Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Vurdering af Vascular Regeneration i CNS Brug af musen Retina

doi: 10.3791/51351 Published: June 23, 2014

Summary

Det gnaver nethinden har længe været anerkendt som en tilgængelig vindue til hjernen. I denne tekniske papir giver vi en protokol, der anvender musemodel af oxygen-induceret retinopati at undersøge de mekanismer, der fører til svigt af vaskulær regenerering inden for det centrale nervesystem efter iskæmisk skade. Det beskrevne system kan også udnyttes til at undersøge strategier til at fremme genvækst af funktionelle blodkar i nethinden og centralnervesystemet.

Abstract

Gnavere nethinden er måske den mest tilgængelige pattedyr system til at undersøge neurovaskulær samspil inden for det centrale nervesystem (CNS). Det er i stigende grad anerkendt, at flere neurodegenerative sygdomme som Alzheimers, multipel sklerose, og amyotrofisk lateral sklerose indeholder elementer vaskulær kompromis. Desuden er de mest fremtrædende årsager til blindhed hos pædiatriske og arbejdsvilkår aldersgrupper (præmatur retinopati og diabetisk retinopati, henholdsvis) er kendetegnet ved vaskulær degeneration og svigt af fysiologisk vaskulær genvækst. Formålet med denne tekniske rapport er at give en detaljeret protokol til at studere CNS vaskulær regenerering i nethinden. Fremgangsmåden kan anvendes til at belyse molekylære mekanismer, der fører til svigt af vaskulær vækst efter iskæmisk skade. Desuden kan udforskes potentielle terapeutiske modaliteter for at fremskynde og genoprette sunde vaskulære plexus. Resultaterne obtained ved hjælp af den beskrevne fremgangsmåde kan give terapeutiske muligheder for iskæmiske retinopatier som den, diabetes eller præmaturitet og muligvis gavne andre vaskulære forstyrrelser i centralnervesystemet.

Introduction

Gennem CNS udvikling, nerver, immunceller og blodkar etablere bemærkelsesværdigt koblede netværk for at sikre tilstrækkelig vævsperfusion og tillade overførsel af sensorisk information 1-5. Fordelingen af vaskulære systemer resulterer i utilstrækkelig iltningen af vævet og kompromitteret metabolisk forsyning og er i stigende grad anerkendt som en vigtig bidragyder til patogenesen af neurodegenerative sygdomme 6. Vaskulær frafald og forværringen af neurovaskulær enhed i hjernen, for eksempel, er forbundet med vaskulær demens, vaskulære læsioner i den hvide substans i hjernen 7 og Alzheimers sygdom med stenose af arterioler og små fartøjer 8. Desuden er nedsat vaskulær barriere funktion menes at bidrage multipel sklerose 9 og amyotrofisk lateral sklerose 10.

Direkte relevans for den retinale model beskrevet i denne protokol, blændendesygdomme, såsom diabetisk retinopati 11 og præmatur retinopati 12, er 13, kendetegnet af en fase med tidlig vaskulær degeneration. Den efterfølgende iskæmisk stress på neurovascular nethinden udløser en anden fase af overdreven og patologisk neovaskularisering som sandsynligvis stammer som en kompenserende reaktion genetablere ilt og energiforsyning 14-16. En attraktiv strategi for at overvinde den iskæmiske stress, der er centralt for sygdomsprogression er at genoprette funktionelle vaskulære netværk specifikt i iskæmiske områder af neuro-nethinden (figur 2 og 3). Fremprovokere en kontrolleret angiogene respons kan komme på tværs som kontra-intuitivt for en tilstand, hvor anti-angiogenese behandlinger såsom anti-VEGFs betragtes som tilpassede behandlinger. Alligevel er bevis for gyldigheden af ​​denne tilgang montering. For eksempel, øge "fysiologisk-lignende" vaskulær genvækst i ischemic retinopatier er elegant demonstreret gennem indførelse af endotel præcursorceller 17, hæmning af Müller celle-udtrykte VEGF-induceret nedregulering af andre angiogene faktorer 18, injektion af myeloide stamceller 19, hæmning af NADPH oxidase induceret apoptose 20, stigende kosten ω-3 polyumættede fedtsyrer syre indtag 21 behandling med et carboxyterminalt fragment af tryptophan tRNA-syntetase 22 og direkte indgivelse af VEGF eller FGF-2 til beskyttelse af gliaceller 23. Desuden har vi påvist, at modulerende klassiske neuronale vejledning tidskoder såsom Semaphorins eller Netrins i iskæmiske retinopatier accelererer vaskulær regenerering af sunde fartøjer i nethinden og dermed reducerer patologisk angiogenese 24, 25. Af direkte klinisk relevans, flere af de førnævnte dyreforsøg bevis for, at fremme vaskulær regeneration i den tidlige fase af iskæmisk retinopati kan reducere synstruende præ-retinal neovaskularisering 19, 23, 24, 26, sandsynligvis gennem reduktion af iskæmisk byrde.

