En metod för att göra en Kraniotomi på den ventrala Skull of Neonatal Gnagare

Summary

En kirurgisk metod beskrivs för att exponera den ventrala skallen på nyfödda råttor. Med hjälp av denna metod är det möjligt att öppna en kraniotomi att utföra akuta elektrofysiologi och två-photon mikroskopi experiment i hjärnstammen på sövda valpar.

Abstract

Användningen av en kraniotomi för experiment in vivo ger en möjlighet att undersöka dynamiken hos olika cellulära processer i däggdjurshjärnan i vuxen ålder och under utveckling. Även om de flesta in vivo-metoder använder en kraniotomi för att studera hjärnregioner som ligger på ryggsidan, hjärnstammen regioner som pons, som ligger på den ventrala sidan förblir relativt understudied. Det huvudsakliga målet med detta protokoll är att underlätta tillgången till ventrala hjärnstamsstrukturer så att de kan studeras in vivo med hjälp av elektrofysiologiska och avbildningsmetoder. Detta tillvägagångssätt gör studie av strukturella förändringar i långväga axoner, mönster av elektrisk aktivitet i singel och ensembler av celler, och förändringar i blod-hjärnbarriären permeabilitet i nyfödda djur. Även om detta protokoll har använts främst för att studera den auditiva hjärnstammen i nyfödda råttor, kan det enkelt anpassas för studier i andra gnagare såsom nyfödda möss, vuxen rodents och andra hjärnstamsregioner.

Introduction

Användningen av en kraniotomi i kombination med fluorescensavbildning och elektrofysiologiska tekniker medger övervakning blodflöde, blodhjärnbarriären permeabilitet och mätning av aktiviteten av neuroner och gliaceller i levande djur ^1-3. Flera laboratorier har använt denna metod för att ge insikt i hjärnans fysiologi hos friska och sjukdomstillstånd, men fortfarande brister i förståelsen av hur dessa processer uppkommer under utveckling. Dessutom har de flesta studier fokuserat på områden i hjärnan som är lätt åtkomliga från den dorsala ytan av skallen, så att ventrala hjärnstamsstrukturer med olika fysiologiska roller har studerats mestadels använder ex vivo metoder.

Det huvudsakliga målet med detta protokoll är att tillhandahålla en metod för att öppna en kraniotomi på den ventrala skallen av gnagare. Detta tillvägagångssätt var anpassad från klassiska studier på större däggdjur som hundar och katter för sensoriska neurofysiologi recordings av den auditiva hjärnstammen ^4-7. I detta protokoll föreligger emellertid den nya utmaningen att utföra proceduren i nyfödda djur. Med hjälp av landmärken kärl har detta anpassat protokoll använts tidigare för att studera den auditiva hjärnstammen av nyfödda råttor, vuxna möss och andra hjärnstams regioner som underlägsna oliv ^8-11 (figur 1).

En stor fördel med en ventral kraniotomi över befintliga metoder för att studera ventrala hjärnstamskärnor är att det ger direkt tillgång till de strukturer av intresse i levande djur. Till exempel är hörselcellerna i den överlägsna olivary komplex lokaliserat några tiotals mikrometer från hjärnans yta, vilket är viktigt för riktad placering av sonder och för att använda två-photon avbildning där bilddjupet kan begränsas till 0,5 mm med ljusvävnadsspridning och absorption. En ventrala kraniotomi ger också ett preparat med relativt intakta neurala kopplingar, WHich störs i akuta och organotypic slice förberedelser ^12. I motsats till andra protokoll för in vivo neurofysiologi experiment ^13, kan kombineras en ventral strategi med multielektrod inspelning och avbildningsmetoder som ger information om cellulära ensembler (figur 6 och 7). Slutligen, i kombination med detta protokoll ett fluorescerande löst ämne kan injiceras i kärlsystemet för att mäta förändringar i blod-hjärnbarriären permeabilitet till lösta ämnet (Figur 8).

Protocol

Följande protokoll följer de riktlinjer djurskötsel fastställts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) på The City College i New York.

