Summary
Хирургический метод описан разоблачить брюшной череп в новорожденных крыс. Используя этот подход, можно открыть трепанации черепа для выполнения острый электрофизиологии и двухфотонные эксперименты микроскопии в стволе мозга анестезированных щенков.
Abstract
Использование трепанации черепа для естественных условиях экспериментов в предоставляет возможность исследовать динамику различных клеточных процессов в мозге млекопитающих в зрелом возрасте и во время развития. Хотя большинство естественных условиях подходы в использовании трепанации черепа для изучения участки мозга, расположенные на спинной стороне, ствола мозга такие регионы, как моста, расположенных на брюшной стороне остаются относительно изученной. Основная цель этого протокола заключается в облегчении доступа к вентральной стволовых структур, чтобы они могли быть изучены в естественных условиях с использованием электрофизиологических и методы воображения. Такой подход позволяет изучение структурных изменений в аксонов большой дальности, моделей электрической активности в одной и ансамблей клеток и изменения в крови мозга барьер проницаемости в новорожденных животных. Хотя этот протокол был использован в основном для изучения слуховой ствол мозга в новорожденных крыс, он может быть легко адаптирована для исследований в других видов грызунов, таких как новорожденных мышей, взрослого РоденTS и других регионов мозга.
Introduction
Использование трепанации черепа в сочетании с флуоресцентной визуализации и методов электрофизиологии позволяет поток мониторирование артериального, через гематоэнцефалический барьер, и измерения активности нейронов и глиальных клеток в живых животных 1-3. Несколько лабораторий использовали этот подход для обеспечения понимания в физиологии мозга у здоровых и болезненных условий, но пробелы в нашем понимании того, как эти процессы возникают в процессе разработки. Кроме того, большинство исследований были сосредоточены на областях мозга, которые легко доступны из спинной поверхности черепа, так что брюшные стволовых структур с разнообразными физиологической роли были изучены в основном используя Экс Vivo подходы.
Основная цель настоящего Протокола заключается в создании способа открытия трепанацию черепа на брюшной черепа грызунов. Этот подход был адаптирован из классических исследований, проведенных в более крупных млекопитающих, таких как собаки и кошки для сенсорных нейрофизиологии RECOrdings слухового ствола мозга 4-7. В этом протоколе однако, есть новый вызов выполнении операции в новорожденных животных. Использование сосудистой ориентиры, это адаптировать протокол был использован ранее для изучения слуховой ствола мозга новорожденных крыс, взрослых мышей и других регионов стволовых как нижней оливы 8-11 (рис. 1).
Главное преимущество брюшной трепанации черепа по сравнению с существующими методами для изучения брюшной ядра ствола мозга является то, что он обеспечивает прямой доступ к структурам, представляющим интерес в живых животных. Например, слуховые клетки верхнем оливарном комплекса локализованы несколько десятков микрометров от поверхности мозга, что очень важно для целевого размещения зондов и для использования подходы изображений двухфотонного в котором глубина визуализации могут быть ограничены до 0,5 мм по рассеяния света ткани и поглощения. Вентральной трепанация черепа также обеспечивает подготовку с относительно нетронутых нервных связей, белыйич нарушается при острых и органотипических препаратов срезов 12. В отличие от других протоколов для в естественных условиях экспериментов нейрофизиологии 13, вентральный подход может сочетаться с записи многоэлектродной и методов визуализации, которые предоставляют информацию о сотовых ансамблей (рис. 6 и 7). Наконец, в сочетании с этим протоколом флуоресцентно меченных растворенного вещества могут быть введены в сосудистой чтобы измерить изменения в гематоэнцефалический барьер, в растворенного вещества (рис. 8).
Protocol
Следующий протокол следует руководству по уходу за животными, установленные на уходу и использованию животных комитета институционального (IACUC) в Городском колледже Нью-Йорке.
1. Животных интубации (10-20 мин)
- До операции, подготовить млекопитающих раствор Рингера. Соберите хирургические инструменты, грелку и небольшая животноводческая вентилятор на скамейке (рис. 2).
- Для измерения через гематоэнцефалический барьер, сделать 10 мл 1% бычьего сывороточного альбумина раствор (BSA) в Ringer и растворить TRITC-декстран 155 кД в 8 мг / мл в 1%-ном растворе БСА, фильтр раствора с 25 мм шприцевой фильтр (0,2 мкм размер пор) и хранить в шприце фольги, покрытой в темноте.
