Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En metode til at tjene en kraniotomi på den ventrale Skull for neonatal Gnavere

Published: May 22, 2014 doi: 10.3791/51350
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Biology, The City University of New York, City College, 2Department of Biomedical Engineering, The City University of New York, City College

Summary

Et kirurgisk fremgangsmåde er beskrevet for at eksponere den ventrale kraniet hos nyfødte rotter. Med denne fremgangsmåde er det muligt at åbne en kraniotomi at udføre akut elektrofysiologi og to-foton mikroskopi eksperimenter i hjernestammen af ​​bedøvede hvalpe.

Abstract

Anvendelsen af en kraniotomi til in vivo eksperimenter giver en mulighed for at undersøge dynamikken i forskellige cellulære processer i pattedyrs hjerne i voksenalderen og under udvikling. Selv om de fleste in vivo metoder bruger en craniotomy til at studere hjernen regioner, der ligger på den dorsale side, hjernestammen regioner såsom pons, der ligger på den ventrale side forbliver relativt understudied. Det vigtigste mål med denne protokol er at lette adgangen til ventrale hjernestammen strukturer, så de kan studeres in vivo ved hjælp af elektrofysiologiske og billeddannende metoder. Denne fremgangsmåde giver mulighed for undersøgelse af strukturelle ændringer i langtrækkende axoner, mønstre af elektrisk aktivitet i single og ensembler af celler, og ændringer i blod-hjerne barrieren permeabilitet i nyfødte dyr. Selv om denne protokol er blevet anvendt for det meste til at studere den auditive hjernestammen hos nyfødte rotter, kan det nemt tilpasses til studier i andre gnaver arter såsom nyfødte mus, voksen Rodents og andre hjernestammen regioner.

Introduction

Anvendelsen af en kraniotomi i kombination med fluorescensimagografi og elektrofysiologiske teknikker tillader overvågning blodgennemstrømning, blod-hjerne-barriere-permeabilitet og måling af aktiviteten af neuroner og gliaceller i levende dyr 1-3. Adskillige laboratorier har brugt denne metode til at give indsigt i hjernens fysiologi i sunde og sygdomstilstande, men der er stadig huller i vores forståelse af, hvordan disse processer opstå under udvikling. Endvidere har de fleste undersøgelser fokuseret på de områder af hjernen, som er let tilgængelige fra ryg overfladen af kraniet, således at ventrale hjernestammen strukturer med forskellige fysiologiske roller er blevet studeret de fleste bruger ex vivo metoder.

Det vigtigste mål med denne protokol er at give en metode til at åbne en kraniotomi på den ventrale kraniet af gnavere. Denne fremgangsmåde blev tilpasset fra klassiske studier udført i større pattedyr, såsom hunde og katte til sensoriske neurofysiologi Recordings af det auditive hjernestamme 4-7. I denne protokol er der dog romanen udfordring at udføre proceduren i nyfødte dyr. Brug landmærker vaskulatur, har det tilpasset protokol tidligere været anvendt til at studere den auditive hjernestammen af nyfødte rotter, voksne mus og andre hjernestammen regioner som ringere oliven 8-11 (figur 1).

En væsentlig fordel ved en ventral kraniotomi i forhold til eksisterende metoder til at studere ventrale hjernestammen kerner er, at det giver direkte adgang til de strukturer af interesse i levende dyr. For eksempel er de auditive celler af den overlegne olivary kompleks lokaliseret nogle få snese mikrometer fra hjernens overflade, som er vigtig for målrettet placering af prober og til anvendelse af to-foton-billedteknik hvor billeddannelse dybde kan begrænses til 0,5 mm ved lys væv spredning og absorption. En ventrale kraniotomi giver også et præparat med relativt intakte neurale forbindelser, WHICH er forstyrret i akutte og organotypiske skive præparater 12. I modsætning til andre protokoller til in vivo neurofysiologi eksperimenter 13, kan en ventral tilgangen kombineres med multi-elektrode optagelse og billeddiagnostiske metoder, der giver oplysninger om cellulære ensembler (figur 6 og 7). Endelig, i kombination med denne protokol en fluorescens-mærket opløst stof kan injiceres i karrene at måle ændringer i blod-hjerne-barriere-permeabilitet til det opløste stof (figur 8).

Protocol

Følgende protokol følger retningslinjerne dyrepleje fastlagt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på City College i New York.

