플루 란 공급을 전환합니다. 동물의 중량에 따른 행정 용적과 환기율을 조정한다.
- 엘라스토머 노출 된 주변 조직 (그림 5a)를 밀봉. 표면을 촉촉하게 유지하고 청소.
2. 기관이나 근육 제거 크래 니움을 노출 (5 ~ 10 분)
- 환기 튜브에 인접한 기관을 잘라 봄 가위 (그림 2D)를 사용합니다. 미각의 꼬리 끝 노출 구강의 근육 벽을 따라 두 인하 수행합니다 (그림 5B).
참고 : 필요한 경우, 출혈을 멈추게하기 위해 cauterizer를 사용합니다. 조절되지 않는 출혈이 동물의 죽음의 원인이됩니다. - 청소지역 링거액 (도 5c)의 풍부한 양의를 사용하여. 마지막으로 척추와 BASI-뒤통수 뼈 (그림 5D) 사이의 간격을 확인합니다.
참고 : 뼈 사이의 간격이 뇌간 구조를 찾을 수있는 유용한 두개골의 랜드 마크입니다. 열등 올리브는이 간격 아래에 있습니다. 청각 뛰어난 olivary 단지는 (그림 1 참조)이 간격에서 주동이의 방향으로 BASI-뒤통수 뼈 아래에 있습니다. - 포셉 (그림 2C)와 스프링 가위 (그림 2D)를 사용하여 영역을 청소합니다. 혈관을 뚫지 마십시오.
참고 : 필요한 경우, 출혈을 멈추게하기 위해 뜸을 뜨다.- 노출 된 지역은 지방과 근육 조직의 깨끗한 후, BASI - 후두 뼈와 마지막 척추를 분리하는 공간을 볼 수있다 (그림 5D)해야한다.
3. 개두 (15 ~ 30 분)
- microdrill 또는 초를 사용소닉 클렌저. 수포의 중간 벽을 찾습니다.
- 기본 동맥 (그림 5E) 볼 수 있습니다 때까지 반전 D 모양 만들기로 얇은 두개골.
참고 : 기저 동맥 (BAS)는 뇌간의 중간 선 위에 실행됩니다. 전방 하부 소뇌 동맥 (AICA) 지점 좌우하고 다른 동물에서 일정한 위치를 가지고 랜드 마크로서 안정적으로 사용할 수 있습니다. - 두개골이 얇아 때, 부드럽게 해부 끌 (그림 2E)을 사용하여 휴식. 집게로 뼈 조각 (그림 2C)를 제거합니다. 또한, 리프트 및 구부러진 바늘을 사용하여 두개골을 휴식.
참고 : 개두술의 크기와 모양이 계획된 실험에 적합 할 때까지이 절차를 반복합니다. BAS와 AICA은 경질 막 (그림 5 층)을 통해 볼 수 있어야합니다.
- 기본 동맥 (그림 5E) 볼 수 있습니다 때까지 반전 D 모양 만들기로 얇은 두개골.
- 지역에게 신선한 링거 용액으로 여러 번 청소합니다. 흡수 PA 사용DS는 경질 막의 표면을 건조.
- 필요한 경우, 랜드 마크 동맥 BAS 및 AICA 변위 또는 파괴하지 않고 경질 막을 제거하기 위해 봉합 바늘을 사용합니다.
참고 : 뇌척수액을 천공 경질이 흘러됩니다시. 링거액과 함께 지역을 청소하고 실험을하는 동안 습하게 유지합니다.
- 필요한 경우, 랜드 마크 동맥 BAS 및 AICA 변위 또는 파괴하지 않고 경질 막을 제거하기 위해 봉합 바늘을 사용합니다.
4. 전기 생리학 실험
- 실험 설계 (도 7a)에 따라 polytrode을 선택합니다. 코트 DII와 polytrode을 미세 페인트 브러시를 사용합니다. , 1 ML의 microcentrifuge 관에 DII 솔루션을 전송 솔루션에 붓을 찍어 부드럽게 (즉, 입체경을 사용하여) 시각적 인지도 아래 polytrode을 공격. 프로브의 끝에서 시작하고 모든 전극이 균일하게 코팅 될 때까지 조심스럽게 진행합니다.
- 구강 내부의 접지 전극을 배치합니다. 전극 홀더 (도 7b에 polytrode를로드
- 에 앰프를 켜고 모든 연결이 잘 작동되는지 확인합니다.
- AICA (위치 영)의 분기점에서 BAS 위의 전극을 배치합니다. 적절한 주동이 측방 좌표 (도 7C)를 이용하여 원하는 목표 지점에 전극을 이동.
- 뇌 표면에 전극을 넣고 5 ~ 10 μm의 단계에서 원하는 깊이로 이동합니다.
- 실험 설계에 따라 녹화를 수행합니다. 추가 분석을 위해 데이터를 저장합니다.
5. 두 광자 이미징 실험
- 현미경의 전원을 켭니다. 여기 파장을 설정하고 적절한 방출 필터를 사용합니다. 800 nm에서 여기 및 TRITC-덱스 트란을 이미징 아니라 607 ± 45 nm의 대역 통과 방출 필터 작업.
- 오른쪽 또는 왼쪽 경동맥을 확인합니다. 무딘 기법을 사용하여 인접하는 결합 조직이나 신경으로부터 경동맥 해부.
- 경동맥을 선택하고 유지지혈과 동맥. 경동맥 주위 봉합의 세 가지를 묶어.
- 혈액의 흐름을 중지하고 느슨한 다른 두 개의 스레드를 떠나 가까이 심장 측면에 나사를 조입니다.
- 공동 실 다음 느슨한 실의 경동맥에 45 ° 각도로 작은 상처를 만들기 위해 미세 가위를 사용합니다.
참고 : 흡수 종이로 혈액을 청소합니다.
- 경동맥을 Cannulate. 약 5 ㎜ 깊이 강아지의 머리 지향 경동맥의 컷에 TRITC-덱스 트란 용액으로 채워진 튜브를 삽입합니다.
- 함께 튜브와 동맥을 유지하기 위해 동맥 주위에 다른 두 개의 스레드를 조입니다. , 나사를 조이 트림과 더욱 안정화 엘라스토머를 추가합니다.
참고 : 튜브의 다른 측면은 (단계 1.1에서 제조) TRITC-덱스 트란 용액을 함유하는 주사기와 연결된다.
- 함께 튜브와 동맥을 유지하기 위해 동맥 주위에 다른 두 개의 스레드를 조입니다. , 나사를 조이 트림과 더욱 안정화 엘라스토머를 추가합니다.
- 주사기 펌프에 주사기를 고정합니다.
- 세트강아지의 경동맥 혈액 유량 속도. 몇 초 동안 주사기 펌프의 전원을 켜고 염료 용액은 경동맥에 주입 될 수 있음을 수동으로 확인합니다. 참고 : 성인 쥐의 경동맥에 해당 혈액 유속 (2백40~2백80그램)을 가정하면 약 3 ㎖ / 14 분, 래트 새끼위한 혈액 유속 (예를 들면 P10 강아지 15-25 g의 무게)로 계산 될 수있다 0.16-0.3 ㎖ / 분까지 다양합니다.
- 현미경 목표 아래 동물을 놓습니다. 혈류로 형광 덱스 트란을 주입.
- 배 공기 목적으로 복부 뇌간에 관심 영역을 식별합니다. 20 배 또는 40 배 목표로 전환이자 (ROI)의 영역에 초점을 (침수, NA는 각각 0.5 또는 0.8, =).
- 촬상을 시작하고, ROI의 맥관의 형광 강도까지 화상 획득 매개 변수 (예를 들어 노광 시간, 레이저 파워, 검출기 이득)을 조정이 최적화된다 (즉,) 너무 약하지하지만 포화하지.
- 경동맥에 염료 용액을 주입하고 고정 초점면에서의 시계열을 확보하기 위해 주사기 펌프의 전원을 켭니다.