- Обезболить животное с помощью ИФ. Используйте 5,0% для индукции и 1.5-3.0% для технического обслуживания. Альтернативно смесь кетамина (41,7 мг / кг) и ксилазина (2,5 мг / кг массы тела) могут быть использованы. Глубина анестезии можно проверить ног пинч рефлексаверхних и нижних конечностей.
- Последующие дозы кетамина (41,7 мг / кг массы тела) и ксилазина (2,3 мг / кг массы тела) следует вводить с шагом ⅓ от максимальной дозы, чтобы избежать передозировки. Использование грызунов вентилятора рекомендуется, чтобы противодействовать ксилазина индуцированных дыхания.
- Поместите наркозом щенка, лежа на его спинной стороне и закрепите его голову с пластиковой конуса используется для доставки анестетика (рис. 3а).
- Закрепите животное с помощью клейкой ленты на передних конечностях и хвосте (рис. 3а).
- Альтернативой обеспечить голову щенка является использование головы табличку, прикрепленную к металлическим прутом.
Примечание: Убедитесь, что грелку установлен на 37 ° С, чтобы избежать переохлаждения (рис. 3а).
- Используйте ножницы (рис. 2, б), чтобы сделать один продольный и четыре боковые разрезы на коже, покрывающий шею (Рис. 3б). Использование тупой технику, рассекают кожу и поместить его в сторону с помощью щипцов (рис. 2в и 3в).
- Держите кожу вниз с помощью клейкой ленты. Стабилизация головку в горизонтальном положении (фиг. 3c).
- Использование пружинных ножниц (рис. 2d) и тупой технику, нажмите желез и жировых слоев в сторону, чтобы выставить в трахею (рис. 3в). Определить местоположение сонных артерий.
- Держите сонные артерии от трахеи.
Примечание: прокалывание сонных артерий может привести к массивной кровопотери и смерти щенка.
- Держите сонные артерии от трахеи.
- Использование пружинных ножниц (рис. 2, г) рассекают продольные мышцы, покрывающие трахеи. Вырезать продольные мышцы, расположенные под трахеи (рис. 3d).
Примечание: кольца трахеи должны быть четко видны (рис. 3e).- Использованиещипцы (рис. 2в), связать две части шва вокруг трахеи. Одна часть шва обеспечит вентиляционную трубу и второй поток будет использоваться, чтобы закрыть трахеи Ростральные к точке ввода вентиляции трубы (рис. 4а).
Примечание: Смочите подвергаются ткани регулярно раствором Рингера, чтобы предотвратить обезвоживание.
- Использованиещипцы (рис. 2в), связать две части шва вокруг трахеи. Одна часть шва обеспечит вентиляционную трубу и второй поток будет использоваться, чтобы закрыть трахеи Ростральные к точке ввода вентиляции трубы (рис. 4а).
- Использование пружинных ножниц (рис. 2, г) сделать надрез на одном из трахеи колец, расположенных между двумя потоками, размещенных в шаге 1.6.1 (рис. 4в).
Примечание: Убедитесь, что жидкость не попадает в открытую трахею. Жидкость в трахее вызовет удушье. - Вставьте интубации трубки (рис. 4б) в трахею и затяните нижнюю нить, чтобы закрепить его. Использование щипцов (рис. 2в), натяжение верхней нити, чтобы закрыть трахеи кзади от точки вставки интубации трубки.
- Tighteп и обрезать концы двух нитей (рис. 4d-е).
Примечание: пара внутри интубации трубки является хорошим признаком управления воздушным потоком.
- Tighteп и обрезать концы двух нитей (рис. 4d-е).
- Оперативно переключить подачу ИФ к вентилятору. Регулировка ударного объема и расхода воздуха в зависимости от веса животного.
- Закройте открытую окружающие ткани с эластомера (рис. 5а). Держите поверхность смоченной и чистый.
2. Трахеи и мышц Переезд в Expose черепа (5-10 мин)
- Используйте пружинные ножницы (рис. 2d) сократить трахею, прилегающей к вентиляционной трубе. Выполнение два разреза вдоль мышечной стенке ротовой полости, чтобы обнажить хвостовой конец вкус (фиг. 5b).
Примечание: При необходимости, использовать cauterizer, чтобы остановить кровотечение. Неконтролируемое кровотечение может привести к смерти животного. - Очиститеплощадь используя обильное количество раствора Рингера (Рисунок 5в). Определите разрыв между последней позвонков и Basi-затылочной кости (рис. 5d).
