En metode å tjene en kraniotomi på ventral Skull of Neonatal Gnagere

Summary

En kirurgisk metode er beskrevet å eksponere ventral skallen i nyfødte rotter. Ved hjelp av denne tilnærmingen er det mulig å åpne en kraniotomi å utføre akutt elektrofysiologi og to-foton mikroskopi eksperimenter i hjernestammen av bedøvet valper.

Abstract

Bruken av en kraniotomi for in vivo-eksperimenter gir en mulighet til å undersøke dynamikken i diverse cellulære prosesser i hjernen hos pattedyr i voksen alder og under utvikling. Selv om de fleste i vivo tilnærminger bruke en kraniotomi å studere hjerneregioner som ligger på ryggsiden, hjernestammen regioner som pons, som ligger på baksiden side forblir relativt lite studert. Hovedmålet med denne protokollen er å lette tilgangen til ventral hjernestrukturer, slik at de kan studeres in vivo ved hjelp av elektrofysiologisk og imaging metoder. Denne tilnærmingen gjør studie av strukturelle endringer i langtrekkende axons, mønstre av elektrisk aktivitet i singel og ensembler av celler, og endringer i blod-hjerne barrieren permeabilitet i nyfødte dyr. Selv om denne protokollen har blitt brukt mest til å studere den auditive hjernestammen i nyfødte rotter, kan det lett bli tilrettelagt for studier i andre gnagerarter som nyfødte mus, voksen rodents og andre hjernestammen regioner.

Introduction

Bruken av en kraniotomi i kombinasjon med fluorescens avbilding og elektrofysiologiske teknikker tillater overvåking blodstrøm, blod-hjerne-barrieren permeabilitet og å måle aktiviteten av neuroner og gliaceller i levende dyr ^1-3. Flere laboratorier har brukt denne tilnærmingen til å gi innsikt i hjernens fysiologi hos friske og sykdomstilstander, men hullene forbli i vår forståelse av hvordan disse prosessene oppstår under utvikling. Videre har de fleste studier fokusert på områder av hjernen som er lett tilgjengelig fra framsiden av skallen, slik at ventral hjernestrukturer med forskjellige fysiologiske roller har blitt studert det meste ved hjelp ex vivo tilnærminger.

Hovedmålet med denne protokollen er å gi en metode for å åpne en kraniotomi på ventral skallen av gnagere. Denne tilnærmingen ble tilpasset fra klassiske studier utført i større pattedyr som hunder og katter for sensoriske nevrofysiologi recordings av den auditive hjernestammen ^4-7. I denne protokollen er det imidlertid den nye utfordringer for å utføre fremgangsmåten i nyfødte dyr. Ved hjelp av landemerker blodkar, har dette tilpasset protokoll blitt brukt tidligere for å studere den auditive hjernestammen av nyfødte rotter, voksne mus og andre hjernestammen regioner som mindreverdig oliven ^8-11 (Figur 1).

En viktig fordel med en ventral craniotomy over eksisterende metoder for å studere ventral hjernestammen atomkjerner er at det gir direkte tilgang til strukturer av interesse i levende dyr. For eksempel er de auditive celler av den overlegne olivary kompleks lokalisert noen titalls mikrometer fra hjernen overflaten, noe som er viktig for målrettet plassering av prober og for bruk av to-foton avbildnings tilnærminger hvor avbildningsdybde kan begrenses til 0,5 mm ved lys vev spredning og absorpsjon. En ventral craniotomy gir også en forberedelse med relativt intakte nerveforbindelser, which blir forstyrret i akutte og organotypic slice forberedelser ^12. I motsetning til andre protokoller for in vivo eksperimenter nevrofysiologi ^13, kan en ventral metode kombineres med flerelektrode-opptak og avbildningsmetoder som gir informasjon om cellulære ensembler (figurene 6 og 7). Til slutt, i kombinasjon med denne protokoll et fluorescensmerkede oppløst stoff kan sprøytes inn i det vaskulære karet for å måle forandringer i blod-hjerne-barrieren permeabilitet til oppløst stoff (figur 8).

Protocol

Følgende protokoll følger retningslinjene dyr omsorg fastsatt av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) på The City College of New York.