Udarbejdelse af terapeutiske strategier, der stimulerer regenerering af funktionelle fartøjer fortsat en stor udfordring for vaskulære biologer. Her beskriver vi et eksperimentelt system, der beskæftiger musemodel af ilt-induceret retinopati (OIR) at undersøge strategier til at modulere vaskulære genvækst i nethinden. Udviklet af Smith et al. I 1994 27, denne model fungerer som en proxy for menneskerettigheder proliferative retinopati og består af udsætte P7 museunger til 75% O 2, indtil P12 og derefter re-introducere hvalpene til omgivende rum O 2-spænding (Figur 1). Dette paradigme løst efterligner et scenarie, hvor en tidlig spædbarn er ventileretmed O 2. Eksponeringen af museunger til hyperoxi provokerer degeneration af retina kapillærer og microvasculature, og giver en reproducerbar område af vaso-udslettelse (VO), typisk vurderes ved udrejse fra O 2 på P12, selvom maksimal VO område nås ved 48 timer (P9) efter eksponering til O 2 28. Hos mus, de avaskulære VO zoner spontant regenerere i løbet af ugen efter re-introduktion til rumluft og til sidst VO zoner er fuldstændig re-vaskulariseret (Figur 2). Reintroduktion til rumluft af mus udsat for OIR provokerer også præ-retinal neovaskularisering (NV) (maksimal ved P17), der typisk vurderes at bestemme effektiviteten af ​​anti-angiogene behandling paradigmer. I sin reneste form, det OIR model giver en meget reproducerbar og kvantificerbar redskab til at vurdere ilt-induceret vaskulær degeneration og bestemme omfanget af destruktive præ-retinal neovaskularisering 29-31.

30, 31. Her giver vi en enkel trin-for-trin procedure at undersøge graduering af fysiologiske revaskularisering inden den neurale nethinde ved farmakologiske forbindelser, potentielle lægemidler, virale vektorer eller studere indflydelsen af ​​kandidatgener i transgene eller knockout-mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik erklæring: Alle dyreforsøg klæber retningslinjer dyrepleje oprettet af Foreningen for Forskning i Vision og Oftalmologi (ARVO) Redegørelse for anvendelsen af dyr i Ophthalmic og Vision Research og Canadian Råd Animal Care.

1.. Oxygen retinopati (OIR)

  1. Optag fødselsdato museunger som P0.
  2. Registrere alle dyrs vægt ved indrejsen i O 2 for at sikre en passende vægt rækkevidde. Bemærk: C57BL / 6 mus ved P17, bør kropsvægten ligge mellem 5 og 7,5 g for maksimal NV 32. For at opretholde miljømæssig konsekvens, anbefales det at bruge kuldsøskende som kontrol (for genmodificerede mus samt mus, der modtog eksperimentelle behandlinger). Ved vurderingen virkningerne af en viral vektor, må man overveje tropisme af virus og give tilstrækkelig tid til fuldt udtryk af viralt leverede transgener. Hurtigt udtrykke viralvektorer, såsom 3. generations lentivira 24, 25, 33 anbefales.
  3. Place museungers på P7 (C57BL / 6 eller ønsket stamme) og en CD1 fremme mor ind i en ilt kammer fastsættes til 75% O 2 i 5 dage 27. Miljø luftfugtighed og temperatur blev holdt konstant gennem O 2 eksponering. Bemærk: Forskning faciliteter udstyret med en central kilde til O 2 er ideelle og begrænse besværlige udskiftning af tomme O 2 tanke. Hvis du arbejder med transgene eller knockout-mus, er det vigtigt at sikre, at kontrol og eksperimenterende mus er erhvervet fra den samme leverandør til at begrænse genetiske driver inden for de samme stammer 30, 29..
  4. På P12, fjerne mus fra ilt kammer og returnere dyr til omgivende O 2.

