Summary
げっ歯類の網膜は、長い脳へのアクセス可能なウィンドウとして認識されている。この技術的な論文では、虚血性損傷後の中枢神経系内の血管再生の故障につながるメカニズムを研究するために、酸素誘発性網膜症のマウスモデルを採用しているプロトコルを提供する。説明したシステムはまた、網膜およびCNS内の機能の血管の成長を促進するための戦略を探求するために利用することができる。
Abstract
げっ歯類の網膜は、おそらく中枢神経系（CNS）内の神経血管の相互作用を調査するためにここで最もアクセスしやすい哺乳動物系である。これは、ますます認識されているように、アルツハイマー病、多発性硬化症、および血管妥協の筋萎縮性側索硬化症などのいくつかの要素が存在する神経変性疾患。また、小児および労働年齢人口（未熟児及び糖尿病性網膜症の網膜症、それぞれ）の失明の最も顕著な原因は、生理的な血管の再成長の血管変性や障害によって特徴づけられる。この技術的論文の目的は、網膜におけるCNSの血管再生を研究するための詳細なプロトコルを提供することです。この方法は、虚血性損傷後の血管増殖の故障につながる分子メカニズムを解明するために用いることができる。また、健康的な血管叢を加速し、回復させる可能性のある治療法を検討することができます。調査結果はobtainedは記載されたアプローチを使用して、糖尿病又は未熟児網膜症と虚血の治療手段を提供し、場合によってはCNSの他の血管障害の利益を得ることができる。
Introduction
CNSの発達、神経、免疫細胞および血管を通して適切な組織灌流を確認し、感覚情報1-5の伝送を可能にするために顕著に結合されたネットワークを確立する。不十分な組織の酸素と妥協代謝供給や血管のシステムの結果の内訳は、ますます神経変性疾患6の病因に重要な貢献者として認識されている。血管ドロップアウトし、脳内の神経血管装置の劣化は、例えば、血管性認知症、脳7の白質の血管病変や動脈および小血管8の狭窄症、アルツハイマー病と関連している。さらに、障害、血管バリア機能9は、多発性硬化症および筋萎縮性側索硬化症10寄与すると考えられる。
まばゆいばかりの、このプロトコルで説明網膜モデルに直接関係の糖尿病性網膜症、未熟児11と12の網膜症などの疾患は、13早期血管変性の位相によって特徴付けられる。神経血管網膜上のその後の虚血性ストレスは、おそらく再、元に戻すの酸素とエネルギー供給14〜16への代償性反応として開始過度および病理学的血管新生の第二段階をトリガします。疾患の進行の中心となる虚血性ストレスを克服するための魅力的な戦略は、特異的に神経網膜（ 図2および図3）の虚血区域に官能血管網を復元することである。制御血管新生反応を誘発することは直感に反するような抗VEGF類のような抗血管新生療法が適応の治療として考慮される条件として出くわすことがあります。しかし、このアプローチの有効性の証拠は、搭載されている。 ischemの例では、「生理的のような「増強する血管の成長ICの網膜症は、エレガントな内皮前駆細胞17、食事、ω-3多価不飽和脂肪酸の増加、他の血管新生因子18、骨髄前駆細胞19の注入、NADPHオキシダーゼ誘導されるアポトーシス20の阻害のミュラー細胞に発現VEGF誘発性ダウンレギュレーションの阻害の導入により実証されている酸摂取21、トリプトファンtRNA合成22のカルボキシル末端断片、およびグリア細胞23の保護のために、VEGFまたはFGF-2の直接投与による治療。また、我々は、虚血性網膜症でそのようなセマフォリンまたはネトリンなどの古典的な神経ガイダンスキューを調節する網膜内の健康な血管の血管再生を加速し、その結果、病的血管新生24,25を低減することを実証した。直接的な臨床的関連性のため、前述の動物実験のいくつかは、血管の再を促進するという証拠を提供する網膜症の初期の虚血性段階の間に発生が大幅に可能性虚血性負荷の低減を通じて、視力を脅かす前網膜新生血管19、23、24、26を減らすことができます。
機能的な血管の再生を刺激治療戦略を考案することは、血管生物学者のための重要な課題である。ここでは、網膜内の血管の再成長を調節する方策を探求するために、酸素誘発性網膜症（OIR）のマウスモデルを用いた実験系を記述する。 Smith らによって開発された。1994年27で、このモデルは、人間の増殖性網膜症のためのプロキシとして機能し、P12まで75％のO 2にP7の仔マウスを暴露し、その後、周囲の部屋のO 2 -緊張します（ 図に子犬を再導入することからなる1）。このパラダイムは緩く未熟児が換気されているシナリオを模倣O 2で。高濃度酸素への仔マウスの露出は、網膜毛細血管や微小血管の変性を誘発し、最大VO領域は48時間後（P9）に達しているが、血管閉塞（VO）の再現性のある区域は、一般的に、P12でのO 2の終了時に評価し得O 2 28への暴露。マウスでは、無血管のVOゾーンは自然に室内空気への再導入、最終的には、VOゾーンは完全に再血管化された（ 図2）は、次の週に渡って再生成します。 OIRを受けたマウスの室内空気への再導入は、典型的には、抗血管新生治療パラダイムの有効性を判断するために評価される前網膜血管新生（NV）（P17で最大）を引き起こす。その純粋な形では、OIRモデルは、酸素によって誘導される血管変性を評価し、破壊的な前網膜新生血管29〜31の範囲を決定するために、高度に再現性があり、定量化可能なツールを提供しています。
30、31により記載されている。ここでは、薬理学的化合物、将来の治療薬、ウイルスベクターによって神経網膜内の生理的血行再建術の変調を調査するか、トランスジェニックやノックアウトマウスでの候補遺伝子の影響を研究するために、簡単なステップバイステップの手順を提供する。
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Protocol
倫理声明：すべての動物実験は、眼科と視覚研究と動物ケアのカナダの協議会での動物の使用に関するビジョンと眼科の研究のための協会（ARVO）文によって確立された動物のケアのガイドラインを遵守しています。
1。酸素誘起網膜症（OIR）
- レコードP0と仔マウスの誕生日。
- 十分な量範囲を確保するためのO 2に入ると動物のすべての重みを記録します。注：P17でC57BL / 6マウスでは、体重は最大ネバダ32 5と7.5グラムの間の範囲であるべきである。環境の一貫性を維持するためには、（遺伝的に改変されたマウス、ならびに実験的治療を受けたマウスの場合）を対照として同腹仔を使用することが推奨される。ウイルスベクターの効果を評価する際に、1は、ウイルスの親和性を考慮し、ウイルスにより配信導入遺伝子の完全な発現に十分な時間を与える必要があります。急速に発現するウイルスこのような第3 世代のレンチウイルス24、25のようなベクターは、33をお勧めします。
- P7（C57BL / 6または所望の歪み）と5日間27、75％のO 2に設定した酸素室に母親の育成CD1の場所の仔マウス。環境湿度と温度は、O 2の曝露を通じて一定に保持した。注：O 2の中央源を備えた研究施設が理想的であり、空のO 2のタンクの面倒な交換を制限する。トランスジェニックまたはノックアウトマウスを操作すると、その対照および実験マウスを確保することが重要である同じ系統30、29内の遺伝的ドリフトを制限するために、同じベンダーから取得する。
- P12で、酸素室からマウスを削除し、O 2を周囲の動物を返す。
インナー網膜に化合物を送達するため2。硝子体内注射 （WH薬理化合物または組換えタンパク質の効果を評価JA）
- P14で、酸素2L /分（または任意の動物保護委員会が承認した麻酔薬）中の2％イソフルランでマウスを麻酔。麻酔の有効性を検証するために、連続してピンセットで尾、リア足と耳をつまむ。
- その腹の上でマウスを置きます。
- 面取りプルガラス針を取り付けた10μlの滅菌注射器を用いて、45°の、眼の後輪部に研究されて化合物またはビヒクル（生理食塩水）を含有する溶液1μlの最大容量の注入を行うレンズを避け、角度。注：プルガラス針は、エポキシ樹脂のドロップを使用して、注射器に取り付けられている。
- マウスの眼に綿棒で潤滑眼軟膏（理想的には、抗生物質を含む）の低下を適用します。
- 母親の育成に戻ってケージにマウスを返します。次いで、マウスを慎重に再まで監視されるカバーされ、完全に歩行可能。
蛍光眼底血管造影による血管灌流およびバリア機能の3。評価（整合性）
- 酸素2L /分（または任意の動物保護委員会が承認した麻酔薬）中の2％イソフルランでマウスを麻酔。麻酔の有効性を検証するために、連続してピンセットで尾、リア足と耳をつまむ。注：再生が評価されるときには、典型的には、P17で行われる。また、搬出分析をP19とP21に血管の完全性を時間をかけて維持されるかどうかを判断する。
- 麻酔をかけた後、マウスの重量を量る。
- 解剖ハサミで正中腹部切開を行います。注：解剖の機器は定期的にチェックし、シャープにする必要があります。
- 横方向にリブをカットし、鉗子を用いて胸郭を上げる。注：これは、心臓への損傷を回避するために横方向にできるだけカットする必要がある。
- peripを除去した後心臓からheral組織、止血鉗子で下行大動脈をクランプする。
- ゆっくりと25 Gの針を用いて、左心室にフルオレセイン - デキストランを注入する。注：血管バリア機能が検討されている場合は、容器の完全性が損なわれたときに血管から漏出するように、70 kDaのフルオレセイン - デキストランが使用される。治験責任医師は、血管をキャストしたい場合は、2のMDAフルオレセイン - デキストランが使用される。重要なステップ：1）、均質な配分を確保するために遠心フルオレセイン - デキストラン、上清を注入する、2）血管収縮を防止するために、加温しフルオレセイン - デキストラン溶液を注入し、3）その循環時間は、過剰の4分いけない。
- 営業はさみで注射後のマウス2分の首。
4。除核と注視
注意：血管再生の速度を評価する際に、まず、P12で、さらに、P14とP17に網膜を収集します。サンプリングされた時点の数を増やす血行再建24の速度をより正確に決定するためにs。
- マウスの頭を傾け、その横に置きます。
- 皮膚や解剖ハサミを使用して、目をカバーするまぶたを削除します。
- アイの下に湾曲した鉗子を置き、静かに視神経が切断されるまで、それを引き出します。
- その反対側にマウスの頭を回して、同じ手順（4.2および4.3ステップ）を行う。
- 固定液の良好な浸透を確実にするために、30 G針を用いて眼の前房に穴を穿刺する。
- 4％パラホルムアルデヒド（PFA）を含有するチューブに目を移し、室温で1時間固定する。
- PFAを削除し、氷冷PBSの溶液で目を4回洗う。
5。網膜解剖
- 冷PBSを含むペトリ皿にマウスの眼を置き、実体顕微鏡下で網膜の解剖を行う。
- 顕微解剖SCIと眼の周囲の余分な脂肪/組織を除去ssors。
- マイクロ解剖はさみで角膜を切り取ります。
- 鉗子の2ペアを使用して、細かく視神経に向かって離れて周辺から強膜を剥離して廃棄します。
- ピンセットでレンズ（角膜の下に白っぽいボール）をつまんで、アイカップからそれを抽出します。支持体として、鉗子の1ペアを使用し、他のグリップに、慎重にレンズを高め、削除してください。
- 小さなブラシ（サイズ0）とピンセットを用いて、網膜の内側から硝子体血管を切り離します。
- ピンセットを用いて視神経乳頭に接続硝子体血管のバンドルを削除します。
- 移転前染色手順を開始する氷上でPBSと場所を含む2ミリリットルの微量遠心管に網膜を解剖した。
6。網膜血管染色
- 1 mMのCaCl 2を含むPBS中の蛍光結合された-イソレクチンB4（ローダミンレクチンまたはその他）の溶液中で4℃で穏やかに振盪しながら一晩を解剖した網膜をインキュベート
- 次の日に、染色溶液を除去し、室温で10分間PBSで3回網膜を洗浄する。
網膜フラットマウントの7。準備
- 顕微鏡スライド上に、光受容側ダウン網膜を転送し、4つの等しいサイズの象限に網膜を分割するために、外科用メスを使用して、4つの深い等距離放射状の切開を行う。それが動かないように切開中に、ブラシで網膜を引き締める。
- PBSに浸した2つのブラシを使用して、慎重に象限の感光体側ダウンを平坦化し、光退色を防止するために媒体を実装する際に網膜を浸す。その後、慎重に圧力を印加し、気泡がカバースリップの下に蓄積しないことを確認することなしにマウントされ、網膜の表面にカバースリップを置く。</李>
前に説明した31のような8。イメージングとVasoobliterationの定量（VO）と血管新生（NV）
- 10Xの倍率でエピ蛍光顕微鏡を用いて固定した網膜全体の画像を撮る。
- 写真編集ソフトウェアで網膜像を開いて、一緒にステッチ、総網膜面積、および無血管面積を測定する。領域をピクセル単位で表すことができる。
- 総網膜領域の画素数で無血管領域の画素数で除して、VOの程度を決定。
- 31が説明されているように、全網膜領域の画素数で、NVの画素数で除して、NVの程度を決定。
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Representative Results
OIRモデルは広く、網膜に酸素誘発性血管変性及び虚血誘導病的な新生血管形成を研究するために使用されており、眼疾患27、29、30のために現在用いられ、抗血管新生治療の開発に尽力してきました。このモデルを用いて得られた知見は緩く、例えば30未熟児の網膜症および増殖性糖尿病網膜症などの虚血性網膜症に外挿することができる。
ここでは、血管の再生を研究するため、このモデルの代替使用を提示する。我々は最近、私たちの研究室で出版された虚血性網膜を再生させる戦略の例について説明する。発表研究では、持続的な神経細胞の虚血が小胞体（ER）ストレスとそのエフェクターリボヌクレアーゼIRE1α、古典の神経ガイダンスキューネトリン1のmRNAを切断の1つを介して活性化させることを実証している。我々はショーネトリン-1の眼内送達は、網膜骨髄細胞中の修復、血管形成のプログラムを刺激するので、活性挿抜25の後の神経組織の血管再生を加速させる。また、我々は、IRE1αのレンチウイルス媒介サイレンを使用して加速し、血管再生の例を提供する。
記載の実験パラダイムは、選択した探索的処置を調査するために修飾することができる。重要なことには、硝子体内注射の時点を探索し、化合物の性質に基づいて決定され、考慮調べ治療が作用する機構を取る必要があります。それは速効型介入が血管再生（ 図の速度を高速化できる網膜の血管再生がまだ加速された時点に対応するように、例えば、薬理学的化合物（受容体アゴニスト、アンタゴニストなど）を研究するために、P14を選択してもよい2および図3（a））。ウイルスベクターである場合採用十分な時間がパッセンジャー遺伝子およびそれ以前の時点の十分な発現を可能にするために割り当てる必要の導入遺伝子または標的遺伝子の完全なサイレンシング（ 図4）の完全な発現を確実にするように選択することができる。レンチウイルスベースのベクターは、それらの迅速な発現、低炎症応答および生産24,25の容易さ、この点で特に適している。これは、標的遺伝子が適切な網膜細胞集団（RGC、内皮細胞、ミュラー細胞、等）に配信され、従って選択されるウイルスベクターの向性を考慮しなければならないことを確実にすることも重要である。代わりに、トランスジェニックやノックアウト動物を用いた血管再生における遺伝子の役割を研究して眼内注射を行うために必要がないという利点を提供しています。
図1。マウスOIRモデルの概略図。マウスの仔や授乳中の母親は、P12にP7から75％のO 2にさらされている。安定したO 2の配信と酸素濃度計で換気酸素室が必要である。この最初の期間中に、網膜血管閉塞が発生します。最大の病的プレ網膜タフティングが発生したときP12に、マウスをP17まで、部屋の空気（21％O 2）に戻される。血管新生は、次の日にわたって後退する。血管再生を研究するための理想的な期間は、P12とP17の間のウィンドウです。サンプリングおよび血管閉塞の程度のためのいくつかの時点を評価するには血管再生の正確な速度を解明するための鍵となります。
図2。酸素によって誘導される血管oblite以下の網膜血管再生の経時配給。網膜flatmounting手順のA）を視覚的に表現。切開は、角膜（黒灰色ドーム）の頂部と強膜（点線赤線）を介して行われ、網膜が出からかわれている。レンズは、角膜/強膜を開いた後、または図に示すように強膜が除去された後のいずれかを抽出することができる。硝子体血管を取り出し、実行さ網膜血管の染色である。染色プロトコルが終了すると、網膜を、4等間隔切片に切断し、顕微鏡スライド容器側を上向きに取り付けられている。OIRに供したマウス由来のB）レクチン染色flatmount網膜。血管が再生するように、（ここではP12で最大）血管閉塞の面積は、病的新血管形成は、P17で最大であり、レクチン染色のOIR網膜における飽和スポットとして表示されますインチ埋める。 P19-P21により、網膜を完全に自分の血管網を再生しています。 （この図は、ビネーらから変更されている。細胞の代謝 2013 25）
ネトリン-1：網膜血管再生を加速させる注射用治療の図3の例。 A）ネトリン-1はP17で評価血管再生のP14と程度で注入される。血管再生の用量依存的増加が観察される。B）血管の完全性は、低分子量蛍光性デキストランで灌流することによって評価することができる。血管が損なわバリア機能を示された場合は、蛍光デキストランは血管（矢印）の外にリークします。 （この図は、ビネーらから変更されている。細胞の代謝 2013 25）
図4。遺伝子サイレンシングのWIの例目の網膜血管再生のためのshRNAレンチウイルス送達：Lv.shIRE1α血管再生を支援するために、網膜神経節ニューロンにおけるIRE1αの遺伝子サイレンシングの能力を評価するために、レンチウイルスをコードshIRE1αための硝子体内注射は、十分な時間を可能にするようにP3で注入した血管の成長と血管閉塞が評価されたときに遺伝子サイレンシング。この実施例で採用第3 世代レンチウイルスは、原形質膜を標的とするように操作された改変された水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSV-G）を含む。これらのベクターは、効率的に網膜神経節細胞に感染するが、発現は、他のローカルの細胞型においても留意することができる。 （A）この処理は、後の時点で測定された血管閉塞のすべての観察の利点が増加し、血管再生によるものであることを示す、P12で決定されるように、酸素によって誘導される血管閉塞の顕著な変化には 至らなかった。 IRE1αI（B）の阻害Nこのパラダイムは劇的P17の活性挿抜の再成長期における血管再生を強化した。 （この図は、ビネーらから変更されている。細胞の代謝 2013 25）（C）のような、P14などの血管閉塞の第3の時点の評価、血行再建術の正確な速度を決定する必要がある。 （この図はJoyal ら、Blood 2011 24から変更されている） 、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
虚血性神経組織内に新しい健全な血管の成長を刺激するための最も効果的な方法は何ですか？それが干渉し、血管再生を天然加速させる治療的に有効である？虚血性網膜症や脳卒中などの神経の虚血性の病変では、血管の変性が低下し、神経機能35-38に関連している。したがって、疾患の初期/即時セグメントの間に、地域微小循環を回復、早期の傷害に対抗することは有益性を実証することができる。眼の文脈では、虚血性網膜の血管再生を加速させる実験パラダイムは、病的な新生血管形成21〜25、34、したがって、このアプローチのメリットはさらに調査を減らす。
20年前に導入されて以来、OIRモデル27は、網膜血管新生研究30に革命をもたらしました。ここでは、将来の戦略を研究するために、このモデルのために追加のアプリケーションを提供虚血性網膜の生理的血管再生を調節するegies。理想的な動物モデルは、ヒトの病態生理学に近い、高い再現性、迅速な実行と、理想的には、低コストなどのいくつかの項目を包含するべきである。 OIRのマウスモデルは、これらすべての基準を満たすと搬出することができる3週間未満で。
数多くの上場のメリットにもかかわらず、欠点が前の分析にマウスを犠牲にする現在の必要性を含め、動物の、したがって正確な縦のモニタリングは、現在のイメージングツールではまだ不可能である。現在、10月またはフルオレセイン血管造影などのin vivoイメージング技術は、に関係のない網膜の最も中心的な地域にイメージングカバレッジ39を減少させ、マウスの眼（曲率半径と小サイズ）の固有の光学限界にほとんど成功しているモデルの初期段階。
Pなどの血管再生を研究するために使用した場合このプロトコルの論文にroposed、新生血管形成を研究に適用されるすべての考慮も監視する必要があります。これらは重く、血管新生32に影響子犬の代謝健康を推定するための記録動物の体重が含まれる。高酸素室での酸素分圧を正確に制御することも重要です。酸素濃度の変化が必然的に重要なデータの誤った解釈につながる可能vasoobliterationに直接的な影響を持っています。従って、チャンバの酸素濃度を連続的に電子監視を実装または最小で、酸素濃度の日変化を監視し、一定の酸素濃度を維持するためにoxycyclerドア開口を制限することのいずれかが推奨される。網膜の最適な処理も練習が必要です。抽出、マウントと比較的壊れ網膜が微妙に取り扱わなければならないように、網膜の染色は注意して実行する必要があります。加えて、遺伝子改変動物、コロニーCの遺伝的浮動を持つすべての実験の場合と交絡の結果。 （例えば、マウスコロニーにおける）は、選択の力の非存在下では、対立遺伝子または遺伝的浮動は、短期間に人口の大きな変化につながる可能性が確率過程である。対立遺伝子頻度は世代から世代へ変更し、サブコロニー40,41の形成をもたらすことができる。これらの突然変異は、大部分は検出不可能であり、それは、同じコロニー内の同じブリーダー対によって生成される世代の数を制限することが重要である。最高の遺伝的安定性を達成するための最も効率的な方法は、 "Stocks"を更新し、すべての5世代または同一の背景の購入をマウスで戻し交配を進めることである。
また、時期尚早の光受容体の変性に起因することができます表現型を交絡避けるために、新しい行を開始する前に、網膜変性変異のために少なくとも一度は1と8 42を 、（RD）をテストすることをお勧めします。トランスジェニック動物のために、それはコントロールおよび変異マウスの両方が同じベンダーから入手し、同じ遺伝的背景に必然であるされていることを確認することが重要である。
我々は、血管形成および増殖の分子機構を解明し続けるにつれて、新規な、遅い加速する、または新生血管が生じている操縦する近づく。血管新生の調節は、病理学的な文脈においてインビボで探索することが可能なモデル系は、CNS内の神経細胞の虚血に対抗するために将来の治療パラダイムを探求する価値のあるツールを提供することができる。血管再生を研究するために、マウスOIRモデルを適応させるような場を提供し、生理学的および病理学的な血管新生の分子基盤の理解を促進するために貴重なツールであり続けるだろう。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
PSは、網膜細胞生物学のカナダの研究の椅子とアルコン研究所新研究者賞を取得しています。この作品は、カナダ衛生研究所（221478）からの補助金によって支えられて、カナダ糖尿病協会（OG -3 - 11から3329-PS）、自然科学とカナダの工学研究会（418637）及び財団ファイティング失明カナダ。サポートも網状のもの·デ·ルシェルシュエンサンテ·デ·ラ·ビジョン·デュ·ケベックから提供された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other) | |||
| CD1 nursing mothers | Vendor of choice | ||
| Operating Scissors straight | World Precision Instruments | 14192 | |
| Dissecting Scissors straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Vannas Eye Scissors | Harvard Apparatus | 72-8483 | |
| Iris Forceps, curved, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Brushes 362R size 0 | Dynasty | ||
| Dumont Forceps #3; straight | World Precision Instruments | 500338 | |
| Surgical Blade, size 10 | Bard-Parker | 371110 | |
| Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Laboratories, Inc | RL-1102 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-368 | |
| Fluoromount G | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope | Zeiss | ||
| Leica MZ9.5 Stereomicroscope | Leica | ||
| Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000 | Sigma-Aldrich | 46945 |
References
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