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Neuroscience

Evaluación de la Vascular regeneración en el SNC Utilizando la retina del ratón

doi: 10.3791/51351 Published: June 23, 2014

Summary

La retina de roedores ha sido reconocida como una ventana de acceso al cerebro. En este documento técnico se proporciona un protocolo que emplea el modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno para estudiar los mecanismos que conducen al fracaso de la regeneración vascular en el sistema nervioso central después de la lesión isquémica. El sistema descrito también se puede aprovechar para explorar estrategias para promover el nuevo crecimiento de vasos sanguíneos funcionales dentro de la retina y sistema nervioso central.

Abstract

La retina de roedor es tal vez el sistema de mamífero más accesible en el que para investigar la interacción neurovascular dentro del sistema nervioso central (SNC). Se está reconociendo cada vez más que algunas enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, la esclerosis múltiple y la esclerosis lateral amiotrófica elementos presentes de compromiso vascular. Además, las causas más importantes de ceguera en la población de edad pediátrica y de trabajo (retinopatía del prematuro y la retinopatía diabética, respectivamente) se caracterizan por una degeneración vascular y la insuficiencia de recrecimiento vascular fisiológico. El objetivo de este documento técnico es proporcionar un protocolo detallado para estudiar la regeneración vascular del SNC en la retina. El método puede ser empleado para dilucidar los mecanismos moleculares que conducen a la insuficiencia de crecimiento vascular después de la lesión isquémica. Además, las posibles modalidades terapéuticas para acelerar y restaurar plexos vasculares sanas se pueden explorar. Hallazgos obtaineD utilizando el enfoque descrito puede proporcionar vías terapéuticas para retinopatías isquémicas tales como el de la diabetes o la prematuridad y posiblemente beneficiar a otros trastornos vasculares del SNC.

Introduction

A lo largo del desarrollo del SNC, los nervios, las células inmunes y los vasos sanguíneos establecer redes notablemente acoplados a garantizar una adecuada perfusión tisular y permitir la transmisión de información sensorial 1-5. El detalle de los resultados de los sistemas vasculares en la oxigenación tisular insuficiente y suministro metabólico comprometido y está cada vez más reconocido como un importante contribuyente a la patogénesis de las enfermedades neurodegenerativas 6. Deserción vascular y el deterioro de la unidad neurovascular dentro del cerebro, por ejemplo, se asocia con demencia vascular, lesiones vasculares de la materia blanca del cerebro 7 y la enfermedad de Alzheimer con estenosis de las arteriolas y los vasos pequeños 8. Además, se cree alteración de la función barrera vascular para contribuir esclerosis múltiple 9 y la esclerosis lateral amiotrófica 10.

De importancia directa para el modelo de la retina se describe en este protocolo, el cegamientoenfermedades tales como la retinopatía diabética 11 y la retinopatía de la prematuridad 12, 13 se caracterizan por una fase de degeneración vascular temprano. El estrés isquémico posterior sobre la retina neurovascular desencadena una segunda fase de la neovascularización excesiva y patológica que probablemente se origina como una respuesta compensatoria a oxígeno restablecerá y suministro de energía 14-16. Una estrategia atractiva para superar el estrés isquémico que es central a la progresión de la enfermedad es restaurar redes vasculares funcionales específicamente en las zonas isquémicas de la neuro-retina (Figuras 2 y 3). Provocar una respuesta angiogénica controlada puede venir a través como contra-intuitivo para una condición en la que los tratamientos anti-angiogénicos tales como anti-VEGF son considerados como tratamientos adaptados. Sin embargo, la evidencia de la validez de este enfoque es el montaje. Por ejemplo, la mejora de recrecimiento vascular "fisiológica-like" en ischemretinopatías ic se ha demostrado elegantemente a través de la introducción de las células precursoras endoteliales 17, la inhibición de VEGF de células de Müller-expresado regulación a la baja inducida de otros factores angiogénicos, 18 de inyección de progenitores mieloides 19, la inhibición de NADPH oxidasa inducida por la apoptosis 20, el aumento de la dieta ω-3 grasos poliinsaturados la ingesta de ácido 21, el tratamiento con un fragmento carboxilo-terminal de triptófano ARNt sintetasa 22, y la administración directa de VEGF o FGF-2 para la protección de las células gliales 23. Por otra parte, hemos demostrado que la modulación de las señales de orientación neuronales clásicas tales como Semaphorins o netrinas en retinopatías isquémicas acelera la regeneración vascular de los vasos sanos dentro de la retina y, en consecuencia reduce la angiogénesis patológica 24, 25. De relevancia clínica directa, varios de los estudios en animales antes mencionados proporcionan evidencia de que la promoción de re vasculargeneración durante la fase isquémica temprana de retinopatías puede reducir significativamente la neovascularización que ponen en peligro la vista previa de la retina 19, 23, 24, 26, probablemente a través de la reducción de la carga isquémica.

La elaboración de estrategias terapéuticas que estimulan la regeneración de los vasos funcionales sigue siendo un reto importante para los biólogos vasculares. Aquí se describe un sistema experimental que emplea el modelo de ratón de la retinopatía inducida por oxígeno (OIR) para explorar estrategias para modular el recrecimiento vascular en la retina. Desarrollado por Smith et al. En 1994 27, este modelo sirve como sustituto de las retinopatías proliferativas humanas y consiste en la exposición de las crías P7 ratón al 75% de O 2 hasta el P12 y, posteriormente, la reintroducción de las crías al ambiente de la sala O2-tensión (Figura 1). Este paradigma imita débilmente un escenario en el que se ventila un bebé prematurocon O 2. La exposición de las crías de ratón a hiperoxia provoca degeneración de los capilares de la retina y de la microvasculatura, y produce una superficie reproducible de vaso-obliteración (VO) suele evaluarse a la salida de O 2 en P12, aunque el área de VO máxima se alcanza a las 48 horas (P9) después exposición a O 2 28. En el ratón, las zonas avasculares VO regeneran espontáneamente en el transcurso de la semana siguiente a la reintroducción de aire de la habitación y finalmente zonas VO están completamente re-vascularizados (Figura 2). La reintroducción de aire de la sala de ratones sometidos a OIR también provoca la neovascularización de la retina antes de la (NV) (máximo a P17) que se evalúa típicamente para determinar la eficacia de los paradigmas de tratamiento anti-angiogénicos. En su forma más pura, el modelo OIR proporciona una herramienta altamente reproducible y cuantificable para evaluar la degeneración vascular inducida por el oxígeno y determinar el grado de destrucción neovascularización pre-retinal 29-31.

30, 31. Aquí le ofrecemos una forma sencilla y paso a paso para investigar la modulación de revascularización fisiológica dentro de la retina neural por compuestos farmacológicos, terapéuticos potenciales, vectores virales o para estudiar la influencia de los genes candidatos en los ratones manipulados genéticamente.

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Protocol

Declaración de Ética: Todos los experimentos con animales se adhiere a los lineamientos de cuidado animal establecidas por la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) Declaración para el uso de animales en Oftálmica y Visión Investigación y el Consejo Canadiense de los Animales.

1. Oxígeno inducido Retinopatía (OIR)

  1. Fecha de apunte de nacimiento de crías de ratón como P0.
  2. Registre todos los pesos de los animales a la entrada en O 2 para asegurar una variedad de peso adecuado. Nota: Para C57BL / 6 ratones a P17, peso corporal debe oscilar entre 5 y 7,5 g para NV máxima 32. Con el fin de mantener la coherencia del medio ambiente, se recomienda utilizar como compañeros de camada de control (para los ratones modificados genéticamente, así como los ratones que recibieron tratamientos experimentales). Al evaluar los efectos de un vector viral, se debe considerar el tropismo del virus y dar tiempo suficiente para la plena expresión de transgenes viralmente entregados. Viral rápidamente expresandovectores tales como los lentivirus 3 ª generación 24, 25, se recomiendan 33.
  3. Cachorros Place ratón en P7 (C57BL / 6 o deseado cepa) y una CD1 fomentar madre en una cámara de oxígeno fijado en el 75% de O 2 durante 5 días 27. La humedad del ambiente y la temperatura se mantienen constantes a lo largo de O 2 de la exposición. Nota: Las instalaciones de investigación equipados con una fuente central de O 2 son ideales y limitan la sustitución engorroso de O 2 tanques vacíos. Si se trabaja con ratones manipulados genéticamente, es importante asegurarse de que los ratones control y experimental se adquieren del mismo proveedor para limitar las derivas genéticas dentro de las mismas cepas 30, 29.
  4. En P12, eliminar a los ratones de la cámara de oxígeno y devolver los animales al ambiente de O 2.

2. Inyección intravítrea de Entrega de los compuestos de la retina interna (Whes evaluar los efectos de un compuesto farmacológico o Proteína Recombinante)

  1. En P14, anestesiar a los ratones con 2% de isoflurano en oxígeno 2 L / min (o comité de protección de los animales aprobado anestésico de elección). Con el fin de verificar la eficacia de la anestesia, secuencialmente pellizcar la cola, pata trasera y el oído con pinzas.
  2. Coloca el ratón sobre su vientre.
  3. Usando una jeringa estéril de 10 l equipado con una aguja de vidrio tirado biselado, realizar una inyección de un volumen máximo de 1 l de solución que contiene el compuesto que está siendo investigado o vehículo (solución salina fisiológica) en el limbo posterior del ojo, con un 45 ° ángulo de evitar la lente. Nota: El-aguja de vidrio arrastrado está unido a la jeringa utilizando una gota de resina epoxi.
  4. Aplique una gota de ungüento oftálmico lubricante (idealmente con antibióticos) con un hisopo para el ojo del ratón.
  5. Devuelva el ratón de nuevo a la jaula con el fomento de la madre. Los ratones son entonces monitoreados cuidadosamente hasta que recubierto y totalmente ambulatoria.

3. Evaluación de la perfusión de buques y la función de barrera (Integridad) mediante angiografía con fluoresceína

  1. Anestesie ratones con 2% de isoflurano en oxígeno 2 L / min (o comité de protección de los animales aprobado anestésico de elección). Con el fin de verificar la eficacia de la anestesia, secuencialmente pellizcar la cola, pata trasera y el oído con pinzas. Nota: Esto se realiza típicamente a P17 cuando se evalúa la regeneración. También llevar-a cabo el análisis en P19 y P21 para determinar si la integridad vascular se conserva en el tiempo.
  2. Una vez anestesiado, se pesa el ratón.
  3. Haga una incisión en la línea media del abdomen con unas tijeras de disección. Nota: Los instrumentos de disección se deben revisar y afilados con regularidad.
  4. Cortar las costillas lateralmente y elevar la caja torácica con la ayuda de fórceps. Nota: Es necesario cortar como lateralmente como sea posible para evitar daños en el corazón.
  5. Después de retirar periptejido heral desde el corazón, pinza la aorta descendente con unas pinzas hemostáticas.
  6. Inyecte lentamente con fluoresceína dextrano al ventrículo izquierdo con una aguja 25. Nota: Si la función de barrera vascular se investiga, se emplea 70 kDa fluoresceína-dextrano, ya que se saldrá de los vasos cuando se ve comprometida la integridad del vaso. Si el investigador quiere lanzar vasos sanguíneos, se utiliza 2 MDa fluoresceína-dextrano. Los pasos críticos: 1) Para asegurar un reparto homogéneo, centrifugar fluoresceína dextrano e inyectar el sobrenadante, 2) Con el fin de prevenir la constricción de vasos, inyectar solución de fluoresceína dextrano calentado, 3) su tiempo de circulación no debe exceso de 4 min.
  7. Decapitar a los ratones 2 min después de la inyección con unas tijeras de funcionamiento.

4. Enucleación y fijación de los ojos

Nota: Al evaluar las posibilidades de regeneración vascular, primero recoger retinas en P12 y P14 y, además, al P17. Aumentar el número de punto en el tiempo de muestreos para una determinación más precisa de las tasas de revascularización 24.

  1. Incline la cabeza del ratón y colocarlo en su lado.
  2. Quite la piel y los párpados cubren los ojos con unas tijeras de disección.
  3. Coloque fórceps curvados debajo del ojo y suavemente tire hacia arriba hasta que el nervio óptico se corta.
  4. Gire la cabeza del ratón hacia el otro lado y realizar los mismos pasos (pasos 4.2 y 4.3).
  5. Para asegurar una mejor penetración de fijador, perforar un agujero en la cámara anterior del ojo utilizando aguja de 30 g.
  6. Transferencia de ojos a un tubo que contiene 4% de paraformaldehído (PFA) y fijar durante 1 hora a temperatura ambiente.
  7. Eliminar PFA y lavar los ojos 4 veces con una solución de PBS enfriado en hielo.

5. Disección de retina

  1. Coloque los ojos de ratón en una placa de Petri que contiene PBS frío y realizar la disección de las retinas bajo un microscopio estereoscópico.
  2. Quite la grasa / tejido adicional que rodea el ojo con ciencia microdisecciónssors.
  3. Cortar la córnea con tijeras micro-disección.
  4. El uso de dos pares de pinzas, minuciosamente la cáscara de la esclerótica de distancia desde la periferia hacia el nervio óptico y desechar.
  5. Apriete la lente (bola blanquecina debajo de la córnea) con unas pinzas y extraerlo de la caja del visor. Use un par de pinzas como soporte, y la otra para agarrar y levantar con cuidado y retire el objetivo.
  6. Separar los vasos hialoideos desde el lado interior de la retina utilizando cepillos pequeños (tamaño 0) y fórceps.
  7. Retire los bloques de vasos hyaloid conectados al disco óptico utilizando fórceps.
  8. Transferencia diseccionó la retina a 2 ml de tubos de microcentrífuga que contiene PBS y lugar en hielo antes de comenzar el procedimiento de tinción.

6. Retiniana vascular tinción

  1. Incubar las retinas disecadas durante la noche con agitación suave a 4 ° C en una solución de fluorescencia B4-isolectina acoplado (rodamina-lectina u otra) en PBS que contenía 1 mM de CaCl2
  2. Al día siguiente, eliminar la solución de tinción y lavar las retinas 3x en PBS durante 10 min a temperatura ambiente.

7. Preparación de la retina Flatmounts

  1. Traslado retinas, del lado de los fotorreceptores hacia abajo, en un portaobjetos de microscopio y hacer cuatro profundas incisiones radiales equidistantes utilizando un bisturí quirúrgico para dividir la retina en cuatro cuadrantes de igual tamaño. Durante las incisiones, prepararse la retina con un cepillo de modo que no se mueve.
  2. El uso de dos cepillos empapados en PBS, aplane cuidadosamente la cuadrantes fotorreceptor boca abajo y sumergir la retina en medio de montaje para evitar la foto-blanqueo. A continuación, coloque cuidadosamente un cubreobjetos sobre la superficie de la retina montado sin la aplicación de presión y asegurarse de que las burbujas de aire no se acumulan debajo de la hoja de la cubierta. </ Li>

8. Imaging y Cuantificación de Vasoobliteration (VO) y neovascularización (NV), como se ha descrito previamente 31

  1. Tomar imágenes de retinas-todo ello montado con un microscopio de epi-fluorescencia con un aumento de 10X.
  2. Abre la imagen en la retina en software de edición fotográfica, hilvanar y medir el área total de la retina, y la zona avascular. Área puede expresarse en píxeles.
  3. Determinar la extensión del VO dividiendo el número de píxeles en la zona avascular por el número de píxeles en el área total de la retina.
  4. Determinar la extensión de NV dividiendo el número de píxeles de NV por el número de píxeles en el área total de la retina tal como se describe 31.

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Representative Results

El modelo OIR es ampliamente utilizado para estudiar la degeneración vascular inducida por el oxígeno y la neovascularización patológica inducida por isquemia en la retina y ha sido instrumental en el desarrollo de tratamientos anti-angiogénicos que trabajan actualmente para las enfermedades oculares 27, 29, 30. Los resultados obtenidos con este modelo pueden ser libremente extrapolar a retinopatías isquémicas tales como la retinopatía diabética proliferativa y retinopatía del prematuro 30.

A continuación les presentamos una alternativa de uso de este modelo para estudiar la regeneración vascular. Vamos a describir un ejemplo de una estrategia para regenerar la retina isquémica que fue publicado recientemente por nuestro laboratorio. En el estudio presentado, se demuestra que la isquemia neuronal sostenida activa retículo endoplasmático (ER) y por medio de uno de sus endorribonucleasas efectoras IRE1α, escinde el ARNm de la clásica señal de orientación neuronal netrina-1. Mostramosque la entrega intraocular del Netrina-1, estimula un programa de la angiogénesis reparadora en las células mieloides de la retina y por lo tanto acelera la revascularización del tejido neural después OIR 25. Además, ofrecemos un ejemplo de regeneración vascular acelerada utilizando lentiviral mediada por silenciamiento de IRE1α.

Los paradigmas experimentales descritos pueden ser modificados para investigar el tratamiento de exploración de elección. Es importante destacar que, el punto de la inyección intravítrea de tiempo se determina sobre la base de la naturaleza del compuesto explorado y debe tener en cuenta el mecanismo por el cual el tratamiento investigado actúa. Por ejemplo, para estudiar un compuesto farmacológico (agonista del receptor, antagonista, etc), P14 puede ser seleccionado como corresponde a un punto de tiempo en que la revascularización de la retina está acelerando aún una intervención de acción rápida puede ayudar a acelerar la tasa de revascularización (Figuras 2 y 3a). Cuando los vectores virales sonempleado, el tiempo suficiente se debe asignar para permitir la plena expresión del gen de pasajeros y un punto de tiempo anterior se puede seleccionar para garantizar la plena expresión del transgén o total silenciamiento del gen diana (Figura 4). Los vectores lentivirales basado están particularmente bien adaptados a este respecto debido a su rápida expresión, bajo la respuesta inflamatoria y la facilidad de producción 24, 25. También es crucial para asegurarse de que el gen diana se entrega a la población de células de la retina apropiada (RGC, célula endotelial, célula Müller, etc), por lo tanto, el tropismo del vector viral seleccionado debe ser considerado. Alternativamente, el estudio de la función de un gen en la regeneración vascular mediante transgénicos o knockout animales ofrece la ventaja de no necesitar para realizar inyecciones intra-oculares.

Figura 1 Figura 1. Representación esquemática del modelo OIR ratón. Las crías de ratón y las madres lactantes están expuestos a un 75% de O 2 de P7 a P12. Se requiere una cámara de oxígeno ventilada con entrega constante de O 2 y oxímetro. Durante este período inicial, la retina vaso-obliteración se produce. En P12, los ratones se volvieron a aire ambiente (21% O 2) hasta P17 cuando se produce tufting pre-retinal patológica máxima. La neovascularización se aleja más de los siguientes días. El período ideal para investigar la regeneración vascular es la ventana entre P12 y P17. Muestreo y evaluación de varios puntos de tiempo de la extensión de vaso-obliteración es clave para dilucidar expedición de la carga de la revascularización.

Figura 2
Figura 2. Evolución temporal de la revascularización de la retina después de inducida por oxígeno vaso-obliteración. A) Representación gráfica de un procedimiento flatmounting retina. Se hace una incisión a través de la parte superior de la córnea (la cúpula gris-negro) y la esclerótica (líneas rojas punteadas) y la retina es molestado a cabo. La lente puede ser extraído ya sea después de la apertura de la córnea / esclerótica o una vez que la esclerótica se retira como se muestra en el diagrama. Vasos hyaloid Luego, se retiran y la tinción de los vasos retinianos realizadas. Una vez que el protocolo de tinción se termina, la retina se corta en 4 secciones igualmente espaciados y montada en un portaobjetos de microscopio recipiente de arriba abajo. B) retinas teñidas con lectina flatmount de ratones sometidos a la OIR. Como se regeneran los vasos, el área de vaso-obliteración (aquí máxima en P12) llena pulg neovascularización patológica es máxima a P17 y aparece como manchas saturadas en lectina manchado retinas OIR. Por P19-P21, retinas han regenerado totalmente sus redes vasculares. (Esta cifra se ha modificado desde Binet et al. Cell Metabolism 2013 25)

<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figura 3
. Figura 3 Ejemplo de un tratamiento inyectable que acelera la regeneración vascular de la retina: Netrina-1. A) Netrina-1 se inyecta a P14 y el alcance de recrecimiento vascular evaluado en P17. Se observa un aumento dependiente de la dosis en la regeneración vascular. Integridad B) vascular se puede evaluar por perfusión con un fluorescente de bajo peso molecular de dextrano. Si los vasos muestran la función de barrera alterada, el dextrano fluorescente se escapará fuera del recipiente (flechas). (Esta cifra se ha modificado desde Binet et al. Cell Metabolism 2013 25)

Figura 4
Figura 4. Ejemplo de silenciamiento génico wiª lentiviral-entregado shRNAs para la regeneración vascular de la retina:. Lv.shIRE1α Para evaluar la capacidad de silenciamiento génico de IRE1α en las neuronas ganglionares de la retina para ayudar a la regeneración vascular, una inyección intravítrea de una codificación de lentivirus para un shIRE1α se inyectó en P3 para permitir tiempo suficiente para el silenciamiento de genes, cuando se evalúa el crecimiento vascular y vaso-obliteración. El lentivirus de 3 ª generación empleado en este ejemplo contiene una glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular modificado (VSV-G), diseñado para orientar las membranas plasmáticas. Aunque estos vectores infectan eficazmente las células ganglionares de la retina, la expresión también puede observarse en otros tipos de células locales. (A) Este tratamiento no dio lugar a variaciones notables en el vaso-obliteración inducida por oxígeno como se determina en P12, lo que significa que todos los beneficios observados en vaso-obliteración medidos en puntos de tiempo posteriores son debido al aumento de la regeneración vascular. (B) Inhibición de la IRE1α in este paradigma ha mejorado dramáticamente la regeneración vascular en la fase de regeneración de la OIR en P17. (Esta cifra se ha modificado desde Binet et al. Cell Metabolism 2013 25) (C) La evaluación de un punto de vaso-obliteración como P14 tercera vez, se requiere para determinar las tasas precisas de revascularización. (Esta cifra se ha modificado desde Joyal et al. Sangre 2011 24) Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

¿Cuál es la forma más eficaz para estimular el crecimiento de nuevos vasos sanos en el tejido nervioso isquémico? ¿Es terapéuticamente válida para interferir con y acelerar origen natural recrecimiento vascular? En patologías neuro-isquémica como retinopatías isquémicas o derrame cerebral, degeneración vascular se asocia con una reducción de la función neuronal 35-38. Por lo tanto para hacer frente a la lesión inicial, el restablecimiento de la microcirculación regional durante la fase inmediata / temprana de la enfermedad puede resultar beneficiosa. En un contexto ocular, paradigmas experimentales que aceleran la revascularización de la retina isquémica reducir la neovascularización patológica 21-25, 34 y por lo tanto este enfoque debe dar una mayor investigación.

Desde su introducción hace 20 años, el 27 modelo OIR ha revolucionado la investigación de la angiogénesis retiniana 30. Aquí le ofrecemos una aplicación adicional para este modelo para estudiar la estrategia prospectivagias para modular la regeneración vascular fisiológica en la retina isquémica. Un modelo animal ideal debe abarcar varios criterios como la proximidad a la fisiopatología humana, alta reproducibilidad, la ejecución rápida y lo ideal, de bajo costo. El modelo de ratón de la OIR cumple todos estos criterios y se llevó a cabo en menos de 3 semanas.

A pesar de los numerosos beneficios que cotizan en bolsa, las desventajas incluyen la necesidad actual de sacrificar el ratón antes de los análisis y el seguimiento longitudinal, por lo tanto precisa de un animal aún no es posible con las herramientas de imágenes actuales. En la actualidad, las técnicas de imagen in vivo como en octubre o la angiografía con fluoresceína son infructuosos debido a la limitación óptica inherente del ojo del ratón (radio de curvatura y pequeño tamaño) que reduce la cobertura de imágenes 39 a las regiones más centrales de la retina que no son relevantes para las primeras etapas del modelo.

Cuando se emplean para estudiar la regeneración vascular como pROPUESTA en este documento de protocolo, todas las consideraciones que se aplican al estudio de la neovascularización también deben ser controlados. Estos incluyen la grabación de peso del animal para estimar la salud metabólica de la cría, que influye mucho en la angiogénesis 32. El control preciso de la tensión de oxígeno en la cámara de hiperóxica también es crítico. Variación de la concentración de oxígeno tiene un impacto directo en vasoobliteration, que puede conducirá inevitablemente a una mala interpretación de datos críticos. Por ello se recomienda para aplicar bien el monitoreo electrónico continuo de la concentración de oxígeno de cámara o en lo más mínimo, monitorear los cambios diarios en los niveles de oxígeno y limitar oxycycler apertura de la puerta para mantener los niveles de oxígeno constante. Procesamiento óptimo de retinas también requiere práctica. La extracción, el montaje y la tinción de la retina debe ser ejecutada con cuidado ya que la retina relativamente frágil debe ser manejado con delicadeza. Además, como para toda la experimentación con animales genéticamente modificados, la deriva genética de una colonia Cse producirá un confunden. En ausencia de una fuerza selectiva (en una colonia de ratones, por ejemplo), la alélica o la deriva genética es un proceso aleatorio que puede dar lugar a grandes cambios en la población en un período corto de tiempo. Las frecuencias alélicas pueden cambiar de generación en generación y resultar en la formación de un sub-colonia 40, 41. Estas mutaciones son en gran parte no detectable y es por lo tanto importante para limitar el número de generaciones producidas por los mismos pares de reproductoras en la misma colonia. La manera más eficaz de lograr la mayor estabilidad genética es refrescar "stocks" cada cinco generaciones o proceder a retrocruzamiento con un ratón comprada de fondo idénticos.

También se recomienda para detectar mutaciones de degeneración de la retina (DR) 1 y 8 42, al menos una vez antes de iniciar una nueva línea con el fin de evitar la confusión de los fenotipos que pueden atribuirse a la degeneración prematura de los fotorreceptores. Para los animales transgénicos,es vital para asegurar que tanto el control y los ratones mutantes se obtienen del mismo vendedor y son necesariamente en el mismo fondo genético.

A medida que seguimos para dilucidar los mecanismos moleculares de la formación de vasos sanguíneos y el crecimiento, nuevos enfoques para acelerar, lento, o dirigir los vasos sanguíneos nacientes están surgiendo. Un sistema modelo en el que la modulación de la vascularización puede ser explorado in vivo en un contexto patológico puede proporcionar una herramienta valiosa para explorar paradigmas terapéuticos potenciales para contrarrestar la isquemia neuronal dentro del SNC. Adaptar el modelo de ratón para estudiar OIR regeneración vascular proporciona un lugar tal y seguirá siendo una herramienta valiosa para mejorar nuestra comprensión de las bases moleculares de la angiogénesis fisiológica y patológica.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

PS tiene una Cátedra de investigación de Canadá en Biología Celular de la retina y el Premio del Instituto de Investigación Alcon Nueva investigador. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (221,478), la Asociación Canadiense de Diabetes (OG-3-11-3329-PS), las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (418.637) y la Fundación Lucha contra la Ceguera Canadá. El apoyo también fue proporcionado por el Réseau de Recherche en Santé de la Vision du Québec.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)
CD1 nursing mothers Vendor of choice
Operating Scissors straight World Precision Instruments 14192
Dissecting Scissors straight World Precision Instruments 14393
Vannas Eye Scissors Harvard Apparatus 72-8483
Iris Forceps, curved, serrated World Precision Instruments 15915
Brushes 362R size 0 Dynasty
Dumont Forceps #3; straight World Precision Instruments 500338
Surgical Blade, size 10 Bard-Parker 371110
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories, Inc RL-1102
Microscope slides VWR 16004-368
Fluoromount G Electron Microscopy Sciences 17984-25
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope Zeiss
Leica MZ9.5 Stereomicroscope Leica
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000 Sigma-Aldrich 46945

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 436, 193-200 (2005).
  2. Eichmann, A., Thomas, J. L. Molecular Parallels between Neural and Vascular Development. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, (2012).
  3. Larrivee, B., Freitas, C., Suchting, S., Brunet, I., Eichmann, A. Guidance of vascular development: lessons from the nervous system. Circ Res. 104, 428-441 (2009).
  4. Stefater Iii, J. A., et al. Regulation of angiogenesis by a non-canonical Wnt-Flt1 pathway in myeloid cells. Nature. 474, 511-515 (2011).
  5. Checchin, D., Sennlaub, F., Levavasseur, E., Leduc, M., Chemtob, S. Potential role of microglia in retinal blood vessel formation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3595-3602 (2006).
  6. Quaegebeur, A., Lange, C., Carmeliet, P. The neurovascular link in health and disease: molecular mechanisms and therapeutic implications. Neuron. 71, 406-424 (2011).
  7. Yamamoto, Y., Craggs, L., Baumann, M., Kalimo, H., Kalaria, R. N. Review: molecular genetics and pathology of hereditary small vessel diseases of the brain. Neuropathol Appl Neurobiol. 37, 94-113 (2011).
  8. Brun, A., Englund, E. A white matter disorder in dementia of the Alzheimer type: a pathoanatomical study. Ann Neurol. 19, 253-262 (1986).
  9. Prat, A., et al. Migration of multiple sclerosis lymphocytes through brain endothelium. Arch Neurol. 59, 391-397 (2002).
  10. Rule, R. R., Schuff, N., Miller, R. G., Weiner, M. W. Gray matter perfusion correlates with disease severity in ALS. Neurology. 74, 821-827 (2010).
  11. Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366, 1227-1239 (2012).
  12. Hartnett, M. E., Penn, J. S. Mechanisms and management of retinopathy of prematurity. N Engl J Med. 367, 2515-2526 (2012).
  13. Sapieha, P., et al. Retinopathy of prematurity: understanding ischemic retinal vasculopathies at an extreme of life. J Clin Invest. 120, 3022-3032 (2010).
  14. Chen, J., Smith, L. Retinopathy of prematurity. Angiogenesis. 10, 133-140 (2007).
  15. Cheung, N. Diabetic retinopathy and systemic vascular complications. Progress in Retinal and Eye Research. 27, 161-176 (2008).
  16. Smith, L. E. Through the eyes of a child: understanding retinopathy through ROP the Friedenwald lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 5177-5182 (2008).
  17. Caballero, S., et al. Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells. Diabetes. 56, 960-967 (2007).
  18. Wang, H., et al. VEGF-mediated STAT3 activation inhibits retinal vascularization by down-regulating local erythropoietin expression. Am J Pathol. 180, 1243-1253 (2012).
  19. Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. J Clin Invest. 116, 3266-3276 (2006).
  20. Saito, Y., Geisen, P., Uppal, A., Hartnett, M. E. Inhibition of NAD(P)H oxidase reduces apoptosis and avascular retina in an animal model of retinopathy of prematurity. Mol Vis. 13, 840-853 (2007).
  21. Connor, K. M., et al. Increased dietary intake of omega-3-polyunsaturated fatty acids reduces pathological retinal angiogenesis. Nat Med. 13, 868-873 (2007).
  22. Banin, E., et al. T2-TrpRS inhibits preretinal neovascularization and enhances physiological vascular regrowth in OIR as assessed by a new method of quantification. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2125-2134 (2006).
  23. Dorrell, M. I., et al. Maintaining retinal astrocytes normalizes revascularization and prevents vascular pathology associated with oxygen-induced retinopathy. Glia. 58, 43-54 (2010).
  24. Joyal, J. -S., et al. Ischemic neurons prevent vascular regeneration of neural tissue by secreting semaphorin 3A. Blood. 117, 6024-6035 (2011).
  25. Binet, F., et al. Neuronal ER Stress Impedes Myeloid-Cell-Induced Vascular Regeneration through IRE1alpha Degradation of Netrin-1. Cell Metab. 17, 353-371 (2013).
  26. Fukushima, Y., et al. Sema3E-PlexinD1 signaling selectively suppresses disoriented angiogenesis in ischemic retinopathy in mice. J Clin Invest. 121, 1974-1985 (2011).
  27. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35, 101-111 (1994).
  28. Lange, C., et al. Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247, 1205-1211 (2009).
  29. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
  30. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 2813-2826 (2010).
  31. Stahl, A., et al. Computer-aided quantification of retinal neovascularization. Angiogenesis. 12, 297-301 (2009).
  32. Stahl, A., et al. Postnatal Weight Gain Modifies Severity and Functional Outcome of Oxygen-Induced Proliferative Retinopathy. Am J Pathol. 177, 2715-2723 (2010).
  33. Cerani, A., et al. Neuron-Derived Semaphorin 3A is an Early Inducer of Vascular Permeability in Diabetic Retinopathy via Neuropilin-1. Cell Metabolism. 18, 505-518 (2013).
  34. Sapieha, P. Eyeing central neurons in vascular growth and reparative angiogenesis. Blood. 120, 2182-2194 (2012).
  35. Dorfman, A., Dembinska, O., Chemtob, S., Lachapelle, P. Early manifestations of postnatal hyperoxia on the retinal structure and function of the neonatal rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 458-466 (2008).
  36. Dorfman, A. L., Joly, S., Hardy, P., Chemtob, S., Lachapelle, P. The effect of oxygen and light on the structure and function of the neonatal rat retina. Doc Ophthalmol. 118, 37-54 (2009).
  37. Chopp, M., Zhang, Z. G., Jiang, Q. Neurogenesis, angiogenesis, and MRI indices of functional recovery from stroke. Stroke. 38, 827-831 (2007).
  38. Li, L., et al. Angiogenesis and improved cerebral blood flow in the ischemic boundary area detected by MRI after administration of sildenafil to rats with embolic stroke. Brain Res. 1132, 185-192 (2007).
  39. Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Dis Model Mech. 5, 444-456 (2012).
  40. Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat Genet. 37, 1181-1186 (2005).
  41. Jenuth, J. P., Peterson, A. C., Shoubridge, E. A. Tissue-specific selection for different mtDNA genotypes in heteroplasmic mice. Nat Genet. 16, 93-95 (1997).
  42. Mattapallil, M. J., et al. The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes. Investigative ophthalmolog., & visual science. 53, 2921-2927 (2012).
Evaluación de la Vascular regeneración en el SNC Utilizando la retina del ratón
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Miloudi, K., Dejda, A., Binet, F., Lapalme, E., Cerani, A., Sapieha, P. Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (88), e51351, doi:10.3791/51351 (2014).More

Miloudi, K., Dejda, A., Binet, F., Lapalme, E., Cerani, A., Sapieha, P. Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (88), e51351, doi:10.3791/51351 (2014).

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