Een methode om een ​​Craniotomie aan de ventrale Schedel van pasgeboren knaagdieren maken

Summary

Een chirurgische methode wordt beschreven om de ventrale schedel aan pasgeboren ratten bloot. Met deze benadering is het mogelijk om een ​​craniotomie acute elektrofysiologie en twee-foton microscopie experimenten in de hersenstam van verdoofde pups openen.

Abstract

Het gebruik van een craniotomie voor in vivo experimenten biedt de gelegenheid om de dynamiek van diverse cellulaire processen in de hersenen van zoogdieren in volwassenheid en tijdens de ontwikkeling te onderzoeken. Hoewel de meeste in vivo benaderingen een craniotomie om hersengebieden gelegen aan de rugzijde te bestuderen, hersenstam regio's zoals de pons, gelegen aan de buikzijde blijven relatief weinig bestudeerd. Het belangrijkste doel van dit protocol is om de toegang tot ventrale hersenstam structuren te vergemakkelijken, zodat ze kunnen worden onderzocht in vivo met behulp van elektrofysiologische en beeldvorming. Deze benadering maakt onderzoek naar structurele veranderingen in lange afstand axonen, patronen van elektrische activiteit in enkele en combinaties van cellen en veranderingen in bloed-hersen barrière permeabiliteit aan pasgeboren dieren. Hoewel dit protocol is vooral gebruikt om de auditieve hersenstam aan pasgeboren rat model, kan het gemakkelijk worden aangepast voor andere studies in knaagdieren zoals pasgeboren muizen, volwassen rodents en andere hersenstam regio.

Introduction

Het gebruik van een craniotomie in combinatie met fluorescentie beeldvorming en elektrofysiologie technieken voor het bewaken bloedstroom, bloed-hersen barrière permeabiliteit en meten van de activiteit van neuronen en gliale cellen in levende dieren ^1-3. Verschillende laboratoria hebben deze benadering gebruikt om inzicht te geven in de hersenen fysiologie in gezonde en aandoeningen, maar verschillen blijven in ons begrip van hoe deze processen zich voordoen tijdens de ontwikkeling. Voorts hebben de meeste studies gericht op hersengebieden die gemakkelijk bereikbaar vanaf het dorsale oppervlak van de schedel, zodat ventrale hersenstam structuren met verschillende fysiologische rollen zijn voornamelijk bestudeerd met behulp van ex-vivo onderzoek.

Het belangrijkste doel van dit protocol is een methode voor het openen van een craniotomie aan de ventrale schedel van knaagdieren te bieden. Deze aanpak werd aangepast van klassieke studies uitgevoerd in grotere zoogdieren zoals honden en katten voor zintuiglijke neurofysiologie recordings van de auditieve hersenstam ^4-7. In dit protocol is er echter de nieuwe uitdaging van het uitvoeren van de procedure aan pasgeboren dieren. Met vasculatuur oriëntatiepunten, heeft deze aangepast protocol al eerder gebruikt om de auditieve hersenstam van pasgeboren ratten volwassen muizen en andere hersenstam regio's zoals de oliva ^8-11 (Figuur 1) te bestuderen.

Een belangrijk voordeel van een ventrale craniotomy over bestaande methoden om ventrale hersenstamkernen studie is dat het biedt directe toegang tot de structuren van belang in levende dieren. Bijvoorbeeld, worden de auditieve cellen van de superieure olivary complex gelokaliseerd enkele tientallen micrometers van het hersenoppervlak, wat belangrijk is voor gerichte plaatsing van sondes en voor het gebruik van twee-foton beeldvormingsbenaderingen waarin beeldvorming diepte beperkt tot 0,5 mm door licht weefsel verstrooiing en absorptie. Een ventrale craniotomy biedt ook een voorbereiding met relatief intacte neurale verbindingen, which verstoord in acute en organotypische slice preparaat ^12. In tegenstelling tot andere protocollen voor in vivo experimenten neurofysiologie ^13, kan een ventrale benadering gecombineerd met multi-elektrode opname en beeldvorming die informatie over cellulaire ensembles verschaffen (figuren 6 en 7). Tenslotte, in combinatie met dit protocol een fluorescent gelabelde opgeloste stof kan worden geïnjecteerd in de vasculatuur veranderingen in bloed-hersen barrière permeabiliteit voor de opgeloste stof (Figuur 8) te meten.

Protocol

Het volgende protocol volgt het dier zorg richtlijnen die door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van het City College of New York.