1.. Animal Intubation (10-20 min)

  1. Før operation, forberede pattedyr Ringer-opløsning. Saml kirurgiske redskaber, varmepude, og små dyr ventilator på bænken (Figur 2).
    1. Til måling af blod-hjerne-barriere-permeabilitet laver 10 ml 1% bovint serumalbumin (BSA) opløsning Ringer og opløses TRITC-dextran-155 kD ved 8 mg / ml i 1% BSA-opløsning, filtreres opløsning med 25 mm sprøjtefilter (0,2 um porestørrelse) og opbevar det i en folieklap sprøjte i mørke.
  2. Bedøver dyret ved hjælp af isofluran. Brug 5,0% til induktion og 1,5-3,0% for vedligeholdelse. Alternativt kan en blanding af ketamin (41,7 mg / kg) og xylazin (2,5 mg / kg) kan anvendes. Dybde af anæstesi kan kontrolleres ved tå knivspids refleks aføvre og nedre ekstremiteter.
    1. Efterfølgende doser af ketamin (41,7 mg / kg legemsvægt) og xylazin (2,3 mg / kg legemsvægt) skal administreres i intervaller af ⅓ af den maksimale dosis for at undgå overdosering. Anvendelse af en gnaver ventilator anbefales at modvirke xylazin-induceret respirationsdepression.
  3. Placer bedøvede pup liggende på rygsiden og sikre dets hoved med Plastskålen anvendt til at levere bedøvelsesmiddel (figur 3a).
    1. Fastgør dyret med tape på Forlemmerne og hale (figur 3a).
    2. Et alternativ til at fastgøre pup hoved er at bruge et hoved plade fastgjort til en metalstang.
      Bemærk: Sørg for varmepuden er sat til 37 ° C for at undgå hypotermi (figur 3a).
  4. Saks (figur 2b) for at gøre en langsgående og fire laterale indsnit på huden overliggende halsen (Figur 3b). Ved hjælp af stump teknik, dissekere huden og læg den til side med pincet (figur 2c og 3c).
    1. Hold huden ned med tape. Stabiliser hovedet i en vandret stilling (fig. 3c).
  5. Brug foråret saks (Figur 2D) og stump teknik, push kirtler og fedt lag bort for at blotlægge trachea (figur 3c). Identificer placeringen af ​​halspulsårer.
    1. Hold halspulsårer væk fra luftrøret.
      Bemærk: punktere halspulsåren kan resultere i massive blodtab og død hvalp.
  6. Brug foråret saks (Figur 2d) dissekere de langsgående muskler dækker luftrøret. Skær de langsgående muskler placeret under luftrøret (figur 3d).
    Bemærk: De luftrør ringene skal være klart synlig (figur 3e).
    1. Brugpincet (fig. 2c), binde to stykker sutur rundt om trachea. Et stykke af sutur vil sikre udluftningsrøret og det andet gevind vil blive brugt til at lukke luftrøret rostralt udluftningsrøret indsætningspunktet (figur 4a).
      Bemærk: Fugt eksponeret væv regelmæssigt med Ringer-opløsning for at undgå dehydrering.
  7. Brug af foråret saks (figur 2d) at foretage et snit på en af tracheale ringe er placeret mellem de to tråde er anbragt i trin 1.6.1 (figur 4c).
    Bemærk: Sørg for, at ingen væske ind i åbne luftrøret. Væske i luftrøret vil forårsage kvælning.
  8. Sæt intubationsrøret (figur 4b) i luftrøret og spænd den nederste tråd for at sikre det. Brug pincet (Figur 2c), stramme overtråden for at lukke luftrøret posterior til indsætningspunktet i intubationsrøret.
    1. Tighten og trim enderne af to tråde (4d-f).
      Bemærk: Vapor inde i intubationsrøret er et godt tegn på luftmængdestyring.
  9. Straks skifte isofluran forsyningen til ventilatoren. Juster slagvolumen og luftskiftet i henhold til vægten af ​​dyret.
    1. Forsegle udsatte omgivende væv med elastomer (figur 5a). Hold overfladen fugtes og rene.

2.. Luftrøret og Muscle Fjernelse at eksponere Cranium (5-10 min)

  1. Brug foråret saks (figur 2d) til at skære luftrøret støder op til udluftningsrøret. Udføre to snit langs musklen væg mundhulen at afsløre den kaudale ende af ganen (figur 5b).
    Bemærk: Hvis det er nødvendigt, skal du bruge en cauterizer at stoppe blødningen. Ukontrolleret blødning vil forårsage død af dyret.
  2. Rengørområde med rigelige mængder af Ringer-opløsning (figur 5c). Identificer gabet mellem den sidste ryghvirvler og dybest nakkebenet (figur 5d).
    Bemærk: Kløften mellem knoglerne er et nyttigt kranium milepæl at lokalisere hjernestamme strukturer. Den ringere oliven er placeret under dette hul. Den auditive overlegne olivary kompleks ligger under basi-occipital knogle i rostral retning fra dette hul (se figur 1).
  3. Rengør området med pincet (figur 2C) og foråret saks (Figur 2d). Må ikke punkteres blodkar.
    Bemærk: Hvis det er nødvendigt, ætse at stoppe blødningen.
    1. Efter det eksponerede område er fri for fedt-og muskelvæv, bør den plads, der adskiller dybest nakkebenet og den sidste ryghvirvel være synlig (figur 5d).