Примечание: Разрыв между костями является полезным череп вехой для поиска стволовых структур. Уступает оливковое находится под этот пробел. Слуховой превосходит овальный комплекс расположен под Basi-затылочные кости в ростральной направлении от этого разрыва (см. также рисунок 1). - Очистите область с помощью щипцов (рис. 2в) и весенние ножницы (рис. 2, г). Не прокола кровеносные сосуды.
Примечание: При необходимости, прижигать, чтобы остановить кровотечение.- После того, как подвергается поверхность чистая жира и мышечной ткани, пространство отделения Basi-затылочную кость и последний позвонок должен быть виден (рис. 5d).
3. Краниотомия (15-30 мин)
- Используйте microdrill или ультразвуковая моющее. Найдите медиальной стенки буллы.
- Тонкий череп, сделав перевернутый D форму, пока основные артерии не могут видеть (рис. 5e).
Примечание: основной артерии (бас) работает на верхней части ствола мозга средней линии. Передней нижней мозжечковой артерии (AICA) отделения двусторонней и может быть надежно использованы в качестве ориентира, поскольку оно имеет постоянное положение в различных животных. - Когда череп тоньше, мягко разорвать его помощью рассекает долото (рис. 2е). Снимите кости кусок щипцами (рис. 2в). С другой стороны, поднимать и сломать череп, используя изогнутую иглу.
Примечание: Повторите эту процедуру до тех пор, размер и форма краниотомии не подходит для запланированного эксперимента. Барельеф и AICA должны быть видны через твердую мембрану (рис. 5е).
- Тонкий череп, сделав перевернутый D форму, пока основные артерии не могут видеть (рис. 5e).
- Очистите область несколько раз со свежим раствором Рингера. Использование абсорбирующего годовыхDS высушить поверхность твердой мозговой оболочки.
- Если необходимо, используйте шовный иглу для удаления твердую мозговую оболочку не сворачивая или нарушение ориентир артерии бас и AICA.
Примечание: При длительность прокалывания спинномозговую жидкость вытечет. Очистите область с раствором Рингера и держать увлажненной в течение всего эксперимента.
- Если необходимо, используйте шовный иглу для удаления твердую мозговую оболочку не сворачивая или нарушение ориентир артерии бас и AICA.
4. Электрофизиологии Эксперимент
- Выберите polytrode в соответствии с дизайном эксперимента (рис. 7а). Используйте тонкую кисть, чтобы покрыть polytrode с DiI. Перенесите раствор Dii в 1 мл трубки микроцентрифужных, опустите кисть в растворе и аккуратно нанести polytrode под визуальным руководством (то есть с использованием стереоскоп). Запуск на кончике зонда и тщательно продолжают до тех пор, пока все электроды покрыты равномерно.
- Поместите заземляющий электрод внутри полости рта. Загрузите polytrode в держатель электрода (рис. 7б
- Включите усилитель и проверьте, что все соединения хорошо работать.
- Расположите выше барельеф электрод на точки ветвления AICA (положение нуля). Перемещение электрода на нужную целевую точку с помощью соответствующего ростральной-поперечной координаты (рис. 7с).
- Поместите электрод на поверхности мозга и переместить его на нужную глубину с шагом 5-10 мкм.
- Выполните запись в соответствии с экспериментальной конструкции. Сохранить данные для дальнейшего анализа.
5. Двухфотонное изображений Эксперимент
- Включите микроскопом. Установите длины волны возбуждения и использовать соответствующий фильтр выбросов. Возбуждение при 800 нм и 607 ± 45 нм полосовой фильтр выбросов хорошо работать для визуализации TRITC-декстран.
- Определите правую или левую сонную артерию. Использование тупой метод препарировать сонной артерии от соседних соединительных тканей или нервов.
- Выберите и удерживайте соннойартерии с кровоостанавливающего. Свяжите три части шва вокруг сонной артерии.
- Затянуть нить ближе к сердечной стороне, чтобы остановить поток крови и оставить две другие темы, свободно.
- Используйте тонких ножниц сделать небольшой надрез под углом 45 ° на сонной артерии между привязанной резьбой и следующей нитку.
Примечание: Очистите кровь с фильтровальной бумаги.
- Иглу сонную артерию. Вставьте трубку, заполненную с TRITC-Декстрана в разрез на сонной артерии около 5 мм в глубину, ориентированной на голову щенка.
- Затянуть две другие темы, вокруг артерии провести трубку и артерию вместе. Затянуть темы, отделка и добавить эластомера для дальнейшей стабилизации.
Примечание: На другой стороне трубки соединен с шприц, содержащий TRITC-декстрана раствор (полученного на стадии 1.1).
- Затянуть две другие темы, вокруг артерии провести трубку и артерию вместе. Затянуть темы, отделка и добавить эластомера для дальнейшей стабилизации.
- Закрепите шприц на шприцевой насос.
- Наборскорость при скорости потока крови сонной артерии на щенка. Включите шприцевой насос на несколько секунд и проверить вручную, что раствор красителя может быть введен в сонной артерии. Примечание: Если предположить, что скорость кровотока в сонной артерии взрослых крыс (240-280 г) составляет около 3 мл / мин 14, скорость потока крови на крысиной щенка (например, P10 щенок весом 15-25 г) может быть рассчитана с Диапазон от 0.16-0.3 мл / мин.
- Место животное под объектив микроскопа. Введите флуоресцентный декстран в кровоток.
- Определить области, представляющие интерес на брюшной мозга с воздуха цели 5X. Переключение на 20-кратным или 40-кратном цели (погружение в воду, NA = 0,5 или 0,8 соответственно), чтобы сосредоточиться область интереса (ROI).
- Начните изображений и настраивайте параметры получения изображений (время например, воздействие, мощность лазера, увеличение детектор) до интенсивности флуоресценции в сосудистой системе ROI оптимизирован (т.е.не слишком низкое, но не насыщенный).
- Включите шприцевого насоса для введения раствора красителя в сонную артерию и получить временной ряд при фиксированной фокальной плоскости.
6. Уход животных следующую процедуру
- Это процедура терминал. В конце эксперимента животных должны быть умерщвлены с повышенной дозы фенобарбитала (100 мг / кг, внутрибрюшинно инъекции) или любой другой метод эвтаназии, утвержденной Американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации эвтаназии принципов.
Примечание: перфузии через сердце с раствором Рингера следуют с фиксирующим раствором рекомендуется для дальнейшего гистологического анализа.
Representative Results
Электропорацию нейронных индикаторов
Медиальное ядро тела трапеции (MNTB) является группа клеток в верхнем оливарном комплекса, которые были изучены ранее с помощью этого протокола. Например, патч зажим пипетки может быть использован для электропорации нейронных индикаторов (рис. 6) 9. Когда пипетки расположены вблизи средней линии, как показано на рисунке 6а, в результате чего перекрещивание афферентные аксоны помечены. Двухфотонного микроскопа оснащен высокой числовой апертурой глубоководное погружение цели могут быть использованы для изображения волокна, достигающие MNTB, в том числе очень мелких побочных ветвей (стрелки на рис 6, б). Нейронные индикаторы также могут быть доставлены в MNTB непосредственно, как показано на рисунке 6c. В результате маркировки клеток и MNTB афферентных аксонов, как можно видеть на изображений с более низким числовой апертурой воды иммерсионный объектив (рис. 6d). МAin Преимущество использования меньшем увеличении цель состоит в том, что более широкий угол обзора могут быть рассмотрены, и хотя это приводит к снижению пространственной разрешающей из-за более низкой объективной числовой апертурой, отдельные MNTB клетки могут быть обнаружены хорошо (стрелки на фигуре 6d) . Средняя продолжительность этих экспериментов для возрастов P1-P5 составляет 3,1 ± 1,4 ч (п = 22 щенков).
Электрофизиологии записи
Спонтанное взрыв стрельба является одной из форм развития электрической активности наблюдается в единичных клетках MNTB до наступления слуха 11,13. Используя этот протокол хирургического можно также целевой многоэлектродного массивов (polytrodes) к MNTB (фиг.7а-B). Результатом является запись спонтанной активности в ансамбле MNTB клеток. Рисунок 7e показывает, представитель запись polytrode от P6 крысы. В этом эксперименте, polytrode была покрыта с DiI липофильных красителей с помощьютонкая кисть (см. шаг 4.1). После выполнения записи мозг был обработан для гистологического анализа и расположение DiI-меченого polytrode дорожке была использована, чтобы подтвердить правильный ориентации в MNTB (рис. 7d). Средняя продолжительность экспериментов на века P1-P6 составляет 2,0 ± 0,7 ч (п = 33 щенков).
Измерение микрососудов проницаемость
Этот протокол также может быть использован для выполнения двухфотонных эксперименты визуализации сосудистой проницаемости. Флуоресцентный растворенное вещество (TRITC-декстрана, МВт 155 кДа, радиус Стокса ~ 8,5 нм) растворяли в 1%-ном растворе БСА Рингера и вводят в мозгового кровообращения через канюлю, вставленную в сонной артерии 14. В отличие от хвостовой вены инъекций, эта процедура обходит сердце и вводит флуоресцентный растворенное вещество непосредственно в микроциркуляции головного мозга. На рисунке 8а иллюстрирует качество маркировки сосудистой крови, возникший из-за использования этой процедуры. После непрерывногоперфузии меченых растворенных веществ в поток крови можно получить покадровой последовательности интересующей области, как показано на рисунке 8b. Общая интенсивность флуоресценции в области, представляющей интерес был измерен в автономном режиме и математическая модель используется для определения через гематоэнцефалический барьер, в флуоресцентно меченных растворенные вещества (рис. 8c) 15. Средняя продолжительность экспериментов на века P9-P10 составляет 2,3 ± 0,8 ч (N = 3 щенков).
Рисунок 1. Относительная расположение брюшных стволовых нервных структур по отношению к сосудистой ориентиров в новорожденных крыс., Боковой вид на мозг. Б, вид снизу мозга. Основные кровеносные сосуды, выделенные красным и нервных структур, представляющих интерес, индвыделенному на цветных квадратов. Не в масштабе. AICA = передняя нижней мозжечковой артерии; барельеф = основной артерии; ICV = уступает церебральный вены; MCA = средней мозговой артерии; верт = позвоночной артерии; VSP = вентральной спинномозговой артерии. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. Хирургическое установки., Хирургия может быть сделано на небольшом борту хлеб (1) покоится на верхней части устойчивой поверхности стола. Грелку (2) и небольшое животное вентилятор (3) может быть прикреплен к борту хлеб, чтобы облегчить перемещение весь препарат при необходимости. Зверек вентилятор может питаться от батареи (4). Магнитный держатель (5) может быть использован для фиксации носовой конус, используемый для доставки анестезии. Носовой конус можеттакже поможет обеспечить головой в устойчивом положении. Если животное не должны быть перемещены, микроманипулятор (6) может быть использован для позиционирования зондов для электрофизиологических экспериментов или нейронных трассировки. Источник света (7) и стереоскоп (нет на фото) необходимы для визуализации знаковые структуры во микрохирургии. Ъ, Маленькие ножницы используются в шаге 1.4. С, щипцы используются с шагом 1.4, 1.6.1, 1.8 и 1.8.1 . д, пружинные ножницы используются с шагом 1,5, 1,6 и 1,7. е, рассечения долото используют на стадии 3.1.2. Бар Масштаб в е = 1 мм, относится к BD. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 3. Разоблачение трахею для интубации., Животное находится под наркозом, помещены в лежачем положении и закрепляется носового конуса и ленты (пунктирные линии). б, Кожа разрезают и помещают в сторону, чтобы разоблачить, лежащую в основе жировой слой. с, перекрывающий жира и желез (показано серым цветом) оттесняются подвергать трахеи. Лента используется для защиты лежащего кожу (пунктирные линии). Г, трахеи рассечена от мускулатуры. Э, Визуализация трахеи колец указывает на успешное удаление покрывающей мышцы. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 4. Интубирование животное., Два шовные нити (белые стрелки) привязаны вокруг трахеи(Т). Б, интубация трубка (она) должен быть тесно связан с у трубки животного вентилятора. С, трахеостомия производится между двумя шовных нитей (черная стрелка). Г, вентиляция труба вставлена и две шовные нити затягиваются. Концы нитей снова затянуты в скрещенном моды (обозначается белыми и черными стрелками). Е, шовные окончаний связаны. Е, шовный окончаний обрезаются и интубация завершена. Нажмите сюда, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 5. Удаление трахею и сделать трепанацию черепа., Препарат стабилизированный эластомер (площадь ИНСИ де зеленый пунктир). б, трахеи идентифицируется а затем разрезы делаются сначала отделить трахею от интубации трубки, а затем сократить нижней челюсти мышцы (пунктирные линии). грн, Очистите поверхность черепа с помощью тупой техника для удаления мышцы и использовать фильтровальной бумагой для удаления жира и крови. д, Пример чистой зоне показывает последний позвонков (V) и Баси-затылочной кости (Bo). Существует естественный разрыв между двумя костями (черные стрелки). Е, Использование microdrill или ультразвуковой моющее тонкий череп в перевернутом виде D (черные стрелки). Аккуратно разбить разбавленной череп и удалить часть кости. Ориентир сосудистую должны быть видны. Е, высокого увеличения вид сосудистых ориентиров на открытой поверхности ствола мозга. Бас = основной артерии; AICA = передняя нижней мозжечковой артерии. Бар Масштаб в б = 1 мм, относится к се.highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 6. Электропорацию нейронных индикаторов., Стеклянный электрод, содержащий нейронной трассирующими микро-рубин находился вблизи средней линии (красный круг). Трассирующими электропорировали помощью 7 секундные импульсы долго -5 мкА доставлен каждые 14 секунд в течение 15 минут. После 1 часа времени восстановления коробку площадь был сфотографирован с двухфотонного микроскопа. P1 крысят. Б, Exemplar Z-Stack образ афферентного аксона маркировки в MNTB. Стрелки указывают на отдельных ветвей коллатеральных. С, стеклянный электрод наполнен микро-рубина была расположена на верхней части MNTB (красный окружности). Трассирующими электропорировали используя те же параметры, описанные в. После 1 часа времени восстановления коробку область былаполученную с использованием двухфотонного микроскопа. P5 крысят. Д, Exemplar Z-Stack образ меченых клеток и аксонов в MNTB. Стрелки указывают отдельные клетки MNTB. Этикетки в в и с показывают объективную увеличение и числовую апертуру, соответственно. Бар Масштаб в и с = 300 мкм; бар шкала в б = 45 мкм; бар шкала в D = 90 мкм. AICA = передняя нижней мозжечковой артерии; барельеф = основной артерии; г = ростральная; л = боковая. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 7. Целевые запись polytrode., Polytrode состоит из 4 хвостовиков с 4 электродами на хвостовиком (черные кружки). Intra-и меж-хвостовиком расстояния между электродами указаны. Б, С, при большем увеличении ориентиров сосудистой используемых для ориентации polytrode. Polytrode позиционируется с помощью ростральной-боковые координаты целевой медиальной ядро трапециевидного тела (красное поле). Д, Posthoc гистологический анализ показывает правильное нацеливание на polytrode DiI покрытием (polytrode трек отображается красным цветом). Е, Exemplar мульти -блок регистрации. Порядок трассировки такая же, как электрода порядка в панели а. В хвостовиком записей имеют тот же цвет. Бар Масштаб в е = 5 секунд. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 8. В естественных условиях двухфотонного визуализации микрососудов головного мозга. , 2-D изображений (рухнул Z-Stack) из головного мозга сосудистой после перфузии TRITC-декстрана 155 кД в сонной артерии. Область отображаемого аналогичен тому, который показан на рисунке 7с. 20x/0.5 погружением в воду цель. P10 крысят. Б, область интереса (ROI) используется для измерения интенсивности флуоресценции (красная рамка заключены область). Микрососудов имел диаметр ~ 14,2 мкм и был расположен 182 мкм ниже поверхности ствола головного мозга. С, типичную кривую интенсивности флуоресценции (нормированное значение) в зависимости от времени. Я 0 является увеличение шагом в интенсивности флуоресценции в ROI, когда fluoresence решение просто заполняет просвет сосуда. (Ди / ТД) 0 и I 0 используются для определения проницаемости микрососудов в растворенного вещества. Проницаемость для TRITC-декстран 155 кДа была рассчитана на 1,5 х 10 -7 см / с.Бар Масштаб в Ь = 100 мкм, относится к. Щелкните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Discussion
Время имеет решающее значение. Опытный исследователь должен иметь возможность завершить этот протокол в течение 1 часа (шаги 1-3). Времена, установленные для различных этапов предположить среду высокого уровня знаний. Правильное и своевременное трахеотомия и интубация имеют решающее значение, так как слабый контроль вентиляции может привести к удушению и гибели животного. Тщательное оформление мышечной и жировой тканей также очень важно, поскольку ошибки могут привести к неконтролируемому кровотечению и гибели животного. Точно так же, при подготовке сонную артерию для вставки канюли, нужно затянуть и сократить артерию тщательно, если поток узел становится свободным неконтролируемое кровотечение состоится. Наконец, трепанация черепа должны быть сделаны тщательно, не разрушая при этом ориентиры сосудов. Неосторожное удаление внешнего менингеального слоя (твердой мозговой) может привести к тяжелым кровотечением и повреждением артериальной питания.
Настройки вентиляции выбираются в зависимости от возраста животного.Большинство коммерческих поставщики предоставляют полезную информацию о таких условиях. Эксперименты на крысах старше P15 потребует использование большого животного вентилятора. Взрослые животные не нуждаются вентиляцию, если наркоз кетамином / ксилазина, но интубации рекомендуется избегать жидкости в трахею.
Один Основным ограничением этого протокола является то, что эксперименты могут быть выполнены только остро. В нашей лаборатории мы провели эксперименты продолжительностью от двух и до десяти часов. Второе ограничение заключается в том, что эксперименты должны быть выполнены под наркозом. Таким образом, выбор анестетика является важной переменной рассмотреть в процессе планирования и планирования экспериментов. С этим связан вопрос, что новорожденных животные могут быть особенно чувствительны к передозировке. Например, если выбрать кетамина / ксилазина микс, рассчитать дозу в зависимости от веса щенка и администрирования лекарства по ⅓ от максимальной громкости. Проверьте состояние животного каждые 5-10 минут на носок щепотку гesponse. При использовании изофлурана, меры предосторожности так же необходимы для поддержания безопасной среды для следователя (надлежащей вентиляции и правильно калиброванного испарителя).
Стереомикроскоп может быть установлен на гибком держателе, чтобы отрегулировать угол обзора и облегчения пространство зазор разместить электроды и переселение животных в двухфотонного микроскопа. Использование батарея для питания вентилятора может облегчить перемещение животных и снизить электрические артефакты во время электрофизиологии экспериментов. С этой целью небольшой макет (7,5 х 12 дюймов) можно использовать, чтобы собрать вместе вентилятор, грелку и анестезированных животных (рис. 2а). Полезным и важным модификация этой установки является добавление устройства для мониторинга жизненно важных функций во время операции. Оксиметр или другие аналоговые устройства могут быть использованы в зависимости от лаборатории бюджета.
Этот протокол был использован с электрофизиологии и визуализации встретилисьHODS, в том числе патч зажим записи 8,10,11, polytrode записей (рис. 7) и двухфотонного визуализации 9 (рис. 6 и 8). Один из возможных будущих приложений будет сочетать эти методы для ориентации флюоресцентно меченых клеток для электрофизиологические записи 16.
Новые приложения визуализации также может включать в себя 2-D или 3-D временных рядов с помощью двухфотонного микроскопа. Например, с помощью болюса загрузку показателей кальция изучать активность ствола мозга нейронных и глиальных клеточных популяций. Как показано на фиг.8, раствор красителя вводят в кровоток через сонную артерию может быть использован для создания высокую контрастность изображения сосудистой мозга. Как флуоресценции краситель заполняет просвет микрососудов и распространяется в окружающие ткани, оно может быть использовано не только для расчета кажущейся растворенного проницаемость гематоэнцефалического барьера, но и растворенное вещество диффузии коэффициентфициента в ткани мозга 3. Одной из главных причин для впрыскивания флуоресцентно меченных растворенные вещества через сонную артерию, что раствор красителя может непосредственно перейти к микрососудов в мозге, не идя в сердце первую, как в инъекции в хвостовую вену. Это приводит по крайней мере два преимущества. Во-первых, концентрация флуоресценция красителя в микрососудов просвет может быть практически постоянным, если скорость перфузии фиксируется на катетеризации сайте. Это гарантирует точное определение гематоэнцефалический барьер проницаемости. Другим является то, что если тест агент включен в перфузате, он будет непосредственно перейти к гематоэнцефалический барьер без разбавления или в сочетании с другими факторами от циркуляции тела.
Новые эксперименты также можете воспользоваться трансгенных животных с генетически кодируемых флуоресцентных журналистами. Это позволило бы обеспечить то преимущество, что флуоресцентные зонды не должны были бы быть загружены на месте (если только дизайн экспериментауказано иное), экономя время и, возможно, что позволяет более нетронутыми препаратов (например, черепно оконных 17).
Наконец, эксперименты могут быть сделано в других регионах, таких как стволовых нижней оливы или лицевого ядра двигателя. Знания о нейроанатомии и развития специфических клеточных популяций в данного вида будет иметь важное значение для достижения этой цели, в частности, анатомические ориентиры могут измениться в животные растут (рис. 1). Мы надеемся, этот протокол побуждает других исследовать брюшной стволовых структур с использованием в естественных условиях электрофизиологических и методов визуализации.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом G12-RR003060 от NIH / NCRR / RCMI, грант SC1HD068129 от Юнис Шрайвер Национального института здравоохранения и человеческого развития ребенка, Национальный научный фонд CBet 0754158 и PSC-CUNY 62337-00 40 из Городского университета Нью- Йорк.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbant pads | Kettenbach | Sugi 31603 | Other options may be available from different companies |
| Cautery | Braintree Scientific, INC | GEM 5917 | Other options may be available from different companies |
| Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran | Sigma | T1287-500MG | Other options may be available from different companies |
| Dissecting Chisel | Fine Science Tools | 10095-12 | Other options may be available from different companies |
| DiI | Invitrogen | V-22885 | Other options may be available from different companies |
| Elastomer | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Other options may be available from different companies |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Other options may be available from different companies |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12,11617-12, 11616-16 | Other options may be available from different companies |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | Other options may be available from different companies |
| Heating pad | FHC | 40-90-2 | Other options may be available from different companies |
| Intubation tubing | Braintree Scientific, INC | BIO CO-KIT | Choose age appropriate size |
| Light source | Spach Optics | Schott Ace illuminator | Other options may be available from different companies |
| Micro drill | Braintree Scientific, INC | MD-1200 120V | Other options may be available from different companies |
| Paper tape | Walgreens | Generic brand | Other options may be available from different companies |
| Syringe filter | VWR | 28145-483 | Other options may be available from different companies |
| Syringe pump | VWR | 52459-008 | Other options may be available from different companies |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | Other options may be available from different companies |
| Suture | Ethicon | Prolene 86979 | 6-0 size |
| Tubing | Braintree Scientific, INC | Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120 | Other options depending on pup’s age |
| Vaporizer (isoflurane) | Vetequip Incorporated | 911103 | Other options may be available from different companies |
| Ventilator (minivent) | Harvard Apparatus | 730043 | Use for P0-P12 rats |
References
- Kerr, J. N. D., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nat. Rev. Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).
- Sigler, A., Murphy, T. H. In vivo 2-photon imaging of fine structure in the rodent brain: before, during, and after stroke. Stroke. 41 (10), 117-123 (2010).
- Shi, L., Zeng, M., Sun, Y., Fu, B. M. Quantification of blood-brain barrier solute permeability and brain transport by multiphoton microscopy. ASME J. of Biomech. Eng. 136 (3), 031005-031005 (2014).
- Galambos, R., Schwartzkopff, J., Rupert, A. Microelectrode study of superior olivary nuclei. Am. J. Physiol. 197, 527-536 (1959).
- Goldberg, J., Brown, P. B. Response of binaural neurons of dog superior olivary complex to dichotic tonal stimuli: some physiological mechanisms of sound localization. J. Neurophysiol. 32 (4), 613-636 (1969).
- Guinan, J. J., Guinan, S. S., Norris, B. E. Single auditory units in the superior olivary complex I: responses to sounds and classifications based on physiological properties. Intern. J. Neurosci. 4, 101-120 (1972).
- Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons. J. Neurophysiol. 63 (5), 1169-1190 (1990).
- Khosrovani, S., Der Giessen, R. S. V. an, De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (40), 15911-15916 (2007).
- Rodríguez-Contreras, A., Van Hoeve, J. S., Habets, R. L., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (14), 5603-5608 (2008).
- Lorteije, J. A., Rusu, S. I., Kushmerick, C., Borst, J. G. G. Reliability and precision of the mouse calyx of Held synapse. J. Neurosci. 29 (44), 13770-13784 (2009).
- Tritsch, N. X., Rodríguez-Contreras, A., Crins, T. T., Wang, H. C., Borst, J. G. G., Bergles, D. E. Calcium action potentials in hair cells pattern auditory neuron activity before hearing onset. Nat. Neurosci. 13 (9), 1050-1052 (2010).
- Tong, H., Steinert, J. R., Robinson, S. W., Chernova, T., Read, D. J., Oliver, D. L., Forsythe, I. D. Regulation of Kv channel expression and neuronal excitability in rat medial nucleus of the trapezoid body maintained in organotypic culture. J. Physiol. 588 (9), London. 1451-1468 (2010).
- Sonntag, M., Englitz, B., Kopp-Scheinpflug, C., Rübsamen, R. Early postnatal development of spontaneous and acoustically evoked discharge activity of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body: an in vivo study in mice). J. Neurosci. 29 (30), 9510-9520 (2008).
- García-Villalón, A. L., Roda, J. M., Alvarez, F., Gómez, B., Diéguez, G. Carotid blood flow in anesthetized rats: effects of carotid ligation and anastomosis. Microsurgery. 13 (5), 258-261 (1992).
- Yuan, W., Lv, Y., Zeng, M., Fu, B. M. Non-invasive method for the measurement of solute permeability of rat pial microvessels. Microvasc. Res. 77 (2), 166-173 (2009).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Haüsser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
