Summary
הרשתית המכרסם כבר זמן רב מוכרת כחלון נגיש למוח. במאמר זה טכני אנו מספקים פרוטוקול אשר מעסיק את מודל העכבר של מחלת רשתית הנגרמת חמצן כדי ללמוד את המנגנונים שיובילו לכישלון של התחדשות כלי דם במערכת העצבים המרכזית, לאחר פגיעה איסכמית. המערכת המתוארת גם ניתן לרתום לבחון אסטרטגיות לקידום צמיחה מחודשת של כלי דם פונקציונליים בתוך הרשתית ומערכת העצבים המרכזית.
Abstract
רשתית המכרסמים היא אולי מערכת היונקים הנגיש ביותר בו כדי לחקור את יחסי גומלין עצבים וכלי דם במערכת העצבים המרכזית (CNS). זה יותר ויותר הכיר בכך שכמה מחלות ניווניות כגון אלצהיימר, טרשת נפוצה, ואלמנטי Amyotrophic Lateral Sclerosis הנוכחיים של פשרה כלי דם. בנוסף, הסיבות העיקריות לעיוורון באוכלוסיות גיל ילדים ועבודה (רטינופתיה של פגות ורטינופתיה סוכרתית, בהתאמה) מתאפיינות בניוון וכישלון כלי דם של צמיחה מחודשת של כלי דם פיזיולוגית. מטרת מאמר טכני זה היא לספק פרוטוקול מפורט ללמוד התחדשות כלי דם במערכת העצבים המרכזית ברשתית. השיטה יכולה להיות מועסק על מנת להבהיר את המנגנונים מולקולריים שיובילו לכישלון של צמיחת כלי דם לאחר פגיעת איסכמית. בנוסף, שיטות טיפוליות פוטנציאל להאיץ ולשחזר plexuses כלי דם בריא יכולות להיחקר. ממצאי obtaineד שימוש בגישה שתוארה עשויה לספק אפיקים טיפוליים לRetinopathies איסכמי כמו זו של סוכרת או פגות ואולי ירוויח מחלות כלי דם אחרות של מערכת העצבים המרכזית.
Introduction
לאורך פיתוח של מערכת העצבים המרכזית, עצבים, תאי מערכת החיסון וכלי דם להקים רשתות בשילוב להפליא כדי להבטיח זלוף רקמות נאות ולאפשר העברת מידע החושי 1-5. הפירוט של תוצאות מערכות כלי דם בחמצון מספיק רקמה ואספקה מטבולים שנפרצו ומוכר יותר ויותר כתורם חשוב בפתוגנזה של מחלות ניווניות 6. נשירת כלי דם ואת ההידרדרות של יחידת העצבים וכלי הדם בתוך המוח, למשל, קשורה לדמנציה וסקולרית, נגעים של כלי דם של החומר הלבן של המוח 7 ומחלת אלצהיימר עם היצרות של כלי דם קטנים וarterioles 8. בנוסף, הוא חשב תפקוד מחסום כלי דם לקוי לתרום טרשת נפוצה 9 וטרשת לרוחב amyotrophic 10.
של שייכות ישירה למודל הרשתית תואר בפרוטוקול זה, מסנוורמחלות כגון רטינופתיה סוכרתית 11 ורטינופתיה של פגות 12, 13 מתאפיינות בשלב של ניוון של כלי דם מוקדם. מתח איסכמי שהתפתח על רשתית העצבים וכלי הדם מפעיל שלב שני של neovascularization מוגזם ופתולוגי, כי סביר להניח שמקורו כתגובה מפצה לחמצן מחדש instate ואספקת אנרגיית 14-16. אסטרטגיה אטרקטיבית כדי להתגבר על מתח איסכמי שהוא מרכזי להתקדמות מחלה היא להחזיר את רשתות כלי דם פונקציונליות במיוחד באזורים איסכמי של נוירו הרשתית (איורים 2 ו -3). מעורר תגובת angiogenic מבוקר עלולה להתקל כמנוגד לאינטואיציה למצב בו טיפולים אנטי angiogenic כגון אנטי VEGFs נחשבים כטיפולים מותאמים. עם זאת, ראיות לתקפותה של גישה זו גוברת. לדוגמא, שיפור צמיחה מחודשת של כלי דם ", כמו פיזיולוגית" בischemRetinopathies ic הודגמה באלגנטיות באמצעות הקדמה של תאי האנדותל מבשר 17, עיכוב של downregulation המושרה VEGF-הביע תא Müller של גורמים האחרים angiogenic 18, הזרקה של אבות מיאלואידית 19, עיכוב של אפופטוזיס מושרה מונואמין NADPH 20, הגדלת שומן רב בלתי רווי בתזונה ω-3 צריכת חומצה 21, טיפול שבבר carboxyl-הטרמינל של synthetase tRNA טריפטופן 22, וניהול ישיר של VEGF או FGF-2 להגנה על תאי גליה 23. יתר על כן, אנו מראים כי ויסות אותות הנחיה עצביות קלאסיים כגון Semaphorins או Netrins בRetinopathies איסכמי מאיצה את התחדשות כלי דם של כלי בריאים בתוך הרשתית וכתוצאה מכך מפחיתה את היווצרות כלי דם פתולוגיים 24, 25. הרלוונטיות קלינית ישירה, כמה מהמחקרים בבעלי החיים האמורים לספק ראיות לכך שקידום מחדש של כלי דםדור בשלב המוקדם של איסכמי Retinopathies יכול להפחית באופן משמעותי neovascularization מסכנות ראייה מראש רשתית 19, 23, 24, 26, סביר להניח שבאמצעות הפחתת נטל איסכמי.
גיבוש אסטרטגיות טיפוליות שלעורר התחדשות של כלי פונקציונליים עדיין מהוות אתגר משמעותי עבור ביולוגים של כלי דם. כאן אנו מתארים מערכת ניסיונית אשר מעסיקה את מודל העכבר של מחלת רשתית הנגרמת חמצן (OIR) לחקור אסטרטגיות כדי לווסת את צמיחה מחודשת של כלי דם בתוך הרשתית. שפותח על ידי סמית et al. ב -1994 27, מודל זה משמש כמדד לRetinopathies שגשוג אנושי וכולל חשיפה של גורי עכבר P7 75% O 2 עד P12 ולאחר מכן מחדש מציגים את הגורים לO חדר הסביבה 2-מתח (איור 1). פרדיגמה זו באופן רופף מחקה תרחיש שבו פג מאוורר עם O 2. החשיפה של גורי עכבר לhyperoxia מעוררת התנוונות של נימים ונימי דם ברשתית, ותשואות אזור לשחזור של הרחבת כלי דם, הכחדה (VO) העריך בדרך כלל על יציאה מO 2 בP12, למרות שהוא הגיע לאזור VO המקסימאלי ב48 שעה (P9) לאחר חשיפה לO 2 28. בעכבר, אזורי VO avascular ספונטני להתחדש במהלך השבוע הבא מחדש מבוא לאוויר חדר וסופו של דבר אזורי VO הם לגמרי מחדש vascularized (איור 2). Re-מבוא לאוויר חדר של עכברים נתון OIR גם מעורר neovascularization מראש הרשתית (NV) (מקסימלי בP17) שהעריך בדרך כלל כדי לקבוע את היעילות של פרדיגמות טיפול אנטי angiogenic. בצורתו הטהורה ביותר, מודל OIR מספק כלי לשחזור וכמותיים מאוד להעריך ניוון של כלי דם נגרם על חמצן ולקבוע את מידת neovascularization מראש רשתית ההרסנית 29-31.
ss = "jove_content"> פרדיגמות טיפול explorative שונות לווסת התחדשות כלי דם במערכת העצבים המרכזית יכולה להיחקר באמצעות מודל OIR כולל שימוש בחומרים פרמקולוגיים, ריפוי גנטי, מחיקת גן ועוד. הנטייה של גישה שניתנה להשפיע לצמיחה מחודשת של כלי דם נבחנת צעד חכם בחלון בין P12 (VO המקסימאלי לאחר יציאה מhyperoxia) וP17 (NV המקסימאלי). הערכה של תוצאות טיפול בNV פתולוגיים ניתן לקבוע במהירות ובקלות במקביל ותוארה ביסודיות על ידי טל ועמיתיו 30, 31 ב. כאן אנו מספקים הליך של צעד אחר צעד פשוט כדי לחקור את האפנון של revascularization הפיזיולוגי בתוך הרשתית העצבית על ידי תרכובות תרופתית, תרופות פוטנציאליים, וקטורים ויראליים או ללמוד את ההשפעה של גנים מועמדים בעכברים מהונדסים או בנוקאאוט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
שמירה על אתיקה: כל הניסויים בבעלי החיים שומרת הנחיות טיפול בבעלי החיים שהוקמו על ידי האגודה לחקר חזון העיניים הצהרה (ארוו) לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים וחזון המחקר והמועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים.
1. רטינופתיה חמצן מושרה (OIR)
- רשום תאריך לידה של גורי עכבר כP0.
- להקליט את כל המשקולות של בעלי חיים עם כניסתו לO 2 כדי להבטיח טווח משקל הולם. הערה: לעכברים C57BL / 6 בP17, משקל גוף צריך לנוע בין 5 ו7.5 גרם לNV המקסימאלי 32. על מנת לשמור על עקביות סביבתית, מומלץ לשימוש להמלטה כבקרה (לעכברים מהונדסים גנטי, כמו גם עכברים שקבלו טיפולים ניסיוניים). כאשר להערכת השפעות של וקטור ויראלי, יש לקחת בחשבון כמיהות של הנגיף ולאפשר מספיק זמן לביטוי מלא של transgenes נמסר-באופן ויראלי. ויראלי במהירות להביעוקטורים כגון 3 lentiviruses הדור שלישי 24, 25, 33 מומלצים.
- גורי עכבר המקום בP7 (C57BL / 6 או רצוי זן) וCD1 טיפוח אם לתא חמצן נקבע על 75% O 2 במשך 5 ימים 27. לחות וטמפרטורה סביבתיות נערכו קבועים לאורך O 2 חשיפה. הערה: מתקני מחקר מצוידים במקור של O 2 מרכזי הם אידיאליים ולהגביל את ההחלפה מסורבלת של O הריק 2 טנקים. אם עובד עם עכברים מהונדסים או בנוקאאוט, חשוב כדי להבטיח ששליטה ועכברי ניסוי נרכשות מאותו הספק להגביל את הסחף גנטי בתוך אותו 30 הזנים, 29.
- בP12, להסיר עכברים מתא החמצן ולהחזיר חיות לסביבת O 2.
2. הזרקת זגוגית עבור משלוח של תרכובות לרשתית הפנימית (מה עלי לעשותאפקטי en הערכה של מתחם תרופתי או חלבון רקומביננטי)
- בP14, להרדים עכברים עם isoflurane 2% ב2 ליטר / דקת חמצן (או הרדמה-אישר ועדת הגנה על בעלי חיים של בחירה). כדי לבדוק את האפקטיביות של ההרדמה, ברצף לצבוט את הזנב, הרגל אחורית ואוזן עם מלקחיים.
- מניחים את העכבר על הבטן שלה.
- שימוש סטרילי מצויד משופעת מחט משכה זכוכית מזרק μl 10, לבצע הזרקה של נפח מקסימאלי של 1 μl של תמיסה המכילה התרכובת נחקרת או רכב (תמיסת מלח פיזיולוגית) בימבוס האחורי של העין, עם 45 ° זווית הימנעות העדשה. הערה: זכוכית המחט משכה מחוברת למזרק באמצעות טיפה של אפוקסי שרף.
- החל ירידה של משחה סיכה עיניים (באופן אידיאלי עם אנטיביוטיקה) עם מקלון לעין של העכבר.
- להחזיר את העכבר בחזרה לכלוב עם אמא של טיפוח. אז עכברים הם במעקב צמוד עד מחדשמכוסה ואמבולטורי באופן מלא.
3. הערכת זלוף כלי ותפקוד מחסום (Integrity) על ידי והעמסת אנגיוגרפיה
- הרדימי עכברים עם isoflurane 2% ב2 ליטר / דקת חמצן (או הרדמה-אישר ועדת הגנה על בעלי חיים של בחירה). כדי לבדוק את האפקטיביות של ההרדמה, ברצף לצבוט את הזנב, הרגל אחורית ואוזן עם מלקחיים. הערה: זו מבוצעת בדרך כלל בP17 כאשר ההתחדשות מוערכת. גם לשאת את הניתוח בP19 P21 וכדי לקבוע אם שלמות כלי דם נשמרה לאורך זמן.
- הרדים פעם, לשקול את העכבר.
- לעשות חתך בבטן קו האמצע עם מספריים לנתח. הערה: מכשירי ביתור צריכים להיבדק באופן קבוע ומחודדים.
- חותכים את צלעות רוחבית ולהעלות את בית החזה בעזרת מלקחיים. הערה: יש צורך לחתוך כרוחבי ככל האפשר, כדי למנוע נזק ללב.
- לאחר הסרת peripרקמת heral מהלב, מהדקת את אב העורקים יורד עם מלקחיים עוצר דמום.
- לאט לאט להזריק העמסה-dextran לחדר השמאלי באמצעות מחט 25 G. הערה: אם תפקוד מחסום כלי דם הוא נחקר, 70 העמסה-dextran kDa מועסק כפי שהוא ידלוף החוצה מכולים כאשר שלמות כלי היא בסכנה. אם החוקר רוצה להפיל כלי דם, משמש 2 העמסה-dextran מד"א. שלבים קריטיים: 1) כדי להבטיח חלוקה מחודשת הומוגנית, והעמסת-dextran צנטריפוגה ומזריק את supernatant, 2) על מנת למנוע כיווץ כלי, להזריק פתרון והעמסת-dextran מחומם, 3) זמן תפוצתו לא צריך עודף 4 דקות.
- לערוף עכברים 2 דקות לאחר הזרקה במספריים הפעלה.
4. Enucleation ועיני קיבוע
הערה: בהערכת שיעורים של התחדשות כלי דם, לאסוף רשתיות ראשונה בP12 ובנוסף בP14 וP17. להגדיל את מספר נקודת זמן נדגמוים להגדרה מדויקת יותר של שיעורי revascularization 24.
- הטה את ראש העכבר ולמקם אותו על צדו.
- הסר את העור ועפעפיים מכסים את העין באמצעות מספריים לנתח.
- הנח מלקחיים מעוקלים מתחת לעין בעדינות למשוך אותו עד לעצב הראייה הוא ניתק.
- לסובב את ראשו של העכבר על הצד האחר שלה ולבצע את אותם צעדים (שלבים 4.2 ו4.3).
- כדי להבטיח חדירה טובה יותר של מקבע, לנקב חור בלשכה הקדמית של העין באמצעות מחט 30 G.
- העבר את העיניים לצינור המכיל paraformaldehyde 4% (PFA) ולתקן במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
- הסר PFA ולשטוף את עיני 4 פעמים עם פתרון של PBS קר כקרח.
5. Dissection רשתית
- הנח את עיני עכבר בצלחת פטרי המכילה PBS הקר ולבצע נתיחה של הרשתית תחת סטראו.
- להסיר את השומן / רקמה נוספת המקיפה את העין עם מדע מיקרו לנתיחהssors.
- חותכים את הקרנית עם מספריים מיקרו לנתיחה.
- באמצעות שני זוגות מלקחיים, בדקדקנות לקלף את לובן העין במרחק מהפריפריה לכיוון עצב הראייה וזורק.
- צבוט את העדשה (כדור לבנבן מתחת לקרנית) עם מלקחיים ולחלץ אותו מכוס העין. השתמש זוג מלקחיים כתמיכה, והשני לאחיזה ולהעלות בזהירות ולהסיר את העדשה.
- לנתק את כלי hyaloid מהצד הפנימי של הרשתית באמצעות מברשות קטנות (גודל 0) ומלקחיים.
- הסרת חבילות של כלי hyaloid מחוברים לדיסק האופטי באמצעות מלקחיים.
- העברה גזור רשתיות ל2 microcentrifuge צינורות מיליליטר המכילים PBS ומניחים על קרח לפני שתתחיל בהליך מכתים.
6. רשתית כלי דם מכתים
- דגירה רשתית גזור לילה עם עדין רועד ב 4 ° C בתמיסה של fluorescently B4 מצמיד isolectin (rhodamine-לקטינים או אחרים) בPBS המכילים 1 מ"מ CaCl 2
- ביום שלאחר מכן, להסיר את הפתרון מכתים ולשטוף רשתית 3x ב PBS עבור 10 דקות בטמפרטורת חדר.
7. הכנת הרשתית Flatmounts
- העבר את הרשתיות, קולטי אור בצד למטה, לשקופית מיקרוסקופ ולעשות ארבעה חתכים רדיאליים במרחק שווה עמוקים באמצעות אזמל כירורגי כדי לחלק את הרשתית לארבעה רבעים שווים בגודלם. במהלך החתכים, לייצב את הרשתית עם מברשת, כך שהוא לא זז.
- באמצעות שתי מברשות ספוגות ב-PBS, לרדד בזהירות את קולטי אור בצד למטה רביעים ולטבול את הרשתית בהרכבה בינונית כדי למנוע צילום הלבנה. לאחר מכן למקם בזהירות coverslip על פני השטח של הרשתית רכוב ללא הפעלת לחץ ולוודא כי בועות אוויר לא לצבור תחת להחליק את המכסה. </ Li>
8. הדמיה וכימות של Vasoobliteration (VO) וneovascularization (NV) כפי שתואר ביום 31 בעבר
- קח תמונות של רשתית רכוב שלמה עם מיקרוסקופ עלית הקרינה בהגדלה של 10X.
- פתח את התמונה ברשתית בתוכנה לעריכת תמונות, לתפור ולמדוד את השטח הכולל של הרשתית, ואזור avascular. אזור יכול לבוא לידי ביטוי בפיקסלים.
- קביעה של VO מידה על ידי חלוקת מספר הפיקסלים באזור avascular ידי מספר הפיקסלים באזור הרשתית בסך הכל.
- קביעה של NV מידה על ידי חלוקת מספר הפיקסלים של NV במספר פיקסלים באזור הרשתית כולל, כפי שתואר ביום 31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מודל OIR נעשה שימוש נרחב ללמוד ניוון של כלי דם נגרם על חמצן וneovascularization פתולוגיים נגרם איסכמיה ברשתית וכבר סייע בפיתוח טיפולים אנטי angiogenic מועסקים כיום למחלות עיניים 27, 29, 30. ממצאים שהתקבלו באמצעות מודל זה ניתן להסיק באופן רופף לRetinopathies איסכמי כגון רטינופתיה סוכרתית שגשוג ורטינופתיה של פגות 30.
כאן אנו מציגים שימוש אלטרנטיבי של מודל זה ללמוד התחדשות כלי דם. נתאר דוגמא לאסטרטגיה להתחדש רשתית איסכמי, שפורסמה לאחרונה על ידי המעבדה שלנו. במחקר שהוצג, אנו מראים כי איסכמיה עצבית מתמשכת מפעילה reticulum endoplasmic (ER) מתח ובאמצעות אחד מendoribonucleases מפעילו IRE1α, דבק mRNA של קיו הדרכה העצבי netrin-1 הקלאסי. אנחנו מראיםשהמשלוח תוך עיני של Netrin-1, מעורר תכנית של אנגיוגנזה מתקנת בתאי מיאלואידית רשתית ובכך מאיץ revascularization רקמה העצבי לאחר OIR 25. יתר על כן, אנו מספקים דוגמא להתחדשות כלי דם מואצת באמצעות השתקת lentiviral בתיווך של IRE1α.
ניתן לשנות פרדיגמות הניסוי שתוארו כדי לחקור את הטיפול החקרני של בחירה. חשוב מכך, נקודת הזרקת זגוגית הזמן נקבעת בהתאם לאופי של המתחם חקר וחייבת לקחת בחשבון את המנגנון שבאמצעותו הטיפול חקר פועל. לדוגמה, כדי ללמוד תרכובת תרופתית (אגוניסט קולטן, אנטגוניסט, וכו '), P14 יכול להיות שנבחר כפי שהוא מתאים לנקודת זמן שבי revascularization רשתית מואצת עדיין התערבות מהירה הפועלת עשויה לעזור להאיץ את קצב revascularization (איורים 2 ו 3 א). כאשר וקטורים ויראליים הםמועסקים, מספיק זמן חייב להיות מוקצב, כדי לאפשר ביטוי מלא של הגן נוסע ונקודת זמן מוקדמת יותר ניתן לבחור כדי להבטיח ביטוי מלא של transgene או השתקה מלאה של גן היעד (איור 4). וקטורי lentiviral מבוסס מתאימים במיוחד גם בעניין זה בשל הביטוי שלהם המהיר, תגובה דלקתית נמוכה וקלות ייצור 24, 25. היא גם חיונית כדי להבטיח שגן היעד מועבר לאוכלוסיית תאים ברשתית המתאימה (RGC, תא אנדותל, תאי מולר, וכו '), ומכאן כמיהות של וקטור ויראלי נבחר חייבת להילקח בחשבון. לחלופין, לומד את תפקידו של גן בהתחדשות כלי דם שימוש בבעלי חיים מהונדסים או נוקאאוט מציע את היתרון שאין צורך לבצע זריקות תוך עיניות.
איור 1. תיאור סכמטי של מודל OIR העכבר. גורי עכבר ואמהות מניקות חשופים ל75% O 2 מP7 לP12. תא חמצן מאוורר עם משלוח O 2 יציב וoximeter נדרש. בתקופה ראשונית זו, הרחבת כלי דם ברשתית-הכחדה מתרחשת. בP12, עכברים חזרו לאוויר חדר (21% O 2) עד P17 כאשר tufting מראש רשתית פתולוגי המקסימלי מתרחשת. Neovascularization נסוג בימים הבאים. התקופה האידיאלית לחקור התחדשות כלי דם היא החלון בין P12 וP17. דגימה והערכה כמה נקודות זמן להרחבת כלי דם של-הכחדת מידה היא מפתח להבהרת שיעורים מדויקים של revascularization.
איור 2. כמובן זמן של revascularization רשתית בעקבות הרחבת כלי דם-oblite-Induced חמצןמנה. א) תיאור גרפי של הליך flatmounting רשתית. חתך נעשה דרך החלק העליון של הקרנית (כיפה שחורה, אפורה) ולובן העין (קווים אדומים מנוקדים) והרשתית הקניטה החוצה. העדשה יכולה להיות מופק גם לאחר פתיחת הקרנית / לובן העין או פעם בלובן העין מוסרת כפי שמוצג בתרשים. אז כלי Hyaloid יוסרו וצביעת כלי רשתית שבוצעו. ברגע שהפרוטוקול מכתים הוא סיים, הרשתית אז הוא חתך לתוך 4 חלקים ברווחים שווים ורכובה על כלי בצד למעלה. B שקופיות מיקרוסקופ) רשתיות flatmount צבעוני קטינים מעכברים נתון OIR. ככולים להתחדש, השטח של הרחבת כלי דם, הכחדה (כאן המקסימלי בP12) ממלא פנימה neovascularization הפתולוגי הוא מקסימאלי בP17 ומופיע ככתמים רוויים ברשתיות OIR קטינים מוכתמות. על ידי P19-p21, רשתיות שנוצרו מחדש באופן מלא ברשתות כלי הדם שלהם. (נתון זה שונה מבינה ואח'. חילוף חומרים בתא 2013 25)
. איור 3 דוגמא לטיפול בזריקות שמאיץ את התחדשות כלי דם ברשתית: Netrin-1. א) Netrin-1 מוזרק בP14 והיקף של צמיחה מחודשת של כלי דם הוערכה בP17. עלייה תלוית מינון בהתחדשות כלי דם הוא ציין. יושרה ב ') כלי דם ניתן להעריך על ידי זלוף עם ניאון משקל מולקולרי נמוך Dextran. אם כלי להראות תפקוד מחסום נפרץ, Dextran הניאון ידלוף מחוץ לכלי (חיצים). (נתון זה שונה מבינה ואח'. חילוף חומרים בתא 2013 25)
איור 4. דוגמא של Wi השתקת גניםה lentiviral נמסר shRNAs להתחדשות כלי דם ברשתית:. Lv.shIRE1α כדי להעריך את היכולת של השתקת גנים של IRE1α בתאי עצב הגנגליון ברשתית כדי לסייע בחידוש כלי דם, הזרקת זגוגית של קידוד lentivirus לshIRE1α הוזרקה בP3 כדי לאפשר מספיק זמן להשתקת גן כאשר צמיחת כלי דם והרחבת כלי דם-הכחדה מוערכת. Lentivirus דור 3 rd המועסק בדוגמא זו מכיל גליקופרוטאין הותאם וירוס stomatitis שלפוחי (VSV-G), מהונדס למקד קרום פלזמה. למרות שהווקטורים האלה בצורה יעילה להדביק תאי הגנגליון ברשתית, ביטוי יכול להיות גם ציין בסוגי תאים מקומיים אחרים. (א) טיפול זה לא גרם לשינויים ניכרים ב- Induced חמצן vaso-הכחדה כפי שנקבעו בP12, מסמן כי כל היתרונות שנצפו על הרחבת כלי דם-מחיקה נמדדים בנקודות זמן מאוחר יותר הן בשל התחדשות כלי דם מוגברת. (ב) עיכוב של IRE1α in פרדיגמה זו באופן דרמטי משופר התחדשות כלי דם בשלב צמיחה מחודשת של OIR בP17. (נתון זה שונה מבינה ואח'. הנייד מטבוליזם 2013 25) (ג) הערכת נקודת vaso-הכחדה כגון P14 פעם שלישית, נדרש לקבוע שיעורים מדויקים של revascularization. (נתון זה שונה מJoyal et al. דם 2011 24) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מהי הדרך היעילה ביותר להמרצת צמיחה של כלי חדשים ובריאים ברקמת העצבים איסכמי? האם זה טיפולי תקף להפריע ולהאיץ באופן טבעי לצמיחה מחודשת של כלי דם? בפתולוגיות נוירו איסכמי כגון Retinopathies או שבץ איסכמי, ניוון של כלי דם קשור לתפקוד עצבי מופחת 35-38. מכאן כדי להתמודד עם פגיעה מוקדמת ומשיב מיקרו זרימת דם אזורי במגזר המיידי / המוקדם של מחלה עשויה להוכיח מועיל. בהקשר עיני, פרדיגמות ניסוי שיאיצו revascularization של רשתית איסכמי להפחית neovascularization פתולוגי 21-25, 34 ולכן חקירה נוספת ראויה לגישה זו.
מאז השקתו לפני 20 שנים, 27 מודל OIR יש מהפכה מחקר אנגיוגנזה רשתית 30. כאן אנו מספקים יישומים נוספים עבור דגם זה ללמוד strat הפוטנציאליegies לווסת התחדשות כלי דם פיזיולוגית ברשתית איסכמי. מודל חיה אידיאלי צריך לכלול מספר קריטריונים כגון קירבה לפתים-פיזיולוגיה אנושית, שחזור גבוה, ביצוע מהיר ואידיאלי, בעלות נמוכה. מודל העכבר של OIR עומד בכל הקריטריונים הללו ויכול להתבצע-בפחות מ -3 שבועות.
למרות יתרונותיה הרשומים הרבים, חסרונות כוללים את הצורך הנוכחי להקריב את העכבר לפני הניתוח וניטור אורך מדויק ומכאן של בעלי חיים עדיין אינו אפשרי עם כלי הדמיה הנוכחיים. נכון לעכשיו, in vivo טכניקות הדמיה כגון אוקטובר או אנגיוגרפיה והעמסת הן במידה רבה לא צלחו בשל המגבלה האופטית הפנימית של העין העכבר (רדיוס עקמומיות וגודל קטן) אשר מפחיתה את כיסוי הדמיה 39 לאזורים של הרשתית אשר אינן רלוונטיות למרכזיים ביותר תחילתו של מודל השלבים.
כאשר מועסק ללמוד התחדשות כלי דם כמו proposed בנייר פרוטוקול זה, כל השיקולים שחלים על לימוד neovascularization צריכים גם להיות במעקב. אלה כוללים במשקל של בעלי חיים הקלטה להעריך את הבריאות המטבולית של הגור, אשר משפיעה אנגיוגנזה 32 בכבדות. שליטה מדויקת של מתח חמצן בתא hyperoxic היא גם קריטית. וריאציה בריכוז חמצן יש השפעה ישירה על vasoobliteration, שבהכרח יכול להוביל לפרשנות מוטעה של נתונים קריטיים. לכן מומלץ לאו ליישם ניטור אלקטרוני רציף של ריכוז תא חמצן או בלפחות, לעקוב אחר שינויים יומיים ברמות חמצן ולהגביל את פתיחת דלת oxycycler כדי לשמור על רמות חמצן קבועה. עיבוד אופטימלי של רשתית גם לוקח בפועל. הפקה, התקנה וצביעה של הרשתית יש לבצע בזהירות כרשתית שרירים יחסית יש לטפל בעדינות. בנוסף, כמו לכל הניסויים בבעלי חיים מהונדסים גנטי, הסחיפה הגנטית של ג מושבהתוצאות לבלבל. בהעדר כוח סלקטיבית (במושבה עכבר לדוגמא), allelic או הסחיפה גנטית היא תהליך אקראי שיכול להוביל לשינויים גדולים באוכלוסייה על פני תקופה קצרה של זמן. תדרי אלל יכולים לשנות מדור לדור ולגרום להיווצרות של תת מושבה 40, 41. מוטציות אלה הן במידה רבה בלתי ניתנות לגילוי 'ולכן חשוב להגביל את מספר הדורות המיוצרים על ידי אותו זוגות המגדל באותה המושבה. הדרך היעילה ביותר להשגת היציבות הגנטית הגבוהה ביותר היא לרענן את "מניות" בכל חמישה דורות, או להמשיך לbackcrossing עם עכבר נרכש רקע זהה.
מומלץ גם לבדוק למוטציות ניוון רשתית (שלישי) 1 ו 8 42, לפחות פעם אחת לפני שמתחיל בשורה חדשה על מנת להימנע מבלבול פנוטיפים שניתן לייחס לניוון קולטי אור המוקדם. לבעלי חיים מהונדסים,זה חיוני כדי להבטיח כי הן שליטה ועכברים שעברו מוטציה מתקבלות מאותו הספק, והם בהכרח על אותו הרקע הגנטי.
ככל שאנו ממשיכים להבהיר את המנגנונים המולקולריים של היווצרות כלי דם וצמיחה, גישות חדשות כדי להאיץ, איטי, או לכוון את כלי דם המתהווה הם נובעים. מערכת מודל שבו אפנון של כלי דם ניתן לחקור in vivo בהקשר פתולוגי עשויה לספק כלי רב ערך כדי לחקור פרדיגמות טיפוליות פוטנציאליים נגד איסכמיה העצבית בתוך מערכת העצבים המרכזית. התאמת מודל OIR העכבר ללמוד התחדשות כלי דם מספקת מקום כזה וימשיך להיות כלי רב ערך כדי לקדם את ההבנה של הבסיס המולקולרי לאנגיוגנזה הפיזיולוגית ופתולוגיים שלנו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
נ.ב. מחזיק מחקר בקנדה קתדרת ביולוגיה של תא רשתית וניו פרס חוקר אלקון מכון המחקר. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הקנדי לבריאות מחקר (221,478), איגוד הסוכרת הקנדי (OG-3-11-3,329-PS), מדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה (418,637) ועיוורון קרן הלחימה קנדה. תמיכה הייתה גם מסופקת על ידי Réseau דה משוכלל ונדיר en סנטה דה לה חזון du קוויבק.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other) | |||
| CD1 nursing mothers | Vendor of choice | ||
| Operating Scissors straight | World Precision Instruments | 14192 | |
| Dissecting Scissors straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Vannas Eye Scissors | Harvard Apparatus | 72-8483 | |
| Iris Forceps, curved, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Brushes 362R size 0 | Dynasty | ||
| Dumont Forceps #3; straight | World Precision Instruments | 500338 | |
| Surgical Blade, size 10 | Bard-Parker | 371110 | |
| Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Laboratories, Inc | RL-1102 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-368 | |
| Fluoromount G | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope | Zeiss | ||
| Leica MZ9.5 Stereomicroscope | Leica | ||
| Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000 | Sigma-Aldrich | 46945 |
References
- Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 436, 193-200 (2005).
- Eichmann, A., Thomas, J. L. Molecular Parallels between Neural and Vascular Development. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, (2012).
- Larrivee, B., Freitas, C., Suchting, S., Brunet, I., Eichmann, A. Guidance of vascular development: lessons from the nervous system. Circ Res. 104, 428-441 (2009).
- Stefater Iii, J. A., et al. Regulation of angiogenesis by a non-canonical Wnt-Flt1 pathway in myeloid cells. Nature. 474, 511-515 (2011).
- Checchin, D., Sennlaub, F., Levavasseur, E., Leduc, M., Chemtob, S. Potential role of microglia in retinal blood vessel formation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3595-3602 (2006).
- Quaegebeur, A., Lange, C., Carmeliet, P. The neurovascular link in health and disease: molecular mechanisms and therapeutic implications. Neuron. 71, 406-424 (2011).
- Yamamoto, Y., Craggs, L., Baumann, M., Kalimo, H., Kalaria, R. N. Review: molecular genetics and pathology of hereditary small vessel diseases of the brain. Neuropathol Appl Neurobiol. 37, 94-113 (2011).
- Brun, A., Englund, E. A white matter disorder in dementia of the Alzheimer type: a pathoanatomical study. Ann Neurol. 19, 253-262 (1986).
- Prat, A., et al. Migration of multiple sclerosis lymphocytes through brain endothelium. Arch Neurol. 59, 391-397 (2002).
- Rule, R. R., Schuff, N., Miller, R. G., Weiner, M. W. Gray matter perfusion correlates with disease severity in ALS. Neurology. 74, 821-827 (2010).
- Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366, 1227-1239 (2012).
- Hartnett, M. E., Penn, J. S. Mechanisms and management of retinopathy of prematurity. N Engl J Med. 367, 2515-2526 (2012).
- Sapieha, P., et al. Retinopathy of prematurity: understanding ischemic retinal vasculopathies at an extreme of life. J Clin Invest. 120, 3022-3032 (2010).
- Chen, J., Smith, L. Retinopathy of prematurity. Angiogenesis. 10, 133-140 (2007).
- Cheung, N. Diabetic retinopathy and systemic vascular complications. Progress in Retinal and Eye Research. 27, 161-176 (2008).
- Smith, L. E. Through the eyes of a child: understanding retinopathy through ROP the Friedenwald lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 5177-5182 (2008).
- Caballero, S., et al. Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells. Diabetes. 56, 960-967 (2007).
- Wang, H., et al. VEGF-mediated STAT3 activation inhibits retinal vascularization by down-regulating local erythropoietin expression. Am J Pathol. 180, 1243-1253 (2012).
- Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. J Clin Invest. 116, 3266-3276 (2006).
- Saito, Y., Geisen, P., Uppal, A., Hartnett, M. E. Inhibition of NAD(P)H oxidase reduces apoptosis and avascular retina in an animal model of retinopathy of prematurity. Mol Vis. 13, 840-853 (2007).
- Connor, K. M., et al. Increased dietary intake of omega-3-polyunsaturated fatty acids reduces pathological retinal angiogenesis. Nat Med. 13, 868-873 (2007).
- Banin, E., et al. T2-TrpRS inhibits preretinal neovascularization and enhances physiological vascular regrowth in OIR as assessed by a new method of quantification. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2125-2134 (2006).
- Dorrell, M. I., et al. Maintaining retinal astrocytes normalizes revascularization and prevents vascular pathology associated with oxygen-induced retinopathy. Glia. 58, 43-54 (2010).
- Joyal, J. -S., et al. Ischemic neurons prevent vascular regeneration of neural tissue by secreting semaphorin 3A. Blood. 117, 6024-6035 (2011).
- Binet, F., et al. Neuronal ER Stress Impedes Myeloid-Cell-Induced Vascular Regeneration through IRE1alpha Degradation of Netrin-1. Cell Metab. 17, 353-371 (2013).
- Fukushima, Y., et al. Sema3E-PlexinD1 signaling selectively suppresses disoriented angiogenesis in ischemic retinopathy in mice. J Clin Invest. 121, 1974-1985 (2011).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35, 101-111 (1994).
- Lange, C., et al. Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247, 1205-1211 (2009).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 2813-2826 (2010).
- Stahl, A., et al. Computer-aided quantification of retinal neovascularization. Angiogenesis. 12, 297-301 (2009).
- Stahl, A., et al. Postnatal Weight Gain Modifies Severity and Functional Outcome of Oxygen-Induced Proliferative Retinopathy. Am J Pathol. 177, 2715-2723 (2010).
- Cerani, A., et al. Neuron-Derived Semaphorin 3A is an Early Inducer of Vascular Permeability in Diabetic Retinopathy via Neuropilin-1. Cell Metabolism. 18, 505-518 (2013).
- Sapieha, P. Eyeing central neurons in vascular growth and reparative angiogenesis. Blood. 120, 2182-2194 (2012).
- Dorfman, A., Dembinska, O., Chemtob, S., Lachapelle, P. Early manifestations of postnatal hyperoxia on the retinal structure and function of the neonatal rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 458-466 (2008).
- Dorfman, A. L., Joly, S., Hardy, P., Chemtob, S., Lachapelle, P. The effect of oxygen and light on the structure and function of the neonatal rat retina. Doc Ophthalmol. 118, 37-54 (2009).
- Chopp, M., Zhang, Z. G., Jiang, Q. Neurogenesis, angiogenesis, and MRI indices of functional recovery from stroke. Stroke. 38, 827-831 (2007).
- Li, L., et al. Angiogenesis and improved cerebral blood flow in the ischemic boundary area detected by MRI after administration of sildenafil to rats with embolic stroke. Brain Res. 1132, 185-192 (2007).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Dis Model Mech. 5, 444-456 (2012).
- Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat Genet. 37, 1181-1186 (2005).
- Jenuth, J. P., Peterson, A. C., Shoubridge, E. A. Tissue-specific selection for different mtDNA genotypes in heteroplasmic mice. Nat Genet. 16, 93-95 (1997).
- Mattapallil, M. J., et al. The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes. Investigative ophthalmolog., & visual science. 53, 2921-2927 (2012).