En. Animal Intubasjon (10-20 min)

1. Før kirurgi, forberede pattedyr Ringer løsning. Monter de kirurgiske verktøy, varmepute, og små dyr ventilator på benken (figur 2).
   1. For målinger av blod-hjerne-barrieren permeabilitet lage 10 ml med 1% bovint serumalbumin (BSA)-løsning i Ringer og oppløse TRITC-dekstran 155 kD ved 8 mg / ml i 1% BSA-oppløsning, filtrere oppløsningen med 25 mm sprøytefilter (0,2 um pore størrelse) og oppbevar i en foliekledd sprøyte i mørket.
2. Anesthetize dyret ved hjelp av isofluran. Bruk 5,0% for induksjon og 1,5-3,0% for vedlikehold. Alternativt kan en blanding av ketamin (41,7 mg / kg) og xylazin (2,5 mg / kg kropps) kan brukes. Anestesidybden kan kontrolleres ved tå klype refleks avøvre og nedre ekstremiteter.
   1. Påfølgende doser av ketamin (41,7 mg / kg kroppsvekt) og xylazin (2,3 mg / kg kroppsvekt) bør gis i trinn på ⅓ av maksimal dose for å unngå overdosering. Bruk av en gnager ventilator anbefales å motvirke xylazin-indusert respiratorisk depresjon.
3. Plasser bedøvet pup liggende på ryggsiden og sikre dens hode med konussen brukes til å levere narkosen (figur 3a).
   1. Sikre dyret med teip på forgrunnen lemmer og hale (figur 3A).
   2. Et alternativ for å feste pup hode er å bruke en hodeplate festet til en metallstang.
      Merk: Kontroller at varmeputen er satt til 37 ° C for å unngå hypotermi (Figur 3a).
4. En saks (fig. 2b) for å lage en langsgående og fire tverrgående snitt på huden som ligger over halsen (Figur 3b). Bruke sløv teknikk, dissekere huden og legg den til side ved hjelp av tang (Tall 2c og 3c).
   1. Hold huden ned med teip. Stabil hodet i en horisontal posisjon (Figur 3c).
5. Bruke våren saks (figur 2d) og sløv teknikk, push kjertler og fett lag til side for å avdekke luftrøret (figur 3c). Identifiser plasseringen av carotis.
   1. Hold carotis bort fra luftrøret.
      Merk: Punktering halspulsårene kan føre til massive blodtap og død av valpen.
6. Bruke våren saks (figur 2d) dissekere de langsgående musklene som dekker luftrøret. Skjær de langsgående musklene som ligger under luftrøret (figur 3d).
   Merk: tracheal ringer skal være godt synlig (figur 3e).
   1. Bruketang (figur 2c), tie to stykker av sutur rundt luftrøret. Et stykke sutur vil sikre at ventilasjonsrøret, og den andre tråden vil bli brukt til å stenge luftrøret rostral til ventilasjonsrøret innsettingspunktet (figur 4a).
      Merk: Fukt eksponert vev regelmessig med Ringer løsning for å hindre dehydrering.
7. Ved hjelp av fjær saks (figur 2d) gjøre et snitt på én av luftrørsringer som ligger mellom de to tråder som er lagt inn i trinn 1.6.1 (figur 4c).
   Merk: Pass på at ingen væske kommer inn i åpne luftrøret. Væske i luftrøret vil forårsake kvelning.
8. Sett intubasjon røret (figur 4b) inn i luftrøret og stram undertråden for å sikre det. Bruk pinsett (figur 2c), stramme overtråden for å lukke luftrøret posterior til innsettingspunktet av intubasjon røret.
   1. Tighten og trimme endene av de to tråder (fig. 4 d-f).
      Merk: Vapor inne i intubasjon røret er et godt tegn på luftkontroll.
9. Straks slå isofluran tilførselen til respiratoren. Juster slagvolum og ventilasjonsraten i henhold til vekten av dyret.
   1. Tett utsatt omkringliggende vev med elastomer (figur 5a). Holde overflaten fuktig og ren.

2. Trachea og Muscle fjerning for å avsløre Cranium (5-10 min)

1. Bruk fjær saks (figur 2d) til å kutte luftrøret tilstøtende til ventilasjonsrøret. Utfør to kutt langs muskelveggen av munnhulen for å eksponere den caudale enden av ganen (figur 5b).
   Merk: Om nødvendig, bruk en cauterizer å stoppe blødning. Ukontrollert blødning vil føre til død av dyret.
2. Rengjørområdet ved hjelp av store mengder Ringer løsning (Figur 5c). Identifiser mellomrommet mellom den siste virvler og basi-occipital ben (figur 5d).
   Merk: Gapet mellom knoklene er en nyttig skallen landemerke for å finne hjernestammen strukturer. Den mindreverdig oliven er plassert under dette gapet. Den auditive overlegen olivary komplekset ligger under basi-occipital bein i rostral retning fra dette gapet (se også figur 1).
3. Rengjør området med tang (figur 2c) og våren saks (figur 2d). Ikke punktere blodkar.
   Merk: Hvis det er nødvendig, cauterize å stoppe blødning.
   1. Når det eksponerte område er fritt for fett-og muskelvev, bør mellomrom som skiller basi-occipital ben og den siste vertebra være synlig (figur 5d).

Tre. Kraniotomi (15-30 min)

1. Bruk en microdrill eller en ultrasonic cleanser. Finn den mediale vegg av bulla.
   1. Thin skallen ved å gjøre en omvendt D form før de underliggende blodårene er synlige (figur 5e).
      Merk: Den basilaris arterie (bas) kjører på toppen av hjernestammen midtlinjen. Den fremre inferior cerebellar arterie (AICA) grener bilateralt og kan anvendes på en pålitelig måte som landemerker som den har en konstant posisjon i forskjellige dyr.
   2. Når skallen blir tynnet, forsiktig bryte den ved hjelp av en dissekere meisel (2e). Fjern bein stykke med tang (figur 2c). Alternativt, løfte og bryte kraniet ved hjelp av en nål som er bøyd.
      Merk: Gjenta denne prosedyren til størrelsen og formen på kraniotomi er hensiktsmessig for det planlagte forsøket. Bas og AICA skal være synlig gjennom dura membran (figur 5f).
2. Rengjør området flere ganger med fersk Ringer løsning. Ved hjelp av absorberende pads tørke overflaten av dura membran.
   1. Om nødvendig, bruk en sutur nål for å fjerne dura membran uten å fortrenge eller bryte landemerket arterier bas og AICA.
      Merk: Ved dura punktering cerebrospinalvæsken vil strømme ut. Rengjør området med Ringer-løsning og holde fuktet gjennom hele eksperimentet.

4. Elektro Experiment

1. Velg polytrode ifølge eksperimentet (figur 7a). Bruk en fin pensel til å belegge polytrode med DII. Overfør DII løsning i en 1 ml mikro tube, dyppe penselen i løsningen og forsiktig streik polytrode henhold visuell veiledning (dvs. ved hjelp av et stereoskop). Start ved enden av sonden og nøye fortsette inntil alle elektrodene er belagt jevnt.
   1. Plasser jordelektroden inne i munnhulen. Laste polytrode inn elektrodeholderen (Figur 7b
   2. Slå forsterkeren på og sjekke at alle tilkoblinger fungerer godt.
2. Plasser elektroden ovenfor bas på forgrening av AICA (posisjon null). Flytt elektroden til ønsket målpunkt ved hjelp av riktig rostral-lateral koordinere (figur 7c).
   1. Plasser elektroden på hjernens overflate og flytte den til ønsket dybde i trinn på 5-10 mikrometer.
3. Utfør opptak i henhold til eksperimentell design. Lagre data for videre analyse.