Animal intubatie 1. (10-20 min)

1. Voorafgaand aan de operatie, bereiden zoogdieren Ringer-oplossing. Monteer de chirurgische instrumenten, verwarming pad en kleine dieren ventilator op de bank (figuur 2).
   1. Voor metingen van bloed-hersen barrière permeabiliteit maken 10 ml van 1% bovine serum albumine (BSA) oplossing van Ringer en lossen TRITC-dextran 155 kD bij 8 mg / ml in 1% BSA-oplossing, filteroplossing 25 mm spuitfilter (0,2 urn poriegrootte) en bewaar in een-folie bedekt spuit in het donker.
2. Verdoven van het dier met behulp van isofluraan. Gebruik 5,0% voor inductie en 1,5-3,0% voor onderhoud. Ook een mengsel van ketamine (41,7 mg / kg) en xylazine (2,5 mg / kg lichaamsgewicht) worden gebruikt. Diepte van de anesthesie kan worden gecontroleerd door teen knijpen reflex vanbovenste en onderste ledematen.
   1. Daaropvolgende doses van ketamine (41,7 mg / kg lichaamsgewicht) en xylazine (2,3 mg / kg lichaamsgewicht) toegediend te worden in stappen van ⅓ van de maximale dosis om overdosering te voorkomen. Gebruik van een knaagdier ventilator wordt aanbevolen om-xylazine geïnduceerde respiratoire depressie tegen.
3. Plaats de verdoofde pup liggend op de rugzijde en veilig zijn kop met de plastic kegel gebruikt om de narcose (Figuur 3a) te leveren.
   1. Beveilig het dier met plakband op de voorpoten en de staart (figuur 3a).
   2. Een alternatief voor het hoofd van de pup veilig te stellen is een kopplaat bevestigd aan een metalen staaf te gebruiken.
      Opmerking: Zorg ervoor dat de verwarming pad is ingesteld op 37 ° C om onderkoeling (figuur 3a) te vermijden.
4. Gebruik een schaar (Figuur 2b) een longitudinale maken en vier laterale incisies op de huid bovenop de nek (Figuur 3b). Met behulp van botte techniek, ontleden de huid en leg het opzij behulp van een tang (fig. 2c en 3c).
   1. Houd de huid af met plakband. Stabiliseren het hoofd in een horizontale positie (Figuur 3c).
5. Met behulp van de lente schaar (figuur 2d) en botte techniek, push klieren en vetlagen opzij om de luchtpijp (figuur 3c) bloot te leggen. Bepaal de locatie van de halsslagaders.
   1. Houd de halsslagaders weg van de luchtpijp.
      Opmerking: aanprikken van de halsslagaders kan leiden tot massaal bloedverlies en de dood van de pup.
6. Met behulp van de lente schaar (figuur 2d) ontleden de longitudinale spieren die de luchtpijp. Snijd de longitudinale spieren zich onder de luchtpijp (figuur 3d).
   Opmerking: De tracheale ringen moet duidelijk zichtbaar (figuur 3e) zijn.
   1. Gebruikpincet (figuur 2c), das twee stukken van hechtdraad rond de luchtpijp. Een stuk van de hechtdraad ventilatie fixeren en de tweede draad wordt gebruikt om de rostrale luchtpijp dicht bij de ventilatiebuis invoegpositie (figuur 4a).
      Opmerking: Bevochtig blootgesteld weefsel regelmatig met Ringer-oplossing om uitdroging te voorkomen.
7. Met veer schaar (figuur 2d) een insnijding aan een van de tracheale ringen tussen de twee draden geplaatst in stap 1.6.1 (figuur 4c).
   Opmerking: Zorg dat er geen vloeistof in de open luchtpijp. Vloeistof in de luchtpijp zal stikken veroorzaken.
8. Steek de intubatie buis (figuur 4b) in de luchtpijp en draai de onderste draad om het te beveiligen. Met behulp van een tang (figuur 2c), draai de bovenste draad aan de luchtpijp posterior sluiten om het invoegpunt van de intubatie buis.
   1. Tighten en trim de uiteinden van de twee draden (Figuur 4d-f).
      Opmerking: Vapor binnen de intubatie buis is een goed teken van de luchtstroom controle.
9. Onmiddellijk wisselen de isofluraan levering aan de ventilator. Pas het slagvolume en de ventilatiesnelheid basis van het gewicht van het dier.
   1. Sluit de vrijgekomen omliggende weefsel met elastomeer (figuur 5a). Houd het oppervlak bevochtigd en schoon.

2. Trachea en Muscle verwijderen met de schedel Expose (5-10 min)

1. Gebruik veer schaar (figuur 2d) aan de luchtpijp naast de ventilatiebuis snijden. Voer twee sneden langs de spierwand van de mondholte aan het caudale einde van de tong bloot (figuur 5b).
   Opmerking: Indien nodig een cauterizer te stoppen met bloeden. Ongecontroleerd bloeden zal dood van het dier veroorzaken.
2. Reinig degebied met overvloedige hoeveelheden Ringer-oplossing (figuur 5c). Identificeer de kloof tussen de laatste wervels en de basi-occipitale bot (figuur 5d).
   Opmerking: De kloof tussen de botten is een nuttig schedel mijlpaal te hersenstam structuren te lokaliseren. De inferieure olijf bevindt zich onder deze kloof. De auditieve superieure olivary complex bevindt zich onder de basi-occipitale bot in de rostrale richting van deze kloof (zie ook figuur 1).
3. Reinig het gebied met behulp van een tang (figuur 2c) en de lente schaar (figuur 2d). Heeft bloedvaten niet doorboren.
   Opmerking: Indien nodig, cauterize te stoppen met bloeden.
   1. Na het blootgestelde oppervlak schoon vet en spierweefsel moet de ruimte scheidt de basi-schedelbeen en de staartwervels zichtbaar (figuur 5d) zijn.

3. Craniotomie (15-30 min)

1. Gebruik een microboor of een ultrasonic cleanser. Zoek de mediale wand van de bulla.
   1. Dun de schedel door het maken van een omgekeerde D vorm totdat de onderliggende bloedvaten zichtbaar zijn (figuur 5e).
      Opmerking: De basilaire slagader (bas) draait bovenop de hersenstam middellijn. De anterior inferior cerebellaire slagader (AICA) takken bilateraal en betrouwbaar kan worden gebruikt als een mijlpaal omdat het een constante positie in verschillende dieren.
   2. Wanneer de schedel wordt uitgedund, voorzichtig breken met behulp van een dissectie beitel (figuur 2e). Verwijder het bot stuk met een pincet (figuur 2c). Als alternatief, tillen en breek de schedel met een verbogen naald.
      Opmerking: Herhaal deze procedure tot de grootte en vorm van de craniotomie geschikt is voor de geplande experiment. De bas en aica moeten zichtbaar zijn door de dura membraan (figuur 5f).
2. Reinig het gebied meerdere malen met verse Ringer-oplossing. Met absorberend pads droog het oppervlak van de dura membraan.
   1. Gebruik indien nodig een hechtdraad naald om de dura membraan te verwijderen zonder het verplaatsen of het breken van de slagaders mijlpaal bas en AICA.
      Opmerking: Bij dura prikken cerebrospinale vloeistof zal stromen. Reinig het gebied met Ringer-oplossing en houd vochtig gedurende het experiment.

4. Electrofysiologie Experiment

1. Selecteer de polytrode volgens experiment ontwerp (figuur 7a). Gebruik een fijne penseel om de vacht van de polytrode met DII. Breng de Dii oplossing in een 1 ml microcentrifugebuis, dompel de penseel in de oplossing en zachtjes slaan de polytrode onder visuele begeleiding (dat wil zeggen met behulp van een stereoscoop). Begin bij de punt van de sonde en zorgvuldig blijven totdat alle elektroden gelijkmatig zijn bedekt.
   1. Plaats de aardelektrode in de mondholte. Laad de polytrode in de elektrode houder (Figuur 7b
   2. Zet de versterker aan en controleer of alle aansluitingen goed werken.
2. Plaats de elektrode boven bas op de tak punt van AICA (nulstand). Beweeg de elektrode naar de gewenste richtpunt met behulp van de juiste rostrale-laterale coördinaat (figuur 7c).
   1. Plaats de elektrode op de hersenen oppervlak en verplaats het naar de gewenste diepte in stappen van 5-10 micrometer.
3. Op te nemen, volgens proefopzet. Gegevens op te slaan voor verdere analyse.

5. Twee-foton Imaging Experiment

1. Zet de microscoop. Stel de excitatie golflengte en gebruik een passende emissienormen filter. Excitatie bij 800 nm en een 607 ± 45 nm band-pass filter emissie werken goed voor de beeldvorming TRITC-dextran.
2. Identificeer de rechter of linker halsslagader. Het gebruik van botte techniek ontleden de halsslagader van de aangrenzende bindweefsel of zenuwen.
   1. Pick en houd de halsslagaderslagader met een hemostaat. Bind drie stukken van hechtdraad rond de halsslagader.
   2. Draai de draad dichter bij het hart kant naar de bloedstroom te stoppen en laat de andere twee draden los.
   3. Gebruik fijne schaar om een ​​klein sneetje te maken in een hoek van 45 ° op de halsslagader tussen de bond draad en de volgende losse draad.
      Opmerking: Reinig het bloed met absorberend papier.
3. Canule de halsslagader. Plaats de buis gevuld met TRITC-dextran-oplossing in de uitsparing op de halsslagader ongeveer 5 mm diep gericht op het hoofd van de pup.
   1. Draai de andere twee draden rond de slagader om de slang en de slagader bij elkaar te houden. Draai de draden, trim en voeg elastomeer om verder te stabiliseren.
      Opmerking: De andere zijde van de buis is verbonden met de spuit met TRITC-dextran-oplossing (bereid in stap 1.1).
4. Bevestig de spuit op de injectiepomp.
   1. Reeksde snelheid van de halsslagader bloed debiet van de pup. Schakel de spuitpomp enkele seconden en controleer handmatig de kleurstofoplossing kan worden geïnjecteerd in de halsslagader. Let op: In de veronderstelling dat de bloedstroom tarief in de halsslagader van volwassen ratten (240-280 g) is ongeveer 3 ml / min ^14, kan de bloedstroom tarief voor een rat pup (bijv. P10 pup wegen 15-25 gram) worden berekend aan range 0,16-0,3 ml / min.
5. Plaats het dier onder de microscoop doelstelling. Injecteer de fluorescerende dextran in de bloedbaan.
   1. Gebieden vast te stellen van de rente op de ventrale hersenstam met een 5X lucht doelstelling. Schakel over naar een 20X of 40X objectief (onderdompeling in water, NA = 0,5 of 0,8, respectievelijk) aan de regio van belang (ROI) richten.
   2. Start beeldvorming en het beeld acquisitie parameters (zoals belichtingstijd, laservermogen, detector winst) te stellen totdat de fluorescentie-intensiteit in het vaatstelsel van de ROI is geoptimaliseerd (dwzniet te laag, maar niet te verzadigd).
   3. Zet de spuit pomp om de kleurstof oplossing te injecteren in de halsslagader en het verwerven van een tijdreeks op een vaste focal plane.

6. Animal Care Na Procedure

1. Dit is een terminal procedure. Aan het einde van een proef dieren worden gedood met een overdosis pentobarbital (100 mg / kg, intraperitoneale injectie) of een methode van euthanasie American Veterinary Medical Association Euthanasie richtsnoeren goedgekeurd.
   Opmerking: Perfusie door het hart met Ringer-oplossing gevolgd met een fixatief oplossing wordt aanbevolen voor verdere histologische analyse.

Representative Results

Elektroporatie van neurale tracers

De mediale nucleus van het trapezium lichaam (MNTB) is een groep cellen in de superieure olivary complex dat eerder onderzocht met dit protocol. Zo kunnen patch clamp pipetten worden gebruikt om neurale tracers elektroporatie (Figuur 6) ^9. Bij pipetten dicht bij de middellijn zoals weergegeven in figuur 6a, is het resultaat dat decussating afferente axonen gelabeld. Een twee-foton microscoop met een hoge numerieke apertuur water immersie objectief kan worden gebruikt om beelden van de vezels bereikt de MNTB, waaronder zeer fijne zijtakken (pijlen in figuur 6b). Neurale tracers kunnen worden geleverd aan de MNTB direct, zoals weergegeven in figuur 6c. Het resultaat is etikettering van MNTB cellen en afferente axonen, zoals kan worden gewaardeerd door beeldvorming met een lagere numerieke apertuur water immersie objectief (figuur 6d). De main voordeel van de lagere vergroting doel is dat een groter gezichtsveld kan worden onderzocht, en hoewel dit resulteert in een afname van ruimtelijke resolutie door het lagere doelstelling numerieke apertuur kunnen afzonderlijke cellen MNTB goed onderscheiden (pijlen in figuur 6d) . De gemiddelde duur van deze experimenten voor kinderen van P1-P5 is 3,1 ± 1,4 uur (n = 22 pups).

Elektrofysiologie opnames

Spontane uitbarsting vuren is een vorm van ontwikkelings-elektrische activiteit waargenomen bij enkele MNTB cellen voor het begin van het horen van ^11,13. Met deze chirurgische protocol is het ook mogelijk om Multielectrode (polytrodes) targeten MNTB (Figuur 7a-b). Het resultaat is een opname van spontane activiteit in een ensemble van MNTB cellen. Figuur 7e toont een representatief polytrode opname van een P6 rat. In dit experiment werd de polytrode bekleed met de lipofiele kleurstof DII meteen dun penseel (zie stap 4.1). Na het uitvoeren van het opnemen van de hersenen verwerkt voor histologische analyse en de locatie van de Dil-gelabelde polytrode nummer is het controleren van de juiste sturing naar de MNTB (figuur 7d). De gemiddelde duur van de experimenten voor kinderen van P1-P6 is 2,0 ± 0,7 uur (n = 33 pups).

Meten microvessel permeabiliteit

Dit protocol kan ook worden gebruikt om twee-foton beeldvorming experimenten van vasculaire permeabiliteit voeren. Een TL opgeloste stof (TRITC-dextran, MW 155 kD Stokes straal ~ 8,5 nm) werd opgelost in 1% BSA Ringer-oplossing en geïnjecteerd in de cerebrale circulatie via een canule ingebracht in de halsslagader ^14. In tegenstelling tot de staart ader injecties, deze procedure omzeilt het hart en introduceert de tl-opgeloste stof direct in de hersenen microcirculatie. Figuur 8a illustreert de kwaliteit van etikettering van bloed vasculatuur die voortvloeit uit het gebruik van deze procedure. Na continueperfusie van gelabelde opgeloste stoffen in de bloedstroom is het mogelijk om een time-lapse sequentie van een gebied van belang te verkrijgen, zie figuur 8b. De totale fluorescentie-intensiteit in het gebied van belang is offline gemeten en een wiskundig model gebruikt om de bloed-hersen barrière permeabiliteit bepalen fluorescent gelabelde opgeloste stoffen (figuur 8c) ^15. De gemiddelde duur van de experimenten voor kinderen van P9-P10 is 2,3 ± 0,8 uur (n = 3 pups).

Figuur 1. Relatieve locatie van ventrale hersenstam neurale structuren met betrekking tot vaatstelsel monumenten in de pasgeborene rat. Een, Zijaanzicht van de hersenen. B, ventrale uitzicht op de hersenen. Grote bloedvaten zijn in rood en neurale structuren van belang zijn indvoor bestemde op kleur pleinen. Niet op schaal. AICA = anterior inferior cerebellaire slagader; bas = basilaire slagader; ICV = inferieure cerebrale ader; mca = midden cerebrale slagader; vert = wervelslagader; VSP = ventrale spinale slagader. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 2. Chirurgische setup. Een, chirurgie kan worden gedaan op een kleine broodplank (1) rust op de top van een stabiel tafelblad. Een verwarmingselement (2) en een klein dier ventilator (3) kan worden bevestigd aan de broodplank vergemakkelijking van de gehele voorbereiding bewegen wanneer nodig. Het kleine dier ventilator kan worden gevoed door een batterij (4). Een magnetische houder (5) kan worden gebruikt om de neuskegel gebruikt om de verdoving te leveren garanderen. De neuskegel kanook helpen beveiligen van de hoofd in een stabiele positie. Wanneer het dier niet te worden verplaatst, een micromanipulator (6) kan worden gebruikt om positie probes voor elektrofysiologie of neurale tracing experimenten. Een lichtbron (7) en een stereoscoop (niet afgebeeld) zijn noodzakelijk om oriëntatiepunt structuren tijdens microchirurgie. B visualiseren, zijn kleine schaar gebruikt in stap 1.4. C, tang worden gebruikt in stappen 1.4, 1.6.1, 1.8 en 1.8.1 . d, lente schaar worden gebruikt in stappen 1.5, 1.6 en 1.7. e wordt ontleden beitel gebruikt in stap 3.1.2. Schaal bar in e = 1 mm, van toepassing op bd. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 3. Ontmaskeren van de luchtpijp voor intubatie.A wordt het dier verdoofd, geplaatst in buikligging en vastgezet met de neuskegel en tape (stippellijnen). b, wordt de huid gesneden en opzij gelegd om de onderliggende vetlaag. c, De bovenliggende vet en klieren (getoond bloot in grijs) worden opzij geduwd om de luchtpijp bloot. Tape wordt gebruikt om de overliggende huid (stippellijnen). D te verzekeren, wordt de luchtpijp ontleed uit de musculatuur. E, Visualisatie van tracheale ringen geeft succesvolle verwijdering van de bovenliggende spier. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 4. Intubating het dier. Een, twee hechtdraad draden (witte pijlen) zijn gebonden rond de luchtpijp(T). B moet de intubatiebuis (it) stevig verbonden worden met de y buis van het dier beademingsapparaat. C, wordt een tracheostomie tussen de twee draden hechtmateriaal (zwarte pijl). D, De ventilatiebuis is geplaatst en de twee hechtdraad draden worden aangescherpt. De uiteinden van de draad weer vastgedraaid in een gekruist mode (aangegeven door witte en zwarte pijlpunten). E, zijn de hechtdraad eindes gebonden. F, worden de hechtingen eindes getrimd en intubatie is voltooid. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 5. Verwijderen luchtpijp en maken de craniotomie. Een, Het preparaat is gestabiliseerd met elastomeer (oppervlakte insi de groene stippellijnen). b, wordt de luchtpijp geïdentificeerd en vervolgens sneden worden gemaakt in de eerste tot de luchtpijp weg van de intubatiebuis scheiden, en dan naar de onderkaak spieren (gestippelde lijnen). c snijden, Reinig het oppervlak van de schedel met behulp van stompe techniek om de spieren te verwijderen en gebruik absorberend papier om vet en bloed. d verwijderen, Voorbeeld van een schone omgeving toont de laatste wervels (v) en de basi-occipitale bot (bo). Er is een natuurlijke opening tussen de twee botten (zwarte pijlen). E, met behulp van een microboor of ultrasone reiniger dun de schedel in een omgekeerde vorm D (zwarte pijlen). Zachtjes breken de verdunde schedel en verwijder het stukje bot. Landmark vaatstelsel moet zichtbaar. F, High-vergroting uitzicht van vasculaire oriëntatiepunten op de blootgestelde hersenstam oppervlak. Bas = basilaire slagader; AICA = anterior inferior cerebellaire slagader. Schaal bar in b = 1 mm, geldt voor de CE.highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 6. Elektroporatie van neurale tracers. A, Een glazen elektrode met de neurale tracer micro-ruby werd geplaatst in de buurt van de middellijn (rode cirkel). De tracer werd geëlektroporeerd met behulp van 7 seconden lang -5 uA pulsen die elke 14 seconden gedurende 15 minuten. Na 1 uur hersteltijd de omlijnde gebied werd afgebeeld met een twee-foton microscoop. P1 rat pup. B, Exemplaargebaseerde z-stack beeld van afferente axon etikettering in de MNTB. Pijlen wijzen naar individuele zijtakken. C, een glaselektrode gevuld met micro-ruby werd boven op de MNTB (rode cirkel). De tracer werd geëlektroporeerd met dezelfde instellingen in een beschreven. Na 1 uur hersteltijd de boxed gebied wasafgebeeld met een twee-foton microscoop. P5 rattenpup. D, Exemplaargebaseerde z-stack imago van gelabelde cellen en axonen in de MNTB. Pijlen geven enkele MNTB cellen. Labels in b en c geven objectiefvergroting en numerieke lensopening, respectievelijk. Schaal bar in a en c = 300 micrometer; schaal bar in b = 45 micrometer; schaal bar in d = 90 micrometer. AICA = anterior inferior cerebellaire slagader; bas = basilaire slagader; r = rostrale; l = laterale. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 7. Gerichte polytrode opname. Een, Polytrode bestaat uit 4 schachten met 4 elektroden per schacht (zwarte cirkels). Intra-en inter-schacht afstanden tussen elektroden worden aangegeven. B, C, hogere vergroting uitzicht op vaatstelsel oriëntatiepunten voor polytrode targeting. De polytrode is gepositioneerd met behulp van rostrale-laterale coördinaten aan de mediale kern van het trapezium lichaam (rode doos). D, Posthoc histologische analyse toont juist richten van de Dil-gecoate polytrode richten (polytrode track wordt weergegeven in rood). E, Exemplar meerdere -eenheid opname. Trace volgorde is dezelfde als elektrode orde in panel een. Binnen schacht opnamen hebben dezelfde kleur. Schaal bar in e = 5 seconden. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 8. In vivo twee-foton beeldvorming van de hersenen microvaatjes. een, 2-D beeld (ingestort Z-stack) van hersenenvasculature na perfusie van TRITC-dextran 155 kD in de halsslagader. Het gebied afgebeeld is vergelijkbaar met die getoond in figuur 7c. 20x/0.5 water immersie objectief. P10 rat pup. B, regio van belang (ROI) gebruikt om de fluorescentie-intensiteit (rood kader ingesloten regio) te meten. De microvaatjes had een diameter van ~ 14,2 urn en 182 urn is gelegen onder het oppervlak hersenstam. C, typisch kromme van fluorescentie-intensiteit (genormaliseerde waarde) als functie van de tijd. I ₀ is de stap toename in fluorescentie-intensiteit in het ROI als de fluorescentie oplossing net vult het vatlumen. (DI / dt) en ₀ I ₀ worden gebruikt om het microvaatje permeabiliteit voor de opgeloste stof te bepalen. De permeabiliteit voor TRITC-dextran 155 kD werd berekend als 1,5 x 10 ^-7 cm / sec.Schaal bar in b = 100 micrometer, geldt voor een. Klik hier voor grotere afbeelding.