2.. Intravitreal injektion for Levering af forbindelser til Inner Retina (When vurdering af effekter et Farmakologisk Compound eller rekombinant protein)

  1. På P14, bedøver mus med 2% isofluran i oxygen 2 L / min (eller dyrebeskyttelse udvalg godkendt bedøvelsesmiddel af valg). For at kontrollere effektiviteten af ​​anæstesi, sekventielt klemme halen, bageste fod og øre med en pincet.
  2. Anbring musen på sin mave.
  3. Ved hjælp af en steril 10 pi sprøjte forsynet med en affaset trukket glas nål, udføre en injektion af en maksimal mængde på 1 ml af opløsningen, der indeholder forbindelsen, der undersøges eller vehikel (fysiologisk saltvand) ved den bageste limbus i øjet, med en 45 ° vinkel undgå linsen. Bemærk: trukket glas nål er fastgjort til sprøjten ved hjælp af en dråbe epoxy-harpiks.
  4. Påfør en dråbe smøremiddel oftalmologiske salve (helst med antibiotika) med en vatpind til musen øje.
  5. Retur musen tilbage til buret med fremme mor. Mus bliver derefter omhyggeligt overvåges, indtil redækket og fuldt ambulant.

3.. Vurdering af Vessel perfusion og barrierefunktion (integritet) ved fluoresceinangiografi

  1. Bedøver mus med 2% isofluran i oxygen 2 L / min (eller dyrebeskyttelse udvalg godkendt bedøvelsesmiddel af valg). For at kontrollere effektiviteten af ​​anæstesi, sekventielt klemme halen, bageste fod og øre med en pincet. Bemærk: Dette er typisk udføres på P17 når regenerering vurderes. Også carry-analysen på P19 og P21 at afgøre, om vaskulær integritet er intakt over tid.
  2. Når bedøvet, vejer musen.
  3. Lav en midterlinjen mave snit med dissekere saks. Bemærk: dissektionsinstrumenter bør kontrolleres regelmæssigt og skærpet.
  4. Skær ribben sideværts og hæve brystkassen ved hjælp af pincet. Bemærk: Det er nødvendigt at skære så sideværts som muligt for at undgå skader på hjerte.
  5. Efter at have fjernet peripHeral væv fra hjertet, klemme aorta descendens med hæmostatiske pincet.
  6. Injicer langsomt fluoresceinmærket dextran til venstre ventrikel ved anvendelse af en 25 G nål. Bemærk: Hvis vaskulær barriere funktion er undersøgt, er 70 kDa fluorescein-dextran ansat, da det vil sive ud af fartøjer, når fartøjets integritet er kompromitteret. Hvis investigator ønsker at kaste blodkar, er 2 MDa fluorescein-dextran anvendes. Kritiske trin: 1) for at sikre en homogen fordeling, centrifuge fluorescein-dextran og injicerer supernatanten, 2) For at forebygge fartøj konstriktion, injicere varmet fluoresceinkonjugeret dextranopløsningen, 3) dens cirkulation tid bør ikke overskydende 4 min.
  7. Halshugge mus 2 min efter injektion med drifts-saks.

4.. Enucleation og Eye Fiksering

Bemærk: Ved vurderingen satser vaskulær regenerering, først samle nethinder på P12 og derudover på P14 og P17. Øge antallet af tid prøvepunkts for mere nøjagtig bestemmelse af satserne for revaskularisering 24.

  1. Vip musen hovedet og placere den på sin side.
  2. Fjern hud og øjenlåg dækker øjet ved hjælp af dissekere saks.
  3. Placer buede pincet under øjet og træk det forsigtigt op, indtil synsnerven er brudt.
  4. Drej musens hovedet på sin anden side og udføre de samme trin (trin 4.2 og 4.3).
  5. For at sikre en bedre gennemtrængning af fiksativ punktere et hul i det forreste kammer i øjet under anvendelse af 30 G nål.
  6. Overfør øjne til et rør indeholdende 4% paraformaldehyd (PFA) og fikseres i 1 time ved stuetemperatur.
  7. Fjern PFA og vask øjnene 4 gange med en opløsning af iskold PBS.

5.. Retinal Dissektion

  1. Placer mus øjne i en petriskål indeholdende kold PBS og udføre dissektion af nethinder under et stereomikroskop.
  2. Fjern ekstra fedt / vævet omkring øjet med mikro-dissektion scissors.
  3. Skær hornhinden med mikro-dissektion saks.
  4. Ved hjælp af to par tænger, minutiøst skræl senehinden væk fra periferien mod synsnerven og kasseres.
  5. Klem linsen (hvidlig bold under hornhinden) med pincet og udtrække det fra øjet kop. Brug en tang som en støtte, og den anden til greb og løft forsigtigt og fjern objektivet.
  6. Frigør de hyaloid skibe fra den indvendige side af nethinden ved hjælp af små børster (størrelse 0) og pincetter.
  7. Fjern bundter af hyaloid fartøjer er forbundet til den optiske disk ved hjælp pincet.
  8. Overførsel dissekeret nethinder til 2 ml mikrocentrifugerør indeholdende PBS og anbring på is før du starter farvningsproceduren.

6.. Retinal Vascular Farvning

  1. Inkuber dissekerede nethinder natten over med forsigtig omrystning ved 4 ° C i en opløsning af fluorescens koblede isolectin B4 (rhodamin-lectin eller andet) i PBS indeholdende 1 mM CaCl2
  2. Den følgende dag fjernes farveopløsning og vask nethinder 3x i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.

7.. Udarbejdelse af Retinal Flatmounts

  1. Overfør nethinder, fotoreceptor nedad, på et objektglas og gøre fire dybe ækvidistante radiale indsnit ved hjælp af en kirurgisk skalpel at opdele nethinden i fire lige store kvadranter. Under indsnit, bandage nethinden med en børste, således at den ikke bevæger sig.
  2. Ved hjælp af to børster gennemvædet i PBS, forsigtigt flade kvadranter fotoreceptor side-ned og fordybe nethinden i montering medium for at forhindre fotoblegende. Så omhyggeligt placere et dækglas på overfladen af ​​den monterede nethinden uden pres og sikre, at luftbobler ikke ophobes under dækglasset. </ Li>

8.. Imaging og kvantificering af Vasoobliteration (VO) og Neovaskularisering (NV) som tidligere beskrevet 31

  1. Tag billeder af hele monteret nethinder med en epi-fluorescens mikroskop med en forstørrelse på 10X.
  2. Åbn det billede på nethinden i fotoredigering software, sy sammen og måle den totale retinal område og avascular område. Område kan udtrykkes i pixels.
  3. Bestem omfanget af VO ved at dividere antallet af pixels i den avaskulære område med antallet af pixels i det samlede nethindeområde.
  4. Bestem omfanget af NV ved at dividere antallet af pixels i NV med antallet af pixels i det samlede nethindeområde som beskrevet 31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den OIR model er almindeligt anvendt til at studere ilt-induceret vaskulær degeneration og iskæmi-induceret patologisk neovaskularisering i nethinden og har været medvirkende i udviklingen af nuværende tidspunkt er ansat anti-angiogenese behandlinger for øjensygdomme 27, 29, 30.. Resultaterne er opnået ved hjælp af denne model kan løseligt ekstrapoleres til iskæmiske retinopatier såsom proliferativ diabetisk retinopati og retinopati hos præmature 30.

Her præsenterer vi en alternativ anvendelse af denne model til at studere vaskulær regenerering. Vi vil beskrive et eksempel på en strategi til at regenerere den iskæmiske retina, der for nylig blev offentliggjort af vores laboratorium. I præsenterede undersøgelsen, viser vi, at vedvarende neuronal iskæmi aktiverer endoplasmatiske reticulum (ER) stress og via en af ​​sine effektor endoribonukleaser IRE1α, spalter mRNA af den klassiske neuronale vejledning cue netrin-1. Vi viserat leveringen intraokulære af Netrin-1 stimulerer et program for reparative angiogenese i retinale myeloide celler og dermed fremskynder nervevæv revaskularisering efter OIR 25. Derudover giver vi et eksempel på accelereret vaskulær regeneration ved hjælp lentiviralt medieret undertrykkelse af IRE1α.

De beskrevne eksperimentelle paradigmer kan modificeres til at undersøge den udforskende behandling af valg. Vigtigere er det tidspunkt af intravitreal injektion opgøres på grundlag af arten af ​​den udforskede forbindelse og skal tage hensyn til den mekanisme, hvormed den undersøgte behandling virker. For eksempel at studere et farmakologisk stof (receptor agonist, antagonist, etc.), P14 kan vælges, da det svarer til et tidspunkt, hvor retinal revaskularisering accelererer endnu en hurtigvirkende indgreb kan bidrage til at fremskynde hastigheden af revaskulariseringsprocedurer (figur 2 og 3a). Når virusvektoreranvendes, tilstrækkelig tid skal tildeles for at tillade fuld ekspression af passager-genet og et tidligere tidspunkt kan vælges til at sikre fuld ekspression af transgenet eller fuldstændig undertrykkelse af målgenet (figur 4). Lentivirale baserede vektorer er særlig velegnet i denne henseende på grund af deres hurtige ekspression lavt inflammatorisk respons og nem produktion 24, 25. Det er også afgørende at gøre sikker på, at målet genet er leveret til den rette retinal celle population (RGC, endotel celle Müller Cell, etc.), dermed tropisme for den valgte virale vektor skal overvejes. Alternativt undersøgelser af betydningen af ​​et gen i vaskulær regenerering ved hjælp af transgene eller knockout-dyr, har den fordel ikke at behøve at udføre intra-okulære injektioner.

Figur 1 Figur 1.. Skematisk visning af musen OIR model. Museunger og ammende mødre er udsat for 75% O 2 fra P7 til P12. En ventileret ilt kammer med konstant O 2 levering og oximeter er påkrævet. I denne indledende periode, opstår retinal vaskulær udslettelse. På P12, mus tilbage til værelse luft (21% O 2), indtil P17 når maksimal patologisk præ-retinal tufting opstår. Neovaskularisering Murværket i de følgende dage. Den ideelle periode til at undersøge vaskulær regenerering er vinduet mellem P12 og P17. Stikprøver og vurdere flere tidspunkter for omfanget af vaso-udslettelse er nøglen til at belyse præcise satser for revaskularisering.

Figur 2
Figur 2. Tidsforløb for retinal revaskularisering følgende oxygen-induceret vaso-obliteration. A) Grafisk skildring af en retinal flatmounting procedure. En incision gennem toppen af ​​hornhinden (sort-grå kuppel) og sclera (stiplede røde linier) og nethinden udredes. Linsen kan udvindes enten efter åbning af hornhinden / sclera eller når sclera fjernes som vist i diagrammet. Hyaloid fartøjer fjernes derefter, og farvning af nethindekar udføres. Når farvningsprotokol er færdig, nethinden skæres derefter i fire jævnt fordelte sektioner og monteret på et objektglas fartøj side opad. B) lectinfarvet flatmount nethinder fra mus udsat for OIR. Som skibe regenerere, området vaso-udslettelse (her maksimal ved P12) udfylder i. Patologisk neovaskularisering er maksimal på P17 og fremstår som mættede pletter i lektin farves Oir nethinder. Ved P19-P21 har nethinder regenereres fuldstændigt deres vaskulære netværk. (Dette tal er blevet ændret fra Binet et al. Cell Metabolism 2013 25)

<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-side = "altid"> Figur 3
. Figur 3 Eksempel på en injicerbar behandling, der accelererer retinal vaskulær regeneration Netrin-1. A) Netrin-1 injiceres ved P14 og omfanget af vaskulær genvækst vurderes på P17. Der observeres en dosisafhængig stigning i vaskulær regenerering. B) vaskulær integritet kan vurderes ved perfusion med en lavmolekylær fluorescerende dextran. Hvis et fartøj viser kompromitteret barriere funktion, vil den fluorescerende Dextran lække uden for fartøjet (pile). (Dette tal er blevet ændret fra Binet et al. Cell Metabolism 2013 25)

Figur 4
Fig. 4. Eksempel gen silencing with lentiviral leveret shRNAs for retinal vaskulær regenerering:. Lv.shIRE1α at vurdere muligheden for gen undertrykkelse af IRE1α i retinale ganglion neuroner til at hjælpe vaskulær regeneration blev en intravitreal injektion af et lentivirus, der koder for en shIRE1α injiceret på P3 at give tilstrækkelig tid til gen-silencing når vaskulær vækst og vaso-udslettelse vurderes. Den 3. generation lentivirus ansat i dette eksempel indeholder en modificeret vesikulær stomatitis virus glycoprotein (VSV-G), konstrueret til at målrette plasma membraner. Selv om disse vektorer effektivt inficere retinale ganglieceller kan ekspression også bemærket i andre lokale celletyper. (A) Denne behandling førte ikke til mærkbare variationer i ilt-induceret vaso-udslettelse som bestemt ved P12, der betyder, at alle observerede fordele på vaso-udslettelse målt på senere tidspunkter skyldes øget vaskulær regenerering. (B) Inhibering af IRE1α in dette paradigme dramatisk forøget vaskulær regeneration i genvækst fase af OIR på P17. (Dette tal er blevet ændret fra Binet et al. Cell Metabolism 2013 25) (C) Vurdering af et tredje tidspunkt af vaso-udslettelse som P14, er forpligtet til at fastsætte præcise satser for revaskularisering. (Dette tal er blevet ændret fra Joyal et al. Blood 2011 24) Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hvad er den mest effektive måde at stimulere væksten af ​​nye sunde skibe i nervøs iskæmisk væv? Er det terapeutisk gyldigt at blande sig og accelerere naturligt forekommende vaskulær genvækst? I neuro-iskæmiske patologier såsom iskæmiske retinopatier eller slagtilfælde, er vaskulær degeneration forbundet med nedsat neuronal funktion 35-38. Derfor at modvirke tidlig skade, genindføre regional mikro-cirkulation i den umiddelbare / tidlig segment af sygdommen kan vise sig gavnligt. I en okulær sammenhæng eksperimentelle paradigmer, som fremskynder revaskularisering af iskæmiske retina reducere patologisk neovaskularisering 21-25, 34 og dermed denne strategi fortjener yderligere undersøgelse.

Siden introduktionen for 20 år siden, har OIR model 27 revolutioneret retinal angiogenese forskning 30. Her giver vi en ekstra ansøgning for denne model til at studere potentielle strattegier til at modulere fysiologiske vaskulær regenerering i den iskæmiske nethinde. En ideel dyremodel bør omfatte flere kriterier såsom nærhed til human patofysiologi, høj reproducerbarhed, hurtig udførelse og ideelt, lave omkostninger. Den musemodel af OIR opfylder alle disse kriterier, og kan gennemføres ud i mindre end 3 uger.

På trods af de mange børsnoterede fordele, ulemper omfatter aktuelle behov for at ofre musen forud for analyser og dermed præcis langsgående overvågning af et dyr er endnu ikke muligt med de nuværende billeddiagnostiske værktøjer. I øjeblikket in vivo billeddiagnostiske teknikker såsom OLT eller fluoresceinangiografi er stort set mislykket på grund af den iboende optisk begrænsning af musen øjet (krumningsradius og lille størrelse), der reducerer billedbehandling dækning 39 til de mest centrale områder af nethinden, der ikke er relevante for de tidlige stadier af modellen.

Når de anvendes til at studere vaskulær regenerering som pORESLÅEDE i denne protokol papir bør alle overvejelser, der gælder for at studere neovaskularisering også overvåges. Disse omfatter optagelse dyrets vægt til at estimere den metaboliske sundhed hvalp, der stærkt påvirker angiogenese 32. Præcis styring af oxygenspænding i hyperoxisk kammer er også kritisk. Variation i iltkoncentrationen har en direkte indvirkning på vasoobliteration, hvilket uundgåeligt kan føre til kritiske data fejlfortolkninger. Det anbefales derfor til enten at gennemføre løbende elektronisk overvågning af koncentrationen kammer ilt eller i den mindste, overvåge daglige ændringer i iltindholdet og begrænse oxycycler dør åbning til at opretholde konstante iltindhold. Optimal behandling af nethinder tager også praksis. Udvinding, montering og farvning af nethinden skal udføres med forsigtighed, da den er relativt skrøbelig nethinden skal fint håndteres. Hertil kommer, som for alle eksperimenter med genetisk modificerede dyr, den genetisk drift af en koloni cen forvirre resultater. I fravær af et selektivt kraft (i en musekolonien for eksempel), den allele eller genetisk drift er en tilfældig proces, der kan føre til store ændringer i populationen over en kort periode. Allelhyppigheder kan ændre sig fra generation til generation og resultere i dannelsen af en sub-koloni 40, 41. Disse mutationer er stort set ikke kan påvises, og det er derfor vigtigt at begrænse antallet af produceret af samme opdrætter par i samme koloni generationer. Den mest effektive måde at nå den højeste genetiske stabilitet er at genopfriske "lagre" hver fem generationer eller gå videre til tilbagekrydsning med en købt mus identisk baggrund.

Det anbefales også at teste for nethindedegeneration mutationer (rd) 1 og 8 42, mindst en gang, før du starter en ny linje for at undgå confounding fænotyper, der kan henføres til for tidlig fotoreceptordegenerering. Transgene dyrdet er afgørende at sikre, at både kontrol og mutant mus stammer fra samme sælger og er nødvendigvis på den samme genetiske baggrund.

Da vi fortsætter med at belyse de molekylære mekanismer for dannelse af blodkar og vækst, nye tilgange til at accelerere, langsom, eller styre spirende blodkar opstår. En model system, hvor modulering af vaskularisering kan udforskes in vivo i en patologisk sammenhæng kan yde et værdifuldt værktøj til at udforske potentielle terapeutiske paradigmer at imødegå neuronal iskæmi inden for CNS. Tilpasning musen OIR model til at studere vaskulær regeneration giver sådan et mødested og vil fortsat være et værdifuldt værktøj til at fremme vores forståelse af det molekylære grundlag for fysiologiske og patologisk angiogenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

PS besidder en Canada Research Chair i Retinal Cellebiologi og Alcon Research Institute New Investigator Award. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den canadiske Institutes of Health Research (221.478), den canadiske diabetesforening (OG-3-11-3329-PS), naturvidenskab og teknik Forskningsråd Canada (418.637) og instituttet Fighting Blindness Canada. Der blev også leveret af Reseau de Recherche en Santé de la Vision du Québec.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)
CD1 nursing mothers Vendor of choice
Operating Scissors straight World Precision Instruments 14192
Dissecting Scissors straight World Precision Instruments 14393
Vannas Eye Scissors Harvard Apparatus 72-8483
Iris Forceps, curved, serrated World Precision Instruments 15915
Brushes 362R size 0 Dynasty
Dumont Forceps #3; straight World Precision Instruments 500338
Surgical Blade, size 10 Bard-Parker 371110
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories, Inc RL-1102
Microscope slides VWR 16004-368
Fluoromount G Electron Microscopy Sciences 17984-25
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope Zeiss
Leica MZ9.5 Stereomicroscope Leica
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000 Sigma-Aldrich 46945

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 436, 193-200 (2005).
  2. Eichmann, A., Thomas, J. L. Molecular Parallels between Neural and Vascular Development. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, (2012).
  3. Larrivee, B., Freitas, C., Suchting, S., Brunet, I., Eichmann, A. Guidance of vascular development: lessons from the nervous system. Circ Res. 104, 428-441 (2009).
  4. Stefater Iii, J. A., et al. Regulation of angiogenesis by a non-canonical Wnt-Flt1 pathway in myeloid cells. Nature. 474, 511-515 (2011).
  5. Checchin, D., Sennlaub, F., Levavasseur, E., Leduc, M., Chemtob, S. Potential role of microglia in retinal blood vessel formation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3595-3602 (2006).
  6. Quaegebeur, A., Lange, C., Carmeliet, P. The neurovascular link in health and disease: molecular mechanisms and therapeutic implications. Neuron. 71, 406-424 (2011).
  7. Yamamoto, Y., Craggs, L., Baumann, M., Kalimo, H., Kalaria, R. N. Review: molecular genetics and pathology of hereditary small vessel diseases of the brain. Neuropathol Appl Neurobiol. 37, 94-113 (2011).
  8. Brun, A., Englund, E. A white matter disorder in dementia of the Alzheimer type: a pathoanatomical study. Ann Neurol. 19, 253-262 (1986).
  9. Prat, A., et al. Migration of multiple sclerosis lymphocytes through brain endothelium. Arch Neurol. 59, 391-397 (2002).
  10. Rule, R. R., Schuff, N., Miller, R. G., Weiner, M. W. Gray matter perfusion correlates with disease severity in ALS. Neurology. 74, 821-827 (2010).
  11. Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366, 1227-1239 (2012).
  12. Hartnett, M. E., Penn, J. S. Mechanisms and management of retinopathy of prematurity. N Engl J Med. 367, 2515-2526 (2012).
  13. Sapieha, P., et al. Retinopathy of prematurity: understanding ischemic retinal vasculopathies at an extreme of life. J Clin Invest. 120, 3022-3032 (2010).
  14. Chen, J., Smith, L. Retinopathy of prematurity. Angiogenesis. 10, 133-140 (2007).
  15. Cheung, N. Diabetic retinopathy and systemic vascular complications. Progress in Retinal and Eye Research. 27, 161-176 (2008).
  16. Smith, L. E. Through the eyes of a child: understanding retinopathy through ROP the Friedenwald lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 5177-5182 (2008).
  17. Caballero, S., et al. Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells. Diabetes. 56, 960-967 (2007).
  18. Wang, H., et al. VEGF-mediated STAT3 activation inhibits retinal vascularization by down-regulating local erythropoietin expression. Am J Pathol. 180, 1243-1253 (2012).
  19. Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. J Clin Invest. 116, 3266-3276 (2006).
  20. Saito, Y., Geisen, P., Uppal, A., Hartnett, M. E. Inhibition of NAD(P)H oxidase reduces apoptosis and avascular retina in an animal model of retinopathy of prematurity. Mol Vis. 13, 840-853 (2007).
  21. Connor, K. M., et al. Increased dietary intake of omega-3-polyunsaturated fatty acids reduces pathological retinal angiogenesis. Nat Med. 13, 868-873 (2007).
  22. Banin, E., et al. T2-TrpRS inhibits preretinal neovascularization and enhances physiological vascular regrowth in OIR as assessed by a new method of quantification. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2125-2134 (2006).
  23. Dorrell, M. I., et al. Maintaining retinal astrocytes normalizes revascularization and prevents vascular pathology associated with oxygen-induced retinopathy. Glia. 58, 43-54 (2010).
  24. Joyal, J. -S., et al. Ischemic neurons prevent vascular regeneration of neural tissue by secreting semaphorin 3A. Blood. 117, 6024-6035 (2011).
  25. Binet, F., et al. Neuronal ER Stress Impedes Myeloid-Cell-Induced Vascular Regeneration through IRE1alpha Degradation of Netrin-1. Cell Metab. 17, 353-371 (2013).
  26. Fukushima, Y., et al. Sema3E-PlexinD1 signaling selectively suppresses disoriented angiogenesis in ischemic retinopathy in mice. J Clin Invest. 121, 1974-1985 (2011).
  27. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35, 101-111 (1994).
  28. Lange, C., et al. Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247, 1205-1211 (2009).
  29. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
  30. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 2813-2826 (2010).
  31. Stahl, A., et al. Computer-aided quantification of retinal neovascularization. Angiogenesis. 12, 297-301 (2009).
  32. Stahl, A., et al. Postnatal Weight Gain Modifies Severity and Functional Outcome of Oxygen-Induced Proliferative Retinopathy. Am J Pathol. 177, 2715-2723 (2010).
  33. Cerani, A., et al. Neuron-Derived Semaphorin 3A is an Early Inducer of Vascular Permeability in Diabetic Retinopathy via Neuropilin-1. Cell Metabolism. 18, 505-518 (2013).
  34. Sapieha, P. Eyeing central neurons in vascular growth and reparative angiogenesis. Blood. 120, 2182-2194 (2012).
  35. Dorfman, A., Dembinska, O., Chemtob, S., Lachapelle, P. Early manifestations of postnatal hyperoxia on the retinal structure and function of the neonatal rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 458-466 (2008).
  36. Dorfman, A. L., Joly, S., Hardy, P., Chemtob, S., Lachapelle, P. The effect of oxygen and light on the structure and function of the neonatal rat retina. Doc Ophthalmol. 118, 37-54 (2009).
  37. Chopp, M., Zhang, Z. G., Jiang, Q. Neurogenesis, angiogenesis, and MRI indices of functional recovery from stroke. Stroke. 38, 827-831 (2007).
  38. Li, L., et al. Angiogenesis and improved cerebral blood flow in the ischemic boundary area detected by MRI after administration of sildenafil to rats with embolic stroke. Brain Res. 1132, 185-192 (2007).
  39. Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Dis Model Mech. 5, 444-456 (2012).
  40. Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat Genet. 37, 1181-1186 (2005).
  41. Jenuth, J. P., Peterson, A. C., Shoubridge, E. A. Tissue-specific selection for different mtDNA genotypes in heteroplasmic mice. Nat Genet. 16, 93-95 (1997).
  42. Mattapallil, M. J., et al. The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes. Investigative ophthalmolog., & visual science. 53, 2921-2927 (2012).
Vurdering af Vascular Regeneration i CNS Brug af musen Retina
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miloudi, K., Dejda, A., Binet, F., Lapalme, E., Cerani, A., Sapieha, P. Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (88), e51351, doi:10.3791/51351 (2014).More

Miloudi, K., Dejda, A., Binet, F., Lapalme, E., Cerani, A., Sapieha, P. Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (88), e51351, doi:10.3791/51351 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter