Eine Methode, um eine Kraniotomie auf der Bauch Schädel des Neugeborenen Nagetiere Stellen

Summary

Ein chirurgisches Verfahren beschrieben, um die Schädel im ventralen Neugeborene Ratten aus. Mit diesem Ansatz ist es möglich, eine Kraniotomie, um akute Elektrophysiologie und der Zwei-Photonen-Mikroskopie Experimente im Hirnstamm von betäubten Jungtiere durchführen zu öffnen.

Abstract

Die Verwendung einer Kraniotomie in vivo Experimenten bietet die Möglichkeit, die Dynamik diverse zelluläre Prozesse im Gehirn von Säugetieren im Erwachsenenalter und während der Entwicklung zu untersuchen. Obwohl die meisten in-vivo-Ansätze mit einem Schädelhirnregionen, um auf der Rückenseite befindet studieren, Hirnstamm Regionen wie die Brücke, auf der Bauchseite liegt noch relativ wenig erforschten. Das Ziel des Protokolls ist es, den Zugang zu ventralen Hirnstammstrukturen zu erleichtern, so dass sie in vivo unter Verwendung von elektrophysiologischen und bildgebenden Verfahren untersucht werden. Dieser Ansatz ermöglicht Untersuchung der strukturellen Veränderungen im Langstrecken-Axone, Muster der elektrischen Aktivität in Einzel-und Ensembles der Zellen und Veränderungen in der Blut-Hirn-Schranke in Neugeborene Tiere. Obwohl dieses Protokoll wurde vor allem verwendet, um den Hirnstamm in Neugeborene Ratten untersucht werden, kann es leicht für Studien in anderen Nagetieren wie Mäusen Neugeborenen, Erwachsenen-roden angepasst werdents und anderen Hirnstammregionen.

Introduction

Die Verwendung einer Kraniotomie in Kombination mit Fluoreszenz-Bildgebung und Elektro Techniken erlaubt die Überwachung der Blutfluss, Blut-Hirn-Schranken-Durchlässigkeit und die Messung der Aktivität von Neuronen und Gliazellen in lebenden Tieren ^1-3. Mehrere Labors haben diesen Ansatz verwendet werden, um Einblick in die Physiologie des Gehirns bei gesunden und Krankheitsbedingungen zu schaffen, aber Lücken in unserem Verständnis, wie diese Prozesse während der Entwicklung entstehen, bleiben. Außerdem haben die meisten Studien zur Hirnregionen, die leicht von der dorsalen Oberfläche des Schädels zugänglich, so dass ventralen Hirnstammstrukturen mit unterschiedlichen physiologischen Rollen wurden hauptsächlich unter Verwendung von Ex-vivo-Ansätze untersucht konzentriert.

Das Ziel des Protokolls ist es, ein Verfahren zum Öffnen einer Kraniotomie an der ventralen Schädel von Nagetieren bereitzustellen. Dieser Ansatz wurde von der klassischen Studien in größeren Säugetieren wie Hunden und Katzen für die sensorische Neurophysiologie durchgeführt reco angepasstrdings des auditorischen Hirnstamm ^4-7. In diesem Protokoll besteht jedoch die neuartige Herausforderung, den Vorgang in Neugeborenen Tiere. Mit Gefäß Sehenswürdigkeiten hat dieses Protokoll angepasst vorher benutzt worden, um den auditorischen Hirnstamm der Neugeborene Ratten, Mäusen und anderen erwachsenen Hirnstamm Regionen wie dem unteren Olive ^8-11 (Abbildung 1) zu studieren.

Ein Hauptvorteil einer ventralen Kraniotomie gegenüber bestehenden Methoden zur ventralen Hirnstammkerne zu studieren ist, dass es einen direkten Zugang zu den Strukturen von Interesse in lebenden Tieren. Zum Beispiel werden die Zellen des Gehör oberen Olivenkomplex lokalisiert ein paar Dutzend Mikrometer von der Hirnoberfläche, was für die gezielte Platzierung von Sonden und zur Verwendung von Zwei-Photon-Imaging-Ansätze, bei denen Bildtiefe auf 0,5 mm begrenzt ist, Licht Gewebestreuung und Absorption. Ein Bauch Kraniotomie stellt auch eine Zubereitung mit relativ intakten neuronalen Verbindungen, whICH werden bei akuten und organotypischen Präparate ¹² gestört. Im Gegensatz zu anderen Protokollen für die Neurophysiologie in vivo Experimente ¹³ kann ein ventral mit Multielektrodenaufnahme und bildgebende Verfahren, die Informationen über Mobil Ensembles bereitzustellen kombiniert werden (Fig. 6 und 7). Schließlich ist in Verbindung mit diesem Protokoll ein fluoreszierend markierter gelösten Stoffes in das Gefäßsystem injiziert werden, um Veränderungen in Blut-Hirn-Schrankendurchlässigkeit für den gelösten Stoff (8) zu messen.

Protocol

Das folgende Protokoll folgt den Tierpflege Richtlinien der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) am City College of New York gegründet.

