Summary
Este protocolo describe registro extracelular de los potenciales de acción respuestas disparados por las neuronas gustativas labellar en Drosophila.
Abstract
La respuesta de sabor periférica de insectos puede ser poderosamente investigó con técnicas electrofisiológicas. El método aquí descrito permite al investigador para medir las respuestas gustativas directa y cuantitativa, lo que refleja la entrada sensorial que el sistema nervioso de los insectos recibe de estímulos de sabor en su entorno. Este protocolo describe todos los pasos clave en la realización de esta técnica. Los pasos críticos en el montaje de una plataforma de electrofisiología, como la selección de los equipos necesarios y un entorno adecuado para la grabación, se delinean. También describe cómo prepararse para la grabación haciendo electrodos de referencia y registro adecuados y soluciones saborizante. Se describe en detalle el método utilizado para preparar el insecto mediante la inserción de un electrodo de referencia de vidrio en la marcha con el fin de inmovilizar la trompa. Mostramos los rastros de los impulsos eléctricos disparados por las neuronas gustativas en respuesta a un azúcar y un compuesto amargo. Aspectos del protocolo son technically desafiante e incluimos una extensa descripción de algunos problemas técnicos comunes que se pueden encontrar, como la falta de señal o ruido excesivo en el sistema, y las posibles soluciones. La técnica tiene limitaciones, tales como la incapacidad para entregar estímulos temporalmente complejos, observar el fondo de disparar inmediatamente antes de la entrega a los estímulos, o utilizar compuestos de sabor insolubles en agua convenientemente. A pesar de estas limitaciones, esta técnica (incluyendo variaciones menores que se hace referencia en el protocolo) es un estándar, procedimiento ampliamente aceptado para la grabación de las respuestas neuronales de Drosophila para probar compuestos.
Introduction
El sentido del gusto permite un insecto para detectar una amplia gama de productos químicos solubles y juega un papel importante en la aceptación de una sustancia nutritiva, o el rechazo de un ser nociva o tóxica. Sabor también se cree que desempeñan un papel en la selección de la pareja, a través de la detección de feromonas 1-5. Estas funciones importantes y diversos han hecho que el sistema del gusto del insecto un objetivo convincente de investigación sobre cómo los sistemas sensoriales traducen señales del medio ambiente en las salidas de comportamiento pertinentes.
La unidad principal del sistema del gusto Drosophila melanogaster es el pelo sabor o sensillum. Las moléculas entran en el sensillum a través de un poro en su punta de 2,6. Sensilla se encuentran en el labelo, las piernas, el margen de ala, y la faringe 6. En el labelo, el número y la ubicación de sensilla es estereotipado. Hay tres clases morfológicas de sensilla basados en longitud: la longitud (L), intermedio (I) y corto (S ) Sensilla 7,8. Cada sensillum contiene ya sea dos (de tipo I) o cuatro (L-y de tipo S) neuronas receptoras gustativas (GRNs) 9. Diferentes GRNs responden a diferentes categorías de estímulos sabor: amargo, el azúcar, la sal y la osmolaridad 7,10 y expresan diferentes subconjuntos de receptores gustativos 8,11-13. Sólo I y de tipo S sensilla contengo GRNs-amargas sensible 8,10. El proyecto GRNs al ganglio subesophageal (TG) y su activación por las moléculas de sabor se transmite al sistema nervioso central superior para la decodificación, lo que resulta en una respuesta de comportamiento 6. El relativamente pequeño número de neuronas y la susceptibilidad a un análisis molecular y de comportamiento hacen que el sistema del gusto Drosophila un excelente modelo para la investigación de los sistemas gustativos en general. La relativa facilidad con la que el sistema puede ser manipulado a través de mutación genética o el sistema de expresión de GAL4-UAS también sirve como una herramienta valiosa 14,15.
ONTENIDO "> Debido a que estos sensilla sobresalen de la superficie del labelo, que son excelentes objetivos para electrofisiología. El disparo de los GRNs se puede supervisar usando la grabación extracelular. Históricamente, el método de grabación de la pared lateral, que utiliza un electrodo de vidrio insertado en la sensillum para registrar la actividad neuronal, 26 se ha utilizado. Sin embargo, este método es técnicamente difícil de realizar, y que es difícil de grabar por mucho tiempo a partir de cada preparación. El método de la punta-de grabación, que mide la respuesta de las neuronas con un electrodo que proporciona simultáneamente un saborizante, se ha convertido ya que el método de elección 9,16. Se ha utilizado para investigar el sistema de sabor de Drosophila melanogaster 8,10,17,18, así como un número de otras especies de insectos 19-23. Tiene sido facilitado en gran medida por el desarrollo del amplificador tastePROBE, que superó uno de los principales inconvenientes del método de grabación de punta mediante la compensación dela gran diferencia de potencial entre el electrodo de referencia y el sensillum de insectos, permitiendo que los potenciales de acción GRN a grabarse sin excesiva amplificación o filtrado 24. Otro acontecimiento importante fue el uso de citrato de tricolina como electrolito grabación 25. TCC suprime las respuestas de la GRN-osmolaridad sensible y no estimula la GRN sensibles a la sal, por lo que las respuestas generadas por los sabores amargos y azúcar mucho más fáciles de analizar 25.Aquí se describe cómo grabar punta de Drosophila labellar sensilla se lleva a cabo actualmente en el laboratorio Carlson. Este protocolo le explicará cómo establecer una plataforma adecuada de electrofisiología, la forma de preparar la marcha, y cómo realizar grabaciones gustativas. También presentamos algunos datos representativos obtenidos mediante el registro de los subconjuntos de Drosophila sensilla, así como algunos problemas comunes y las posibles soluciones que se pueden encontrar cuando se utiliza estetécnica.
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Protocol
El siguiente protocolo cumple con todas las pautas de cuidado de animales de la Universidad de Yale.
1. Reactivos y Preparación del equipo
- Ajuste del equipo de grabación (Figura 1A).
- Elija una habitación para la configuración plataforma que está libre de grandes variaciones de temperatura o humedad, y también aislado de fuentes de ruido eléctrico y mecánico, como refrigeradores y centrifugadoras.
Figura 1. (A) Descripción general de la configuración equipo de grabación. Estereomicroscopio (a) está montado en la plataforma anti-vibración (b) soporte del electrodo. Referencia (c) está montado en la plataforma frente a la headstage (d), a través de micromanipuladores. Un tubo de plástico de salida (e) la entrega de corriente de aire humidificado dirigida a la preparación mosca está montado también en Tél plataforma. El headstage está conectado al amplificador (f), que está conectado al sistema digital de adquisición (DAS) (g), el cual está conectado a un PC (h). (B) La configuración de los electrodos y el tubo de salida:. Electrodo de referencia de la izquierda, la grabación de electrodos a la derecha, y el tubo de salida de la corriente de aire dirigida a la preparación mosca Haga clic aquí para ver la imagen más grande. - Monte estereoscópico para centro de mesa anti-vibración o plataforma.
- Adjuntar micromanipulador para la preparación del electrodo de referencia / insecto y headstage / electrodo de registro a la izquierda y derecha del microscopio, respectivamente, utilizando soportes magnéticos.
- Montaje de tubo de plástico de salida en un tercer micromanipulador para la parte trasera del microscopio, orientado de tal manera que la abertura del tubo es apuntada hacia la ubicación de preparación de mosca (véase la Figura 1B).
- El uso de tubos de plástico flexible, por lotubo de plástico de salida del tacómetro a un matraz de vacío parcialmente lleno con agua. Conectar una pequeña bomba de acuario de la burbuja de aire a través del agua en el matraz, la generación de una corriente de aire humidificado a través del tubo de plástico de salida hacia la mosca.