1. Animal Intubation (10-20 min)

1. Före operation, förbereda däggdjur Ringers lösning. Montera kirurgiska verktyg, värmedyna, och små djur ventilator på bänken (Figur 2).
   1. För mätningar av blod-hjärnbarriären permeabilitet göra 10 ml av 1% bovint serumalbumin (BSA)-lösning i Ringer och lös TRITC-dextran 155 kD vid 8 mg / ml i 1% BSA-lösning, filtrerades lösningen med 25 mm sprutfilter (0,2 | im porstorlek) och förvara i en folietäckt spruta i mörkret.
2. Bedöva djuret med hjälp av isofluran. Använd 5,0% för induktion och 1,5-3,0% för underhåll. Alternativt kan en blandning av ketamin (41,7 mg / kg) och xylazin (2,5 mg / kg kroppsvikt) kan användas. Kan kontrolleras anestesidjup genom tå nypa reflex avövre och nedre extremiteterna.
   1. Efterföljande doser av ketamin (41,7 mg / kg kroppsvikt) och xylazin (2,3 mg / kg kroppsvikt) bör administreras i steg om ⅓ av den maximala dosen för att undvika överdosering. Användning av en gnagare ventilator rekommenderas att motverka xylazin-inducerad andningsdepression.
3. Placera sövd pup liggande på ryggsidan och säkra dess huvud med plastmembran används för att leverera bedövningsmedel (figur 3a).
   1. Säkra djuret med tejp på frambenen och svansen (figur 3a).
   2. Ett alternativ för att säkra valpens huvud är att använda en huvudplatta fäst vid en metallstång.
      OBS: Se till att värmedynan är satt till 37 ° C för att undvika hypotermi (figur 3a).
4. Använd en sax (Figur 2b) för att göra en longitudinell och fyra sido snitt på huden som ligger över halsen (Figur 3b). Med hjälp av trubbiga teknik, dissekera huden och lägg den åt sidan med hjälp av pincett (figur 2c och 3c).
   1. Håll huden ner med hjälp av tejp. Stabilisera huvudet i horisontellt läge (Figur 3c).
5. Använda våren sax (figur 2d) och trubbiga teknik, tryck körtlar och fettlager åt sidan för att exponera luftstrupen (Figur 3c). Identifiera placeringen av halspulsåder.
   1. Håll halspulsåder bort från luftstrupen.
      Notera: punktera halspulsådern kan leda till massiv blodförlust och död av valpen.
6. Använda våren sax (figur 2d) dissekera de längsgående muskler som täcker luftstrupen. Skär de längsgående muskler sitter under luftstrupen (figur 3d).
   Obs! Trakealringar ska synas tydligt (Figur 3e).
   1. Användapincett (Figur 2c), slips två bitar av sutur kring luftstrupen. En bit av suturen kommer att säkra ventilationsröret och den andra gängan kommer att användas för att stänga luftstrupen rostralt till ventilationsröret insättningspunkten (Figur 4a).
      Obs: fukta exponerad vävnad regelbundet med Ringer-lösning för att förhindra uttorkning.
7. Använda våren sax (figur 2d) göra ett snitt på en av de trakeala ringarna som är belägna mellan de två trådarna placerade i steg 1.6.1 (figur 4c).
   OBS: Se till att ingen vätska kommer in i öppna luftstrupen. Vätska i trakea kommer att orsaka kvävning.
8. Sätt i intubation röret (figur 4b) i luftstrupen och dra undertråden för att säkra den. Använd pincett (Figur 2c), dra övertråden för att stänga luftstrupen bakre till insättningspunkten för intubation röret.
   1. Filttätn och trimma ändarna av de två trådarna (fig 4d-f).
      OBS: Ånga inuti intubering röret är ett gott tecken på luftkontroll.
9. Genast växla isofluran försörjningen till ventilatorn. Justera slagvolymen och ventilationsgraden i enlighet med vikten hos djuret.
   1. Täta exponeras omgivande vävnad med elastomeren (figur 5a). Håll ytan fuktig och ren.