5. To-foton Imaging Experiment

1. Slå på mikroskopet. Sett eksitasjon bølgelengde og bruke en egnet utslipp filter. Eksitasjon ved 800 nm og en 607 ± 45 nm båndpassfilter utslipps fungerer godt for avbilding TRITC-dekstran.
2. Identifiser høyre eller venstre halspulsåren. Bruke sløv teknikk dissekere halspulsåren fra de tilstøtende bindevev eller nerver.
   1. Plukk og hold carotisarterie med en hemostat. Bind tre stykker av sutur rundt halspulsåren.
   2. Stram tråden nærmere hjertet side for å stanse blodstrøm og la de to andre tråder løs.
   3. Bruk gode saks for å lage et lite snitt i en 45 ° vinkel på halspulsåren mellom bundet tråden og den neste løs tråd.
      Merk: Rengjør blod med absorberende papir.
3. Cannulate halspulsåren. Sett slangen fylt med TRITC-dekstran-løsning i snitt på karotidarterien ca 5 mm dype orientert mot pup hode.
   1. Stram de to andre tråder rundt arterien for å holde slangen og arterien sammen. Stram trådene, trim og legge elastomer til ytterligere stabilisere seg.
      Merk: Den andre siden av slangen er forbundet med sprøyten innehold TRITC-dekstran-løsning (fremstilt i trinn 1.1).
4. Fest sprøyten på sprøytepumpen.
   1. Sethastigheten karotidarterien blodstrømningshastighet på pup. Slå på sprøytepumpe i noen få sekunder, så at manuelt fargestoffet løsningen kan injiseres i karotidarterien. Merk: Forutsatt at blodmengde i halspulsåren av voksne rotter (240-280 g) er ca 3 ml / min ^14, kan blodmengde for en rotteavkom (f.eks P10 valp som veier 15-25 g) beregnes til området 0,16 til 0,3 ml / min.
5. Plasser dyret under mikroskopet målet. Injisere fluorescerende dekstran i blodet.
   1. Identifisere områder av interesse på ventral hjernestammen med en luft mål 5X. Bytt til en 20X eller 40X objektiv (nedsenking i vann, NA = 0,5 eller 0,8, henholdsvis) å fokusere regionen av interesse (ROI).
   2. Begynn bildebehandling og justerer bildeinnlastingen parametere (for eksempel eksponeringstid, laser makt, detektor gain) til fluorescens intensiteten i blodkar av ROI er optimalisert (dvs.ikke er for lavt, men ikke til mettet).
   3. Slå på sprøytepumpe for å tilføre fargestoff oppløsningen inn i halspulsåren, og tilegne en tidsserie til en fast fokalplan.

6. Animal Care følge fremgangsmåte

1. Dette er en terminal prosedyre. På slutten av et eksperiment dyr må avlives med en overdose av Pentobarbital (100 mg / kg, intraperitoneal injeksjon) eller noen annen metode for aktiv dødshjelp er godkjent av American Veterinary Medical Association Eutanasi retningslinjer.
   Merk: Perfusjons gjennom hjertet med Ringer løsning fulgt med en fiksativ løsning er anbefalt for videre histologisk analyse.

Representative Results

Electroporation av nevrale tracere

Den mediale kjernen av trapesens legemet (MNTB) er en gruppe av celler i den overlegne olivary kompleks som har blitt studert tidligere bruk av denne protokoll. For eksempel kan patch clamp pipetter benyttes til å electroporate nevrale tracere (figur 6) ^9. Når pipetter er plassert i nærheten av midtlinjen, som vist på figur 6a, er resultatet at decussating afferente aksoner er merket. En to-foton mikroskop utstyrt med en høy numerisk apertur vannimmersjonsobjektiv kan benyttes til bilde fibrene som når MNTB, inkludert svært fine sikkerhet grener (piler i figur 6b). Neural tracere kan også bli levert til MNTB direkte, som vist på figur 6c. Resultatet er merking av MNTB celler og afferente aksoner, som kan bli satt pris på ved avbildning med en lavere numerisk apertur vannimmersjonsobjektiv (fig. 6d). Den main Fordelen med lavere forstørrelse formål er at et bredere synsfelt kan undersøkes, og selv om dette resulterer i en reduksjon i romlig oppløsning på grunn av det lavere objektiv numerisk apertur, kan individuelle MNTB celler skjelnes brønn (pilene i fig 6d) . Den gjennomsnittlige varigheten av disse eksperimentene for aldre P1-P5 er 3,1 ± 1,4 timer (n = 22 valper).