1. Tier Intubation (10-20 min)

1. Vor der Operation vorzubereiten Säugetier Ringer-Lösung. Montieren Sie die chirurgische Werkzeuge, Heizkissen, und Kleintierbeatmungsgerät auf der Bank (Abbildung 2).
   1. Zur Messung von Blut-Hirn-Schrankendurchlässigkeit machen 10 ml 1% Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung in Ringer auflösen TRITC-Dextran 155 kD bei 8 mg / ml in 1% BSA-Lösung, Filterlösung mit 25 mm-Spritzenfilter (0,2 &mgr; m Porengröße) und an einem folienbedeckten Spritze in der Dunkelheit.
2. Anesthetize das Tier mit Isofluran. Verwenden Sie 5,0% für die Induktion und 1,5-3,0% für die Wartung. Alternativ könnte eine Mischung von Ketamin (41,7 mg / kg) und Xylazin (2,5 mg / kg) verwendet werden. Narkosetiefe kann durch Zehe Prise Reflex überprüft werdenoberen und unteren Extremitäten.
   1. Weitere Dosen von Ketamin (41,7 mg / kg Körpergewicht) und Xylazin (2,3 mg / kg Körpergewicht) sind in Einheiten von ⅓ der maximalen Dosis Überdosierung zu vermeiden, verabreicht werden. Die Verwendung von einem Nagetier Ventilator wird empfohlen, Xylazin-induzierte Atemdepression entgegenzuwirken.
3. Setzen Sie den narkotisierten Welpen auf seiner dorsalen Seite liegend und sichern Sie den Kopf mit der Kunststoffkegel verwendet werden, um die Narkose (Abbildung 3a) zu liefern.
   1. Sichern Sie das Tier mit Klebeband auf den vorderen Gliedmaßen und Schwanz (Abbildung 3a).
   2. Eine Alternative zum Kopf des Welpen zu sichern, ist eine Kopfplatte an einer Metallstange befestigt zu verwenden.
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass das Heizkissen auf 37 ° C eingestellt ist, Hypothermie (Abbildung 3a) zu vermeiden.
4. Mit einer Schere (Abb. 2b) eine Längs zu machen und vier seitliche Einschnitte auf der Haut über dem Hals (Figur 3b). Mit stumpfen Technik, sezieren die Haut und legen Sie sie beiseite mit einer Pinzette (2c und 3c).
   1. Halten Sie die Haut nach unten mit Klebeband. Stabilisieren Sie den Kopf in eine horizontale Position (Abbildung 3c).
5. Mit Federschere (Abbildung 2d) und stumpfe Technik Push Drüsen-und Fettschichten zur Seite, um die Luftröhre (Abbildung 3c) aus. Ermitteln Sie die Position der Halsschlagadern.
   1. Halten Sie die Halsschlagadern von der Luftröhre.
      Hinweis: Punktion der Halsschlagadern kann zu massiven Blutverlust und Tod der Welpen führen.
6. Mit Federschere (Abbildung 2d) sezieren die Längsmuskeln für den Luftröhre. Schneiden Sie die Längsmuskeln unter der Luftröhre (Abbildung 3d) befindet.
   Hinweis: Die Trachealringe muss deutlich sichtbar (Abbildung 3e) sein.
   1. MitZange (Fig. 2c), binden zwei Stücke Nahtmaterial um die Luftröhre. Ein Stück Faden sichert das Lüftungsrohr und der zweite Thread wird verwendet, um die Luftröhre rostral des Belüftungsrohr Einfügemarke (Abbildung 4a) zu schließen.
      Hinweis: Befeuchten Sie freiliegende Gewebe regelmäßig mit Ringer-Lösung, um eine Austrocknung zu verhindern.
7. Mit Federschere (Abbildung 2d) einen Einschnitt auf einer der Trachealringe zwischen den beiden Themen in Schritt 1.6.1 (Abbildung 4c) platziert entfernt.
   Hinweis: Stellen Sie sicher, dass keine Flüssigkeit in die Luftröhre offen. Flüssigkeit in die Luftröhre wird zum Ersticken.
8. Legen Sie die Intubationstubus (Abbildung 4b) in die Luftröhre, und ziehen Sie den Unterfaden, um es zu sichern. Mit einer Pinzette (Abbildung 2c), ziehen Sie den Oberfaden, um die Luftröhre hinter der Einfügemarke des Intubationstubus schließen.
   1. Anzugsmon und schneiden Sie die Enden der beiden Gewinde (Abbildung 4d-f).
      Hinweis: Vapor innerhalb Intubationstubus ist ein gutes Zeichen für Luftstromregelung.
9. Prompt schalten Sie die Isofluran Versorgung an das Beatmungsgerät. Einstellen des Schlagvolumens und der Luftwechselrate in Abhängigkeit vom Gewicht des Tieres.
   1. Verschließen Sie die ausgesetzt umliegende Gewebe mit Elastomer-(Abb. 5a). Halten Sie die Oberfläche angefeuchtet und sauber.