2. Trachea och Muscle Removal att Exponera Cranium (5-10 min)

1. Använd fjäder sax (figur 2d) för att skära luftstrupen i anslutning till ventilationsröret. Utför två snitt längs muskelväggen av munhålan för att avslöja den kaudala änden av gommen (figur 5b).
   OBS: Om det behövs, använd en cauterizer att stoppa blödning. Okontrollerad blödning orsakar djuret dör.
2. Rengörområde med rikliga mängder av Ringer-lösning (Figur 5c). Identifiera gapet mellan den sista kotorna och basi-occipital ben (figur 5d).
   OBS: Klyftan mellan benen är en användbar skalle landmärke att lokalisera hjärnstamsstrukturer. Den sämre oliv finns under denna lucka. Hörsel överlägsna olivary komplex ligger under basi-occipital ben i den rostrala riktningen från denna lucka (se även figur 1).
3. Rengör området med hjälp av pincett (Figur 2c) och våren sax (figur 2d). Gör inte hål blodkärl.
   OBS: Om det behövs, bränna för att stoppa blödning.
   1. Efter det exponerade området är rent av fett-och muskelvävnad, bör det utrymme som skiljer basi-occipital ben och den sista kotan vara synlig (Figur 5d).

3. Kraniotomi (15-30 min)

1. Använd en Microdrill eller en ultrasonic rengöringsmedel. Leta reda på den mediala väggen i bulla.
   1. Tunna skallen genom att göra en inverterad D formen tills de underliggande blodkärlen syns (Figur 5e).
      Obs: basilar artär (BAS) körs på toppen av hjärnstammen mittlinjen. Den främre sämre cerebellar artären (AICA) filialer bilateralt och kan användas tillförlitligt som ett landmärke som den har en konstant position i olika djur.
   2. När skallen förtunnas, försiktigt bryta den med en dissekera stämjärn (figur 2e). Ta bort ben bit med pincett (Figur 2c). Alternativt, lyfta och bryta skallen med en böjd nål.
      OBS: Upprepa detta tills storleken och formen på kraniotomi är lämplig för den planerade experiment. BAS och AICA ska vara synlig genom dura membranet (figur 5f).
2. Rengör området flera gånger med färska Ringers lösning. Med hjälp av absorberande pads torka ytan av dura membranet.
   1. Använd vid behov en sutur nål för att ta bort dura membranet utan att tränga undan eller bryta landmärke artärer bas och AICA.
      OBS: Vid dura punktering cerebrospinalvätska rinner ut. Rengör området med Ringer-lösning och hålla fuktade under hela experimentet.

4. Elektro Experiment

1. Välj polytrode enligt experimentets utformning (figur 7a). Använd en fin pensel för att belägga polytrode med Dil. Överför DII lösningen i en 1 ml mikrocentrifugrör, doppa penseln i lösningen och försiktigt strejk polytrode under visuell ledning (dvs. med hjälp av en stereoskop). Start vid sondens spets och försiktigt fortsätta tills alla elektroder är belagda jämnt.
   1. Placera jordelektroden inuti munhålan. Fyll på polytrode i elektrodhållaren (Figur 7b
   2. Slå på förstärkaren och kontrollera att alla anslutningar fungerar bra.
2. Placera elektroden ovanför bas vid grenpunkten AICA (läge noll). Flytta elektroden till önskad målpunkt genom användning av den lämpliga rostral-lateral koordinat (fig. 7c).
   1. Placera elektroden på hjärnans yta och flytta den till det önskade djupet i steg om 5 till 10 | im.
3. Utför inspelning enligt experimentell design. Spara information för vidare analys.

5. Två-foton Imaging Experiment

1. Slå på mikroskopet. Ställ excitationsvåglängden och använda ett lämpligt filter utsläpp. Excitation vid 800 nm och en 607 ± 45 nm bandpassemissionsfilter fungerar bra för avbildning TRITC-dextran.
2. Identifiera höger eller vänster halspulsådern. Att använda trubbiga teknik dissekera halspulsådern från intilliggande bindväv och nerver.
   1. Plocka och håll halspulsådernartär med en hemostat. Knyt tre stycken av sutur runt halspulsådern.
   2. Dra åt tråden närmare hjärtat sida för att stoppa blodflödet och lämna de andra två trådar lös.
   3. Använd fina sax för att göra ett litet snitt i 45 ° vinkel på halspulsådern mellan den bundna tråden och nästa lös tråd.
      OBS: Rengör blod med absorberande papper.
3. Kanylera karotidartären. För in slangen fylls med TRITC-dextranlösning i snitt på halspulsådern ca 5 mm djup inriktad mot valpens huvud.
   1. Dra åt de andra två trådar runt artären för att hålla slangen och artären tillsammans. Dra trådarna, trim och lägga elastomer att ytterligare stabilisera.
      Anmärkning: Det andra sidan av slangen är ansluten till sprutan innehållande TRITC-dextran-lösning (framställd i steg 1.1).
4. Fäst sprutan på sprutpumpen.
   1. Sethastigheten vid karotidartären blodflödeshastigheten i valp. Slå på sprutpump under några sekunder och kontrollera manuellt att färgämnet lösningen kan injiceras i karotidartären. Anmärkning: Om man antar att blodflödeshastigheten i halsartären hos vuxna råttor (240-280 g) är ca 3 ml / min ¹⁴ kan blodflödeshastigheten för en råttunge (t.ex. P10 pup vägande 15-25 g) beräknas till intervallet 0,16 till 0,3 ml / min.
5. Placera djuret under mikroskop målet. Injicera fluorescerande dextran i blodomloppet.
   1. Identifiera områden av intresse på den ventrala hjärnstammen med en 5x luft mål. Växla till en 20X eller 40X mål (nedsänkning i vatten, NA = 0,5 eller 0,8, respektive) för att fokusera på regionen av intresse (ROI).
   2. Börja avbildning och justera bildinsamlingsparametrar (t ex exponeringstid, lasereffekt, detektorns förstärkning) tills fluorescensintensiteten i vaskulaturen av ROI är optimerad (dvs.inte är för låg men inte mättad).
   3. Slå på sprutpumpen för att injicera färgämneslösningen i karotidartären och förvärva en tidsserie till ett fast fokalplan.

6. Djurvård följande procedur

1. Detta är en terminal förfarande. I slutet av ett experiment djur måste avlivas med en överdos av pentobarbital (100 mg / kg, intraperitoneal injektion) eller någon annan metod för dödshjälp godkänd av American Veterinary Medical Association Eutanasi riktlinjer.
   OBS: perfusion genom hjärtat med Ringer-lösning, följt med en fixeringslösning rekommenderas för vidare histologisk analys.

Representative Results

Elektroporering av neurala spårämnen

Den mediala kärnan hos den trapetsformade kroppen (MNTB) är en grupp av celler i superior olivary komplex som tidigare har studerats med hjälp av detta protokoll. Till exempel kan patch clamp-pipetter kan användas för att elektroporera neurala spårämnen (fig 6) ^9. När pipetterna är placerade i närheten av mittlinjen, såsom visas i figur 6a, är resultatet att decussating afferenta axoner är märkta. En två-photon mikroskop utrustat med en hög numerisk apertur nedsänkning i vatten mål kan användas för att bilden fibrerna når MNTB, inklusive mycket fina säkerheter grenar (pilar i figur 6b). Neurala spårämnen kan också levereras till MNTB direkt, såsom visas i fig. 6c. Resultatet är märkning av MNTB celler och afferenta axoner, såsom kan inses av avbildning med lägre numerisk apertur vattenimmersionsobjektiv (figur 6d). Den main fördel med att använda den lägre förstoring mål är att ett bredare synfält kan undersökas, och även om detta leder till en minskning i spatial upplösning på grund av den lägre objektiv numerisk apertur kan individuella MNTB celler urskiljas väl (pilarna i figur 6d) . Den genomsnittliga längden på dessa experiment för åldrarna P1-P5 är 3,1 ± 1,4 timmar (n = 22 valpar).

Elektrofysiologiska registreringar

Spontan sprack bränning är en form av utvecklings elektrisk aktivitet observerats i enstaka MNTB celler före uppkomsten av hörsel ^11,13. Med användning av denna kirurgiska protokollet är det också möjligt att rikta multielektrodtyp kedjor (polytrodes) till MNTB (Figur 7a-b). Resultatet är en inspelning av spontan aktivitet i en ensemble av MNTB celler. Figur 7e visar ett representativt polytrode inspelning från en P6 råtta. I detta experiment var den polytrode belagd med de lipofila färgämnet Dil använderen tunn pensel (se steg 4.1). Efter utförande av inspelning hjärnan bearbetades för histologisk analys och placeringen av Dil-märkta polytrode spår användes för att bekräfta korrekt målinriktning mot MNTB (figur 7d). Den genomsnittliga längden på experiment för åldrarna P1-P6 är 2,0 ± 0,7 timmar (n = 33 valpar).

Mätning mikrokärls permeabilitet

Detta protokoll kan också användas för att utföra två-photon imaging experiment av vaskulär permeabilitet. En fluorescerande löst ämne (TRITC-dextran, molekylvikt 155 kD, Stokes-radie ~ 8,5 nm) löstes i 1% BSA-Ringer-lösning och injiceras i den cerebrala cirkulationen genom en kanyl insatt i halsartären ^14. Till skillnad från svansvenen injektioner, detta förfarande leds förbi hjärtat och introducerar den fluorescerande lösta ämnet direkt in i hjärnan mikrocirkulationen. Figur 8a illustrerar kvaliteten på märkning av blodkärlen, som resulterar från användning av denna procedur. Efter kontinuerligperfusion av märkta lösta ämnen in i blodströmmen är det möjligt att erhålla en tidsförlopp sekvens av en region av intresse, såsom visas i fig. 8b. Den totala fluorescensintensiteten i regionen av intresse mättes offline och en matematisk modell används för att bestämma blod-hjärnbarriären permeabilitet för fluorescensmärkta lösta ämnen (figur 8c) ^15. Den genomsnittliga längden på experiment i evig P9-P10 är 2,3 ± 0,8 timmar (n = 3 valpar).