Elektrofysiologiske opptak

Spontan burst skyting er en form for utviklings elektrisk aktivitet observert hos enkelte MNTB celler før utbruddet av å høre ^11,13. Ved hjelp av dette kirurgiske protokoll er det også mulig å målrette multielectrode matriser (polytrodes) til MNTB (figur 7a-b). Resultatet er et opptak av spontan aktivitet i et ensemble av MNTB celler. Figur 7e viser et representativt polytrode opptak fra en P6 rotte. I dette eksperimentet ble polytrode belagt med lipophylic fargestoff DII hjelpen tynn pensel (se trinn 4.1). Etter å ha utført den opptaket hjernen ble bearbeidet for histologisk analyse og plasseringen av DII merkede polytrode spor ble anvendt for å bekrefte riktig rettet til MNTB (figur 7d). Den gjennomsnittlige varigheten av eksperimenter for aldre P1-P6 er 2,0 ± 0,7 timer (n = 33 valper).

Måling microvessel permeabilitet

Denne protokollen kan også benyttes til å utføre to-foton avbildnings eksperimenter av vaskulær permeabilitet. En fluoriserende oppløste stoff (TRITC-dextran, MW 155 kD, Stokes radius ~ 8,5 nm) ble oppløst i 1% BSA Ringers løsning og injisert i den cerebrale sirkulasjon via en kanyle satt inn i halspulsåren ^14. Til forskjell fra halevenen injeksjoner, denne prosedyren omgår hjertet og innfører det fluorescerende oppløst stoff direkte inn i hjernen mikrosirkulasjonen. Fig. 8a illustrerer kvaliteten på merking av blod blodkar som et resultat av å bruke denne fremgangsmåten. Etter kontinuerligperfusjon av merkede oppløste stoffer inn i blodstrømmen er det mulig å oppnå en tidsintervallsekvensen for et område av interesse, slik som vist i figur 8b. Den totale fluorescensintensitet i regionen av interesse ble målt frakoblet, og en matematisk modell som brukes for å bestemme blod-hjerne-barrieren permeabilitet til fluorescensmerkede oppløste stoffer (figur 8c) ^15. Den gjennomsnittlige varigheten av eksperimenter for aldre P9-P10 er 2,3 ± 0,8 timer (n = 3 valper).

Figur 1 Relativ plassering av ventral hjernestammen nevrale strukturer med hensyn til landemerker blodkar i den nyfødte rotte.. En, Sidevisning av hjernen. B, ventral view av hjernen. Store blodårer er vist i rødt og nevrale strukturer av interesse er indicated etter farge firkanter. Ikke trukket til skala. AICA = anterior underlegne lillehjernen arterie; bas = basilaris arterien; ICV = mindreverdig cerebral vene; MCA = midten cerebral arterie; vert = ryggvirvel arterien; VSP = ventral spinal arterie. Klikk her for å se større bilde.

Figur 2. Kirurgisk oppsett. A, kan kirurgi utføres på en liten brød bord (1) som hviler på toppen av en stabil bordplaten. En varmepute (2) og et lite dyr ventilator (3) kan festes til brød brett for å lette flytting av hele preparatet når det er nødvendig. Den lille dyret ventilator kan drives av et batteri (4). En magnetholder (5) kan brukes til å feste nesepartiet brukes til å levere narkosen. Nesen membran kanogså bidra til å sikre hodet i en stabil posisjon. Hvis dyret ikke behøver å bli flyttet, en mikromanipulator (6) kan benyttes for å posisjonsfølere for elektro eller nevrale tracing eksperimenter. En lyskilde (7) og et stereoskop (ikke illustrert) som er nødvendige for å visualisere Landmark strukturer under mikrokirurgi. B., er liten saks anvendes i trinn 1.4. C., blir tenger benyttes i trinn 1.4, 1.6.1, 1.8.1 og 1.8 . d, blir våren saks brukes i trinn 1.5, 1.6 og 1.7. e, er dissekere meisel brukes i trinn 3.1.2. Scale bar i e = 1 mm, gjelder bd. Klikk her for å se større bilde.

Figur 3.. Utsette luftrøret for intubasjon.en, er det dyret bedøves, plasseres i liggende stilling og sikret med nesepartiet og tape (stiplede linjer). b, er huden kuttet og plassert til side for å avdekke underliggende fett laget. c, Den overliggende fett og kjertler (vist i grått) blir skjøvet til side for å avdekke luftrøret. Tape brukes til å sikre den overliggende huden (stiplede linjer). D, er Luftrøret dissekert fra muskulaturen. E, Visualisering av tracheal ringer indikerer vellykket fjerning av overliggende muskel. Klikk her for å se større bilde.

Figur 4 intubere dyret.. En, er to sutur tråder (hvite piler) knyttet rundt luftrøret(T). B., må den intubasjon rør (it) være tett forbundet med y øret til dyret ventilator. C, er en trakeostomi laget mellom de to sutur tråder (sort pil). D, Ventilasjonsrøret er innsatt og den to sutur tråder er strammet. Endene av trådene er strammet igjen i en krysset mote (angitt med hvite og svarte pilspisser). E, er sutur avslutninger bundet. F, er sutur avslutninger trimmet og intubasjon er fullført. Klikk her for å se større bilde.

Figur 5. Fjerne luftrøret og gjør kraniotomi. En, er Utarbeidelse stabilisert med elastomer (område insi de grønne stiplede linjer). b, er Luftrøret identifisert og deretter kutt er gjort først å skille luftrøret bort fra intubasjon røret, og deretter å kutte de kjevemusklene (stiplede linjer). c, Rengjør overflaten av skallen hjelp sløv Teknikken for å fjerne muskel og bruke absorberende papir for å fjerne fett og blod. d. Eksempel et rent område viser den siste virvler (v) og basi-occipitale ben (bo). Det er en naturlig gap mellom de to bein (svarte piler). E, Bruke en microdrill eller ultralyd cleanser tynn skallen i en invertert D form (svarte piler). Forsiktig bryte tynnet skallen og fjern stykke bein. Landmark blodkar skal være synlig. F, Høy forstørrelse visning av vaskulære landemerker på den eksponerte hjernestammen overflaten. Bas = basilaris arterien; AICA = anterior underlegne lillehjernen arterie. Scale bar i b = 1 mm, gjelder ce.highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.

Figur 6. Electroporation av nevrale sporstoffer. En, en glasselektrode som inneholder nevrale tracer mikro-rubin ble plassert i nærheten av midtlinjen (rød sirkel). Den tracer ble electroporated bruker syv andre lang -5 μA pulser levert hver 14 sekunder i 15 minutter. Etter 1 time for utvinning tid eske området ble fotografert med en to-foton mikroskop. P1 rotteavkom. B, Forbilde z-stack bilde av afferent axon merking i MNTB. Pilene peker på de enkelte sikkerhets grener. C, ble en glasselektrode fylt med mikro-rubin plassert på toppen av MNTB (rød sirkel). Den tracer ble elektroporert med de samme innstillinger som er beskrevet i en. Etter en time med utvinning tid eske området varavbildes med en to-foton mikroskop. P5 rotteavkom. D, Forbilde z-stack bilde av merket celler og axons i MNTB. Pilene angir enkelt MNTB celler. Etiketter i b og c viser objektivforstørrelsen og numerisk apertur, henholdsvis. Scale bar i en og c = 300 mikrometer; Målestokk i b = 45 mikrometer; Målestokk i d = 90 mikrometer. AICA = anterior underlegne lillehjernen arterie; bas = basilaris arterien; r = rostral; l = lateral. Klikk her for å se større bilde.

Figur 7. Målrettet polytrode opptak. En, består Polytrode av fire Shanks med fire elektroder per skaft (svarte sirkler). Intra-og internakke avstander mellom elektrodene er indikert. B, C, høyere forstørrelse visning av blodkar landemerker som brukes for polytrode målretting. Den polytrode er plassert ved hjelp av rostral-lateral koordinater for å målrette den mediale kjernen av trapes kroppen (rød boks). D, Posthoc histologisk analyse demonstrerer riktig målretting av DII-belagt polytrode (polytrode sporet vises i rødt). E, Forbilde multi -unit-opptak. Trace rekkefølge er den samme som elektroden orden i et panel. Innenfor tange opptak har samme farge. Scale bar i e = 5 sekunder. Klikk her for å se større bilde.