Discussion

Is kritisch. Een ervaren onderzoeker moet in staat zijn om dit protocol te ronden in 1 uur (stappen 1-3). De aangegeven tijden voor de verschillende stappen gaan uit van een gemiddeld tot hoog niveau van deskundigheid. Juiste en tijdige tracheotomie en intubatie zijn kritisch, omdat slechte ventilatie controle kan leiden tot stikken en de dood van het dier. Zorgvuldige klaring van spier-en vetweefsel is ook erg belangrijk, want fouten kunnen leiden tot ongecontroleerde bloeden en de dood van het dier. Ook wanneer de voorbereiding van de halsslagader voor canule inbrengen, moet men zorgvuldig te scherpen en snijd de slagader, als de draad knoop losraakt ongecontroleerde bloeden zal plaatsvinden. Ten slotte moet de craniotomie zorgvuldig worden gemaakt, zonder verstoring van het vaatstelsel bezienswaardigheden. Onzorgvuldig verwijderen van de externe meningeale laag (dura) kan leiden tot ernstige bloeden en beschadiging van de arteriële aanvoer.

Ventilatie instellingen worden gekozen op basis van de leeftijd van het dier.De meeste commerciële leveranciers bieden nuttige informatie over dergelijke instellingen. Experimenten bij ratten ouder dan P15 zal gebruik maken van een groot dier ventilator nodig. Volwassen dieren mogen niet ventilatie nodig als verdoofd met ketamine / xylazine, maar intubatie wordt aanbevolen om fluïdum dat de luchtpijp te voorkomen.

Een belangrijke beperking van dit protocol is dat experimenten alleen acuut kan worden uitgevoerd. In ons laboratorium hebben we experimenten duurzaam uitgevoerd tussen twee en maximaal tien uur. Een tweede beperking is dat experimenten onder verdoving worden uitgevoerd. Daarom is de keuze van de verdoving is een belangrijke variabele te overwegen bij het plannen en ontwerpen van experimenten. Een verwant probleem is dat pasgeboren dieren bijzonder gevoelig zijn voor overdosering kunnen zijn. Als bijvoorbeeld kiezen ketamine / xylazine mengsel Bereken de dosis vanwege het gewicht pup en beheren drugs op ⅓ van het maximale volume. Controleer de toestand van het dier elke 5-10 minuten met de teen knijpen response. Bij gebruik van isofluraan, zijn voorzorgsmaatregelen ook nodig om een ​​veilige omgeving te handhaven voor de onderzoeker (goede ventilatie, en een deugdelijk gekalibreerde verdamper).

De stereomicroscoop kan op een flexibele houder worden gemonteerd kijkhoek aan te passen en ruimte klaring vergemakkelijken elektroden en verplaatsing van het dier te plaatsen aan de twee-foton microscoop. Gebruik van een batterij om de ventilator van stroom te kunnen vergemakkelijken het verplaatsen van de dieren-en elektrische artefacten te verminderen tijdens elektrofysiologische experimenten. Hiertoe kan een kleine breadboard (7,5 x 12 inch) worden gebruikt om de montage van de ventilator, verwarming pad en het verdoofde dier (Figuur 2a). Een bruikbare en belangrijke wijziging van deze opstelling is de toevoeging van een inrichting voor het bewaken vitale functies tijdens chirurgie. Een oxymeter of andere analoge apparaten kunnen worden gebruikt, afhankelijk van het laboratorium budget.