3.. Kraniotomi (15-30 min)

  1. Brug en mikroborehuller eller en ultrasonic sæbe. Find den mediale væg bulla.
    1. Tynd kraniet ved at gøre et omvendt U form, indtil de underliggende arterier er synlige (fig. 5e).
      Bemærk: Den basilararterien (bas) kører på toppen af hjernestammen midterlinjen. Den forreste ringere cerebellare arterie (AICA) filialer bilateralt og kan bruges pålideligt som en milepæl, da det har en konstant position i forskellige dyr.
    2. Når kraniet fortyndes forsigtigt bryde det ved hjælp af en dissekere mejsel (Figur 2e). Fjern knoglen stykke med pincet (figur 2c). Alternativt, løft og bryde kraniet ved en bøjet nål.
      Bemærk: Gentag denne procedure, indtil den størrelse og form af kraniotomi er passende for den planlagte eksperiment. De bas og AICA skal være synlig gennem dura membran (fig. 5f).
  2. Rengør området flere gange med frisk Ringer løsning. Brug absorberende pads tørre overfladen af ​​dura membran.
    1. Brug om nødvendigt en sutur nål til at fjerne dura membran uden at flytte eller bryde den skelsættende arterier bas og AICA.
      Bemærk: Ved dura punktere cerebrospinalvæske vil flyde ud. Rengør området med Ringer-opløsning og holde fugtet gennem hele forsøget.

4.. Elektrofysiologi Experiment

  1. Vælg polytrode ifølge eksperiment design (figur 7a). Brug en fin pensel til pels polytrode med Dil. Overfør Dil opløsning i en 1 ml mikrocentrifugerør, dyppe penslen i løsningen og forsigtigt strejke polytrode under visuel vejledning (dvs. ved hjælp af en stereoscope). Start på spidsen af ​​sonden og omhyggeligt indtil alle elektroder er belagt ensartet.
    1. Placer jordelektroden inde i mundhulen. Indlæs polytrode i elektrodeholderen (figur 7b
    2. Tænd for forstærkeren og kontrollere, at alle forbindelser fungerer godt.
  2. Placer elektroden over bas på den gren punkt AICA (position nul). Flyt elektroden til det ønskede målpunkt ved anvendelse af den passende rostralt-sidekoordinaten (fig. 7c).
    1. Sæt elektroden på hjernen overflade og flytte det til den ønskede dybde i trin på 5-10 mM.
  3. Udfør optagelse i henhold til eksperimentel design. Gemme data til yderligere analyse.

5. To-foton Imaging Experiment

  1. Tænd mikroskopet. Indstil excitationsbølgelængden og bruge en passende emission filter. Excitation ved 800 nm og en 607 ± 45 nm band-pass emission filter arbejde godt for billeddannelse TRITC-dextran.
  2. Identificer højre eller venstre halspulsåre. Ved stump teknik dissekere halspulsåren fra de tilstødende bindevæv eller nerver.
    1. Pluk og hold carotisarterie med en hæmostat. Bind tre stykker af sutur omkring halspulsåren.
    2. Spænd tråden tættere på hjertet side for at stoppe blodgennemstrømningen og efterlade de to andre tråde løs.
    3. Brug fine saks til at lave et lille snit i en 45 ° vinkel på halspulsåren mellem den bundne tråd og den næste løs tråd.
      Bemærk: Rengør blod med absorberende papir.
  3. Cannulate halspulsåren. Sæt slangen fyldt op med TRITC-dextranopløsningen i snit på halspulsåren omkring 5 mm dyb orienteret mod hvalpen hoved.
    1. Spænd de to andre tråde omkring arterien for at holde slangen og arterien sammen. Stram trådene, trim og tilføje elastomer til yderligere at stabilisere.
      Bemærk: Den anden side af røret er forbundet med sprøjten med TRITC-dextran-opløsning (fremstillet i trin 1.1).
  4. Fastgør sprøjten på sprøjtepumpen.
    1. Sethastigheden halspulsåren blod strømningshastighed pup. Tænd sprøjtepumpen nogle få sekunder, og kontrollér manuelt at farvestoffet opløsning kan injiceres i halspulsåren. Bemærk: Hvis man antager, at blod flow i halspulsåren af voksne rotter (240-280 g), er omkring 3 ml / min 14, kan blodgennemstrømningen sats for en rotteafkommets (fx P10 pup vejer 15-25 g) beregnes til området fra 0,16 til 0,3 ml / min.
  5. Placer dyret under mikroskop mål. Sprøjt fluorescerende dextran ind i blodbanen.
    1. Identificere områder af interesse på den ventrale hjernestammen med en 5x luft mål. Skift til en 20X eller 40X målsætning (nedsænkning i vand, NA = 0,5 eller 0,8, henholdsvis) for at fokusere regionen af ​​interesse (ROI).
    2. Start billedbehandling og justere billedet erhvervelse parametre (f.eks eksponering tid, laser magt, detektor gain), indtil fluorescensintensitet i karrene af ROI er optimeret (dvs.ikke er for lavt, men ikke mættet).
    3. Tænd sprøjtepumpen at injicere farveopløsning i halspulsåren og erhverve en tidsserie på et fast brændplan.

6.. Animal Care følgende procedure

  1. Dette er en terminal procedure. Ved afslutningen af ​​et eksperiment dyr skal aflives med en overdosis pentobarbital (100 mg / kg, intraperitoneal injektion), eller enhver anden metode af eutanasi er godkendt af American Veterinary Medical Association eutanasi retningslinjerne.
    Bemærk: Perfusion gennem hjertet med Ringer-opløsning fulgt med en fikseringsopløsning anbefales for yderligere histologisk analyse.

Representative Results

Elektroporation af neurale sporstoffer

Den mediale kerne trapez legeme (MNTB) er en gruppe af celler i den overlegne olivary kompleks, der er blevet undersøgt tidligere ved hjælp af denne protokol. For eksempel kan patch-clamp pipetter anvendes til at elektroporere neurale sporstoffer (figur 6) 9. Når pipetter er placeret i nærheden af midterlinjen som vist i figur 6a, er resultatet, at decussating afferente axoner er mærket. En to-foton mikroskop udstyret med en høj numerisk apertur vand immersionsobjektivet kan anvendes til afbildning af fibrene når frem til MNTB, herunder meget fine sidelinier (pile i figur 6b). Neurale sporstoffer kan også blive leveret til MNTB direkte, som vist i figur 6c. Resultatet er mærkning af MNTB celler og afferente axoner, som kan forstås af billeddannelse med en lavere numeriske åbning vand immersionsobjektivet (figur 6d). Den main fordel ved at bruge den lavere forstørrelse målet er, at kan undersøges et bredere synsfelt, og selv om dette resulterer i et fald i rumlig opløsning på grund af den lavere objektive numeriske åbning kan individuelle MNTB celler anes godt (pile i figur 6d) . Den gennemsnitlige varighed af disse eksperimenter for aldre P1-P5 er 3,1 ± 1,4 time (n = 22 hvalpe).

Elektrofysiologi optagelser

Spontan burst fyring er en form for udviklingsmæssig elektriske aktivitet observeret i enkelte MNTB celler før starten af at høre 11,13. Ved hjælp af denne kirurgiske protokol er det også muligt at målrette multielectrode arrays (polytrodes) til MNTB (7a-b). Resultatet er en optagelse af spontan aktivitet i et ensemble af MNTB celler. Figur 7e viser et repræsentativt polytrode optagelse fra en P6 rotte. I dette eksperiment blev polytrode belagt med de lipofile farvestof Dil hjælpen tynd pensel (se trin 4.1). Efter udførelse af optagelsen hjernen blev forarbejdet til histologisk analyse og placeringen af Dil-mærkede polytrode spor blev anvendt til at bekræfte korrekt målretning mod MNTB (figur 7d). Den gennemsnitlige varighed af eksperimenter for aldre P1-P6 er 2,0 ± 0,7 time (n = 33 hvalpe).

Måling mikrokardannelse permeabilitet

Denne protokol kan også anvendes til at udføre to-foton billeddannelse eksperimenter vaskulær permeabilitet. En fluorescerende opløste (TRITC-dextran, MW 155 kD, Stokes radius ~ 8,5 nm) blev opløst i 1% BSA Ringer-opløsning og injiceres i den cerebrale cirkulation via en kanyle indsat i halspulsåren 14. I modsætning haleveneinjektioner denne procedure omgår hjertet og indfører fluorescerende opløste stof direkte i mikrocirkulationen i hjernen. 8a illustrerer kvaliteten af ​​mærkning af blod vasculature at resultaterne fra at bruge denne procedure. Efter kontinuerligperfusion af mærkede opløste stoffer i blodet, er det muligt at opnå en tidsforskudt sekvens af et område af interesse, som vist i figur 8b. Den totale fluorescens intensitet i området af interesse blev målt offline og en matematisk model, der anvendes til at bestemme blod-hjerne-barriere-permeabilitet til fluorescensmærket opløste stoffer (figur 8c) 15. Den gennemsnitlige varighed af eksperimenter for aldre P9-P10 er 2,3 ± 0,8 time (n = 3 hvalpe).