6. 동물 관리 다음 절차
- 이 터미널의 절차입니다. 실험 동물의 끝에서 펜토 바르 비탈의 과다 복용 (100 ㎎ / ㎏, 복강 내 주사) 또는 미국의 의학 협회 안락사 가이드 라인에 의해 승인 안락사의 다른 방법으로 안락사해야합니다.
참고 : 관류가 링거 용액과 마음을 통해 정착 솔루션을 따라 더욱 조직 학적 분석을 위해 좋습니다.
Representative Results
신경 추적자의 일렉트로
사다리꼴 본체 (MNTB)의 내측 핵이 프로토콜을 이용하여 이전에 검토되고있다 뛰어난 olivary 복잡 셀들의 그룹이다. 예를 들어, 패치 클램프 피펫 (도 6)으로 15 신경 트레이서 electroporate하는데 사용될 수있다. 그림 6a와 같이 피펫은 중앙선 근처에 위치하는 경우, 결과는 decussating 심성 축색 돌기가 표시되는 것입니다. 높은 개구 수침 대물 탑재 이광자 현미경은 매우 미세한 담보 분기 등 MNTB 도달 섬유, 화상에 사용될 수있다 (도 6B의 화살표는). 도 6c에 도시 된 바와 같이 신경 트레이서 또한 직접 MNTB로 전달 될 수있다. 하부 개구 수침 대물 (도 6D)으로 촬상에 의해 이해 될 수있는 바와 같이 결과는 MNTB 세포 및 심성 축삭의 표지이다. M저배율 대물를 사용 아인 장점은 뷰의 넓은 필드를 검사 할 수 있도록하고,이 때문에 상기 하부 대물 개구에 공간 분해능의 저하가 발생되지만, 개별 MNTB 세포는 잘 (도 6d에 화살표) 식별 될 수있다 . 나이 P1-P5에 대한이 실험의 평균 기간은 3.1 ± 1.4 시간 (N = 22 새끼)입니다.
전기 생리학 녹음
자연스러운 버스트 발사는 11,13 청각의 발병하기 전에 하나의 MNTB 세포에서 관찰 발달 전기 활동의 한 형태이다. 이 수술 프로토콜을 사용하여 그것을 MNTB (도 7a-b)로 다중 전극 배열 (polytrodes)을 대상으로하는 것도 가능하다. 결과는 MNTB 세포의 앙상블 자발적인 활동의 기록이다. 그림 7E는 P6 쥐의 대표 polytrode 기록을 보여줍니다. 이 실험에서 사용은 polytrode lipophylic 염료 DII으로 코팅 한얇은 붓 (단계 4.1 참조). 기록을 수행 한 후 뇌 조직 학적 분석을 위해 가공하고, DII - 표지 polytrode 트랙의 위치는 MNTB (도 7D)에 타겟팅 적절한 확인을 위해 사용 하였다. 나이 P1-P6에 대한 실험의 평균 기간은 2.0 ± 0.7 시간 (N = 33 새끼)입니다.
미세 혈관 투과성을 측정
이 프로토콜은 또한 혈관 투과성의 이광자 촬상 실험을 수행하기 위해 사용될 수있다. 형광 용질 (TRITC-덱스 트란, MW 155 kD이고, 스토크 스 반경은 8.5 ~ NM)를 1 % BSA 링거 용액에 용해시키고, 경동맥 (14)에 삽입 된 캐 뉼러를 통해 대뇌 순환에 주입 하였다. 꼬리 정맥 주사와는 달리,이 절차는 마음을 무시하고 직접 뇌의 미세 혈관에 형광 용질을 소개합니다. 도 8a는이 절차를 사용한 결과 인 혈액 맥관의 라벨의 품질을 나타낸다. 지속적인 후도 8b에 도시 된 바와 같이 혈류로 표지 된 용질의 관류 그것은, 관심 영역의 시간 경과 시퀀스를 획득 할 수있다. 또한 영역 전체 형광 강도 오프라인 측정 수학적 모델은 형광 (도 8C) 15 용질을 표시하는 혈액 뇌 장벽의 투과성을 결정하는 데 사용되었다. 나이 P9-P10에 대한 실험의 평균 기간은 2.3 ± 0.8 시간 (N = 3 새끼)입니다.
그림 1. 신생아 쥐에서 혈관의 관광 명소에 대한 복부 뇌간의 신경 구조의 상대 위치., 뇌의 측면보기. B, 두뇌의 복부보기. 주요 혈관 관심 빨간색과 신경 구조에 표시되어 있습니다 IND색 사각형으로 icated. 척도로 그리지 않음. AICA = 전방 하부 소뇌 동맥; BAS = 기저 동맥; ICV = 열등한 대뇌 정맥; MCA = 중간 대뇌 동맥; = 척추 동맥 높이 요; VSP = 복부 척추 동맥. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 외과 설치., 수술 (1) 안정된 테이블 위에 맨 위에 놓고 작은 빵 보드에 수행 할 수 있습니다. 가열 패드 (2) 및 작은 동물 인공 호흡기 (3) 필요할 때, 전체 제조를 용이하게하기 위해 이동 빵 보드에 고정 될 수있다. 작은 동물 인공 호흡기를 배터리에 의해 구동 될 수있다 (4). 자석 홀더 (5) 마취제를 전달하는 데 사용되는 노즈 콘을 고정 할 수있다. 코 콘 할 수또한 안정된 위치에서 머리를 보호. 동물이 재배치 될 필요가없는 경우, 미세 조작기 (6) 전기 생리학 또는 신경 추적 실험 위치 프로브로 사용될 수있다. 광원 (7)과 (그림 생략) 입체경이 미세. B 중 랜드 마크의 구조를 시각화하는 데 필요한, 작은 가위 단계 1.4에서 사용된다. C, 겸자는 단계 1.4, 1.6.1, 1.8 및 1.8.1에서 사용되는 . D, 봄 가위가 단계 1.5, 1.6 및 1.7. 전자에 사용되는 해부 끌 단계 3.1.2에서 사용된다. E = 1mm의 스케일 바는, BD에 적용됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 삽관 기관을 노출., 동물은 마취가 발생하기 쉬운 위치에 배치하고, 코 콘 테이프 (점선). B로 고정되어, 피부는 잘라 기본 지방층. C, 위에 놓인 지방과 땀샘 (도시를 노출 옆으로 배치됩니다 회색) 기관을 노출 밀려있다. 테이프를 덮고있는 피부 (점선). D를 고정하는 데 사용됩니다, 기관은 근육 해부한다. 전자, 기관 반지의 시각화 위에있는 근육의 성공적인 제거를 나타냅니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 동물을 삽관.은 두 봉합 실 (흰색 화살표)는 기관의 주위에 묶여있다(t). B, 삽관 튜브 (는) 밀접 동물 인공 호흡기. C의 Y 관에 연결되어야, 기관 절개는이 봉합 실 (검은 화살표). D, 통풍 관이 삽입되는 사이 만들어져 두 봉합 스레드가 강화된다. 스레드의 끝 (흰색과 검은 화살촉으로 표시) 교차 방식으로 다시 조여. 전자, 봉합 엔딩 묶여있다. F, 봉합 엔딩 트리밍 및 삽관이 완료됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 기관을 제거하고 뇌 수술을하고.는 제조는 엘라스토머 (지역 INSI와 안정 드 녹색) 점선. B, 기관이 확인 된 후 상처가 먼저 떨어져 삽관 튜브의 기관을 분리 한 다음 하악 근육 (점선). C를 잘라, 둔기를 사용하여 두개골의 표면을 청소하고 만들어 기술 근육을 제거하고 지방과 혈액. D를 제거하는 흡수 종이를 사용하여 깨끗한 지역의 예는 마지막 척추 (V) 및 BASI - 후두골 (보)를 보여줍니다. 두 뼈 (검은 색 화살표) 사이의 자연적인 차이가있다. 전자, 반전 D 모양 (검은 색 화살표)에서 microdrill 또는 초음파 클렌저 얇은 두개골을 사용. 부드럽게 얇아진 두개골을 중단하고 뼈 조각을 제거합니다. 랜드 마크 혈관이 표시. F, 노출 된 뇌간 표면에 혈관 랜드 마크의 높은 배율 볼 수 있어야합니다. BAS = 기저 동맥; AICA = 전방 하부 소뇌 동맥. B = 1 mm 단위 스케일 바는, CE에 적용됩니다.highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 신경 추적자의 일렉트로., 신경 추적 마이크로 루비를 포함하는 유리 전극은 중간 선 (빨간색 원) 근처에 배치되었다. 추적 7 제 2 롱 -5 μA 펄스가 15 분 후 14 초 전달하여 일렉트로했다. 복구 시간의 1 시간 후 박스형 영역 이광자 현미경으로 이미지화 하였다. P1 쥐 강아지. B, MNTB에있는 구 심성 축삭 라벨의 모범 Z-스택의 이미지. 화살표는 개별 담보 지점을 가리 킵니다. C가, 마이크로 루비 가득 유리 전극 MNTB (빨간색 원)의 상부에 위치했다. 트레이서은 설명 된 것과 동일한 설정을 사용하여 전기 천공 하였다. 복구 시간의 1 시간 후 박스 영역이었다이광자 현미경으로 이미지화. P5 쥐 강아지. D, MNTB에 표시된 세포와 축삭의 모범 Z-스택의 이미지. 화살표는 단일 MNTB 세포를 나타냅니다. B와 C의 레이블 목적 배율 및 개구를 표시였다. ;에서 A와 C = 300 μm의 스케일 바 = 45 μm의 B의 스케일 바; D = 90 μm의에서 스케일 바. AICA = 전방 하부 소뇌 동맥; BAS = 기저 동맥; R = 주동이; L = 측면. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. polytrode 녹화를 대상으로., Polytrode는 정강이 당 4 개의 전극 (검은 색 원) 4 정강이로 구성되어 있습니다. 전극 사이의 내부 간 생크 거리가 표시됩니다. B, C, polytrode 대상에 사용되는 혈관의 랜드 마크의 높은 배율의 뷰. polytrode은 (polytrode 트랙이 빨간색으로 표시됩니다) 사다리꼴의 본체 (빨간색 상자). D, Posthoc 조직 학적 분석은 DII 코팅 polytrode의 정확한 타겟팅을 보여줍니다의 내측 핵을 대상으로 주동이의 - 측면 좌표를 사용하여 위치한다. 전자, 모범 다 단위 기록. 트레이스 순서는 패널의 전극의 순서와 동일하다. 생크 녹음 내에서 동일한 색상이 있습니다. 전자의 스케일 바 = 오초. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
뇌의 미세 혈관의 그림 8. 생체 내 두 광자 이미징. 경동맥에 TRITC-덱스 트란 155 가와사끼 관류 후 뇌 혈관의 2-D 이미지 (축소 Z-스택). 묘화 영역은도 7C에 도시 된 것과 유사하다. 20x/0.5 침수 목적. P10 쥐 강아지. B, 관심 (ROI)의 지역 형광 강도 (빨간색 프레임 둘러싸인 지역)을 측정하는 데 사용됩니다. 미세 혈관은 ~ 14.2 ㎛의 직경을 가지고 있었고. C, 형광 강도 (정규화 된 값)의 전형적인 곡선은 시간의 함수로서 182 μM 뇌간 표면 아래에 위치시켰다. fluoresence 솔루션이 바로 혈관 내강을 채우고 때 0은 투자 수익 (ROI)의 형광 강도의 단계의 증가이다. (DI / DT) 0 I 0는 용질의 미세 혈관의 투과성을 결정하는 데 사용됩니다. TRITC-덱스 트란 155 kD의에 투자율은 1.5 × 10-7 cm / 초 계산되었다.B = 100 μm의에서 눈금 막대는 적용됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
시간이 중요합니다. 경험이 풍부한 연구원 (1-3 단계) 1 시간이 프로토콜을 수행 할 수 있어야한다. 여러 단계에 명시된 시간은 전문 지식을 높은 수준으로 매체를 가정합니다. 환기가 컨트롤이 동물의 질식과 사망을 초래할 수 있기 때문에 적절하고 적시에 기관 절개 및 삽관 법은 중요하다. 실수는 동물의 억제되지 않는 출혈과 사망을 초래할 수 있기 때문에 근육과 지방 조직의주의 정리도 매우 중요합니다. 캐 뉼러 삽입 경동맥를 준비 할 때 마찬가지로, 하나는 실 매듭이 느슨해지면 억제되지 않는 출혈이 일어날 것입니다, 조심스럽게 동맥을 강화하고 잘라해야합니다. 마지막으로, 뇌 수술은 혈관의 관광 명소를 방해하지 않고, 신중하게해야한다. 외장 수막 층 (경질)의 부주의 제거는 심한 출혈과 동맥 공급 장치의 손상을 초래할 수 있습니다.
환기 설정은 동물의 연령에 따라 선택된다.대부분의 상용 공급 업체는 이러한 설정에 대한 유용한 정보를 제공합니다. P15보다 나이가 쥐의 실험은 큰 동물 인공 호흡기의 사용이 필요합니다. 성인 동물 마취제 / 자일 라진 마취 경우 환기가 필요하지 않을 수도 있지만, 삽관 법은 기관들이 유체를 방지하는 것이 좋습니다.
본 프로토콜의 하나의 주된 제한은 실험만을 심하게 수행 될 수 있다는 것이다. 우리의 실험실에서 우리는 두 가지와 최대 10 시간 정도 지속되는 실험을 수행했습니다. 두 번째 제한은 실험 마취하에 수행해야한다는 것입니다. 따라서 마취의 선택은 실험의 계획 및 설계에서 고려해야 할 중요한 변수이다. 관련 문제는 신생아 동물 했나봐에 특히 민감 할 수 있다는 것입니다. 예를 들면, 케타민 / 자일 라진 혼합을 선택할 경우, 강아지의 중량을 기준으로 용량을 계산하고 최대 볼륨의 ⅓에 약물을 투여. 발가락 핀치 R로 5-10 분 간격으로 동물의 상태를 확인esponse. 이소 플루 란을 사용하는 경우의주의 사항도 조사 (통풍 및 올바르게 조정 기화기)를 위해 안전한 환경을 유지하기 위해 필요합니다.
실체는 이광자 현미경으로 전극 및 동물의 재배치를 배치 시야각을 조정 및 공간 간극을 용이하게하기 위해가요 성 홀더에 장착 될 수있다. 인공 호흡기에 전원을 공급하기 위해 배터리를 사용하면 동물을 이동 촉진하고 전기 생리학 실험을하는 동안 전기 아티팩트를 줄일 수 있습니다. 이를 위해 작은 브레드 (7.5 × 12 인치) 인공 호흡기, 가열 패드와 마취 된 동물 (도 2a)를 함께 조립하기 위해 사용될 수있다. 이 설정에 대한 유용하고 중요한 수정은 수술하는 동안 생체 신호를 모니터링 할 수있는 장치의 추가이다. 맥박 산소 측정기 또는 다른 아날로그 장치는 실험실 예산에 따라 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 전기 생리학과 만난 영상에 사용 된패치 클램프 녹음 8,10,11, polytrode 레코딩 (도 7), 두 개의 광자 촬상 구 등 hods, (도 6 및도 8). 한 가지 가능한 미래의 응용 프로그램은 전기 생리학 기록 16에 형광 표지 세포를 대상으로 이러한 방법을 결합하는 것입니다.