Figur 8. In vivo to-foton avbildning av hjernen microvessels. a, 2-D bilde (kollapset Z-stabel) av hjernens blodkar etter perfusjon av TRITC-dekstran 155 kD inn karotidarterien. Området avbildes er lik den som er vist på figur 7c. 20x/0.5 vannimmersjonsobjektiv. P10 rotteavkom. B, Region av interesse (ROI) som brukes til å måle fluorescens intensitet (rød ramme vedlagt region). Den microvessel hadde en diameter på ~ 14,2 mikrometer og 182 mikrometer ble plassert under hjernestammen overflate. C, typisk kurve for fluorescensintensitet (normalisert verdi) som en funksjon av tiden. Jeg ₀ er det trinnet økning i fluorescens intensitet i ROI når fluorescens løsningen bare fyller opp årehulrommet. (DI / dt) ₀ og I ₀ benyttes for å bestemme microvessel permeabilitet for oppløst stoff. Permeabiliteten til TRITC-dekstran 155 kD ble beregnet å være 1,5 x 10 ^-7 cm / sek.Scale bar i b = 100 mikrometer, gjelder en. Klikk her for å se større bilde.

Discussion

Tiden er kritisk. En erfaren forsker bør være i stand til å fullføre denne protokollen i en time (trinn 1-3). Oppgitte for de ulike trinnene ganger anta en middels til høy kompetanse. Riktig og rettidig trakeotomi og intubasjon er kritisk, ettersom dårlig ventilasjon kontroll kan føre til kvelning og død av dyret. Nøye clearance av muskel-og fettvevet er også meget viktig, fordi feil kan føre til ukontrollert blødning og død av dyret. Tilsvarende, når du forbereder halspulsåren for kanyle innsetting, må man stramme og kutte pulsåren nøye, hvis tråden knute blir løs ukontrollert blødning vil finne sted. Endelig bør craniotomy gjøres nøye, uten å forstyrre de landemerker blodkar. Uaktsom fjerning av det ytre hinne-lag (Dura) kan føre til alvorlig blødning og skade av arteriell tilførsel.

Ventilasjonsinnstillinger er valgt i henhold til alder på dyret.De fleste kommersielle leverandører gir nyttig informasjon om slike innstillinger. Forsøk på rotter eldre enn P15 vil kreve bruk av et stort dyr ventilator. Voksne dyr trenger kanskje ikke ventilasjon hvis bedøvet med ketamin / xylazin, men intubasjon anbefales å unngå væsken inn i luftrøret.

En hoved begrensning av denne protokollen er at eksperimenter kan kun utføres akutt. I vårt laboratorium har vi utført eksperimenter som varer mellom to og opp til ti timer. En annen begrensning er at eksperimenter må utføres under anestesi. Derfor er valg av anestesi en viktig variabel for å vurdere i planlegging og utforming av eksperimenter. Et beslektet problem er at nyfødte dyr kan være spesielt følsomme for overdosering. For eksempel, hvis du velger ketamin / xylazin mix, beregne dosen basert på pup vekt og administrere legemidler på ⅓ av maksimalt volum. Sjekk tilstanden til dyret hvert 5-10 minutter med tå klype response. Hvis du bruker isofluran, er forholdsregler også nødvendig for å opprettholde et trygt miljø for etterforskeren (god ventilasjon, og en riktig kalibrert fordamper).

Den stereomikroskop kan være montert på en fleksibel holderen for å justere synsvinkel og letter plass klaring for å plassere elektrodene og flytting av dyret til to-foton-mikroskop. Bruk av et batteri for å drive ventilatoren kan det lettere å flytte dyret og redusere elektriske gjenstander under elektrofysiologiske eksperimenter. For å oppnå dette, kan en liten brødfjel (7,5 x 12 inches) brukes til å montere sammen ventilator, varmeputen og bedøvet dyret (figur 2a). En nyttig og viktig modifikasjon til dette oppsettet er i tillegg en enhet for overvåking av vitale tegn under operasjonen. En oxymeter eller andre analoge enheter kan brukes avhengig av laboratoriet budsjett.

Denne protokollen har blitt brukt med elektrofysiologi og bildebehandling møtthods, inkludert patch clamp opptak ^8,10,11, polytrode opptak (figur 7), og to-foton bildebehandling ⁹ (Tall 6 og 8). En mulig fremtidig anvendelse ville være å kombinere disse metoder for målretting fluorescensmerkede celler for elektro opptaket ^16..

Nye bildebehandlingsapplikasjoner kan også omfatte 2-D eller 3-D-tidsserier ved hjelp av to-fotonmikroskopi. For eksempel, ved hjelp av bolus-lasting av kalsium indikatorer for å undersøke aktiviteten av hjernestammen neuronal og glial cellepopulasjoner. Som vist i figur 8, et fargestoff oppløsning injisert inn i blodsirkulasjonen gjennom halspulsåren kan brukes til å generere bilder av hjernens blodkar med høy kontrast. Som fluorescens fargestoff fyller microvessel lumen og sprer seg inn i det omgivende vev, kan det brukes ikke bare for å beregne den tilsynelatende oppløste stoff permeabilitet av blod-hjernebarrieren, men også det oppløste stoffet diffusjon coeftiv i hjernevev ^tre. En hovedårsak for injisering av de fluorescensmerkede oppløste stoffer via halspulsåren, er at fargeløsning kan gå direkte til de microvessels i hjernen uten å gå til hjertet først som i en halevene-injeksjon. Dette fører i det minste to fordeler. Den ene er at fluorescens fargestoff konsentrasjonen i microvessel lumen kan være praktisk talt konstant dersom perfusjon frekvensen er fastsatt til kanylering side. Dette sikrer nøyaktig bestemmelse av blod-hjerne-barrieren permeabilitet. En annen er at hvis et testmiddel er inkludert i perfusatet, vil den gå direkte til blod-hjerne-barrieren uten å bli fortynnet eller i kombinasjon med andre faktorer fra kroppen sirkulasjon.

Nye eksperimenter kan også dra nytte av transgene dyr med genetisk kodet fluorescerende reportere. Dette vil gi den fordelen at fluorescerende prober ikke trenger å bli lastet in situ (med mindre utformingen av eksperimentetsier noe annet), noe som sparer tid og muligens noe som åpner for flere intakte preparater (f.eks kranievindus ^17).

Endelig kan eksperimenter gjøres på andre hjerneregioner som mindreverdig oliven eller ansikts motor kjernen. Kunnskap om nevroanatomi og utvikling av spesifikke cellulære populasjoner i en gitt art vil være viktig å få til dette, særlig når anatomiske landemerker kan endres etter hvert som dyrene vokser (Figur 1). Vi håper denne protokollen oppfordrer andre til å studere ventral hjernestrukturer ved hjelp av in vivo elektrofysiologisk og imaging metoder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbant pads	Kettenbach	Sugi 31603	Other options may be available from different companies
Cautery	Braintree Scientific, INC	GEM 5917	Other options may be available from different companies
Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran	Sigma	T1287-500MG	Other options may be available from different companies
Dissecting Chisel	Fine Science Tools	10095-12	Other options may be available from different companies
DiI	Invitrogen	V-22885	Other options may be available from different companies
Elastomer	World Precision Instruments	KWIK-SIL	Other options may be available from different companies
Fine Scissors	Fine Science Tools	14060-09	Other options may be available from different companies
Forceps	Fine Science Tools	11027-12,11617-12, 11616-16	Other options may be available from different companies
Spring Scissors	Fine Science Tools	15009-08	Other options may be available from different companies
Heating pad	FHC	40-90-2	Other options may be available from different companies
Intubation tubing	Braintree Scientific, INC	BIO CO-KIT	Choose age appropriate size
Light source	Spach Optics	Schott Ace illuminator	Other options may be available from different companies
Micro drill	Braintree Scientific, INC	MD-1200 120V	Other options may be available from different companies
Paper tape	Walgreens	Generic brand	Other options may be available from different companies
Syringe filter	VWR	28145-483	Other options may be available from different companies
Syringe pump	VWR	52459-008	Other options may be available from different companies
Stereomicroscope	Olympus	SZ61	Other options may be available from different companies
Suture	Ethicon	Prolene 86979	6-0 size
Tubing	Braintree Scientific, INC	Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120	Other options depending on pup’s age
Vaporizer (isoflurane)	Vetequip Incorporated	911103	Other options may be available from different companies
Ventilator (minivent)	Harvard Apparatus	730043	Use for P0-P12 rats