Figur 1
Figur 1. Relative placering af ventrale hjernestamme neurale strukturer med hensyn til seværdigheder vaskulatur hos neonatale rotter. En, fra siden af hjernen. B ventrale visning af hjernen. Større blodkar er vist i røde og neurale strukturer af interesse er INDlemstore af farve firkanter. Ikke målfast. AICA = forreste ringere cerebellare arterie; bas = basilararterien; ICV = ringere cerebral vene; MCA = midtcerebralarterie; vert = vertebral arterie; VSP = ventral spinal arterie. Klik her for at se større billede.

Figur 2
Figur 2. Kirurgisk setup. En, kan kirurgi udføres på et lille brød bord (1) hviler på toppen af en stabil bordplade. En varmepude (2) og et lille dyr ventilator (3) kan fastgøres til brød bord for at lette flytte hele præparat, når det er nødvendigt. Den lille dyr ventilator kan drives af et batteri (4). En magnetisk holder (5) kan anvendes til at fastgøre næsekeglen anvendt til at levere bedøvelsesmiddel. Næsekeglen kanogså medvirke til at sikre hovedet i en stabil position. Hvis dyret ikke behøver at blive flyttet, en mikromanipulator (6) kan anvendes til at placere prober til elektrofysiologi eller neurale sporingsforanstaltninger eksperimenter. En lyskilde (7) og en stereoskop (ikke afbilledet) er nødvendige for at visualisere skelsættende konstruktioner under mikrokirurgi. B er en lille saks der anvendes i trin 1.4. C, er Tang anvendes i trin 1.4, 1.6.1, 1.8 og 1.8.1 . d, der forår saks anvendes i trin 1.5, 1.6 og 1.7. e er dissekere mejsel anvendes i trin 3.1.2. Målestokken i e = 1 mm, gælder bd. Klik her for at se større billede.

Figur 3
Figur 3.. Udsættes luftrøret for intubation.a, Dyret bedøves, placeret i bugleje og fastgøres med næsen kegle og tape (stiplede linjer). B, Huden skæres og placeres til side for at eksponere den underliggende fedtlag. c, The overliggende fedt og kirtler (vist i gråt) er skubbet til side for at blotlægge trachea. Tape bruges til at sikre den overliggende hud (stiplede linjer). D, er luftrøret dissekeres fra muskulatur. E, Visualisering af trakeal ringe indikerer vellykket fjernelse af overliggende muskler. Klik her for at se større billede.

Figur 4
Figur 4.. Intubating dyret. En, to suturtråde (hvide pile) er bundet omkring trachea(T). B, skal den intubationsrøret (det) være tæt forbundet til y rør af dyret ventilator. C, er en trakeostomi mellem de to suturtråde (sort pil). D, ventilation tube er indsat, og to suturtråde er spændt. Enderne af trådene strammes igen i en krydset måde (angivet med hvide og sorte pilespidser). E bliver suturen endelser bundet. F, bliver suturen endelser trimmes og intubation er færdig. Klik her for at se større billede.

Figur 5
Figur 5.. Fjernelse af luftrøret og gøre kraniotomi. En, er forberedelsen stabiliseret med elastomer (område insi de grønne stiplede linier). B, Luftrøret identificeret og derefter nedskæringer er lavet først at adskille luftrøret væk fra intubationsrøret og derefter at skære underkæbens muskler (stiplede linier). c, Rengør overfladen af kraniet ved stump teknik til at fjerne muskler og bruge absorberende papir for at fjerne fedt og blod. d, Eksempel på et rent område viser det sidste ryghvirvler (v) og basi-occipital bone (bo). Der er en naturlig kløft mellem de to knogler (sorte pile). E, Brug en mikroborehuller eller ultralyd sæbe tynde kraniet i en omvendt U-form (sorte pile). Forsigtigt bryde den fortyndede kraniet og fjern det lille stykke knogle. Landmark vasculature skal være synlig. F, høj forstørrelse billede af vaskulære vartegn på den udsatte hjernestammen overfladen. Bas = basilararterien; AICA = anterior ringere cerebellar arterie. Målestokken i b = 1 mm, gælder CE.highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.