새로운 이미징 응용 프로그램은 2-D 또는 두 광자 현미경을 사용하여 3-D 시계열을 포함 할 수있다. 예를 들어, 뇌간의 신경 세포와 아교 세포 집단의 활동을 연구하는 칼슘 지표 러스 로딩을 사용. 도 8에 도시 된 바와 같이, 염료 용액은 경동맥을 통해 혈액 순환 내로 주입은 뇌 혈관의 높은 콘트라스트 이미지를 생성하는 데 사용될 수있다. 형광 염료는 미세 혈관 내강을 채우고 주변 조직에 퍼져로서, 용질 확산 COEF는 혈액 뇌 장벽의 겉보기 용질 투과성을 계산 뿐만이 아니라 사용될 수있다뇌 조직 3 ficient. 경동맥을 통해 찬란 용질을 주입하기위한 하나의 주 이유는 염료 용액에 직접 꼬리 정맥 주입과 같이 먼저 마음을하지 않고 뇌의 미세 혈관에 갈 수 있다는 것입니다. 이것은 적어도 두 가지 장점을 제공합니다. 하나는 관류 속도가 삽관 사이트에 고정되어있는 경우 미세 혈관 내강에서 형광 염료의 농도가 실질적으로 일정하게 될 수 있다는 것이다. 이 혈액 - 뇌 장벽의 투과성의 정확한 결정을 보장한다. 또 다른 테스트 에이전트는 관류에 포함되면, 그것이 직접 신체 순환에서 다른 요소로 희석하거나 결합되지 않고 혈액 - 뇌 장벽으로 이동한다는 것이다.
새로운 실험은 유전자 인코딩 형광 기자들과 형질 전환 동물의 장점을 취할 수있다. 이것은 (형광 프로브 반응계에로드 할 필요가 있다는 것이 이점을 제공하지 않는 한 실험의 설계시간을 절약하거나 더 그대로 준비 (예를 들어 두개골 창 (17))를 허용), 그렇지 않으면 상태.
마지막으로, 실험은 열등 올리브 또는 얼굴 모터 핵 뇌간과 같은 다른 영역에서 수행 될 수있다. 특정 종의 특정 세포 집단의 신경 해부학 및 개발에 대한 지식은 해부학 적 동물 (그림 1) 성장에 따라 변경 될 수 있습니다 특히,이 끝 부분에 중요하다. 우리는이 프로토콜은 생체 전기 생리학 및 이미징 방법에 사용하여 복부 뇌간의 구조를 연구하기 위해 다른 사람을 격려 바랍니다.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH / NCRR / RCMI에서 부여 G12-RR003060에 의해 지원되었다, 새로운시 대학에서 아동 건강 및 인간 발달, 국립 과학 재단 (National Science Foundation) CBET 0,754,158 및 PSC-CUNY 62337-00 (40)의 유니스 슈라이버 국립 연구소에서 SC1HD068129을 부여 뉴욕.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbant pads | Kettenbach | Sugi 31603 | Other options may be available from different companies |
| Cautery | Braintree Scientific, INC | GEM 5917 | Other options may be available from different companies |
| Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran | Sigma | T1287-500MG | Other options may be available from different companies |
| Dissecting Chisel | Fine Science Tools | 10095-12 | Other options may be available from different companies |
| DiI | Invitrogen | V-22885 | Other options may be available from different companies |
| Elastomer | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Other options may be available from different companies |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Other options may be available from different companies |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12,11617-12, 11616-16 | Other options may be available from different companies |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | Other options may be available from different companies |
| Heating pad | FHC | 40-90-2 | Other options may be available from different companies |
| Intubation tubing | Braintree Scientific, INC | BIO CO-KIT | Choose age appropriate size |
| Light source | Spach Optics | Schott Ace illuminator | Other options may be available from different companies |
| Micro drill | Braintree Scientific, INC | MD-1200 120V | Other options may be available from different companies |
| Paper tape | Walgreens | Generic brand | Other options may be available from different companies |
| Syringe filter | VWR | 28145-483 | Other options may be available from different companies |
| Syringe pump | VWR | 52459-008 | Other options may be available from different companies |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | Other options may be available from different companies |
| Suture | Ethicon | Prolene 86979 | 6-0 size |
| Tubing | Braintree Scientific, INC | Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120 | Other options depending on pup’s age |
| Vaporizer (isoflurane) | Vetequip Incorporated | 911103 | Other options may be available from different companies |
| Ventilator (minivent) | Harvard Apparatus | 730043 | Use for P0-P12 rats |
References
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