- Monte de fibra óptica la fuente de luz de la mesa de vibración, la orientación de las salidas para iluminar la preparación al reflejar la luz a través de un pedazo de papel de tarjetas blanco justo debajo de la preparación. Asegúrese de que la fuente de luz no descansa sobre la mesa. Nota: el beneficio de lo que refleja la fuente de luz en un disco de papel es doble: mejora el contraste, por lo que sensilla más fácil de visualizar, y se evita el calentamiento de la preparación que se derivarían de la luz directa.
- Conecte el amplificador tastePROBE en el sistema de adquisición digital (DAS), y el DAS en un ordenador personal, de acuerdo con el manual de proveedores. Enchufe el pie del pedal de disparo en y organizar bajo espacio de trabajo. Nota: Los enchufes de pared eléctricamente aisladas para el amplificador y el DAS son altamente deseablecapaz.
- Conectar a tierra el microscopio, micromanipuladores y fuente de luz mediante la conexión de los componentes de metal para mesa con pinzas de cocodrilo y longitudes de cable eléctrico aislado y cinta aislante. Conectar a tierra la plataforma de metal mediante la conexión a tierra del edificio o del DAS, que está conectado a tierra a través del enchufe de alimentación.
- Instalar el software apropiado para la adquisición de la DAS de elección en el ordenador personal. Nota: Asegúrese de que los controladores de adquisición digital son compatibles con el sistema operativo en el PC.
- Configurar la amplificación de software (10-100x), filtrado de señal (típicamente un filtro de paso de banda de Bessel ajustar de 100 Hz-3, 000 Hz), y la tasa de muestreo (por lo menos 10 KHz). Nota: Las amplitudes de señal de las neuronas gustativas están típicamente en el rango mV 0,5-2, por lo que la escala de visualización está configurado para facilitar su visualización. Nota: El filtro de 100 Hz ayuda a excluir el ruido eléctrico extraña, sin embargo, cambia la forma de los picos y puede hacer pico de clasificación avanzada More impugnar. Alternativamente, un filtro de 1 Hz se puede utilizar.
- Opcionalmente, una jaula de Faraday puede ser configurado alrededor de toda la mesa de vibración. Sin embargo, pequeñas hojas de papel de aluminio son por lo general suficiente para reducir cualquier ruido generado por el ambiente externo o el investigador.
- Elija una habitación para la configuración plataforma que está libre de grandes variaciones de temperatura o humedad, y también aislado de fuentes de ruido eléctrico y mecánico, como refrigeradores y centrifugadoras.
- Glass Preparación del electrodo
Figura 2. Referencia y registro de electrodos. Photograph bajo ampliación de capilares de vidrio tirados en el electrodo de referencia, con (A) y sin (B) la punta rota, y los electrodos de grabación (C). Barra blanca representa 2 mm. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.- Tire de la referenciaelectrodo de un capilar de vidrio utilizando un instrumento extractor de pipeta. Nota: Los ajustes exactos del programa extractor de pipeta pueden variar de un instrumento a otro. Trate de lograr una reducción gradual muy largo. El tamaño de poro en la punta no es crucial, ya que la punta se romperá antes de la preparación mosca (Figuras 2A y 2B), sin embargo, asegurarse de que el diámetro de la longitud ahusada del electrodo no es ni demasiado delgada, que no permita la suficiente inmovilización del labelo, ni demasiado grande, que podría dañar las neuronas gustativas o romper las glándulas salivales.
- Tire del electrodo graba desde un capilar de vidrio de borosilicato con filamento usando un instrumento extractor pipeta. Trate de lograr una conicidad que es menos profunda que la del electrodo de referencia, y un diámetro de poro de aproximadamente 10-15 micras (Figura 2C) 28.
- Preparación de soluciones saborizante
- Utilice Beadle-Ephrussi solución Ringerción (B & E) como electrolito del electrodo de referencia. Para hacer un litro de B & E, disolver 7,5 g de NaCl, 0,35 g de KCl, y 0,279 g de CaCl 2 ∙ 2H 2 O en un litro de agua ultrapura. Almacenar alícuotas menores a -20 ° C.
- Utilice 30 mM de solución de citrato de tricolina (TCC) como electrolito electrodo de registro y disolvente para soluciones saborizante 25, si las respuestas GRN amargas o de azúcar se van a medir. Alternativamente, una solución de cloruro de potasio mM 1-3 se puede utilizar si las respuestas de la celda de agua se van a medir.
- Para hacer soluciones saborizante, pesar la cantidad adecuada de saborizante en polvo y añadir al TCC para hacer una concentración inicial de acciones. Use esto para hacer diluciones seriadas de esta población inicial para producir la concentración deseada para la prueba. Nota: Si estimulantes del gusto no se disuelven fácilmente en agua, otro disolvente, tal como etanol, se puede utilizar para hacer que la concentración de stock inicial. Una solución de control adecuado de TCC y el disolvente sin saborizantese debe utilizar en este caso.
- Alícuotas de las tiendas a largo plazo a -20 ° C. Almacenar una alícuota de una solución de trabajo saborizante a 4 ° C para el registro de uso de hasta una semana, dependiendo de las propiedades químicas de saborizante.
2. Preparación de Drosophila
Figura 3. Preparación de mosca para la grabación. (A) Posición de inserción del electrodo de referencia en el tórax dorsal de la mosca. La flecha blanca indica el electrodo de referencia. (B) Posición intermedia del electrodo de referencia: avanzar a través del cuello y la cabeza, probóscide aún no extendidos. (C, D) Vuela con electrodo de referencia en la posición final con la punta del electrodo en el interior labelo, y la probóscidecompletamente extendido. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.
- Recoger las moscas recién eclosed para grabar a partir de cultivos de moscas bien mantenidas, cultivadas bajo y temperatura-condiciones de humedad controlada, y envejecerlos 5-10 días en frascos de cultivo fresco antes de grabar.
- Chill placa de microscopio en hielo durante 15 a 30 min antes de preparar la mosca.
- Relleno electrodo de referencia de vidrio con B & E solución usando una larga aguja de plástico, delgada de 0,5 mm de diámetro, tal como una aguja espinal y jeringa de 1 ml y golpear suavemente las burbujas. Romper pequeña cantidad de la punta de uso de fórceps y utilizar la acción capilar para extraer todas las burbujas restantes con un pañuelo desechable, observando bajo microscopio de disección.
- Slide B & E llenas electrodo de referencia sobre el alambre de soporte del electrodo de referencia, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire.
- Aspirar volar en una punta de pipeta P200, utilizando un aspirador fly integradoa partir de tubos, malla, y la punta de la pipeta; 29 lugar en el cubo de hielo y el frío durante 30-60 seg.
- Retire la placa de microscopio de hielo, elimine los restos de humedad y la posición por debajo del microscopio. Golpear suavemente volar fuera de la punta de la pipeta sobre la placa de microscopio.
Nota: la mosca debe ser suficientemente inmovilizado para manipular fácilmente. - En condiciones de baja magnificación, retire suavemente las patas delanteras con un par de pinzas, mientras mantiene la estabilidad del tórax con el otro par de pinzas. Coloque la mosca en su parte ventral, frente a lado dorsal hacia arriba. Nota: Siempre tenga cuidado de no tocar el labelo con las pinzas en todo momento durante el proceso de preparación para reducir al mínimo los daños mecánicos.
- Mientras mantiene la marcha en su lugar con un par de fórceps, insertar el electrodo de referencia en la línea media de la parte posterior tórax dorsal. Un ángulo sugerido de entrada es de aproximadamente cuarenta y cinco grados, en la dirección de la cabeza (Figura 3A).
- Asegure el electrod referenciatitular e con plastilina de tal manera que la mosca es visible bajo el microscopio con una gran ampliación. Maniobra y el ángulo del electrodo de vidrio a través del cuello y la cabeza, deslizando la marcha hacia el soporte del electrodo de referencia utilizando dos pares de pinzas. Nota: Trabajar con rapidez, pero sin problemas, es más fácil de completar este paso, mientras que la marcha todavía está inmovilizado por el frío (Figura 3B).
