우리는 마우스 배아 피부의 해부와 생체의 문화를 설명합니다. 배양 시스템은 조직 표면에 걸쳐 공기 – 액체 계면을 유지하고 거꾸로 현미경의 이미징을 허용한다. Melanoblasts, 개발 피부의 구성 요소는, 형광 그들의 행동은 공 초점 현미경을 사용하여 관찰 할 수 있도록 표시되어 있습니다.
Melanoblasts은 멜라닌 세포의 전구체를 파생 신경 문장이다; 피부와 머리카락의 색소를 생산에 대한 책임 세포. Melanoblasts는 이후에 개발 머리가 1,2 여포 식민지 배의 표피를 통해 마이그레이션 할 수 있습니다. 신경 능선 세포의 이동은 광범위하게 체외에서 연구되고 있지만, 생체 내 방법을 아직 잘 특히 포유류의 시스템에서 개발되지 않습니다. 하나의 대안은 생체의 Organotypic 문화 3-6을 사용하는 것입니다. 마우스 배아 피부 배양 조직 3,6의 표면에 걸쳐 공기 – 액체 계면 (ALI)의 유지 보수를 필요로한다. 마우스 배아 피부의 고해상도 라이브 영상이 ALI를 유지뿐만 아니라 문화가 반전 짧은 작동 거리 대물 렌즈와 대부분의 공 초점 현미경 따라서 호환 할 수 있습니다뿐만 아니라 좋은 방법의 부족에 의해 방해되었다. 이 문서에서는 메타에 최신의 향상된 기능에 대해 설명합니다OD 즉, 이러한 문제점을 극복하고 생체 외 배양 6 배아 피부의 고해상도 촛점 이미징을 허용하는 가스 투과 막을 사용한다. melanoblast 특정 크레-재조합 효소가 R26YFPR 기자 라인과 함께 마우스 라인을 표현을 사용함으로써 우리는 형광이 피부의 문화 내에서 melanoblast 인구 레이블을 할 수 있습니다. 이 기술은 수 melanoblasts 자신의 행동과 그들이 개발하는 조직과의 상호 작용을 관찰의 라이브 영상. 대표 결과는 사양에 라이브 이미지를 병렬로 6 문화를 보여주기 위해 포함되어 있습니다.
전통적으로 배아 피부는 마우스 배아에서 해부와 폴리 카보네이트 (polycarbonate) 뉴 클레오 포어 막에 장착하여 배양하고있다. 멤브레인이어서 따라서 현상 3,4 조직의 표면에 걸쳐 공기 – 액체 계면을 유지 배지에 부유된다. 이 기술은 조직을 고정하고 마커 7로 β-갈 락토시다 아제를 사용하여 melanoblast 분포를 평가하여 melanoblast 동작을 분석 실험하는 데 사용되었습니다. 우리는 생체 피부의 문화 6 라이브 영상의 형광 표지 melanoblasts 수있는 방법을 개발했습니다. 여기에서 우리는 공 촛점 이미징을 살고, 설정에, 해부에서 세부 방법을 설명하고 최근의 일부 개선을 포함한다.
Melanoblasts은 멜라닌 세포의 배아 전구체, 머리와 피부에 색소를 생산하는 세포입니다. Melanoblasts는 개발 마우스 전자에서 배아 일 9 (E9) 주위에 신경 튜브에 인접한 신경 능선에서 발생mbryo. 그 후 그들은 외배엽 및 개발 somites 사이의 dorsolateral 경로를 따라 이동한다. E12.5에서 그들은 증식과 그들의 이동을 계속 표피 진피에서 이동합니다. 기본 모낭 패턴이 모공을 지역화하는 E14.5에서 표피와 E15.5의 melanoblasts에 의해 형성하기 시작합니다. melanoblast / 멜라닌 세포 개발의 검토를 위해 토마스 에릭슨 (2008) 1을 참조하십시오. melanoblast 인구 레이블을하기 위해 우리는 티르를 결합했다 :: 조건부 ROSA26 궤적 9에서 노란색 형광 단백질 (YFP)을 표현 R26YFPR 동물과 마우스 티로시나 아제 프로모터 (8)에 의해 구동 크레-재조합 효소를 표현 CREB 동물.
우리는 거꾸로 공 초점 현미경을 사용하여 문화 배아 피부와 캡처 이미지를하는 방법을 설명합니다. 그것은 모트 등의 설명 원래의 방법. (2010) 6 형태로 구성된다. 본방법은 6 자 형식으로 영상을 허용하고 문화를 지원하는 뉴 클레오 포어 막에와 리겔에 대한 의존도를 제거합니다. 대신 배아 피부를 안정화하는 1 % 아가로 오스의 소 블록을 사용. 마트 리겔에 대한 의존도를 제거하면, 특히 수용성 성장 인자에 대한 배아 피부의 반응이 연구의 초점이 상황에서 중요하다. 우리의 원래 방법은 이미 melanoblast 개발 10-13에 새로운 통찰력을 얻기 위해 사용되었습니다 그리고 우리는 우리가 여기에서 설명하는 개선이 다수의 병렬 문화가 요구 사항, 특히 실험적인 기술로 더 강력 할 것으로 예상.
우리는 거꾸로 공 초점 현미경에하는 라이브 세포 이미징 의무 특수성이다 문화 배아 피부에하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 6 문화가 병렬로 몇 군데 리겔 원래의 방법 (6)의 뉴 클레오 포어 막에 대한 의존도를 제거 할 수 있도록 최근의 개선 사항이 포함되어 있습니다. 유사한 기술에서 중요한 기술적 인 차이는 공기 액체 계면을 확립하고 또한 커버 슬립 역할을 가스 투과성 움직임?…
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 의학 연구위원회에서 핵심 기금에 의해 지원되었다. 우리는 기술 도면을 준비 크레이그 니콜에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 그들의 영상 지원을위한 마태 복음 피어슨와 폴 페리에게 감사의 말씀을 전합니다.
DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
Penicillin | Sigma | P3032 | |
Streptomycin | Sigma | S9137 | |
Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
Ethanol | Generic | ||
Live imaging chamber | Custom made | ||
Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
Agarose | Biogene | 300-300 | |
Fine pastette | Generic | ||
PBS | Generic | ||
Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30cm | |
Toothbrush | Generic | ||
Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |