Summary
Het knaagdier netvlies is lang erkend als een toegankelijke venster naar de hersenen. In dit technisch document bieden we een protocol dat het muismodel van zuurstof geïnduceerde retinopathie van de mechanismen die leiden tot het falen van vasculaire regeneratie binnen het centrale zenuwstelsel na ischemische schade te bestuderen in dienst heeft. Het beschreven systeem kan ook worden ingezet om strategieën te ontwikkelen om hergroei van functionele bloedvaten te bevorderen binnen het netvlies en CNS.
Abstract
Het knaagdier netvlies is misschien wel de meest toegankelijke van zoogdieren systeem waarin om neurovasculaire samenspel binnen het centrale zenuwstelsel (CNS) te onderzoeken. Het wordt steeds meer erkend dat verscheidene neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer, multiple sclerose en amyotrofe laterale sclerose aanwezige elementen van vasculaire compromis. Bovendien zijn de belangrijkste oorzaken van blindheid bij kinderen en werkende leeftijd populaties (prematuren retinopathie en diabetische retinopathie, respectievelijk) gekenmerkt door vasculaire degeneratie en falen van fysiologische vasculaire hergroei. Het doel van dit technische document is een gedetailleerd protocol bieden aan CNS vasculaire regeneratie te bestuderen in het netvlies. De werkwijze kan worden toegepast om de moleculaire mechanismen die leiden tot falen van vasculaire groei na ischemisch letsel te helderen. Daarnaast kunnen potentiële therapeutische modaliteiten te versnellen en het herstel van gezonde vasculaire plexus worden onderzocht. Bevindingen obtaineD De beschreven benadering kan therapeutische middelen voor ischemische retinopathie zoals diabetes of prematuriteit en eventueel gebruikmaken andere vasculaire aandoeningen van het CZS.
Introduction
Gedurende CNS ontwikkeling, zenuwen, immuuncellen en bloedvaten vast opmerkelijk gekoppeld netwerken om adequate weefsel perfusie zorgen en laat de transmissie van sensorische informatie 1-5. De verdeling van vasculaire systemen resulteert in onvoldoende zuurstofvoorziening van de weefsels en gecompromitteerde metabole vraag en wordt steeds meer erkend als een belangrijke bijdrage aan de pathogenese van neurodegeneratieve ziekten 6. Vasculaire uitval en de verslechtering van de neurovasculaire eenheid binnen de hersenen, bijvoorbeeld, is geassocieerd met vasculaire dementie, vasculaire laesies van de witte stof van de hersenen 7 en Alzheimer met stenose van arteriolen en kleine vaten 8. Bovendien wordt verslechterde vasculaire barrièrefunctie gedacht multiple sclerose 9 en amyotrofe laterale sclerose 10 dragen.
Van direct belang zijn voor de retinale model beschreven in dit protocol, verblindendeziekten zoals diabetische retinopathie en 11 retinopathie van prematuriteit 12, 13 gekenmerkt door een fase van vroege vasculaire degeneratie. De daaropvolgende ischemische belasting van de neurovasculaire netvlies veroorzaakt een tweede fase van overmatig en pathologische neovascularisatie die waarschijnlijk afkomstig als compenserende reactie opnieuw instate zuurstof en energievoorziening 14-16. Een aantrekkelijke strategie om de ischemische stress die centraal ziekteprogressie overwinnen is om functionele vasculaire netwerken herstellen specifiek in de ischemische gebieden van de neuro-retina (figuren 2 en 3). Veroorzakend een gecontroleerde angiogene respons kan overkomen contra-intuïtief een aandoening waarbij anti-angiogene behandelingen zoals anti-VEGF's worden beschouwd als aangepast behandelingen. Toch bewijs voor de geldigheid van deze aanpak is montage. Bijvoorbeeld, het verbeteren van "fysiologische-achtige" vasculaire hergroei in ischemic retinopathiën is elegant aangetoond door middel van introductie van endotheliale voorlopercellen 17, remming van Müller-cel tot expressie VEGF geïnduceerde downregulatie van andere angiogene factoren 18, injectie van myeloïde voorlopercellen 19, remming van NADPH oxidase geïnduceerde apoptose 20, het verhogen van de voeding ω-3 meervoudig onverzadigde vetzuren zuur inname 21 behandeling met een carboxyl-terminaal fragment van tryptofaan tRNA synthetase 22 en directe toediening van VEGF of FGF-2 voor de bescherming van gliacellen 23. Bovendien hebben we aangetoond dat het moduleren van neuronale klassieke Praktische signalen zoals Semaforines of netrins in ischemische retinopathie versnelt vasculaire regeneratie van gezonde vaten in het netvlies en daardoor vermindert pathologische angiogenèse 24, 25. Van directe klinische relevantie, een aantal van de hiervoor genoemde dierlijke studies tonen aan dat het bevorderen van vasculaire regeneratie tijdens de vroege fase van ischemische retinopathie kan een aanzienlijke besparing-zicht bedreigen pre-retinale neovascularisatie 19, 23, 24, 26, waarschijnlijk door de vermindering van ischemische belasting.
Het bedenken van therapeutische strategieën die regeneratie van functionele schepen te stimuleren blijft een belangrijke uitdaging voor vasculaire biologen. Hier beschrijven we een experimenteel systeem dat de muis-model van zuurstof-geïnduceerde retinopathie (OIR) om strategieën te verkennen om vasculaire hergroei te moduleren in het netvlies in dienst heeft. Ontwikkeld door Smith et al.. In 1994 27, dit model fungeert als een proxy voor de menselijke proliferatieve retinopathieën en bestaat uit het blootstellen van P7 muis pups tot 75% O 2 tot P12 en vervolgens opnieuw introduceren van de pups tot omgevingstemperatuur O 2-spanning (Figuur 1). Dit paradigma losjes bootst een scenario waarbij een te vroeg geboren baby wordt geventileerdmet O 2. De blootstelling van de muis pups te hyperoxie veroorzaakt degeneratie van het netvlies haarvaten en microvasculature, en levert een reproduceerbare gebied van vaso-uitwissen (VO) doorgaans aan bij het verlaten van O 2 op P12, hoewel maximale VO gebied na wordt bereikt bij 48 uur (P9) blootstelling aan O2 28. In de muis, de avasculaire VO zones spontaan te regenereren in de loop van de week na herintroductie om ruimte lucht en uiteindelijk VO zones zijn volledig opnieuw gevasculariseerd (figuur 2). Herintroductie kamerlucht van muizen blootgesteld aan OIR lokt pre-retinale neovascularisatie (NV) (maximaal bij P17) die meestal wordt beoordeeld om de effectiviteit van anti-angiogene behandeling paradigma bepalen. In zijn zuiverste vorm, de OIR model geeft een zeer reproduceerbare en kwantificeerbare instrument om zuurstof-geïnduceerde vasculaire degeneratie beoordelen en bepalen de omvang van de destructieve pre-retinale neovascularisatie 29-31.
30, 31. Hier geven we een eenvoudige stap-voor-stap procedure om de modulatie van fysiologische revascularisatie onderzoeken in de neurale retina van farmacologische verbindingen potentiële therapeutica, virale vectoren of de invloed van kandidaat genen in transgene of knockout-muizen te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek verklaring: Alle dierproeven houdt zich het dier zorg richtlijnen die door de Vereniging voor Onderzoek naar Visie en Oogheelkunde (ARVO) verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Vision Research en de Canadese Raad van Animal Care.
1. Zuurstof Induced retinopathie (OIR)
- Geboortedatum van muisjongen als P0 Record.
- Noteer alle gewichten van de dieren bij binnenkomst in O 2 om een voldoende gewicht bereik te garanderen. Opmerking: Voor C57BL / 6 muizen op P17, dient het lichaamsgewicht variëren tussen 5 en 7,5 g voor maximale NV 32. Om milieu consistentie wordt aanbevolen om nestgenoten als controle (voor genetisch gemodificeerde muizen en muizen die experimentele behandelingen). Bij de beoordeling van effecten van een virale vector, moet men tropisme van het virus te overwegen en voldoende tijd voor de volle ontplooiing van viraal geleverd transgenen. Snel uiten viralevectoren zoals 3e generatie lentivirussen 24, 25, 33 worden aanbevolen.
- Plaats muis pups op P7 (C57BL / 6 of gewenst stam) en een CD1 bevorderen moeder in een zuurstofkamer vastgesteld op 75% O 2 voor 5 dagen 27. Milieu vochtigheid en temperatuur werden constant gehouden gedurende O 2 blootstelling. Opmerking: Onderzoek faciliteiten uitgerust met een centrale bron van O 2 zijn ideaal en beperken de omslachtige vervanging van lege O 2 tanks. Als het werken met transgene of knock-out muizen is belangrijk dat de controle en experimentele muizen van dezelfde leverancier verworven genetische afwijkingen binnen dezelfde stammen 30, 29 beperken.
- Bij P12, verwijder muizen uit de zuurstof kamer en dieren terugkeren naar O 2 omgevingstemperatuur.
2. Intravitreale Injectie voor Levering van verbindingen naar de Inner Retina (When beoordelen van effecten van een Farmacologische verbinding of recombinant eiwit)
- Bij P14, verdoven muizen met 2% isofluraan in zuurstof 2 L / min (of dierenbescherming-commissie keurt verdoving van keuze). Om de doeltreffendheid van de anesthesie controleren, achtereenvolgens knijp de staart, achterste voet en oor met een pincet.
- Plaats de muis op zijn buik.
- Met behulp van een steriele 10 ul injectiespuit voorzien van een schuine getrokken glazen naald Voer een injectie van een maximaal volume van 1 pl van de oplossing die verbinding wordt onderzocht of drager (fysiologische zoutoplossing) en het achterste limbus van het oog, met een 45 ° hoek het vermijden van de lens. Opmerking: De getrokken glazen naald aan de spuit bevestigd met een druppel epoxyhars.
- Breng een druppel smeermiddel oogzalf (idealiter met antibiotica) met een wattenstaafje om het oog van de muis.
- De terugkeer van de muis terug naar de kooi met het bevorderen van de moeder. Muizen worden vervolgens zorgvuldig gevolgd tot reoverdekt en volledig ambulant.
3. Beoordeling van Vessel perfusie en barrièrefunctie (Integrity) door fluorescentie angiografie
- Verdoven muizen met 2% isofluraan in zuurstof 2 L / min (of dierenbescherming-commissie keurt verdoving van keuze). Om de doeltreffendheid van de anesthesie controleren, achtereenvolgens knijp de staart, achterste voet en oor met een pincet. Opmerking: Dit wordt meestal uitgevoerd op P17 wanneer regeneratie wordt beoordeeld. Ook carry-out van de analyse op P19 en P21 om te bepalen of vasculaire integriteit bewaard blijft in de tijd.
- Eenmaal verdoofd, wegen de muis.
- Maak een middellijn buik incisie met dissectieschaar. Opmerking: Opheldering instrumenten moeten regelmatig worden gecontroleerd en aangescherpt.
- Delen van ribben lateraal en de ribbenkast te verhogen met behulp van een tang. Opmerking: Het is noodzakelijk om zo lateraal mogelijk gesneden om schade aan het hart te voorkomen.
- Na het verwijderen peripHeral weefsel van het hart, klem de dalende aorta met hemostatische tang.
- Langzaam injecteren fluoresceïne-dextran aan de linker ventrikel met behulp van een 25 G naald. Opmerking: Als vasculaire barrièrefunctie wordt onderzocht, is 70 kDa fluoresceïne-dextran gebruikt als het zal lekken van schepen als integriteit vaartuig in het gedrang komt. Als de onderzoeker wil bloedvaten werpen, wordt 2 MDa fluoresceïne-dextran gebruikt. Kritische stappen: 1) Om een homogene verdeling, centrifuge fluoresceïne-dextran zorgen en injecteer het supernatant, 2) Met het oog op vaatvernauwing voorkomen, injecteren opgewarmd fluoresceïne-dextran oplossing, 3) Zijn omlooptijd moet niet teveel 4 min.
- Onthoofden muizen 2 min na injectie met operationele schaar.
4. Enucleatie en oogfixatie
Opmerking: Bij de beoordeling van de tarieven van de vasculaire regeneratie, eerste netvliezen afhalen op P12 en bovendien op P14 en P17. Verhoog het aantal bemonsterde tijdstips voor meer nauwkeurige bepaling van de tarieven van revascularisatie 24.
- Kantel de muis hoofd en plaats deze op zijn kant.
- Verwijder het vel en de oogleden die het oog met behulp van dissectieschaar.
- Plaats gebogen pincet onder het oog en trek het voorzichtig tot de oogzenuw is doorgesneden.
- Draai het hoofd van de muis op zijn andere zijde en voer dezelfde stappen (stappen 4.2 en 4.3).
- Om een betere penetratie van fixatief zorgen, prik een gat in de voorste kamer van het oog met behulp van 30 G naald.
- Breng ogen een buis met 4% paraformaldehyde (PFA) en vast gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Verwijder en was PFA ogen 4 maal met een oplossing van ijskoude PBS.
5. Netvlies Dissection
- Plaats muis ogen in een petrischaal met koude PBS en voeren dissectie van de netvliezen onder een stereomicroscoop.
- Verwijder extra vet / weefsel rondom het oog met micro-dissectie scissors.
- Snijd het hoornvlies met micro-dissectie schaar.
- Gebruik van twee paar tang, minutieus schil de sclera weg van de periferie naar de oogzenuw en gooi.
- Knijp de lens (witachtige bal onder het hoornvlies) met een tang en haal hem uit het oog beker. Gebruik een pincet als een ondersteuning, en de andere om grip en voorzichtig omhoog en verwijder de lens.
- Met behulp van kleine borstels (maat 0) en een tang de hyaloid schepen uit de binnenzijde van het netvlies los.
- Verwijder bundels hyaloid vaartuigen verbonden met de optische schijf met behulp van een tang.
- Transfer ontleed netvliezen tot 2 ml microcentrifugebuizen met PBS en leg ze op ijs voorafgaand aan het starten van de kleuringsprocedure.
6. Netvlies vaatverkleuring
- Incubeer ontleed netvlies overnacht onder zacht schudden bij 4 ° C in een oplossing van fluorescent gekoppelde isolectin B4 (rhodamine-lectine of andere) in PBS bevattende 1 mM CaCl2
- De volgende dag, verwijder kleuroplossing en was netvlies 3x in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
7. Bereiding van Retinale Flatmounts
- Transfer netvliezen, fotoreceptor-kant naar beneden, op een microscoop glijbaan en maken vier diepe gelijke afstand radiale incisies met behulp van een chirurgische scalpel aan het netvlies te verdelen in vier even grote kwadranten. Tijdens de insnijdingen, brace het netvlies met een borstel, zodat het niet beweegt.
- Met behulp van twee borstels gedrenkt in PBS, zorgvuldig plat de kwadranten photoreceptor side-down en dompel het netvlies in montage medium om fotoblekingsreactie voorkomen. Dan plaatst u voorzichtig een dekglaasje op het oppervlak van de gemonteerde netvlies zonder druk uit te oefenen en ervoor te zorgen dat de luchtbellen niet ophopen onder het dekglas. </ Li>
8. Imaging en kwantificering van Vasoobliteration (VO) en Neovascularisatie (NV) zoals eerder beschreven 31
- Neem foto's van de hele gemonteerde netvlies met een epi-fluorescentie microscoop bij een vergroting van 10x.
- Open de retinale afbeelding in foto-editing software, steek elkaar en meet de totale netvlies gebied, en avasculaire gebied. Gebied kan worden uitgedrukt in pixels.
- Bepaal omvang van VO door het aantal pixels in het avasculaire gebied van het aantal pixels in het totale netvliesgebied.
- Bepaal omvang van NV door het aantal pixels van NV door het aantal pixels in het totale netvliesgebied beschreven 31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De OIR model wordt veel gebruikt om zuurstof geïnduceerde vasculaire degeneratie en ischemie geïnduceerde pathologische neovascularisatie studeren in de retina en is bij de ontwikkeling van de momenteel toegepaste anti-angiogene behandelingen voor oogziekten 27, 29, 30 zijn. Bevindingen verkregen met behulp van dit model kan los worden geëxtrapoleerd naar ischemische retinopathie zoals proliferatieve diabetische retinopathie en retinopathie van prematuriteit 30.
Hier presenteren we een alternatief gebruik van dit model aan vasculaire regeneratie te bestuderen. We zullen een voorbeeld van een strategie beschrijven aan de ischemische retina die onlangs werd gepubliceerd door ons lab te regenereren. In de gepresenteerde studie, tonen we aan dat aanhoudende neuronale ischemie activeert endoplasmatisch reticulum (ER) stress en via een van de effector endoribonucleasen IRE1α, splitst het mRNA van de klassieke neuronale begeleiding cue netrine-1. We tonendat intra-oculaire levering van de Netrin-1, stimuleert een programma van herstellende angiogenese in retinale myeloïde cellen en dus versnelt zenuwweefsel revascularisatie na OIR 25. Bovendien hebben we een voorbeeld van een versnelde vasculaire regeneratie met behulp van lentivirale gemedieerde silencing van IRE1α.
De beschreven experimentele paradigma's kunnen worden aangepast aan de exploratieve voorkeursbehandeling onderzoeken. Belangrijk is dat het tijdstip van intravitreale injectie bepaald op basis van de aard van de verbinding en onderzocht moet rekening houden met het mechanisme waardoor de onderzochte behandeling optreedt. Bijvoorbeeld, om een farmacologische stof (receptor agonist, antagonist, enz.) te bestuderen, P14 kan worden geselecteerd als deze overeenkomt met een tijdstip waar retinale revascularisatie nog aan het versnellen is een snelwerkende interventie kan helpen versnellen het tempo van revascularisatie (Cijfers 2 en 3a). Wanneer virale vectoren zijntoegepast, voldoende moet worden toegewezen om volledige expressie van de passagier gen en een eerder tijdstip worden gekozen volledige expressie van het transgen of de volledige uitschakeling van het doelgen (figuur 4) te waarborgen. Lentivirale gebaseerde vectoren zijn bijzonder geschikt in dit verband vanwege hun snelle expressie lage ontstekingsreactie en gemak van productie 24, 25. Het is ook essentieel om er zeker van dat het doelgen wordt aan de juiste retinale celpopulatie (RGC, endotheelcellen, Müller Cell, enz.), waardoor het tropisme van het geselecteerde virale vector worden overwogen maken. Alternatief bestuderen van de rol van een gen voor vasculaire regeneratie transgene of knockout dieren biedt het voordeel van niet om intra-oculaire injecties uitgevoerd.
Figuur 1. Schematische weergave van de muis OIR model. Mouse pups en zogende moeders worden blootgesteld aan 75% O 2 uit P7 tot P12. Een geventileerde zuurstofkamer met gestage O 2 levering en oximeter is vereist. Tijdens deze eerste periode, retinale vaso-vernietiging optreedt. Op P12 worden muizen terug naar kamerlucht (21% O2) tot P17 bij maximale pathologische retinale tuften ontstaat. Neovascularisatie terugtrekt over de volgende dagen. De ideale periode om vasculaire regeneratie onderzoeken is het venster tussen P12 en P17. Bemonstering en beoordelen van verschillende tijdstippen voor de omvang van vaso-vernietiging is de sleutel tot het ophelderen van actuele tarieven van revascularisatie.
Figuur 2. Time loop van retinale revascularisatie na zuurstof-geïnduceerde vaso-obliterantsoen. A) Grafische voorstelling van een retinale flatmounting procedure. Een incisie wordt gemaakt door de bovenkant van het hoornvlies (zwart-grijs koepel) en de sclera (gestippelde rode lijnen) en het netvlies wordt ontward. De lens kan ofwel na het openen van het hoornvlies / sclera of eenmaal de sclera wordt verwijderd zoals weergegeven in het schema worden geëxtraheerd. Hyaloid vaten worden vervolgens verwijderd en kleuring van retinale vaten uitgevoerd. Zodra de kleuringsprotocol is voltooid, wordt het netvlies dan snijd in 4 gelijke afstand secties en gemonteerd op een microscoop dia schip-side-up. B) Lectin gebeitst flatmount netvliezen van muizen blootgesteld aan OIR. Zoals vaartuigen regenereren, het gebied van vaso-uitwissing (hier maximaal bij P12) vult in Pathologische neovascularisatie is maximaal bij P17 en verschijnt als verzadigde plekken lectine gekleurd OIR netvlies. Door P19-P21 zijn netvlies volledig geregenereerd hun vasculaire netwerk. (Dit cijfer is gewijzigd van Binet et al.. Cell Metabolism 2013 25)
. Figuur 3 Voorbeeld van een injecteerbare behandeling die retinale vasculaire regeneratie versnelt: Netrin-1. A) Netrin-1 wordt geïnjecteerd op P14 en omvang van vasculaire hergroei beoordeeld op P17. Een dosis-afhankelijke toename van vasculaire regeneratie waargenomen. B) vasculaire integriteit kan worden beoordeeld door perfusie met een laag molecuulgewicht fluorescerende Dextran. Wanneer schepen gecompromitteerde barrièrefunctie tonen, zal de fluorescerende dextran lekken buiten het vat (pijlen). (Dit cijfer is gewijzigd van Binet et al.. Cell Metabolism 2013 25)
Figuur 4. Voorbeeld van gene silencing with lentivirale-geleverde shRNAs voor retinale vasculaire regeneratie:. Lv.shIRE1α Om het vermogen van gene silencing van IRE1α in retinale ganglion neuronen vasculaire regeneratie steun te beoordelen, werd een intravitreale injectie van een lentivirus dat codeert voor een shIRE1α geïnjecteerd op P3 om voldoende tijd te geven voor gene silencing bij vasculaire groei en vaso-vernietiging wordt beoordeeld. De 3e generatie lentivirus toegepast in dit voorbeeld bevat een gemodificeerd vesiculaire stomatitis virus glycoproteïne (VSV-G), ontworpen om plasmamembranen richten. Hoewel deze vectoren efficiënt infecteren retinale ganglioncellen, kan expressie worden opgemerkt in andere lokale celtypen. (A) Deze behandeling leidde niet tot merkbare variaties in zuurstof geïnduceerde vaso-vernietiging als bepaald bij P12, betekent dat alle waargenomen voordelen van vaso-vernietiging gemeten op latere tijdstippen worden door verhoogde vasculaire regeneratie. (B) Remming van IRE1α in dit paradigma drastisch verbeterde vasculaire regeneratie in de hergroei fase van OIR op P17. (Dit cijfer is gewijzigd van Cell Metabolism Binet et al.. 2013 25) (C) Het beoordelen van een derde tijdstip van vaso-uitwissen zoals P14, is nodig om actuele tarieven van revascularisatie bepalen. (Dit cijfer is aangepast Joyal et al.. Blood 2011 24) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wat is de meest effectieve manier om de groei van nieuwe gezonde schepen in ischemisch zenuwweefsel stimuleren? Is het therapeutisch geldig te beïnvloeden en versnellen van nature voorkomende vasculaire hergroei? In de neuro-ischemische aandoeningen zoals ischemische retinopathie of een beroerte, wordt vasculaire degeneratie geassocieerd met een verminderde neuronale functie 35-38. Vandaar vroeg letsel tegen te gaan, het herstel van regionale micro-circulatie tijdens de onmiddellijke / vroege segment van de ziekte kunnen blijken gunstig. In een oculaire context, experimentele paradigma dat revascularisatie van de ischemische retina versnellen verminderen pathologische neovascularisatie 21-25, 34 en dus deze aanpak verder onderzoek verdient.
Sinds de introductie 20 jaar geleden, heeft de OIR model 27 een revolutie retinale angiogenese onderzoek 30. Hier geven we een aanvullende aanvraag voor dit model aan potentiële strat studerentegieën om fysiologische vasculaire regeneratie moduleren in de ischemische retina. Een ideale diermodel moet met een aantal criteria zoals de nabijheid van menselijke pathofysiologie, hoge reproduceerbaarheid, snelle uitvoering en ideaal, lage kosten omvatten. Het muismodel van OIR voldoet aan al deze criteria en kan in minder dan 3 weken worden uitgevoerd-out.
Ondanks de vele vermelde voordelen, nadelen omvatten de huidige behoefte om de muis offeren voor analyse en dus nauwkeurige longitudinale bewaking van een dier nog niet mogelijk is met huidige grafische gereedschappen. Momenteel in vivo beeldvorming technieken zoals LGO of fluoresceïne angiografie grotendeels verzonden door de inherente optische beperking van de muis oog (kromtestraal en klein formaat) die beeldvorming dekking 39 reduceert tot de centrale gebieden van de retina die niet relevant zijn het begin van het model.
Bij gebruik van vasculaire regeneratie bestuderen pOORGESTELDE in dit protocol papier, moeten alle overwegingen die van toepassing zijn op het bestuderen van neovascularisatie ook worden gecontroleerd. Deze omvatten het opnemen gewicht van het dier te schatten de metabole gezondheid van de pup, die sterk van invloed op angiogenese 32. Nauwkeurige regeling van de zuurstofspanning in de hyperoxic kamer is ook kritisch. Variatie in zuurstofconcentratie heeft een directe impact op vasoobliteration, die onvermijdelijk leiden tot kritieke gegevens misinterpretatie. Het wordt daarom aanbevolen om ofwel de uitvoering van continue elektronische bewaking van kamer zuurstofconcentratie of in het minst, monitoren dagelijkse veranderingen in zuurstof niveaus en beperken oxycycler deur naar constant zuurstofgehalte op peil te houden. Optimale verwerking van netvliezen neemt ook de praktijk. Extractie, montage en kleuring van het netvlies moet worden uitgevoerd met zorg als de relatief kwetsbaar netvlies moeten delicaat worden behandeld. Bovendien, als voor alle experimenten met genetisch gemodificeerde dieren, genetische drift van een kolonie ceen beschamen resultaten. Indien een selectieve kracht (in een muizenkolonie bijvoorbeeld), de allele of genetische drift is een willekeurig proces dat kan leiden tot grote veranderingen in de populatie over een korte tijdsperiode. Allelfrequenties veranderen van generatie op generatie en resulteren in de vorming van een sub-kolonie 40, 41. Deze mutaties zijn grotendeels sporen en het is derhalve belangrijk om het aantal generaties door dezelfde kweker paren in dezelfde kolonie beperken. De meest efficiënte manier om de hoogste genetische stabiliteit te bereiken is "stocks" vernieuwen om de vijf generaties of overgaan tot terugkruisen met een gekochte muis identieke achtergrond.
Het is ook aanbevolen om te testen voor retinadegeneratie mutaties (rd) 1 en 8 42, ten minste een keer voordat u een nieuwe lijn om te voorkomen verwarrende fenotypes die kunnen worden toegeschreven aan voortijdige fotoreceptor degeneratie. Bij transgene dieren,is het van belang ervoor te zorgen dat zowel de controle en mutante muizen worden verkregen van dezelfde leverancier en zijn noodzakelijk op dezelfde genetische achtergrond.
Als we doorgaan met de moleculaire mechanismen van vorming en groei van bloedvaten op te helderen, nieuwe benaderingen om te versnellen, te vertragen of te sturen ontluikende bloedvaten zijn ontstaan. Een modelsysteem waarin modulatie van vascularisatie kan worden onderzocht in vivo in een pathologische context kan een waardevol hulpmiddel voor potentiële therapeutische paradigma staand neuronale ischemie in het CZS tegen te verschaffen. Aanpassing van de muis OIR model om vasculaire regeneratie studie verschaft een dergelijke locatie en blijft een waardevol instrument om ons begrip van de moleculaire basis voor fysiologische en pathologische angiogenese verder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
PS heeft een Canada Research Chair in retinale Celbiologie en de Alcon Research Institute New Investigator Award. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Canadese Institutes of Health Research (221.478), de Canadese Diabetes Association (OG-3-11-3329-PS), de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (418.637) en de Stichting Bestrijding Blindheid Canada. Ondersteuning werd ook door de Reseau de Recherche en Sante de la Vision du Quebec.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other) | |||
| CD1 nursing mothers | Vendor of choice | ||
| Operating Scissors straight | World Precision Instruments | 14192 | |
| Dissecting Scissors straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Vannas Eye Scissors | Harvard Apparatus | 72-8483 | |
| Iris Forceps, curved, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Brushes 362R size 0 | Dynasty | ||
| Dumont Forceps #3; straight | World Precision Instruments | 500338 | |
| Surgical Blade, size 10 | Bard-Parker | 371110 | |
| Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Laboratories, Inc | RL-1102 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-368 | |
| Fluoromount G | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope | Zeiss | ||
| Leica MZ9.5 Stereomicroscope | Leica | ||
| Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000 | Sigma-Aldrich | 46945 |
References
- Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 436, 193-200 (2005).
- Eichmann, A., Thomas, J. L. Molecular Parallels between Neural and Vascular Development. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, (2012).
- Larrivee, B., Freitas, C., Suchting, S., Brunet, I., Eichmann, A. Guidance of vascular development: lessons from the nervous system. Circ Res. 104, 428-441 (2009).
- Stefater Iii, J. A., et al. Regulation of angiogenesis by a non-canonical Wnt-Flt1 pathway in myeloid cells. Nature. 474, 511-515 (2011).
- Checchin, D., Sennlaub, F., Levavasseur, E., Leduc, M., Chemtob, S. Potential role of microglia in retinal blood vessel formation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3595-3602 (2006).
- Quaegebeur, A., Lange, C., Carmeliet, P. The neurovascular link in health and disease: molecular mechanisms and therapeutic implications. Neuron. 71, 406-424 (2011).
- Yamamoto, Y., Craggs, L., Baumann, M., Kalimo, H., Kalaria, R. N. Review: molecular genetics and pathology of hereditary small vessel diseases of the brain. Neuropathol Appl Neurobiol. 37, 94-113 (2011).
- Brun, A., Englund, E. A white matter disorder in dementia of the Alzheimer type: a pathoanatomical study. Ann Neurol. 19, 253-262 (1986).
- Prat, A., et al. Migration of multiple sclerosis lymphocytes through brain endothelium. Arch Neurol. 59, 391-397 (2002).
- Rule, R. R., Schuff, N., Miller, R. G., Weiner, M. W. Gray matter perfusion correlates with disease severity in ALS. Neurology. 74, 821-827 (2010).
- Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366, 1227-1239 (2012).
- Hartnett, M. E., Penn, J. S. Mechanisms and management of retinopathy of prematurity. N Engl J Med. 367, 2515-2526 (2012).
- Sapieha, P., et al. Retinopathy of prematurity: understanding ischemic retinal vasculopathies at an extreme of life. J Clin Invest. 120, 3022-3032 (2010).
- Chen, J., Smith, L. Retinopathy of prematurity. Angiogenesis. 10, 133-140 (2007).
- Cheung, N. Diabetic retinopathy and systemic vascular complications. Progress in Retinal and Eye Research. 27, 161-176 (2008).
- Smith, L. E. Through the eyes of a child: understanding retinopathy through ROP the Friedenwald lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 5177-5182 (2008).
- Caballero, S., et al. Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells. Diabetes. 56, 960-967 (2007).
- Wang, H., et al. VEGF-mediated STAT3 activation inhibits retinal vascularization by down-regulating local erythropoietin expression. Am J Pathol. 180, 1243-1253 (2012).
- Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. J Clin Invest. 116, 3266-3276 (2006).
- Saito, Y., Geisen, P., Uppal, A., Hartnett, M. E. Inhibition of NAD(P)H oxidase reduces apoptosis and avascular retina in an animal model of retinopathy of prematurity. Mol Vis. 13, 840-853 (2007).
- Connor, K. M., et al. Increased dietary intake of omega-3-polyunsaturated fatty acids reduces pathological retinal angiogenesis. Nat Med. 13, 868-873 (2007).
- Banin, E., et al. T2-TrpRS inhibits preretinal neovascularization and enhances physiological vascular regrowth in OIR as assessed by a new method of quantification. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2125-2134 (2006).
- Dorrell, M. I., et al. Maintaining retinal astrocytes normalizes revascularization and prevents vascular pathology associated with oxygen-induced retinopathy. Glia. 58, 43-54 (2010).
- Joyal, J. -S., et al. Ischemic neurons prevent vascular regeneration of neural tissue by secreting semaphorin 3A. Blood. 117, 6024-6035 (2011).
- Binet, F., et al. Neuronal ER Stress Impedes Myeloid-Cell-Induced Vascular Regeneration through IRE1alpha Degradation of Netrin-1. Cell Metab. 17, 353-371 (2013).
- Fukushima, Y., et al. Sema3E-PlexinD1 signaling selectively suppresses disoriented angiogenesis in ischemic retinopathy in mice. J Clin Invest. 121, 1974-1985 (2011).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35, 101-111 (1994).
- Lange, C., et al. Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247, 1205-1211 (2009).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 2813-2826 (2010).
- Stahl, A., et al. Computer-aided quantification of retinal neovascularization. Angiogenesis. 12, 297-301 (2009).
- Stahl, A., et al. Postnatal Weight Gain Modifies Severity and Functional Outcome of Oxygen-Induced Proliferative Retinopathy. Am J Pathol. 177, 2715-2723 (2010).
- Cerani, A., et al. Neuron-Derived Semaphorin 3A is an Early Inducer of Vascular Permeability in Diabetic Retinopathy via Neuropilin-1. Cell Metabolism. 18, 505-518 (2013).
- Sapieha, P. Eyeing central neurons in vascular growth and reparative angiogenesis. Blood. 120, 2182-2194 (2012).
- Dorfman, A., Dembinska, O., Chemtob, S., Lachapelle, P. Early manifestations of postnatal hyperoxia on the retinal structure and function of the neonatal rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 458-466 (2008).
- Dorfman, A. L., Joly, S., Hardy, P., Chemtob, S., Lachapelle, P. The effect of oxygen and light on the structure and function of the neonatal rat retina. Doc Ophthalmol. 118, 37-54 (2009).
- Chopp, M., Zhang, Z. G., Jiang, Q. Neurogenesis, angiogenesis, and MRI indices of functional recovery from stroke. Stroke. 38, 827-831 (2007).
- Li, L., et al. Angiogenesis and improved cerebral blood flow in the ischemic boundary area detected by MRI after administration of sildenafil to rats with embolic stroke. Brain Res. 1132, 185-192 (2007).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Dis Model Mech. 5, 444-456 (2012).
- Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat Genet. 37, 1181-1186 (2005).
- Jenuth, J. P., Peterson, A. C., Shoubridge, E. A. Tissue-specific selection for different mtDNA genotypes in heteroplasmic mice. Nat Genet. 16, 93-95 (1997).
- Mattapallil, M. J., et al. The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes. Investigative ophthalmolog., & visual science. 53, 2921-2927 (2012).