2. Trachea und Muskelentfernung, die Cranium Expose (5-10 min)

1. Verwenden Frühjahr Schere (Abbildung 2d), um die Luftröhre neben dem Lüftungsrohr geschnitten. Führen zwei Schnitte entlang der Muskelwand der Mundhöhle, die Schwanzende des Gaumens aussetzen (Abbildung 5b).
   Hinweis: Falls erforderlich, verwenden Sie ein cauterizer Blutung zu stoppen. Unkontrollierte Blutungen wird der Tod des Tieres führen.
2. Reinigen Sie dieBereich mit reichlich Ringer-Lösung (Abbildung 5c). Identifizieren Sie die Lücke zwischen dem letzten Wirbel und der Basi-Hinterhauptbein (Abbildung 5d).
   Hinweis: Der Abstand zwischen den Knochen ist eine nützliche Schädelhirnstammstrukturen Wahrzeichen zu finden. Die unteren Olive wird unter diesem Spalt befindet. Der Gehör oberen Olivenkomplex wird unter der Basi-Hinterhauptbein im rostralen Richtung von dieser Lücke befindet (siehe auch Abbildung 1).
3. Reinigen Sie den Bereich mit einer Pinzette (Abbildung 2c) und Feder Schere (Abb. 2d). Nicht durchstoßen Blutgefäße.
   Hinweis: Falls erforderlich, ätzen die Blutung zu stoppen.
   1. Nach der freigelegte Bereich ist frei von Fett-und Muskelgewebe, sollte der Raum Trennung der Basi-Hinterhauptbein und der letzte Wirbel sichtbar (Abbildung 5d) sein.

3. Kraniotomie (15-30 min)

1. Verwenden Sie einen Mikrobohrer oder ein ultraSchallreinigungsmittel. Suchen Sie die mediale Wand der Bulla.
   1. Dünne der Schädel, indem ein umgekehrtes D-Form, bis die zugrunde liegenden Arterien sichtbar (Abbildung 5e) sind.
      Hinweis: Die A. basilaris (bas) läuft auf den Hirnstamm Mittellinie. Der vordere untere Kleinhirnarterie (AICA) Äste bilateral und zuverlässig als Wahrzeichen verwendet werden, da es eine konstante Position in verschiedenen Tieren.
   2. Wenn der Schädel wird ausgedünnt, sanft brechen sie mit einem Präparationsmeißel (Abbildung 2e). Entfernen Sie das Knochenstück mit der Pinzette (Abbildung 2c). Alternativ heben und brechen den Schädel mit einer gebogenen Nadel.
      Hinweis: Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Größe und die Form des Schädel für das geplante Experiment geeignet ist. Die bas aica und sollte durch die Dura-Membran (5f) sichtbar sein.
2. Reinigen Sie den Bereich mehrmals mit frischem Ringer-Lösung. Mit saugfähigen pads Trocknen der Oberfläche der Dura-Membran.
   1. Falls erforderlich, verwenden Sie eine Nähnadel, die Dura Membran ohne Verschieben oder brechen die Wahrzeichen und Arterien bas aica entfernen.
      Hinweis: Nach der Punktion Dura Rückenmarksflüssigkeit fließt aus. Reinigen Sie den Bereich mit Ringer-Lösung und halten Sie während des gesamten Experiments angefeuchteten.

4. Elektrophysiologie Experiment

1. Wählen Sie das polytrode nach Versuchsplanung (Abbildung 7a). Mit einem feinen Pinsel, um den Mantel polytrode mit Dil. Übertragen Sie die Dil-Lösung in eine 1 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, tauchen Sie den Pinsel in die Lösung und sanft schlagen die polytrode unter Sichtführung (dh mit einem Stereoskop). Beginnen an der Spitze der Sonde und sorgfältig fortgesetzt, bis alle Elektroden gleichmäßig beschichtet.
   1. Legen der Masseelektrode in der Mundhöhle. Laden der polytrode in den Elektrodenhalter (7b
   2. Schalten Sie den Verstärker ein und überprüfen Sie, ob alle Verbindungen funktionieren gut.
2. Positionieren Sie die Elektrode über bas am Verzweigungspunkt der AICA (Position Null). Bewegen Sie die Elektrode an der gewünschten Zielpunkt unter Verwendung des entsprechenden rostral-lateralen Koordinate (7c).
   1. Setzen Sie die Elektrode auf der Hirnoberfläche und verschieben Sie sie in die gewünschte Tiefe in Schritten von 5-10 um.
3. Führen Sie die Aufnahme nach experimentelles Design. Daten für weitere Analysen.

5. Zwei-Photonen-Imaging Experiment

1. Einschalten des Mikroskops. Stellen Sie die Anregungswellenlänge und verwenden ein geeignetes Emissionsfilter. Anregung bei 800 nm und einem 607 ± 45 nm Bandpass-Emissionsfilter Arbeit gut für die Abbildung TRITC-Dextran.
2. Identifizieren Sie den rechten oder linken Halsschlagader. Mit stumpfen Technik sezieren die Halsschlagader von den benachbarten Bindegewebe oder Nerven.
   1. Wählen und halten Sie die HalsschlagArterie mit einer Arterienklemme. Binden drei Stücke Naht um die Halsschlagader.
   2. Ziehen Sie den Faden näher an der Herzseite, um den Blutfluss zu stoppen und lassen Sie die anderen zwei Threads lose.
   3. Verwenden einer feinen Schere, einen kleinen Schnitt im 45 °-Winkel an der Halsschlagader zwischen dem Faden gebunden und der nächsten losen Faden zu machen.
      Hinweis: Reinigen Sie das Blut mit saugfähigem Papier.
3. Kanülieren der Halsschlagader. Legen Sie den Schlauch mit TRITC-Dextran-Lösung in den Schnitt an der Halsschlagader ca. 5 mm tief in Richtung Kopf des Welpen orientierte gefüllt.
   1. Ziehen Sie die beiden anderen Themen rund um die Arterie, um den Schlauch und die Arterie zusammen zu halten. Ziehen Sie die Fäden, schneiden und fügen Elastomer weiter zu stabilisieren.
      Anmerkung: Die andere Seite des Schlauchmaterials mit der Spritze mit TRITC-Dextran-Lösung (die in Schritt 1.1 hergestellten) verbunden ist.
4. Befestigen Sie die Spritze auf der Spritzenpumpe.
   1. Setdie Geschwindigkeit, mit der Halsschlagader Blutflussrate der Welpen. Schalten Sie den Spritzenpumpe für ein paar Sekunden und manuell überprüfen, dass die Farbstofflösung in die Halsschlagader injiziert werden. Hinweis: Unter der Annahme, dass der Blutdurchfluss in der Halsschlagader von erwachsenen Ratten (240-280 g) ist etwa 3 ml / min ¹⁴ kann der Blutflussrate für ein Jungtier (zB P10 Welpen mit einem Gewicht von 15-25 g) berechnet werden Bereich von 0,16 bis 0,3 ml / min.
5. Legen Sie das Tier unter dem Mikroskop-Objektiv. Spritzen Sie die fluoreszierenden Dextran in die Blutbahn.
   1. Identifizieren Sie Bereiche von Interesse auf der ventralen Hirnstamm mit einem 5fach-Luft Ziel. Zu einem 20X oder 40X-Objektiv wechseln (Eintauchen in Wasser, NA = 0,5 oder 0,8, respectively), die Region of Interest (ROI) zu konzentrieren.
   2. Starten Bildgebung und passen Sie die Bildaufnahmeparameter (zB Belichtungszeit, Laserleistung, Detektorverstärkung), bis die Fluoreszenzintensität in das Gefäßsystem des ROI optimiert (dhnicht zu niedrig, aber nicht gesättigt).
   3. Schalten Sie den Spritzenpumpe, die Farbstofflösung in die Halsschlagader injiziert und erwerben eine Zeitreihe mit einer festen Brennebene.

6. Animal Care Nach Ordnung

1. Dies ist ein Anschluss Verfahren. Am Ende eines Experiments müssen die Tiere mit einer Überdosis Pentobarbital (100 mg / kg, intraperitoneale Injektion) oder in einem anderen Verfahren der Euthanasie von American Veterinary Medical Association Euthanasie Richtlinien genehmigt eingeschläfert werden.
   Hinweis: Perfusion durch das Herz mit Ringerlösung, gefolgt mit einer Fixierungslösung wird für weitere histologische Analyse empfohlen.

Representative Results

Elektroporation von neuronalen Tracer

Die mediale Kern des Trapezes Körper (MNTB) ist eine Gruppe von Zellen in der oberen Olivenkomplex, der zuvor mit diesem Protokoll untersucht wurde. Zum Beispiel können Patch-Clamp-Pipetten verwendet, um neuronale Tracer Elektroporation (6) ⁹ ist. Wenn Pipetten sind in der Nähe der Mittellinie angeordnet, wie in Fig. 6a gezeigt, ist das Ergebnis, dass decussating afferenten Axone sind markiert. (6b Pfeile in) Ein Zwei-Photonen-Mikroskop mit hoher numerischer Apertur Wasserimmersionsobjektiv ausgestattet, um die Bild verwendet werden die Fasern Erreichen der MNTB, auch sehr feine Seitenlinien. Neuronale Tracer können auch die MNTB direkt zugestellt werden, wie in 6c gezeigt. Das Ergebnis ist die Kennzeichnung von MNTB Zellen und afferenten Axone, wie durch die Abbildung mit einem niedrigeren numerischen Apertur Wasserimmersionsobjektiv (Abb. 6d) geschätzt. Die main Vorteil der Verwendung der geringere Vergrößerung Ziel ist, dass ein breiteres Sichtfeld untersucht werden kann, und auch wenn dies zu einem Rückgang der räumlichen Auflösung aufgrund der geringeren Ziel numerische Apertur, können einzelne Zellen MNTB gut erkennbar (Pfeile in Abb. 6d) . Die durchschnittliche Dauer dieser Experimente für Kinder ab P1-P5 beträgt 3,1 ± 1,4 h (n = 22 Jungtiere).

Elektrophysiologie-Aufnahmen

Spontane Burst-Feuer ist eine Form der Entwicklungs elektrische Aktivität im Einzel MNTB Zellen vor Beginn der Anhörung ^11,13 beobachtet. Unter Verwendung dieses chirurgische Protokoll ist es auch möglich, Multielektrodenarrays (polytrodes) zum MNTB (7a-b) zu erreichen. Das Ergebnis ist eine Aufnahme von spontanen Aktivität in einem Ensemble von MNTB Zellen. 7e zeigt eine repräsentative polytrode Aufnahme von einem P6 Ratte. In diesem Experiment wurde die polytrode mit den lipophilen Farbstoff beschichtet mit DiIein dünner Pinsel (siehe Schritt 4.1). Nach der Durchführung der Aufnahme wurde das Gehirn für die histologische Analyse verarbeitet und die Lage der DiI-markierten polytrode Track wurde verwendet, um zu bestätigen richtigen Ausrichtung auf die MNTB (Abbildung 7d). Die durchschnittliche Dauer der Experimente für Kinder ab P1-P6 ist 2,0 ± 0,7 h (n = 33 Jungtiere).

Messmikrogefäßdurchlässigkeit

Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um Zwei-Photonen-Imaging-Experimenten der vaskulären Permeabilität führen werden. Eine fluoreszierende gelösten (TRITC-Dextran, MW 155 kD, Stokes-Radius ~ 8,5 nm) wurde in 1% BSA-Ringer-Lösung gelöst und in den zerebralen Kreislauf über eine Kanüle in die Halsschlagader ¹⁴ eingespritzt. Im Gegensatz zu Schwanzvene Injektionen, umgeht dieses Verfahren das Herz und führt die gelösten fluoreszierenden direkt in das Gehirn Mikrozirkulation. 8a zeigt die Qualität der Kennzeichnung von Blutgefäßsystem, die aus der Nutzung dieser Verfahren führt. Nach der kontinuierlichenPerfusion von markiertem gelösten Stoffen in die Blutbahn ist es möglich, ein Zeitraffersequenz einer Region von Interesse zu erhalten, wie in 8b gezeigt. Die Gesamtfluoreszenzintensität in der Region von Interesse wurde offline gemessen, und ein mathematisches Modell verwendet, um die Blut-Hirn-Schrankendurchlässigkeit zu bestimmen fluoreszenzmarkierten Solute (8c) ^15. Die durchschnittliche Dauer der Experimente für Kinder ab P9-P10 beträgt 2,3 ± 0,8 h (n = 3 Jungtiere).

A, Seitenansicht des Gehirns. Abbildung 1 b. Relative Lage der ventralen Hirnstammnervenstrukturen in Bezug auf Sehenswürdigkeiten Gefäßsystem bei Neugeborenen Ratte., Bauchansicht des Gehirns. Wichtige Blutgefäße sind rot und Nervenstrukturen von Interesse gezeigt sind indvon Farb-Quadrate icated. Nicht maßstabsgetreu. aica = vorderen unteren Kleinhirnarterie; bas = Basilararterie; ICV = inferior cerebri; mca = A. cerebri media; vert = vertebralis; vsp = ventralen Wirbelsäulenarterie. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Abbildung 2. Surgical-Setup. Ein, kann Chirurgie auf einem kleinen Brot (1) auf einem stabilen Tischplatte ruht geführt werden. Heizkissen (2) und einer kleinen Tierbeatmungsgerät (3) mit dem Steckbrett befestigt werden, um das Bewegen der gesamten Zubereitung, wenn nötig. (4) die Kleintierbeatmungsgerätes kann durch eine Batterie betrieben werden. Ein Magnethalter (5) kann verwendet werden, um die Nase Kegel verwendet werden, um die Narkose zu liefern sichern. Der Nasenkegel kannauch helfen, sichern Sie den Kopf in einer stabilen Lage. Wenn das Tier muss nicht verlegt werden, ein Mikromanipulator (6) in die Position für die Elektrosonden oder neuronale Tracing Experimente eingesetzt werden. Notwendig, Wahrzeichen Strukturen während der Mikrochirurgie. B visualisieren Eine Lichtquelle (7) und ein Stereoskop (nicht im Bild) sind, kleine Schere in Schritt 1.4 verwendet. C sind Pinzetten in Schritten 1.4, 1.6.1, 1.8 und 1.8.1 verwendet . d, spring Scheren werden in Schritten 1.5, 1.6 und 1.7. E verwendet wird, wird seziert Meißel in Schritt 3.1.2 verwendet. Maßstabsbalken in e = 1 mm, gilt für bd. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Abbildung 3. Offenlegen der Luftröhre zur Intubation.ein, wird das Tier betäubt, in der Bauchlage gelegt und mit der Nase Kegel und Band (gestrichelte Linien). b befestigt ist, die Haut schneiden und beiseite gelegt, um die zugrunde liegenden Fettschicht. c, Die darüber liegende Fett-und Drüsen (gezeigt aussetzen in grau) werden beiseite geschoben, um die Luftröhre freizulegen. Das Band wird verwendet, um die darüber liegende Haut (gestrichelte Linien). D zu sichern, ist die Luftröhre von der Muskulatur seziert. E, Visualisierung von Trachealringe zeigt die erfolgreiche Entfernung des darüber liegenden Muskeln. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

4. Intubating das Tier. Ein, zwei Nähfäden (weiße Pfeile) um die Luftröhre gebunden(T). B müssen Intubationstubus (es) fest an der Y-Rohrs des Tieres Ventilator. C verbunden ist, wird eine Tracheostomie zwischen den beiden Nähfäden (schwarzer Pfeil). D Das Lüftungsrohr eingeführt wird, und hat die zwei Nahtfäden werden angezogen. Die Enden der Fäden wieder kreuzweise (durch weiße und schwarze Pfeilspitzen markiert) angezogen. E, sind die Nahtenden gebunden. F, Die Nahtenden zugeschnitten und Intubation abgeschlossen ist. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Abbildung 5. Entfernen der Luftröhre und macht die Kraniotomie. Ein, Die Zubereitung ist mit Elastomer (insi Bereich stabilisiert de grün gestrichelte Linien). B ist die Luftröhre identifiziert und Schnitte werden gemacht, um die erste Luftröhre von der Intubationstubus trennen, und dann die Unterkiefermuskeln (gestrichelte Linien). c schneiden, Reinigen Sie die Oberfläche des Schädels mit stumpfen Technik, um Muskeln zu entfernen und saugfähigem Papier, Fett und Blut. d entfernen, Beispiel einer sauberen Bereich zeigt die letzten Wirbel (v) und der Basi-Hinterhauptbein (bo). Es gibt eine natürliche Lücke zwischen den zwei Knochen (schwarze Pfeile). E, Mit einem Mikrobohrer oder Ultraschallreiniger dünnen der Schädel in einer umgekehrten D-Form (schwarze Pfeile). Brechen Sie vorsichtig die ausgedünnte Schädel und die Knochenstück zu entfernen. Landmark Gefäßsystem sichtbar. F, High-Vergrößerung Ansicht von Gefäß Sehenswürdigkeiten auf dem freiliegenden Hirnstamm-Oberfläche sein. Bas = Basilararterie; aica = vorderen unteren Kleinhirnarterie. Maßstabsbalken in b = 1 mm, gilt für ce.highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Abbildung 6. Elektroporation von neuronalen Tracer. A, A-Glaselektrode, die das neuronale Tracer Mikro Rubin wurde in der Nähe der Mittellinie (roter Kreis) gelegt. Der Tracer wurde mit 7 Sekunden lang -5 uA Impulse geliefert alle 14 Sekunden für 15 Minuten elektroporiert. Nach 1 Stunde wurde die Erholungszeit eingerahmten Bereich mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop abgebildet. P1 Ratte Welpen. B-, Bild-Exemplar z-Stapel von afferenten Axon Kennzeichnung in der MNTB. Pfeile zeigen auf einzelne Nebenzweige. C, A-Glaselektrode mit Mikro-ruby gefüllt war, auf der Oberseite des MNTB (roter Kreis) positioniert. Der Tracer wurde mit einem in die gleichen Einstellungen beschrieben elektroporiert. Nach 1 Stunde Erholungszeit der Box-Bereich warmit einem Zwei-Photonen-Mikroskop abgebildet. P5 Ratte Welpen. D-, Bild-Exemplar Z-Stapel von markierten Zellen und Axone im MNTB. Die Pfeile zeigen die einzelnen MNTB Zellen. Etiketten in b und c zeigen, Objektiv-Vergrößerung und einer numerischen Apertur auf. Scale-Bar in einem und c = 300 um; Maßstab in b = 45 um; Maßstab in d = 90 um. aica = vorderen unteren Kleinhirnarterie; bas = Basilararterie; r = rostral; l = lateral. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Abbildung 7. Gezielte polytrode Aufnahme. Ein, Polytrode besteht aus 4 Schäfte mit 4 Elektroden pro Schaft (schwarze Kreise). Intra-und Inter-Schaftabstände zwischen den Elektroden angegeben. B, C, höhere Vergrößerungsansicht Gefäßwahrzeichen für polytrode Targeting eingesetzt. Die polytrode wird mit rostral-lateralen Koordinaten an den medialen Kern des Trapezkörpers (roter Kasten). D, Post-hoc-Analyse zeigt histologische korrekte Ausrichtung der Dil-beschichteten polytrode Ziel (polytrode Spur ist rot dargestellt) positioniert ist. E, Exemplar Mehr -Einheit Aufnahme. Trace Reihenfolge ist die gleiche wie Elektrode, um in ein Panel. Im Schaft Aufnahmen haben die gleiche Farbe. Maßstabsbalken in E = 5 Sekunden. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Abbildung 8. In vivo Zwei-Photonen-Imaging von Gehirnmikrogefäßen. a, 2-D (klappt Z-Stapel) von Hirngefäßsystem nach Perfusion des TRITC-Dextran-155 kD in der Halsschlagader. Die Fläche abgebildet ist ähnlich zu der in Fig. 7c dargestellt. 20x/0.5 Wasserimmersionsobjektiv. P10 Ratte Welpen. B, Region of Interest (ROI), die zur Fluoreszenzintensität (roter Rahmen umschlossenen Bereich) zu messen. Die Mikrogefäß hatte einen Durchmesser von ca. 14,2 um und wurde 182 &mgr; m unter der Oberfläche des Hirnstamms. C, typische Kurve der Fluoreszenzintensität (normierter Wert) als Funktion der Zeit entfernt. I ₀ ist der Schritt Anstieg der Fluoreszenz-Intensität in der ROI, wenn die Fluoreszenzlösung füllt gerade das Gefäßlumen. (DI / dt) ₀ und I ₀ verwendet, um die Mikrogefäßdurchlässigkeit, um den gelösten Stoff zu bestimmen. Die Durchlässigkeit für TRITC-Dextran 155 kD berechnet auf 1,5 x 10 ^-7 cm / sec.Maßstabsbalken in b = 100 um, gilt ein. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Discussion

Die Zeit ist entscheidend. Ein erfahrener Forscher sollten in der Lage, dieses Protokoll in 1 Stunde abgeschlossen werden (Schritte 1-3). Die für die verschiedenen Schritte erklärt mal davon eine mittlere bis hohe Kompetenz. Die richtige und rechtzeitige Intubation und Tracheotomie sind kritisch, da schlechte Belüftung Kontrolle kann zu Erstickung und Tod des Tieres führen. Sorgfältige Clearance von Muskel-und Fettgewebe ist auch sehr wichtig, denn Fehler können zu unkontrollierten Blutungen und zum Tod des Tieres führen. Ebenso, wenn die Vorbereitung der Halsschlagader für die Kanüle Insertion, muss man vorsichtig anziehen und schneiden die Arterie, wenn der Thread Knoten wird locker unkontrollierte Blutungen stattfinden wird. Schließlich sollte die Kraniotomie sorgfältig gemacht werden, ohne die Gefäß Sehenswürdigkeiten stören. Careless Entfernung der externen Hirnhautschicht (Dura) kann zu schweren Blutungen und Schäden an der arterielle Versorgung führen.

Beatmungseinstellungen sind nach dem Alter des Tieres gewählt.Die meisten kommerziellen Anbieter nützliche Informationen über solche Einstellungen. Experimente an Ratten, die älter als P15 wird die Verwendung einer großen Tierbeatmungsgerät benötigen. Erwachsene Tiere können nicht Belüftung benötigen, wenn mit Ketamin / Xylazin, aber Intubation wird empfohlen, die Flüssigkeit in die Luftröhre zu vermeiden.

Eine Hauptbeschränkung dieses Protokolls ist, dass Experimente nur akut durchgeführt werden. In unserem Labor haben wir Experimente mit einer Dauer von zwei bis zehn Stunden durchgeführt. Eine zweite Einschränkung ist, dass Experimente wurden unter Vollnarkose durchgeführt werden. Daher ist die Wahl der Betäubung eine wichtige Variable bei der Planung und Gestaltung der Experimente zu betrachten. Ein ähnliches Problem ist, dass Neugeborene Tiere können besonders empfindlich auf eine Überdosierung sein. Zum Beispiel, wenn die Wahl Ketamin / Xylazin-Mix, die Berechnung der Dosis bezogen auf das Gewicht der Welpen und zu verwalten, Medikamente zu ⅓ der maximalen Lautstärke. Überprüfen Sie den Zustand des Tieres alle 5-10 Minuten mit dem Fuß Prise response. Bei Verwendung von Isofluran, sind Vorsichtsmaßnahmen auch notwendig, um eine sichere Umgebung für die Ermittler (richtige Belüftung und eine richtig kalibriert Verdampfer) zu halten.

Das Stereomikroskop kann auf einem flexiblen Halter Betrachtungswinkel einzustellen und Lückenzwischenraum zu erleichtern, um die Elektroden und die Verlagerung des Tieres auf das Zwei-Photonen-Mikroskop Stelle montiert werden. Die Verwendung eines Akkus, um den Ventilator einschalten können, erleichtern das Tier bewegt und elektrische Artefakte während der elektrophysiologischen Experimente zu reduzieren. Zu diesem Zweck kann ein kleines Steckbrett (7,5 x 12 Zoll) verwendet, die zusammen Ventilator, Heizkissen und der narkotisierten Tier (Abbildung 2a) zu montieren werden. Eine nützliche und wichtige Änderungen an dieser Konfiguration ist die Zugabe einer Vorrichtung zur Überwachung der Vitalfunktionen während der Operation. Ein Oxymeter oder anderen analogen Geräten in Abhängigkeit von der Labor Haushalt verwendet werden.

Dieses Protokoll wurde mit Elektrophysiologie und Bildgebung erfüllt eingesetztTragmulden, einschließlich Patch-Clamp-Aufnahmen ^8,10,11, polytrode Aufnahmen (Figur 7), und der Zwei-Photonen-Bildgebung ⁹ (Fig. 6 und 8). Eine mögliche zukünftige Anwendung wäre es, diese Methoden für die Ausrichtung fluoreszenzmarkierten Zellen für elektrophysiologische Aufnahme ¹⁶ zu kombinieren.

Neue Imaging-Anwendungen kann auch 2-D oder 3-D-Zeitreihe mit Zwei-Photonen-Mikroskopie. Beispielsweise unter Verwendung von Calcium-Bolus Ladeindikatoren, die Aktivität des Hirnstamms neuronalen und glialen Zellpopulationen zu untersuchen. Wie in Fig. 8 gezeigt ist, eingespritzt wird eine Farbstofflösung in den Blutkreislauf durch die Halsschlagader verwendet werden, um Bilder mit hohem Kontrast von Hirngefäßsystem zu erzeugen. Da der Fluoreszenzfarbstoff füllt die Mikrogefäßlumen und breitet sich in das umgebende Gewebe, kann es nicht nur zur Berechnung der scheinbaren gelösten Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke, sondern auch die Diffusion gelöster Stoff verwendet werden COEFreichend in das Hirngewebe ^3. Ein Hauptgrund für die Injektion der fluoreszenzmarkierten gelösten Stoffen über die Halsschlagader ist, dass die Farbstofflösung kann direkt zu den Mikrogefäßen im Gehirn zu gehen, ohne zuerst auf das Herz in einer Injektion in die Schwanzvene. Das bringt zumindest zwei Vorteile. Einer ist, dass die Fluoreszenzfarbstoffkonzentration in der Mikrogefäßlumen kann praktisch konstant sein, wenn die Durchblutungsrate in der Kanülierungsstelle befestigt. Dies gewährleistet eine genaue Bestimmung der Blut-Hirn-Schranken-Permeabilität. Ein weiterer Grund ist, dass, wenn ein Testmittel im Perfusat enthalten ist, wird es direkt an der Blut-Hirn-Schranke zu gehen, ohne verdünnt oder mit anderen Faktoren von dem Körperkreislauf in Verbindung.

Neue Experimente können auch Vorteil von transgenen Tieren, die mit genetisch kodierten Fluoreszenz Reportern zu nehmen. Dies hätte den Vorteil, dass fluoreszierende Sonden müssten nicht in situ geladen werden kann (es sei denn, das Design des Experimentsbesagt nichts anderes), das spart Zeit und vielleicht so für mehr intakt Zubereitungen (z. B. Hirn Fenster ^17).

Schließlich können Experimente in anderen Hirnstammregionen wie die unteren Olive oder Nucleus facialis erfolgen. Das Wissen über die Neuroanatomie und die Entwicklung von spezifischen Zellpopulationen in einer bestimmten Art werden zu diesem Zweck von Bedeutung sein, insbesondere da anatomische Landmarken kann sich ändern, wie die Tiere wachsen (Abbildung 1). Wir hoffen, dass dieses Protokoll ermutigt andere, ventralen Hirnstammstrukturen in vivo Studie mit elektrophysiologischen und bildgebenden Verfahren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbant pads	Kettenbach	Sugi 31603	Other options may be available from different companies
Cautery	Braintree Scientific, INC	GEM 5917	Other options may be available from different companies
Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran	Sigma	T1287-500MG	Other options may be available from different companies
Dissecting Chisel	Fine Science Tools	10095-12	Other options may be available from different companies
DiI	Invitrogen	V-22885	Other options may be available from different companies
Elastomer	World Precision Instruments	KWIK-SIL	Other options may be available from different companies
Fine Scissors	Fine Science Tools	14060-09	Other options may be available from different companies
Forceps	Fine Science Tools	11027-12,11617-12, 11616-16	Other options may be available from different companies
Spring Scissors	Fine Science Tools	15009-08	Other options may be available from different companies
Heating pad	FHC	40-90-2	Other options may be available from different companies
Intubation tubing	Braintree Scientific, INC	BIO CO-KIT	Choose age appropriate size
Light source	Spach Optics	Schott Ace illuminator	Other options may be available from different companies
Micro drill	Braintree Scientific, INC	MD-1200 120V	Other options may be available from different companies
Paper tape	Walgreens	Generic brand	Other options may be available from different companies
Syringe filter	VWR	28145-483	Other options may be available from different companies
Syringe pump	VWR	52459-008	Other options may be available from different companies
Stereomicroscope	Olympus	SZ61	Other options may be available from different companies
Suture	Ethicon	Prolene 86979	6-0 size
Tubing	Braintree Scientific, INC	Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120	Other options depending on pup’s age
Vaporizer (isoflurane)	Vetequip Incorporated	911103	Other options may be available from different companies
Ventilator (minivent)	Harvard Apparatus	730043	Use for P0-P12 rats