Figur 6
Figur 6.. Elektroporation af neurale sporstoffer. A, Et glas elektrode indeholder den neurale sporstof mikro-rubin blev placeret i nærheden af midterlinjen (rød cirkel). Sporstof blev elektroporeret under anvendelse af syv sekunder lang -5 uA impulser afgivet hver 14 sekunder 15 minutter. Efter 1 times restitutionstid den indrammede område blev afbildet med en to-foton mikroskop. P1 rotteafkommets. B Exemplar z-stak billede af afferente axon mærkning i MNTB. Pile peger på individuelle sikkerhedsstillelse filialer. C. blev Et glas elektrode fyldt med mikro-rubin placeret på toppen af MNTB (rød cirkel). Sporstof blev elektroporeret med de samme indstillinger, der er beskrevet i et. Efter 1 times nyttiggørelse tid var det indrammede områdeafbildet med en to-foton mikroskop. P5 rotte hvalp. D, Exemplar z-stak billede af mærkede celler og axoner i MNTB. Pile angiver single MNTB celler. Etiketter i b og c angiver objektiv forstørrelse og numerisk blænde, hhv. Skala bar i en og c = 300 m; Målestokken i b = 45 m; Målestokken i d = 90 um. AICA = forreste ringere cerebellare arterie; bas = basilararterien; r = rostralt; l = lateral. Klik her for at se større billede.

Figur 7
Figur 7.. Målrettet polytrode optagelse. A, Polytrode består af 4 skafter med 4 elektroder pr skaft (sorte cirkler). Intra-og inter-skaft afstande mellem elektroderne er angivet. B, C, Højere forstørrelse udsigt over vartegn vasculature bruges til at målrette polytrode. Den polytrode er placeret ved hjælp rostral-laterale koordinater til at målrette den mediale kerne af trapez krop (rød boks). D, Posthoc histologisk analyse viser korrekt målretning af Dil-belagt polytrode (polytrode spor er vist i rødt). E, Exemplar multi -enhed optagelse. Trace ordre er den samme som elektrode orden i panelet en. Inden skaft optagelser har samme farve. Målestokken i e = 5 sekunder. Klik her for at se større billede.

Figur 8 Fig. 8. In vivo-to-foton-billeddannelse af hjernen mikrokar. en, 2-D billede (sammenfaldet Z-stack) af hjernen vaskulaturen efter perfusion af TRITC-dextran-155 kD i halspulsåren. Området afbildes ligner den, der er vist i figur 7c. 20x/0.5 nedsænkning i vand mål. P10 rotteafkommets. B, Region af interesse (ROI), der anvendes til at måle fluorescens intensitet (rød ramme lukket område). Den mikrokar havde en diameter på ~ 14,2 um og blev placeret 182 um under hjernestammen overfladen. C Typisk kurve fluorescensintensitet (normaliseret værdi) som en funktion af tiden. I 0 er det skridt stigning i fluorescens intensitet i ROI, når fluorescens løsning blot fylder op karhulrummet. (DI / dt) 0 og I 0 anvendes til at bestemme mikrokar permeabilitet for det opløste stof. Permeabiliteten for TRITC-dextran-155 kD blev beregnet til at være 1,5 x 10 -7 cm / sek.Målestokken i b = 100 um, gælder for en. Klik her for at se større billede.

Discussion

Tid er kritisk. En erfaren forsker bør være i stand til at fuldføre denne protokol i 1 time (trin 1-3). Begrundelsen for de forskellige trin tider antager en medium til høj grad af ekspertise. Korrekt og rettidig trakeostomi og intubation er kritiske, da dårlig ventilation kontrol kan føre til kvælning og død for dyret. Omhyggelig clearance af muskel-og fedtvæv er også meget vigtigt, fordi fejl kan føre til ukontrolleret blødning og død for dyret. Tilsvarende, når udarbejdelsen af ​​halspulsåren for kanyle indsættelse, er man nødt til at stramme og skære arterien omhyggeligt, hvis tråden knude bliver løs ukontrolleret blødning vil finde sted. Endelig bør kraniotomi gøres omhyggeligt, uden at forstyrre vartegn kar. Careless fjernelse af det ydre meningeal lag (dura), kan føre til alvorlige blødninger og skader på den arterielle forsyning.

Ventilation indstillinger vælges efter dyrets alder.De fleste kommercielle leverandører give nyttige oplysninger om disse indstillinger. Forsøg med rotter er ældre end P15 vil kræve anvendelse af et stort dyr ventilator. Voksne dyr måske ikke brug for ventilation, hvis bedøvet med ketamin / xylazin, men anbefales intubation for at undgå væske ind i luftrøret.

En af de største begrænsning af denne protokol er, at eksperimenter kan kun udføres akut. I vores laboratorium har vi foretaget eksperimenter varighed på mellem to og op til ti timer. En anden begrænsning er, at forsøgene skal udføres under bedøvelse. Derfor er valget af bedøvelsesmiddel er en vigtig variabel at overveje i planlægning og design af eksperimenter. Et beslægtet problem er, at nyfødte dyr kan være særligt følsomme over for overdosering. For eksempel, hvis du vælger ketamin / xylazin mix, beregne dosis baseret på pup vægt og administrere lægemidler på ⅓ af den maksimale lydstyrke. Kontroller tilstanden af ​​dyret hver 5-10 minutter ved tå knivspids response. Hvis du bruger isofluran, er der også behov forholdsregler for at opretholde et sikkert miljø for investigator (ordentlig ventilation, og en korrekt kalibreret fordamper).

Stereomikroskop kan monteres på en fleksibel holder til at justere betragtningsvinkel og lette plads clearance at placere elektroderne og flytning af dyret for to-foton mikroskop. Anvendelse af et batteri til magten ventilatoren kan lette at flytte dyr og reducere elektriske artefakter under elektrofysiologiske eksperimenter. Til dette formål kan en lille breadboard (7,5 x 12 inches) anvendes til at samle sammen ventilatoren varmepuden og bedøvede dyr (figur 2a). En nyttig og vigtig modifikation denne opsætning er tilføjelsen af ​​en indretning til overvågning af vitale tegn i løbet af operationen. En oxymeter eller andre analoge enheder kan bruges, afhængigt af laboratoriets budget.

Denne protokol er blevet anvendt med elektrofysiologi og billedbehandling opfyldttoder, herunder patch clamp optagelser 8,10,11, polytrode optagelser (fig. 7), og to-foton billeddannelse 9 (figur 6 og 8). En mulig fremtidig anvendelse vil være at kombinere disse metoder til målretning fluorescens-mærkede celler til elektrofysiologiske optagelse 16.

Nye programmer til billedbehandling kan også omfatte 2-D eller serie 3-D tid ved hjælp af to-foton mikroskopi. For eksempel ved hjælp af bolus lastning af calcium indikatorer til at studere aktiviteten af ​​hjernestammen neuronal og glial cellepopulationer. Som vist i figur 8, et farvestof opløsning injiceres i blodcirkulationen gennem halspulsåren kan bruges til at generere billeder med høj kontrast af hjernen vaskulaturen. Som fluorescens farvestof fylder mikrokar lumen og spredes i det omgivende væv, kan det ikke kun anvendes til at beregne den tilsyneladende opløste permeabiliteten af ​​blodhjernebarrieren, men også det opløste diffusion coefkelige i hjernevævet 3. En af hovedårsagerne til at injicere fluorescensmærkede opløste via halspulsåren at farveopløsningen direkte kan gå til mikrokar i hjernen uden at gå til hjertet først som en injektion i halevenen. Dette bringer mindst to fordele. Den ene er, at koncentrationen fluorescens farvestof i mikrokardannelse lumen kan være praktisk talt konstant hvis perfusionshastigheden fastsættes på kanyleringssted. Dette sikrer en nøjagtig bestemmelse af blod-hjerne-barriere-permeabilitet. En anden er, at hvis en prøve middel er inkluderet i perfusatet, vil det gå direkte til blod-hjerne-barrieren uden at blive fortyndet eller kombineret med andre faktorer fra kroppen cirkulation.

Nye eksperimenter kan også drage fordel af transgene dyr med genetisk kodet fluorescerende journalister. Dette ville give den fordel, at fluorescerende prober ikke behøver at blive indlæst i situ (medmindre udformningen af forsøgetanfører andet), hvilket sparer tid og eventuelt giver mulighed for mere intakte præparater (f.eks kraniel vindue 17).

Endelig kan forsøgene gøres i andre hjernestammen regioner, såsom ringere oliven eller ansigtets motoriske kerne. Viden om neuroanatomi og udvikling af specifikke cellulære populationer i en given art vil være vigtigt i denne retning, især da anatomiske kendetegn kan ændre sig som dyr vokse (Figur 1). Vi håber, at denne protokol opfordrer andre til at studere ventrale hjernestammen strukturer ved hjælp af in vivo elektrofysiologiske og billeddannende metoder.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud G12-RR003060 fra NIH / NCRR / RCMI indrømme SC1HD068129 fra Eunice Shriver National Institute of Child Health & Human Development, National Science Foundation cbet 0.754.158 og PSC-CUNY 62.337-00 40 fra City University of New York.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbant pads Kettenbach Sugi 31603 Other options may be available from different companies
Cautery Braintree Scientific, INC GEM 5917 Other options may be available from different companies
Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran Sigma T1287-500MG Other options may be available from different companies
Dissecting Chisel Fine Science Tools 10095-12 Other options may be available from different companies
DiI Invitrogen V-22885 Other options may be available from different companies
Elastomer World Precision Instruments KWIK-SIL Other options may be available from different companies
Fine Scissors Fine Science Tools 14060-09 Other options may be available from different companies
Forceps Fine Science Tools 11027-12,11617-12, 11616-16 Other options may be available from different companies
Spring Scissors Fine Science Tools 15009-08 Other options may be available from different companies
Heating pad FHC 40-90-2 Other options may be available from different companies
Intubation tubing Braintree Scientific, INC BIO CO-KIT Choose age appropriate size
Light source Spach Optics Schott Ace illuminator Other options may be available from different companies
Micro drill Braintree Scientific, INC MD-1200 120V Other options may be available from different companies
Paper tape Walgreens Generic brand Other options may be available from different companies
Syringe filter VWR 28145-483 Other options may be available from different companies
Syringe pump VWR 52459-008 Other options may be available from different companies
Stereomicroscope Olympus SZ61 Other options may be available from different companies
Suture Ethicon Prolene 86979 6-0 size
Tubing Braintree Scientific, INC Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120 Other options depending on pup’s age
Vaporizer (isoflurane) Vetequip Incorporated 911103 Other options may be available from different companies
Ventilator (minivent) Harvard Apparatus 730043 Use for P0-P12 rats

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kerr, J. N. D., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nat. Rev. Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).
  2. Sigler, A., Murphy, T. H. In vivo 2-photon imaging of fine structure in the rodent brain: before, during, and after stroke. Stroke. 41 (10), 117-123 (2010).
  3. Shi, L., Zeng, M., Sun, Y., Fu, B. M. Quantification of blood-brain barrier solute permeability and brain transport by multiphoton microscopy. ASME J. of Biomech. Eng. 136 (3), 031005-031005 (2014).
  4. Galambos, R., Schwartzkopff, J., Rupert, A. Microelectrode study of superior olivary nuclei. Am. J. Physiol. 197, 527-536 (1959).
  5. Goldberg, J., Brown, P. B. Response of binaural neurons of dog superior olivary complex to dichotic tonal stimuli: some physiological mechanisms of sound localization. J. Neurophysiol. 32 (4), 613-636 (1969).
  6. Guinan, J. J., Guinan, S. S., Norris, B. E. Single auditory units in the superior olivary complex I: responses to sounds and classifications based on physiological properties. Intern. J. Neurosci. 4, 101-120 (1972).
  7. Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons. J. Neurophysiol. 63 (5), 1169-1190 (1990).
  8. Khosrovani, S., Der Giessen, R. S. V. an, De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (40), 15911-15916 (2007).
  9. Rodríguez-Contreras, A., Van Hoeve, J. S., Habets, R. L., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (14), 5603-5608 (2008).
  10. Lorteije, J. A., Rusu, S. I., Kushmerick, C., Borst, J. G. G. Reliability and precision of the mouse calyx of Held synapse. J. Neurosci. 29 (44), 13770-13784 (2009).
  11. Tritsch, N. X., Rodríguez-Contreras, A., Crins, T. T., Wang, H. C., Borst, J. G. G., Bergles, D. E. Calcium action potentials in hair cells pattern auditory neuron activity before hearing onset. Nat. Neurosci. 13 (9), 1050-1052 (2010).
  12. Tong, H., Steinert, J. R., Robinson, S. W., Chernova, T., Read, D. J., Oliver, D. L., Forsythe, I. D. Regulation of Kv channel expression and neuronal excitability in rat medial nucleus of the trapezoid body maintained in organotypic culture. J. Physiol. 588 (9), London. 1451-1468 (2010).
  13. Sonntag, M., Englitz, B., Kopp-Scheinpflug, C., Rübsamen, R. Early postnatal development of spontaneous and acoustically evoked discharge activity of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body: an in vivo study in mice). J. Neurosci. 29 (30), 9510-9520 (2008).
  14. García-Villalón, A. L., Roda, J. M., Alvarez, F., Gómez, B., Diéguez, G. Carotid blood flow in anesthetized rats: effects of carotid ligation and anastomosis. Microsurgery. 13 (5), 258-261 (1992).
  15. Yuan, W., Lv, Y., Zeng, M., Fu, B. M. Non-invasive method for the measurement of solute permeability of rat pial microvessels. Microvasc. Res. 77 (2), 166-173 (2009).
  16. Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Haüsser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
  17. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).

Tags

Neuroscience auditive system; blod-hjerne-barriere-permeabilitet; udvikling; neurofysiologi; to-foton mikroskopi elektrofysiologi
En metode til at tjene en kraniotomi på den ventrale Skull for neonatal Gnavere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodríguez-Contreras, A., Shi,… More

Rodríguez-Contreras, A., Shi, L., Fu, B. M. A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents. J. Vis. Exp. (87), e51350, doi:10.3791/51350 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter