Summary

마우스 배아의 피부와 Melanoblast 이주의 라이브 영상의 생체 문화

Published: May 19, 2014
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Summary

우리는 마우스 배아 피부의 해부와 생체의 문화를 설명합니다. 배양 시스템은 조직 표면에 걸쳐 공기 – 액체 계면을 유지하고 거꾸로 현미경의 이미징을 허용한다. Melanoblasts, 개발 피부의 구성 요소는, 형광 그들의 행동은 공 초점 현미경을 사용하여 관찰 할 수 있도록 표시되어 있습니다.

Abstract

Melanoblasts은 멜라닌 세포의 전구체를 파생 신경 문장이다; 피부와 머리카락의 색소를 생산에 대한 책임 세포. Melanoblasts는 이후에 개발 머리가 1,2 여포 식민지 배의 표피를 통해 마이그레이션 할 수 있습니다. 신경 능선 세포의 이동은 광범위하게 체외에서 연구되고 있지만, 생체 내 방법을 아직 잘 특히 포유류의 시스템에서 개발되지 않습니다. 하나의 대안은 생체의 Organotypic 문화 3-6을 사용하는 것입니다. 마우스 배아 피부 배양 조직 3,6의 표면에 걸쳐 공기 – 액체 계면 (ALI)의 유지 보수를 필요로한다. 마우스 배아 피부의 고해상도 라이브 영상이 ALI를 유지뿐만 아니라 문화가 반전 짧은 작동 거리 대물 렌즈와 대부분의 공 초점 현미경 따라서 호환 할 수 있습니다뿐만 아니라 좋은 방법의 부족에 의해 방해되었다. 이 문서에서는 메타에 최신의 향상된 기능에 대해 설명합니다OD 즉, 이러한 문제점을 극복하고 생체 외 배양 6 배아 피부의 고해상도 촛점 이미징을 허용하는 가스 투과 막을 사용한다. melanoblast 특정 크레-재조합 효소가 R26YFPR 기자 라인과 함께 마우스 라인을 표현을 사용함으로써 우리는 형광이 피부의 문화 내에서 melanoblast 인구 레이블을 할 수 있습니다. 이 기술은 수 melanoblasts 자신의 행동과 그들이 개발하는 조직과의 상호 작용을 관찰의 라이브 영상. 대표 결과는 사양에 라이브 이미지를 병렬로 6 문화를 보여주기 위해 포함되어 있습니다.

Introduction

전통적으로 배아 피부는 마우스 배아에서 해부와 폴리 카보네이트 (polycarbonate) 뉴 클레오 포어 막에 장착하여 배양하고있다. 멤브레인이어서 따라서 현상 3,4 조직의 표면에 걸쳐 공기 – 액체 계면을 유지 배지에 부유된다. 이 기술은 조직을 고정하고 마커 7로 β-갈 락토시다 아제를 사용하여 melanoblast 분포를 평가하여 melanoblast 동작을 분석 실험하는 데 사용되었습니다. 우리는 생체 피부의 문화 6 라이브 영상의 형광 표지 melanoblasts 수있는 방법을 개발했습니다. 여기에서 우리는 공 촛점 이미징을 살고, 설정에, 해부에서 세부 방법을 설명하고 최근의 일부 개선을 포함한다.

Melanoblasts은 멜라닌 세포의 배아 전구체, 머리와 피부에 색소를 생산하는 세포입니다. Melanoblasts는 개발 마우스 전자에서 배아 일 9 (E9) 주위에 신경 튜브에 인접한 신경 능선에서 발생mbryo. 그 후 그들은 외배엽 및 개발 somites 사이의 dorsolateral 경로를 따라 이동한다. E12.5에서 그들은 증식과 그들의 이동을 계속 표피 진피에서 이동합니다. 기본 모낭 패턴이 모공을 지역화하는 E14.5에서 표피와 E15.5의 melanoblasts에 의해 형성하기 시작합니다. melanoblast / 멜라닌 세포 개발의 검토를 위해 토마스 에릭슨 (2008) 1을 참조하십시오. melanoblast 인구 레이블을하기 위해 우리는 티르를 결합했다 :: 조건부 ROSA26 궤적 9에서 노란색 형광 단백질 (YFP)을 표현 R26YFPR 동물과 마우스 티로시나 아제 프로모터 (8)에 의해 구동 크레-재조합 효소를 표현 CREB 동물.

우리는 거꾸로 공 초점 현미경을 사용하여 문화 배아 피부와 캡처 이미지를하는 방법을 설명합니다. 그것은 모트 등의 설명 원래의 방법. (2010) 6 형태로 구성된다. 본방법은 6 자 형식으로 영상을 허용하고 문화를 지원하는 뉴 클레오 포어 막에와 리겔에 대한 의존도를 제거합니다. 대신 배아 피부를 안정화하는 1 % 아가로 오스의 소 블록을 사용. 마트 리겔에 대한 의존도를 제거하면, 특히 수용성 성장 인자에 대한 배아 피부의 반응이 연구의 초점이 상황에서 중요하다. 우리의 원래 방법은 이미 melanoblast 개발 10-13에 새로운 통찰력을 얻기 위해 사용되었습니다 그리고 우리는 우리가 여기에서 설명하는 개선이 다수의 병렬 문화가 요구 사항, 특히 실험적인 기술로 더 강력 할 것으로 예상.

Protocol

모든 동물의 작업은 영국 홈 오피스 (프로젝트 라이센스 번호 PPL 3천7백85분의 60 및 4천4백24분의 60)에 의해 라이센스하에 제도적 지침에 따라 수행 하였다. 1. 준비 형광 기자 마우스 라인과 적절한 크레-재조합 효소 발현하는 마우스 라인을 결합하여 개발 피부에 melanoblasts 레이블을 지정합니다. 티르 :: CREA, 티르 :: CREB 8 Wnt1의 :: 크레 (14) …

Representative Results

그림 2는 티르에서 배아의 피부를 사용하여 시간 경과 실험에서 대표적인 결과를 보여줍니다 :: CREB는 E14.5에서 R26YFPR 배아를 x. 6 배아 피부의 문화는 18 시간 동안 매 2 분 공 초점 현미경으로 몇 군데 있었다. 프리웨어 이미지 분석 소프트웨어 패키지는 ImageJ에 6 영화 YFP – 표지 melanoblasts의 행동을 분석하는데 사용 하였다. melanoblasts 자동 (제스퍼 Søndergaard이 페더슨?…

Discussion

우리는 거꾸로 공 초점 현미경에하는 라이브 세포 이미징 의무 특수성이다 문화 배아 피부에하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 6 문화가 병렬로 몇 군데 리겔 원래의 방법 (6)의 뉴 클레오 포어 막에 대한 의존도를 제거 할 수 있도록 최근의 개선 사항이 포함되어 있습니다. 유사한 기술에서 중요한 기술적 인 차이는 공기 액체 계면을 확립하고 또한 커버 슬립 역할을 가스 투과성 움직임?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 의학 연구위원회에서 핵심 기금에 의해 지원되었다. 우리는 기술 도면을 준비 크레이그 니콜에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 그들의 영상 지원을위한 마태 복음 피어슨와 폴 페리에게 감사의 말씀을 전합니다.

Materials

DMEM high glucose Biochrom AG F0475 without phenol red
Penicillin Sigma P3032
Streptomycin Sigma S9137
Fetal calf serum Hyclone SV30160.03
Glutamax Gibco 35050-038
Ethanol Generic
Live imaging chamber Custom made
Lummox dishes Sarstedt 94.6077.410
6-well plate Greiner Bio-One 657-160
Single edged razor blade Fisher Scientific 1244-3170
Agarose Biogene 300-300
Fine pastette Generic
PBS Generic
Kebab skewers Waitrose Bamboo BBQ skewers 30cm
Toothbrush Generic
Petri dishes Greiner Bio-One 633185
Suture thread Look SP115 Black silk suture thread

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Cite This Article
Mort, R. L., Keighren, M., Hay, L., Jackson, I. J. Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration. J. Vis. Exp. (87), e51352, doi:10.3791/51352 (2014).

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