Dit protocol is gebruikt met de elektrofysiologie en imaging voldaanhods, waaronder patch clamp ^8,10,11, polytrode opnamen (figuur 7), en twee-foton beeldvorming ⁹ (figuren 6 en 8). Een mogelijke toekomstige toepassing zou zijn om deze methoden te combineren voor het richten van fluorescent gelabelde cellen voor elektrofysiologische opname ^16.

Nieuwe beeldvormende toepassingen kunnen ook 2-D of 3-D tijdreeksen met twee-foton microscopie. Bijvoorbeeld met behulp bolus laden van calcium indicatoren voor de activiteit van hersenstam neuronale en gliale celpopulaties te bestuderen. Zoals getoond in figuur 8, een kleurstof oplossing geïnjecteerd in de bloedsomloop via de halsslagader kan worden om contrastrijke beelden van de hersenen vasculatuur genereren. Omdat de fluorescentie kleurstof vult het microvaatje lumen en verspreidt in het omringende weefsel, kan niet alleen worden gebruikt voor de berekening van de opgeloste schijnbare permeabiliteit van de bloed-hersen barrière, maar ook de opgeloste stof diffusie coëfficiëntcoëfficiënt in het hersenweefsel ^3. Een belangrijke reden voor het injecteren van de fluorescent gelabelde opgeloste stoffen via de halsslagader is dat de kleurstof oplossing direct kan gaan naar de bloedvaten in de hersenen zonder naar het hart eerst als in een staart ader injectie. Dit brengt ten minste twee voordelen. Een daarvan is dat de fluorescentie kleurstof concentratie in de microvessel lumen nagenoeg constant kan zijn als de perfusie percentage is vastgesteld op de canulatieplaats. Dit zorgt voor een nauwkeurige bepaling van de bloed-hersen barrière permeabiliteit. Een andere is dat als een testmiddel wordt in het perfusaat, zal het direct naar de bloed-hersen barrière zonder verdund of in combinatie met andere factoren uit het bloedsomloop.

Nieuwe experimenten kunnen ook gebruik maken van met genetisch gecodeerd fluorescerende reporters transgene dieren. Dit zou het voordeel dat fluorescerende probes niet hoeft in situ worden geladen verschaffen (indien het model van de proefanders is bepaald), bespaart tijd en mogelijk waardoor meer intacte preparaten (bijv. craniale venster ^17).

Ten slotte kan experimenten worden gedaan in andere hersenstam regio's zoals de inferieure olijf-of het gezicht motor nucleus. Kennis over neuro-anatomie en de ontwikkeling van specifieke cellulaire bevolking in een bepaalde soort is van groot belang om dit doel, vooral als anatomische oriëntatiepunten kunnen veranderen als dieren groeien (figuur 1). We hopen dat dit protocol spoort anderen aan ventrale hersenstam structuren te bestuderen met behulp van in vivo elektrofysiologische en beeldvorming.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbant pads	Kettenbach	Sugi 31603	Other options may be available from different companies
Cautery	Braintree Scientific, INC	GEM 5917	Other options may be available from different companies
Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran	Sigma	T1287-500MG	Other options may be available from different companies
Dissecting Chisel	Fine Science Tools	10095-12	Other options may be available from different companies
DiI	Invitrogen	V-22885	Other options may be available from different companies
Elastomer	World Precision Instruments	KWIK-SIL	Other options may be available from different companies
Fine Scissors	Fine Science Tools	14060-09	Other options may be available from different companies
Forceps	Fine Science Tools	11027-12,11617-12, 11616-16	Other options may be available from different companies
Spring Scissors	Fine Science Tools	15009-08	Other options may be available from different companies
Heating pad	FHC	40-90-2	Other options may be available from different companies
Intubation tubing	Braintree Scientific, INC	BIO CO-KIT	Choose age appropriate size
Light source	Spach Optics	Schott Ace illuminator	Other options may be available from different companies
Micro drill	Braintree Scientific, INC	MD-1200 120V	Other options may be available from different companies
Paper tape	Walgreens	Generic brand	Other options may be available from different companies
Syringe filter	VWR	28145-483	Other options may be available from different companies
Syringe pump	VWR	52459-008	Other options may be available from different companies
Stereomicroscope	Olympus	SZ61	Other options may be available from different companies
Suture	Ethicon	Prolene 86979	6-0 size
Tubing	Braintree Scientific, INC	Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120	Other options depending on pup’s age
Vaporizer (isoflurane)	Vetequip Incorporated	911103	Other options may be available from different companies
Ventilator (minivent)	Harvard Apparatus	730043	Use for P0-P12 rats