Figur 1. Relativ placering av ventrala hjärnstams neurala strukturer med avseende på landmärken kärl i den neonatala råttan. Ett, från sidan av hjärnan. B, ventral bild av hjärnan. Stora blodkärl visas i rött och neurala strukturer av intresse är indicated av färg rutor. Inte ritade i skala. AICA = anterior sämre cerebellär artär; bas = basilaris artär; icv = sämre cerebral ven; MCA = mellersta cerebral artär; vert = vertebral artär; VSP = ventrala spinal artär. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2. Kirurgisk setup. Ett, kan operation göras på ett litet bröd bräda (1) som vilar på toppen av en stabil bordsskivan. En värmedyna (2) och en liten djur ventilator (3) kan sättas fast på brödkortet för att underlätta förflyttning av hela preparatet när det behövs. Det lilla djuret fläkten kan drivas av ett batteri (4). En magnethållare (5) kan användas för att säkra noskonen används för att leverera bedövningsmedel. Noskonen kanockså bidra till att säkra huvudet i ett stabilt läge. Om djuret inte behöver flyttas, en mikromanipulator (6) kan användas för att placera sonderna för elektrofysiologi eller neurala spårning experiment. En ljuskälla (7) och en stereoskop (ej på bild) som är nödvändiga för att visualisera landmärkes strukturer under mikrokirurgi. B är liten sax används i steg 1,4. C, Tång används i steg 1.4, 1.6.1, 1.8 och 1.8.1 . d, våren sax används i steg 1.5, 1.6 och 1.7. e är dissekera mejsel används i steg 3.1.2. Skala bar i e = 1 mm, gäller för bd. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 3. Exponera luftstrupen för intubation.a, är djuret bedövas, placeras i liggande läge och säkras med noskonen och tejp (streckade linjer). B, Huden skärs och placeras åt sidan för att avslöja den underliggande fettlagret. c., den överliggande fett och körtlar (visas i grått) skjuts åt sidan för att exponera luftstrupen. Tejp används för att fästa den överliggande huden (streckade linjer). D., är Luftstrupen dissekeras från muskulaturen. E, Visualisering av trakealringar indikerar lyckad borttagning av överliggande muskler. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 4. Intuberande djuret. En, två sutur trådar (vita pilar) är bundna runt luftstrupen(T). B, ska den intubation rör (det) vara tätt kopplad till y röret av djuret respirator. C, är en trakeostomi görs mellan de två sutur trådar (svart pil). D, Ventilationsröret är insatt och två suturtrådar är åtdragna. Ändarna av trådarna dras åt igen i en korsad sätt (anges med vita och svarta pilspetsar). E, är suturen ändelser bundna. F., är suturen ändelser trimmas och intubation är klar. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 5. Ta bort luftstrupen och göra kraniotomi. En är Beredningen stabiliseras med elastomer (område insi de gröna streckade linjer). b., är Luftstrupen identifieras och sedan nedskärningar görs först för att separera luftstrupen från intubation röret, och sedan skära den mandibular musklerna (streckade linjer). c, Rengör ytan av skallen med hjälp av trubbiga teknik för att ta bort muskler och använda absorberande papper för att ta bort fett och blod. d. Exempel på ett rent område visar den sista kotorna (v) och basi-occipital ben (bo). Det finns en naturlig gapet mellan de två benen (svarta pilar). E, Med användning av en mikroborr eller ultraljudsrengöring tunna skallen i en inverterad D form (svarta pilar). Bryta försiktigt uttunnade skallen och ta bort den bit av benet. Landmark kärlsystemet ska vara synliga. F., hög förstoring bild av kärllandmärken på den exponerade hjärnstammen ytan. Bas = basilaris artär; AICA = anterior sämre cerebellär artär. Skala bar i b = 1 mm, gäller för ce.highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

Figur 6. Elektroporation av neurala spårämnen. En, en glaselektrod som innehåller neurala spårmikro ruby var placerad nära mittlinjen (röd cirkel). Spårämnet elektroporerades med användning av 7 andra lång -5 iA pulser varje 14 sekunder under 15 minuter. Efter 1 timme av återhämtning tid den inramade området avbildades med ett två-foton-mikroskop. P1 hos råttungar. B, föredöme z-stack bild av afferenta axon märkning i MNTB. Pilarna pekar på individuella kollaterala grenar. C, en glaselektrod fylld med mikro rubin positionerad ovanpå MNTB (röd cirkel). Den spårades elektro med samma inställningar som beskrivs i ett. Efter 1 timme av återhämtning tid den inramade området varavbildas med en två-foton-mikroskop. P5 hos råttungar. D., föredöme z-stack bild av märkta celler och axoner i MNTB. Pilar anger enkel MNTB celler. Etiketter i b och c anger objektivförstoring och numerisk bländare, respektive. Scale bar in a och c = 300 pm; skalstock i b = 45 um; skalstock i d = 90 um. AICA = anterior sämre cerebellär artär; bas = basilaris artär; r = rostral; l = sidled. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 7. Riktad polytrode inspelning. A, Polytrode består av 4 skaft med 4 elektroder per skaft (svarta cirklar). Intra-och interskaft avstånd mellan elektroderna anges. B, C, högre förstoring bild av landmärken kärl används för polytrode inriktning. Den polytrode Ingen placeras med rostral-laterala koordinater för att rikta den mediala kärnan i den trapetsformade kroppen (röd ruta). D, Posthoc histologiska analys visar korrekt inriktning av Dil belagda polytrode (polytrode spår visas i rött). E, föredöme multi -enhet inspelning. Trace ordning är samma som elektrod ordning i panel a. Inom skaft inspelningar har samma färg. Skala bar i e = 5 sekunder. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 8. In vivo två-photon avbildning av hjärnan mikrokärl. a, 2-D bild (kollapsade Z-stack) av hjärnans kärl efter perfusion av TRITC-dextran 155 kD in i halspulsådern. Området avbildas är liknande den som visas i figur 7c. 20x/0.5 nedsänkning i vatten mål. P10 hos råttungar. B, region av intresse (ROI) som används för att mäta fluorescensintensiteten (röd ram sluten region). Den mikrokärls hade en diameter på ~ 14,2 ^ m och var belägen 182 pm under hjärnstammen ytan. C, typisk kurva av fluorescensintensitet (normaliserat värde) som en funktion av tiden. I ₀ är ökningen steg i fluorescensintensiteten i ROI när fluorescenslösningen fyller bara upp kärllumen. (Di / dt) ₀ och jag ₀ används för att bestämma mikrokärls permeabilitet för det lösta ämnet. Permeabiliteten för TRITC-dextran 155 kD beräknades vara 1,5 x 10 ^-7 cm / sek.Skala bar i b = 100 um, gäller för en. Klicka här för att visa en större bild.

Discussion

Tiden är kritisk. En erfaren forskare ska kunna slutföra detta protokoll i 1 timme (steg 1-3). Tiderna som anges för de olika stegen antar en medelhög till hög kompetens. Korrekt och aktuell trakeotomi och intubation är kritiska, eftersom dålig ventilation kontroll kan leda till kvävning och djuret dör. Noggrann clearance av muskel-och fettvävnader är också mycket viktigt eftersom misstag kan leda till okontrollerad blödning och djuret dör. På samma sätt vid upprättandet av halspulsådern för kanyl insättning, måste man dra åt och skära artären försiktigt, om tråden knut lossnar okontrollerad blödning kommer att ske. Slutligen bör kraniotomi göras försiktigt, utan att störa de landmärken kärlbädden. Vårdslös borttagande av det yttre meningeal skikt (dura) kan leda till allvarlig blödning och skada på det arteriella försörjningen.

Ventilationsinställningarna väljs efter djurets ålder.De flesta kommersiella leverantörer ger användbar information om dessa inställningar. Experiment på råttor äldre än P15 kommer att kräva användning av ett stort djur ventilator. Vuxna djur kanske inte behöver ventilation om bedövas med ketamin / xylazin, men intubation rekommenderas att undvika att vätska kommer in i luftstrupen.

En viktig begränsning i detta protokoll är att experiment endast kan utföras akut. I vårt laboratorium har vi utfört experiment som varar mellan två och upp till tio timmar. En andra begränsning är att experiment måste utföras under anestesi. Därför är valet av narkosmedel en viktig variabel att beakta vid planeringen och utformningen av experiment. En annan risk är att nyfödda djur kan vara särskilt känsliga för överdosering. Till exempel, om du väljer ketamin / xylazin mix, beräkna dosen baserat på valpens vikt och administrera läkemedel på ⅓ av den maximala volymen. Kontrollera tillståndet för djuret varje 5-10 minuter från tå nypa response. Om du använder isofluran, skall säkerhetsåtgärder också behövs för att upprätthålla en säker miljö för forskaren (ventilation, och en riktigt kalibrerad förångare).

Den stereomikroskop kan monteras på en flexibel hållare för att justera betraktningsvinkel och underlätta utrymme klare att placera elektroder och flytt av djuret till två-photon mikroskop. Användning av ett batteri för att driva fläkten kan underlätta att flytta djuret och minska elektriska artefakter under elektrofysiologi experiment. För detta ändamål kan en liten kopplingsdäck (7,5 x 12 inches) användas för att montera ihop ventilatorn värmedyna och sövda djur (Figur 2a). En användbar och viktig modifiering av denna inställning är tillägget av en anordning för övervakning av vitala funktioner under kirurgi. En oxymeter eller andra analoga enheter kan användas beroende på laboratoriebudgeten.

Detta protokoll har använts med elektrofysiologi och bildhantering möttestrågen, inklusive patch clamp inspelningar ^8,10,11, polytrode inspelningar (figur 7) och två-foton-avbildning ⁹ (fig 6 och 8). En möjlig framtida applikation skulle vara att kombinera dessa metoder för inriktning fluorescerande celler för elektrofysiologiska inspelning ^16.

Nya bildprogram kan också innehålla 2-D eller 3-D tidsserier med hjälp av två-photon mikroskopi. Exempelvis med användning av bolus-lastning av kalcium indikatorer för att studera aktiviteten av hjärnstammen neuronala och gliala cellpopulationer. Såsom visas i fig 8, insprutas en färgämneslösning in i blodcirkulationen genom halspulsådern kan användas för att alstra bilder med hög kontrast av hjärnan vasculature. Eftersom fluorescens färgämne fyller mikrokärllumen och sprider sig in i den omgivande vävnaden, kan den användas inte bara för att beräkna den skenbara upplösta ämnet permeabiliteten hos blod-hjärnbarriären, utan även det lösta ämnet diffusion coefligt i hjärnvävnaden ^3. En viktig anledning till att injicera fluorescerande lösta ämnen via halspulsådern är att färglösningen direkt kan gå till mikrokärl i hjärnan utan att gå till hjärtat först som i en svansveninjektion. Detta medför åtminstone två fördelar. En är att den fluorescerande färgämneskoncentrationen i mikrokärls lumen kan vara praktiskt taget konstant om perfusionshastighet är fast vid kanyle platsen. Detta säkerställer noggrann bestämning av blod-hjämbarriären. En annan är att, om ett testmedel ingår i perfusatet, kommer det att gå direkt till blod-hjärnbarriären utan att bli utspädd eller i kombination med andra faktorer från kroppen cirkulationen.

Nya experiment kan också dra nytta av transgena djur med genetiskt kodade fluorescerande reportrar. Detta skulle ge den fördelen att fluorescerande prober inte skulle behöva laddas in situ (om utformningen av experimentetsäger annat), vilket sparar tid och eventuellt möjliggör mer intakta preparat (t ex skallfönster ^17).

Slutligen kan experiment utföras i andra hjärnstamsregioner såsom sämre olivolja eller ansiktsmotorkärnan. Kunskap om neuroanatomi och utveckling av specifika cellpopulationer i en viss art kommer att vara viktigt i detta syfte, särskilt som anatomiska landmärken kan förändras när djuren växer (Figur 1). Vi hoppas att detta protokoll uppmuntrar andra att studera ventrala hjärnstamsstrukturer med hjälp av in vivo-elektrofysiologiska och avbildningsmetoder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbant pads	Kettenbach	Sugi 31603	Other options may be available from different companies
Cautery	Braintree Scientific, INC	GEM 5917	Other options may be available from different companies
Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran	Sigma	T1287-500MG	Other options may be available from different companies
Dissecting Chisel	Fine Science Tools	10095-12	Other options may be available from different companies
DiI	Invitrogen	V-22885	Other options may be available from different companies
Elastomer	World Precision Instruments	KWIK-SIL	Other options may be available from different companies
Fine Scissors	Fine Science Tools	14060-09	Other options may be available from different companies
Forceps	Fine Science Tools	11027-12,11617-12, 11616-16	Other options may be available from different companies
Spring Scissors	Fine Science Tools	15009-08	Other options may be available from different companies
Heating pad	FHC	40-90-2	Other options may be available from different companies
Intubation tubing	Braintree Scientific, INC	BIO CO-KIT	Choose age appropriate size
Light source	Spach Optics	Schott Ace illuminator	Other options may be available from different companies
Micro drill	Braintree Scientific, INC	MD-1200 120V	Other options may be available from different companies
Paper tape	Walgreens	Generic brand	Other options may be available from different companies
Syringe filter	VWR	28145-483	Other options may be available from different companies
Syringe pump	VWR	52459-008	Other options may be available from different companies
Stereomicroscope	Olympus	SZ61	Other options may be available from different companies
Suture	Ethicon	Prolene 86979	6-0 size
Tubing	Braintree Scientific, INC	Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120	Other options depending on pup’s age
Vaporizer (isoflurane)	Vetequip Incorporated	911103	Other options may be available from different companies
Ventilator (minivent)	Harvard Apparatus	730043	Use for P0-P12 rats