- Extender suavemente la trompa con un par de fórceps, mientras desliza la marcha más abajo en el electrodo de referencia de vidrio, hasta que la punta del electrodo está dentro del labelo y la trompa está totalmente extendida (Figuras 3C y 3D). Nota: Tenga cuidado de no perforar cualquier parte del tejido probóscide o distender el borde del labelo con el electrodo de referencia, ya que esto puede dañar la marcha y / o sabor neuronas y afectar la calidad de la grabación.
3. Grabación desde Labellar Sensilla
Figura 4. Grabación de mosca. (A) labelo de la preparación de la mosca en la izquierda con electrodo de registro alineados para el contacto a la derecha, con gran aumento. (B) electrodo de registro y solo sensillum el labelo en contacto, con gran aumento. Haz click aquí para ver la imagen más grande.
- Siempre tierra tocando la superficie metálica de la mesa anti-vibración o la plataforma antes de tocar cualquier equipo durante el proceso de grabación! Nota: Es muy importante que no se entregará una carga estática al headstage ya que puede dañar el circuito.
- Secure portaelectrodos referencia a micromanipulador montados en mesa de aire de recording plataforma. Coloque un lóbulo del labelo en microscopio de campo de vista, con gran aumento (típicamente al menos 140X), y en línea con la corriente de aire húmedo.
- Encienda el flujo de aire humidificado, ordenador, DAS, y el amplificador. Software de adquisición en Abrir.
- Enjuague y llene electrodo de registro de vidrio con saborizante deseado.
- Enjuague electrodo de registro de vidrio con agua ultrapura mediante el uso de una jeringa y un tubo de plástico 28 para tirar de pequeñas cantidades de agua a través del tubo de al menos diez veces.
- Enjuague electrodo de registro con saborizante al menos cinco veces. Llenar electrodo de registro de aproximadamente un tercio a medio camino completo con saborizante y retirar del tubo. Si hay burbujas de aire, toque para liberar o simplemente rellene el electrodo.
- Deslizar electrodo sobre alambre de plata de la headstage de forma rápida y sin problemas con el fin de no introducir burbujas de aire.
- Estimular sola sensillum con electrodo de registro saborizante lleno.
- Utilice la micromanipulator para llevar el electrodo de registro alineado con sensillum de interés.
- Presione el pedal para activar el modo de adquisición del amplificador.
- Avanzar el electrodo de registro con el mando de control fino de micromanipulador cuidadosamente hasta que haga contacto con la punta de sensillum y grabación comience.
- Quite el electrodo después de 1-2 segundos.
- Repita el paso 3.5 con otra sensilla, si se desea. Nota: Espere al menos 1 minuto entre presentaciones al mismo sensillum. Si se graba con un único saborizante durante un período prolongado de tiempo, la solución saborizante puede secarse y la solución en la punta puede ser más concentrado. Esto puede remediarse poniendo en contacto suavemente la punta del electrodo de vidrio con papel suave para extraer una pequeña cantidad de líquido por acción capilar.
- Para grabar las respuestas a otro saborizante, enjuague y electrodo de registro de carga con el nuevo saborizante y repita el paso 3.4. Nota: Completamente enjuagar el electrodo entre estimulantes del gusto es absolutely crucial para evitar la contaminación cruzada.
- Guarde los archivos de datos periódicamente con información de identificación, como la fecha, el genotipo y estimulantes del gusto. Nota: Es importante mantener un registro escrito de la saborizante y la identidad de cada sensillum presentación durante la sesión de grabación para el análisis de datos.
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Representative Results
La Figura 5A muestra la respuesta de un sensillum L para un azúcar, sacarosa. La misma sensillum no responde a un compuesto amargo, berberina. Figura 5B muestra que un sensillum de tipo I, que contiene una neurona de respuesta amarga, muestra grandes picos de amplitud en respuesta a la berberina, y más pequeños picos de amplitud en respuesta a la sacarosa. L sensilla mostrar una mínima respuesta de fondo para el control de disolvente, TCC, mientras yo muestro sensilla prácticamente ninguna respuesta a la TCC (Figura 5). Para obtener más información sobre las respuestas de la sal y el agua de GRNs labellar, consulte Hiroi 10.
Figura 5. Vestigios representativos de los de tipo salvaje respuestas Drosophila labellar (A) sensillu L m respuesta a sacarosa 100 mM (SUC), berberina mM 1 (BER), y 30 mM de CTP. (B) que sensillas respuesta a SUC, BER, y TCC. La punta de flecha indica el artefacto de contacto que se produce al comienzo de cada grabación. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 6. Representativas resultados electrofisiológicos subóptimos. (A) completa falta de señal (B) 50/60 Hz "ruido" (C) de ruido estocástico (D) de la neurona mecanosensorial disparar solo (E) amarga GRN (triángulos abiertos) y las neuronas mecanosensorial ( triángulos) llena tanto de tiro./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig6highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
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Discussion
Sensilla Labellar varían en la facilidad de la grabación debido a las diferencias en la morfología y organización anatómica. A veces, un sensillum no responde a ningún estimulantes del gusto, incluso uno que se conoce para provocar una respuesta positiva. La frecuencia con la que ocurre esto varía dependiendo del tipo de sensillum. L sensilla son más consistentemente sensible y son relativamente fáciles de acceder debido a su longitud. En general, S sensilla son consistentemente sensible, pero su corta longitud y posición en el labelo hacen buen contacto desafiante. Me sensilla se puede acceder más fácilmente, dependiendo del ángulo de la preparación, sin embargo, que son con más frecuencia que no responde. En cualquier preparación mosca dada, una mayor proporción de la I sensilla puede ser que no responde a L o S sensilla. Antecedentes genéticos puede afectar a la coherencia de las respuestas del gusto también. Por ejemplo, algunas moscas transgénicas pueden mostrar respuestas menos consistente que de tipo salvaje, presumiblemente debido a que los transgenes afectan a la GENeral la salud de la mosca. Hemos observado que w - moscas mutantes son particularmente difíciles de grabar.
Un problema técnico común es la falta de la señal, es decir, no se observan picos (Figura 6A). En primer lugar, a veces uno sensillum particular puede no responder, mientras que otros de la misma clase en la misma mosca pueden responder. En segundo lugar, puede haber una burbuja de aire en el electrodo de registro o el electrodo de referencia. Si se sospecha que el electrodo de registro, esto se puede solucionar por la simple eliminación y volver a llenar el electrodo de vidrio, golpeando suavemente e inspeccionar con una lupa para asegurarse de que no hay burbujas. Si se sospecha que el electrodo de referencia para contener una burbuja, es rehacer la preparación con una nueva mosca es la forma más fácil de resolver este problema. En tercer lugar, algunas veces los cables que transportan la señal eléctrica no pueden ser conectados de forma segura. En cuarto lugar, de vez en cuando la señal de tensión que se recibe puede ser mayor o menor queel rango del amplificador puede medir. Si se utiliza el amplificador tastePROBE, compruebe si bien el clip hacia arriba o hacia abajo el clip indicador luminoso está encendido. Si la luz del indicador de saturación hasta está en, a menudo quitar y volver a llenar el electrodo de referencia de vidrio, teniendo cuidado de llenar no más de medio camino y limpiando el exterior para eliminar la humedad va a resolver el problema. La humedad en el exterior del electrodo de vidrio puede hacer una conexión eléctrica entre la carcasa de metal del electrodo y el cable, el envío de la señal de fuera de rango del amplificador. Si no logra resolver el problema, o la luz del indicador de saturación hacia abajo está en, considerar las sugerencias en el siguiente párrafo de lucha contra el ruido eléctrico en el sistema. En quinto lugar, a veces una mosca puede morir durante la preparación o es de otra manera que no responde a pesar de la apariencia saludable de la preparación. Las condiciones de cultivo, tales como la humedad, la temperatura, edad, calidad de los alimentos, y la microbiota, así como un fondo genético menos saludable podrían contribuir a una mayorproporción de moscas "que no responden". Por último, en raras ocasiones, una pieza de equipo puede ser no funcional. Si está constantemente no está logrando la señal y todas las demás posibilidades se han agotado, puede ser necesario investigar la funcionalidad de cada pieza del equipo: headstage, amplificador y un digitalizador. La manera más fácil de hacer esto es para reemplazar una pieza de equipo con otro a partir de un equipo de perforación que se sabe que es funcional. Si sólo hay un equipo de perforación está presente en un laboratorio, un generador de señal se puede utilizar para probar la funcionalidad de los componentes electrónicos.
Otra cuestión técnica común es la de "ruido", que es una señal observada que no aparece para representar a los potenciales de acción neuronales disparados en respuesta a un estímulo gustativo (Figuras 6B-E). En primer lugar, la señal puede ser el resultado de 50/60 Hz ruido eléctrico de equipos de grabación o de otros equipos cercanos (Figura 6B). Sin mosca en el electrodo de referencia, directaly conectar los electrodos de registro y de referencia a través de una gota de la solución de Ringer y entrar en el modo de paso a través del amplificador pulsando el botón de arriba. Si el ruido es observable en la señal de paso a través, esto probablemente significa que el ruido es externo a la preparación mosca. Asegúrese de que todos los equipos de la plataforma está conectada a tierra correctamente y que el estaño escudos de aluminio están en su lugar. Pruebe a desconectar los equipos cercanos para ver si el ruido se elimina, o proteger los componentes adicionales. En segundo lugar, el ruido puede aparecer estocástico (Figura 6C). En este caso, todavía deben llevarse a cabo los pasos que se detallan a 50/60 Hz de ruido. Además, trate de desconectar o sustituir los diferentes componentes del aparato de control, en particular el headstage y / o amplificador. Si no se observa ningún ruido cuando los electrodos están conectados directamente, la fuente es probable que la preparación mosca sí mismo. Por lo general es más sencilla de preparar una nueva mosca para la grabación, teniendo cuidado de minimizar el daño a la mosca. En tercer lugar, la activaciónde la neurona mecanosensorial contenida dentro del sensillum pueden observarse (Figuras 6D y 6E). La neurona mecanosensorial se puede activar si la sensillum es desviada o doblarse después de la aplicación del electrodo de registro, o se golpea durante el contacto. Los picos son generalmente distinguibles de los picos de quimiosensoriales por su patrón irregular, que suele aparecer en coordinación con la disrupción mecánica, no de la aplicación de un estímulo gustativo. De disparo mecanosensorial se puede minimizar mediante la alineación del electrodo de registro con el sensillum y avanzando suavemente sólo en la medida que sea necesario para hacer contacto con la punta de la sensillum. En cuarto lugar, pico estocástico "estallar" se puede observar, lo que parece similar a la descarga neuronal, pero es de alta frecuencia y la amplitud, no coordinado en respuesta a un estímulo. Esto por lo general resulta de la propia preparación mosca, no desde el equipo, y puede ser debido a un nervio interrumpido por el electrodo de referencia. </ P>
Una tercera cuestión técnica común es que la preparación es móvil, haciendo que el labelo se mueva, lo que hace relación con una difícil sensillum. En primer lugar, la preparación mosca puede ser inestable. Compruebe que el electrodo de referencia está en la posición correcta, y reajustar si es necesario. En segundo lugar, el electrodo de referencia puede ser demasiado delgada en la punta para mantener la trompa e inmóvil labelo. Intenta romper una cantidad larga de la punta antes de preparar la marcha. Si eso no es suficiente, vuelva a ajustar la configuración del extractor de pipeta según sea necesario para cambiar la forma del electrodo de referencia de manera que la conicidad es más gradual y el diámetro se incrementa ligeramente. En tercer lugar, la mosca puede ser inusualmente activo. Vuelva a realizar la preparación con una nueva marcha.
Para obtener información general y más electrofisiología guía de solución de problemas, consulte la Guía Axon 30.
Hay algunas limitaciones para el método de punta-grabación descritos en este publicatde iones. Una limitación es que el saborizante debe ser soluble en agua, ya que se entrega en el electrodo de registro junto con el electrolito. Esto aumenta la dificultad de la grabación con compuestos de hidrocarburos, aunque el uso de un disolvente como DMSO ha hecho algunos de grabación con feromonas posibles 4. Los enfoques alternativos son para utilizar un electrodo de tungsteno afilado para llevar a cabo las grabaciones de la base de enchufe de la sensillum, o utilizar un electrodo de vidrio para realizar grabaciones de la pared lateral de la sensillum, en ambos de los cuales el saborizante se entrega de forma independiente de la electrodo de registro 26,27. Sin embargo, estas técnicas son difíciles y grabaciones de pared lateral son más perjudiciales para el órgano sabor. Otra limitación es la cantidad de tiempo necesario para el intercambio de la solución saborizante (Protocolo de paso 3.3), lo que reduce el rendimiento, y limita el uso de complicados paradigmas de estímulo a menudo visto en grabaciones olfativas. Neuronas receptoras gustativas presentan cierta variabilidaden amplitud que depende de la frecuencia pico. Esta característica puede complicar la evaluación de la identidad neuronal y hacer pico avanzado de clasificación más difícil 25,31-33. Además, debido a la naturaleza del método de punta-de grabación no se puede registrar el disparo basal inmediatamente antes de la entrega de un estímulo, tal como se hace comúnmente en grabaciones olfativas. A pesar de estos inconvenientes, el método de grabación de la punta ha sido utilizado con éxito para elucidar muchos de los principios de la codificación de sabor en Drosophila y otras especies 8,10,17,19,21-23.
La técnica de preparación mosca esbozado aquí es sólo un enfoque posible. En este método de preparación de la trompa está fijado en una posición extendida para facilitar el contacto del electrodo de registro con el sensillum de interés, y el electrodo de referencia se inserta en el animal. Otros métodos de preparación incluyen el montaje del animal a una bola de modelado de la arcilla y el uso de tiras delgadas decinta adhesiva para fijar la trompa 34. De hecho, siempre y cuando se cumplan los parámetros básicos de la estabilización del tejido y la colocación del electrodo de referencia, sensilla en otras localizaciones o de diferentes especies puede ser grabado desde casi de la misma manera. Por ejemplo, sensilla pierna puede ser grabado desde mediante la fijación del cuerpo de una mosca a un portaobjetos de microscopio Sylgard recubiertos con los pins de insectos finas, extendiendo las piernas por el borde de la copa ligeramente 35. Es posible administrar agentes farmacológicos para el sensilla a través del electrodo de registro para investigar la transducción de señales en las neuronas receptoras gustativas. Es simplemente una tarea de experimentación para determinar qué método funciona mejor para el resultado deseado.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca predoctoral 1F31DC012985 NRSA (RD) y por el NIH subvenciones a JC
Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Linnea Weiss por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito, el doctor Ryan Joseph para ayudar a compilar las cifras, y el Dr. Frederic Marion-Poll de asesoramiento técnico útil. También nos gustaría agradecer los útiles comentarios de cuatro colaboradores.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150X magnification with long working distance table mount stand |
| Antivibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
| Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5 ml serological pipette for extended range |
| Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5 mm diameter |
| Retort Stand | generic | ||
| Outlet Plastic Tube | generic, 1 cm diameter | ||
| Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
| 500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
| Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
| Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
| White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
| Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
| Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
| Insulated Electrical Wire | Generic | ||
| Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use LabView with NI-6251 |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
| Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10-40X magnification |
| Ice Bucket | Generic | ||
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
| 1 ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
| 10 ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
| Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |
References
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