Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Elektrofizyolojik Kayıt Published: February 26, 2014 doi: 10.3791/51355
Automatic Translation
1, 1, 1
1MCDB, Yale University

Summary

Bu protokol Drosophila labellar tat nöronlar tarafından ateş aksiyon potansiyel yanıtları hücre dışı kayıt açıklar.

Abstract

Böceklerin çevresel tat tepkisi güçlü elektrofizyolojik teknikler ile araştırılabilir. Burada anlatılan yöntem olup, araştırmacı böcek sinir sisteminin ortamında tat uyaranlara aldığı duyusal giriş yansıtan doğrudan ve kantitatif tat tepkilerini ölçmek için izin verir. Bu protokol, bu tekniği yerine getiren bütün önemli adımlar sıralanıyor. Bu tür gerekli ekipman ve kayıt için uygun bir ortam seçimi gibi bir elektrofizyoloji teçhizat, montaj kritik adımlar, çizilir. Biz de uygun başvuru ve kayıt elektrotları yaparak kayıt için nasıl hazırlanacağını tarif ve tat arttırıcı çözümleri. Ayrıntılı olarak proboscis hareketsiz kılmak için anında bir cam referans elektrotunun sokulması ile böcek hazırlanması için kullanılan bir yöntem tarif eder. Bir şeker ve acı bir bileşiğe karşılık olarak tat nöronların ateş elektrik darbeleri izlerini gösterir. Protokolün Yönleri t vardırechnically zorlu ve biz böyle sinyal veya sistemde aşırı gürültü olmaması ve olası çözümler olarak karşılaşılabilecek bazı ortak teknik zorluklar, geniş bir açıklama içerir. Tekniği gibi, geçici karmaşık uyaranlara teslim teslim uyaran hemen öncesinde ateş arka plan gözlemlemek, ya da uygun suda çözünmeyen tat bileşikleri kullanmak için yetersizlik olarak sınırlamaları vardır. Bu kısıtlamalara rağmen, (protokol başvurulan minör varyasyonlar dahil), bu teknik, bileşikler tat Drosophila nöron yanıtları kaydetmek için genel olarak kabul edilen prosedür bir standarttır.

Introduction

Tat duygusu bir böcek çözünen kimyasallar geniş bir yelpazede algılamasını sağlar ve bir besleyici maddenin kabulü önemli bir rol ya da bir zararlı veya toksik birinin reddi oynar. Tat da feromon 1-5 saptanması yoluyla, ortak seçiminde bir rol oynadığı düşünülmektedir. Bu önemli ve farklı fonksiyonları duyu sistemleri çevresel ipuçları uygun bir davranış çıkışlara çevirmek nasıl içine böcek tat alma sistemi soruşturmanın zorlayıcı bir hedef haline gelmiştir.

Drosophila melanogaster tat sisteminin temel birimi tat saç veya Sensillum olduğunu. Moleküller ucu 2,6 bir gözenek yoluyla Sensillum girin. Sensilla labellum, bacak, kanat marjı ve farenks 6 bulunur. Labellum üzerine, Sensilla sayısı ve konumu streotiplenmiştir. Uzun (L), ara madde (I) ve kısa (S: Üç morfolojik uzunluğuna göre Sensilla sınıfları vardır ) 7,8 Sensilla. Her iki Sensillum (I-tipi) veya dört (L-ve S-tipi) tat reseptör nöronları (GRNs) 9 ya içerir. Farklı GRNs tat uyaranlara farklı kategorilerde cevap: acı, şeker, tuz ve osmolaritesi 7,10 ve tat reseptörlerinin 8,11-13 farklı alt grupları ifade eder. Sadece I ve S-tipi Sensilla acı-duyarlı GRNs 8,10 içerir. Subesophageal ganglion (SOG) ve lezzet molekülleri ile bunların aktivasyon için GRNs Proje, davranış yanıtı 6 ile sonuçlanan, kod çözme için daha yüksek bir merkezi sinir sistemine iletilir. Nöronlar, nispeten az sayıda ve moleküler ve davranışsal analiz amenability Drosophila tat sistemi genel olarak tat sistemlerinin araştırılması için mükemmel bir model olun. Sistem genetik mutasyona veya GAL4-UAS sentezleme sistemi ile manipüle edilebildiği nispeten kolay olması, aynı zamanda, bir değerli bir araç 14,15 olarak hizmet vermektedir.

Bu Sensilla labellum yüzeyinden çıkıntı için "ontent>, bunlar elektrofizyoloji için mükemmel bir hedef yapmak. GRNs ait ateşleme hücre dışı kayıt kullanılarak izlenebilir. Tarihsel olarak, içine yerleştirilen bir cam elektrod kullanarak yan duvar kayıt yöntemi, Sensillum nöronal aktivitenin kaydetmek için, 26 kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yöntem gerçekleştirmek için teknik olarak zor ve uzun her preparattan kayıt yapmak zordur. bir elektrotla nöronların tepkisini ölçer ucu kayıt yöntemi, bu eş zamanlı olarak, bir tat yoğunluğu arttırıcı maddeyi sunar, bu yana seçim 9,16 göre bir yöntem haline gelmiştir. O Drosophila melanogaster 8,10,17,18 tadı sisteminin yanı sıra diğer böcek türleri 19-23 bir dizi araştırmak için kullanılmıştır. O sahiptir büyük ölçüde telafi tarafından uç-kayıt yönteminin önemli sakıncaları biri üstesinden tastePROBE amplifikatör gelişimi ile kolaylaştırıldıGRN aksiyon potansiyelleri aşırı amplifikasyonu ya da filtre 24 olarak kaydedilmiş izin veren referans elektrot ile böcek Sensillum arasında büyük bir potansiyel farkı. Bir diğer önemli gelişme kaydederken elektrolit 25 olarak trikolin sitrat kullanımı oldu. TCC ozmolaritenin duyarlı GRN yanıtlarını bastırır ve 25 analiz etmek çok daha kolay acı ve şeker tat yoğunluğu arttırıcı tarafından oluşturulan yanıtları yapma, tuz-duyarlı GRN teşvik etmez.

Burada Drosophila labellar Sensilla ucu kayıt anda Carlson laboratuvarda yapılır anlatacağız. Bu protokol, uygun bir elektrofizyoloji nasıl sinek hazırlamak için teçhizat, ve nasıl tat kayıtları gerçekleştirmek için nasıl kurulacağını anlatacağım. Bu kullanırken Biz de Drosophila Sensilla altkümelerinden yanı sıra bazı ortak sorunlar ve karşılaşılabilecek olası çözümleri kayıt sonucu elde edilen bazı temsilci veri mevcuttekniği.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Aşağıdaki protokol Yale Üniversitesi'nin tüm hayvan bakım kurallarına uygundur.

1.. Reaktifler ve Ekipmanları Hazırlık

  1. Kayıt ekipman kurulumu (Şekil 1A).
    1. Sıcaklık veya nem büyük farklılıklar ücretsiz ve aynı zamanda buzdolabı ve santrifüjler gibi elektriksel ve mekanik gürültü kaynaklarından izole olan teçhizat kurulumu için bir oda seçin.
      Şekil 1
      Şekil 1. Kayıt teçhizat kurulumu (A) genel bakış. Stereomikroskopta (a) mikromanipülatörler ile, (b). Referans elektrot tutucu (c) headstage (d) karşısında bir platform üzerine monte edilmiş bir anti-vibrasyon platform üzerine monte edilir. Sinek hazırlanması yönelik, nemlendirilmiş hava akımı sağlayan bir çıkış, plastik boru (e) t monte edilirplatformu diye. Headstage bir PC (h) ile bağlanan, dijital kazanım sistemi (DAS) (g), bağlanan bir amplifikatör (f), bağlanır. Elektrotlar ve çıkış borusu (B) Yapılandırma:. Referans soldaki elektrot, sağda kayıt elektrot ve sinek hazırlık yönelik hava akımı çıkış borusunun büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
    2. Anti-titreşim tablo veya platformun merkezine Dağı stereomikroskopta.
    3. Manyetik bantları kullanarak sırasıyla mikroskop sağında ve solunda, referans elektrot / böcek hazırlanması ve headstage / kayıt elektrot için mikromanipülatörler takın.
    4. Tüp açma sinek hazırlık yere doğru işaret edilmektedir şekilde odaklı mikroskop arka, (Şekil 1B bakınız) üçüncü micromanipulator Mount çıkış plastik tüp.
    5. At, esnek plastik boru kullanılarakkısmen su ile dolu bir vakum şişeye tako çıkış plastik boru. Sinek doğru çıkış plastik tüpü boyunca nemli bir hava akımının üretilmesi, şişe içinde su ile kabarcık havaya küçük bir akvaryum pompası bağlayın.
    6. Doğrudan hazırlanması aşağıda beyaz kart bir kağıt parçası aracılığıyla ışığı yansıtarak hazırlık aydınlatmak için çıkışlarını yönlendirme titreşim masadan Dağı fiber optik ışık kaynağı. Işık kaynağı masanın üzerinde dinlenmek değil emin olun. Not: Bir kağıt disk üzerindeki ışık kaynağı yansıtma faydası iki yönlüdür: görselleştirmek için Sensilla kolaylaştırarak, kontrastı artırır ve doğrudan ışıktan neden olacaktır hazırlık ısınmayı önler.
    7. Tedarikçi kılavuzuna göre, dijital kazanım sistemi (DAS) ve bir kişisel bilgisayara DAS içine tastePROBE amplifikatör takın. Ayak pedalı tetiği Tak ve çalışma altında düzenlemek. Not: Elektrikle izole duvar amplifikatör için priz ve DAS derece Desir vardıredebiliyoruz.
    8. Elektrikle timsah klipleri ve yalıtımlı elektrik teli ve elektrik bandı uzunlukları kullanarak tabloya metal parçaları bağlayarak mikroskobu, mikromanipülatörler ve ışık kaynağı zemin. Elektriksel zemin veya güç kaynağı fişi ile topraklanır DAS, bina bağlayarak metal bir platform zemin.
    9. Kişisel bilgisayarda tercih DAS için uygun toplama yazılımı yükleyin. Not: Dijital edinme sürücüleri PC'de işletim sistemi ile uyumlu olduğundan emin olun.
    10. Yazılım amplifikasyon (10-100x) yapılandırın, sinyal filtreleme, ve örnekleme hızı (en az 10 KHz) (tipik bir Bessel bant geçiren filtre 100 Hz-3, 000 Hz arasında ayarlanabilir). Not: tat nörondan sinyal genlikleri 0.5-2 mV aralığında genellikle, bu yüzden ekran ölçek onların görselleştirme kolaylaştırmak için ayarlanır. Not: 100 Hz filtresi dışarıdan gelen elektriksel gürültü çıkarmak için yardımcı olur, ancak sivri şeklini değiştirir ve gelişmiş başak sıralama mor yapabilirsinize zorlu. Alternatif olarak, 1 Hz filtre kullanılabilir.
    11. İsteğe bağlı olarak, bir Faraday kafesi bütün titreşim masa etrafında kurulabilir. Bununla birlikte, küçük bir alüminyum folyo levhalar genellikle dış çevre ya da araştırmacı tarafından üretilen herhangi bir gürültü azaltmak için yeterlidir.
  2. Cam Elektrot Hazırlanması
    Şekil 2,
    Şekil 2. Referans ve kayıt elektrotlar. (A) ile, referans elektrot içine çekti cam kılcal damarların büyütme altında ve kırık (B) ucu olmadan Fotoğraf ve kayıt elektrot (C). Beyaz bar 2 mm'yi temsil eder. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
    1. Başvuru çekinBir pipet çektirmenin aleti kullanarak bir cam kılcal elektrot. Not: pipet çektirmenin programının kesin ayarlar cihazdan cihaza değişir. Çok uzun bir kademeli konik ulaşmak için çalışın. Bununla birlikte, yeterli izin vermeyen, elektrotun konik uzunluğunun çapı ne çok ince olduğundan emin olmak, uç sinek hazırlanması (Şekil 2A ve 2B) daha önce kırılacak çünkü ucundaki gözenek boyutu önemli değildir tat nöronlara zarar veya tükürük bezleri delinebilir labellum immobilizasyonu, ne de çok büyük.
    2. Bir pipet çektirmenin enstrüman kullanarak teli olan bir borosilikat cam kılcal kayıt elektrot çekin. Referans elektrotunun daha sığ olan bir konik ve yaklaşık olarak 10-15 um (Şekil 2C) 28 arasında bir gözenek çapına elde deneyin.
  3. Tat yoğunluğu arttırıcı madde çözeltiler hazırlanması
    1. Mübaşir-Ephrussi Ringer Solu kullanıntion (B & D) referans elektrot elektrolit olarak. B ve E bir litre için, 7.5 g NaCl, 0.35 g KCI ve 0.279 g CaCl çözülür 2 ∙ ultra saf bir litre su içinde 2H 2 O. -20 ° C'de küçük alikotları saklayın
    2. Acı veya şeker GRN tepkileri ölçülecek ise, kayıt elektrot elektrolit ve tat arttırıcı çözümler için 25 çözücü olarak 30 mm trikolin sitrat solüsyonu (TCC) kullanın. Su hücrenin yanıtlar için, alternatif olarak, 1-3 mM potasyum klorür solüsyonu kullanılabilir.
    3. Tat yoğunluğu arttırıcı madde çözüm için, toz biçiminde tat yoğunluğu arttırıcı madde uygun miktarda tartmak ve bir başlangıç ​​stok konsantrasyonu için TCC ekleyin. Test için istenen konsantrasyonu elde etmek üzere, bu ilk stoğundan seri dilüsyonları için kullanın. Not: tat yoğunluğu arttırıcı madde, su içinde kolaylıkla çözülür yoksa, örneğin etanol gibi bir solvent, başlangıç ​​stok konsantrasyonu için kullanılabilir. Uygun bir kontrol TTK çözümü ve tat yoğunluğu arttırıcı olmadan çözücüBu durumda kullanılmalıdır.
    4. -20 ° C'de saklayın tümbölenleri uzun vadeli Tat yoğunluğu arttırıcı madde ve kimyasal özelliklerine bağlı olarak, en fazla bir hafta kullanım kayıt boyunca 4 ° C 'de, bir tat yoğunluğu arttırıcı madde çözeltisinin bir çalışma kısım saklayın.

2.. Drosophila Hazırlık

Şekil 3,
Şekil 3,. Kayıt için sinek hazırlanması. Sineği dorsal toraksa referans elektrotunun (A) ekleme konumu. Beyaz ok referans elektrodu gösterir. (B) referans elektrot Ara pozisyon: boyun ve kafa ile gelişmiş, hortum henüz genişletilmiş değil. (C, D) labellum iç elektrot ucu ve hortum ile son konumda bir referans elektrot uçuntamamen uzatılmış. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

  1. Sıcaklık ve nem kontrollü koşullar altında yetiştirilen bakımlı sinek kültürleri, kayıt için yeni eclosed sinekleri toplayın, ve kaydetmeden önce taze kültür şişeleri 5-10 gün onları yaş.
  2. Sinek hazırlamadan önce 15-30 dakika boyunca buz üzerinde mikroskop plaka Chill.
  3. Nazikçe Dolgu Cam referans böyle bir spinal iğne ve 1 ml şırınga olarak 0.5 mm çapında uzun, ince bir plastik iğne kullanılarak B & E çözeltisi ile elektrot ve herhangi kabarcıkları dışarı dokunun. Forseps kullanarak kapalı ucu küçük bir miktar kırmak ve diseksiyon mikroskop altında gözlemleyerek, bir doku ile geriye kalan tüm kabarcıklar çekmek için kılcal eylemi kullanabilirsiniz.
  4. Slide B & hava kabarcıkları tanıtmak için özen, referans elektrot tutucu tel üzerine referans elektrodu E-doldurdu.
  5. Aspire inşa sinek aspiratörü kullanarak, bir P200 pipet içine sinekborudan, örgü, ve pipet ucu, 30-60 saniye boyunca buz kovası ve soğuk 29 yer.
  6. , Buz mikroskop plakasını sökün nemi silin, ve mikroskop altında pozisyon. Yavaşça mikroskop tabağa pipet uçup dokunun.
    Not: sinek yeterli kolayca manipüle hareketsiz olmalıdır.
  7. Forseps diğer çifti ile toraks kararlı tutarken düşük büyütme altında, yavaşça, forseps bir çift ön ayaklarını kaldırın. Dorsal yüzü yukarı bakacak, ventral tarafta sinek yerleştirin. Not: Her zaman mekanik hasarı en aza indirmek için hazırlık sürecinde her zaman forseps ile labellum dokunmamak için dikkatli olun.
  8. Forseps bir çift ile yerde sinek tutarken, posterior dorsal toraks ve orta hatta referans elektrodu takın. Giriş önerilen bir açı baş (Şekil 3A) yönünde yaklaşık olarak kırk beş derecedir.
  9. Referans elektrodu sabitlemeksinek yüksek büyütmede mikroskop altında görünür olduğu şekilde modelleme kil ile e yeri. Forseps iki çift kullanarak referans elektrot tutucuya doğru sinek kaydırarak, boyun ve kafa ile cam elektrot Manevra ve açı. Not: hızlı ama düzgün çalışır; sineği hala soğuk (Şekil 3B) den hareketsiz iken bu adımı tamamlamak için daha kolaydır.
  10. Ayrıca cam referans elektrot aşağı sinek kayarken elektrot ucu labellum içinde ve hortum tam (Şekil 3C ve 3D) genişletilmiş kadar Yavaşça, forseps bir çift burnumun uzatmak. Not: Bu sinek zarar verebilir ve / veya nöronlar tat ve kayıt kalitesini etkileyebilir gibi, hortum dokusunun herhangi bir bölümünü delinme veya referans elektrodu ile labellum kenarını gerilmek için değil dikkat edin.

3. Labellar Sensilla itibaren kayıt


Yüksek büyütme altında sağda temas için hizalanmış kayıt elektrot ile soldan sinek hazırlanması Şekil 4. Sinek kaydı. (A) labellum. (B) kayıt elektrot ve yüksek büyütme altında temas labellum üzerinde tek Sensillum. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

  1. Önce her zaman kayıt işlemi sırasında herhangi bir ekipman dokunmadan titreşim tablo veya platform metal yüzeye dokunarak kendinizi topraklayın! Not: O devrelerine zarar verebilir gibi Headstage statik yükü teslim etmek son derece önemlidir.
  2. Micromanipulator Güvenli referans elektrot tutucu recordin hava masaya monte edilmişg kulesi. Yüksek büyütmede (tipik olarak en az 140x) altında mikroskop görüş alanında labellum konumu bir lob, ve nemlendirilmiş hava akımı doğrultusunda.
  3. Nemlendirilmiş hava akımı, bilgisayar, DAS, ve amplifikatör açın. Açık kazanım yazılım.
  4. Durulayın ve istenilen tat yoğunluğu arttırıcı cam kayıt elektrodu doldurun.
    1. Tüpün en az on kat ile az miktarda su çekmek için bir şırınga ve plastik boru 28 kullanılarak saf su ile cam kayıt elektrodu durulayın.
    2. Tat yoğunluğu arttırıcı ile en az beş defa kayıt elektrodu durulayın. Yaklaşık üçte biri tat yoğunluğu arttırıcı ile yarıya kadar dolu kayıt elektrodu doldurun ve tüp kaldırmak. Hava kabarcıkları varsa, serbest ya da sadece elektrot dolum dokunun.
    3. Hava kabarcıkları tanıtmak için değil çok hızlı ve sorunsuz headstage gümüş tel üzerine elektrot kaydırın.
  5. Tat yoğunluğu arttırıcı madde dolu kayıt elektrot ile tek Sensillum uyarır.
    1. Micromanipu kullanınilgi Sensillum ile uyumlu kayıt elektrodu getirmek lator.
    2. Amplifikatör satın alma moduna tetiklemek için ayak pedalına basın.
    3. Bu Sensillum ve kayıt başlar ucu ile temas edinceye kadar dikkatlice micromanipulator ince kontrol düğmesi ile kayıt elektrodu ilerlemek.
    4. 1-2 sn sonra elektrodu sökün.
    5. Eğer arzu edilirse, diğer Sensilla ile adım 3.5 tekrarlayın. Not: aynı Sensillum sunumlar arasında en az 1 dakika bekleyin. Zaman uzun bir süre için tek bir tat yoğunluğu arttırıcı ile kayıt varsa, tat yoğunluğu arttırıcı çözüm kuruyabilir ve ucu çözümü daha fazla konsantre olabilir. Bu hafifçe kılcal eylem tarafından sıvı küçük bir miktar kaldırmak için pürüzsüz kağıt, cam elektrot ucu temas çözülebilir.
  6. , Başka bir tat yoğunluğu arttırıcı yanıtlarını kaydetmek durulayın ve yeni tat yoğunluğu arttırıcı ile yük kayıt elektrot ve adım 3.4 tekrarlayın. Not: iyice tat yoğunluğu arttırıcı arasındaki elektrot durulama absÇapraz bulaşmayı önlemek için olutely önemlidir.
  7. Tarih, genotip ve tat yoğunluğu arttırıcı olarak bilgiyi belirleme ile periyodik veri dosyaları kaydedin. Not: Bu veri analizi için oturum kayıt sırasında tat yoğunluğu arttırıcı ve her sunum Sensillum kimliğinin yazılı kaydını tutmak için önemlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 5A, bir şeker, sakaroz bir L Sensillum tepkisini gösterir. Aynı Sensillum acı bir bileşiğine cevap vermez, berberin. Şekil 5B, bir acı duyarlı nöron ihtiva eden bir I tipi Sensillum, berberin yanıt olarak büyük genlik sivri ve sakaroz tepki olarak daha küçük bir amplitüd sivri görüntüler gösterir. I TCC esasen hiçbir karşılık vermez (Şekil 5) göstermek Sensilla ise L, çözücü kontrol, TCC için minimal arka plan yanıt görüntülemek Sensilla. Labellar GRNs tuz ve su tepkiler üzerine daha fazla bilgi için, Hiroi 10 bakın.

Şekil 5,
Şekil 5,., Vahşi tip Drosophila labellar cevapların Örnek izleri (A) L sensillu 100 mM sükroz (SUC), 1 mM berberin (BER) ve 30 mM TTK. (B) m tepki ben SUC'ye, BER ve TTK tepki sensillar. Ok ucu, her kaydın başında gerçekleşir temas objeyi gösterir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 6,
Şekil 6.. Temsilcisi bırakıyorsa elektrofizyolojik sonuçları. (A) sinyalinin tam eksikliği (B) 50/60 Hz "gürültü" (C) stokastik gürültü (D) tek başına (E) acı GRN (açık üçgenler) ve mechanosensory nöronu (ateş mechanosensory nöron pişirim hem de üçgenler) doldurdu./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig6highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Labellar Sensilla bağlı morfolojik organizasyonu ve anatomik farklılıklara kayıt kolaylığı değişir. Bazen bir Sensillum, herhangi bir tat yoğunluğu arttırıcı olumlu bir yanıt ortaya çıkarmak için bilinen bir tane bile yanıt vermiyor. Bu durumda sıklığı, Sensillum türüne bağlı olarak değişir. L Sensilla en tutarlı duyarlı ve nedeniyle uzunluğa erişmek için nispeten kolaydır. Genel olarak, S Sensilla sürekli duyarlı olan, ancak kısa boyu ve labellum pozisyon iyi temas zorlu hale. I preparatın açısına bağlı olarak, daha kolay erişilebilir Sensilla, ancak daha sık yanıt vermiyor. Herhangi bir sinek hazırlanması, ben Sensilla büyük bir oranı L veya S Sensilla daha tepkisiz olabilir. Genetik arka plan hem de tat yanıtların tutarlılığını etkileyebilir. Transgenlerin GE etkiler muhtemelen çünkü Örneğin, bir transgenik sinekleri, yabani-tipten daha az tutarlı yanıtları görüntüleyebilirsinek neral sağlık. Mutant sinekler özellikle kayıt için zorlu - Biz w olduğunu gözlemledik.

Hiçbir sivri (Şekil 6A) gözlenir, yani ortak bir teknik sorun, sinyal bir eksikliğidir. Aynı anında aynı sınıfın diğerleri yanıt olurken Birincisi, bazen belirli bir Sensillum, tepkisiz olabilir. İkinci olarak, bir kayıt elektrotu veya referans elektrotu bir hava kabarcığı olabilir. Kayıt elektrot şüphesi varsa, bu sadece kaldırma ve cam elektrot dolumu, hafifçe dokunarak ve hava kabarcığı mevcut olduğundan emin olmak için büyütme altında incelenerek tespit edilebilir. Referans elektrot, yeni bir sinek ile hazırlık remaking, bir hava kabarcığı içeren şüphesi varsa, bu sorunu gidermek için en kolay yoludur. Üçüncü olarak, bazen elektrik sinyalini taşıyan telleri sıkıca bağlı olabilir. Dördüncü olarak, zaman zaman alınan voltaj sinyali daha yüksek veya daha düşük ya olabiliramplifikatör ölçebilirsiniz aralığı. TastePROBE amplifikatör kullanıyorsanız, klip yukarı veya gösterge ışığı aşağı klip ya da üzerinde olup olmadığını görmek için kontrol edin. Klip up gösterge ışığı yanıyorsa yarıya daha fazla değil doldurmak için özen ve nemin giderilmesi için dışını silerek sorunu çözmek olurken, sık sık, kaldırma ve cam referans elektrot dolumu. Cam elektrodun dış nem yükselticinin aralık dışında sinyal göndererek, elektrot ve telin metal kasa arasında bir elektrik bağlantısı yaratabilir. Bu sorunu, ya da klip aşağı gösterge ışığı çözmek için başarısız olursa üzerine, sistemdeki elektriksel gürültü ile mücadele için aşağıdaki paragrafta önerileri dikkate almaktadır. Beşinci olarak, bazen bir sinek hazırlanması sırasında ölmek ya da müstahzarın sağlıklı görünümüne rağmen aksi tepkisiz olabilir. Bu tür nem, sıcaklık, yaş, gıda kalitesi ve mikrobiyota, hem de daha az sağlıklı genetik arka planı olarak büyüme koşulları, daha yüksek bir katkıda bulunabilir"tepkisiz" Sineklerin oranı. Son olarak, nadiren, bir ekipman parçası işlevsiz olabilir. Headstage, amplifikatör ve sayısallaştırıcıya: sinyal sürekli elde edilmemesi ve bütün diğer olasılıklar tüketildi varsa, her bir donanım parçasının işlevselliğini araştırmak için gerekli olabilir. Bunu yapmanın en kolay yolu, işlevsel olduğu bilinen bir teçhizat gelen başka bir ekipmanın değiştirmektir. Sadece bir kulesi bir laboratuarda varsa, bir sinyal oluşturucu elektronik bileşenlerin işlevselliğini sınamak için kullanılabilir.

Başka bir yaygın bir teknik sorun, bir tat uyarıcı (Şekil 6B-E) yanıt olarak ateş nöronal aksiyon potansiyelleri temsil görünmüyor gözlenen bir sinyal "gürültü" olmasıdır. İlk olarak, sinyal yakındaki kayıt cihazları veya diğer ekipmanların (Şekil 6B) 50/60 Hz elektrik gürültüye neden olabilir. Referans elektrot üzerinde uçuşa, direktly Ringer solüsyonu bir damla yoluyla kayıt ve referans elektrotlar bağlayıp yukarı düğmesine basarak amplifikatör geçidi moduna girin. Gürültü sinyalinin geçidi üzerinde gözlenebilir ise, bu olasılıkla gürültü sinek hazırlanması dışında olduğu anlamına gelir. Tüm teçhizat ekipman doğru topraklanmış ve kalay folyo kalkanlar yerdesiniz emin olun. Gürültü elimine olup olmadığını görmek, ya da ek bileşenler kalkan yakın ekipmana sökmeyi deneyin. İkincisi, gürültü stokastik (Şekil 6C) görünebilir. Bu durumda, 50/60 Hz gürültü için ayrıntılı adımlar yine de yapılmalıdır. Ayrıca, kayıt cihazının farklı bileşenleri, özellikle headstage ve / veya amplifikatör çıkarmadan veya değiştirmeyi deneyin. Elektrotlar doğrudan bağlı olduğunda herhangi bir gürültü gözlenmiştir, kaynak olasılıkla sinek hazırlanması kendisidir. Bu sineğe zarar en aza indirmek için bakımı, kayıt için yeni bir sinek hazırlamak için genellikle basit değildir. Üçüncü olarak, aktivasyonSensillum içinde bulunan mechanosensory nöronun (Şekil 6D ve 6E) gözlenebilir. Sensillum bükülmesi ya da kayıt elektrot uygulanması üzerine bükülmüş ya da temas sırasında, bombeli ise mechanosensory nöron etkinleştirilebilir. Ani kendi düzensiz desen tarafından kimyasal duyusal sivri genellikle ayırt genellikle mekanik bozulma değil, bir tat uyaran uygulama ile koordineli göründüğü. Mechanosensory ateşleme Sensillum ile kayıt elektrodu hizalayarak ve Sensillum ucuyla temas yapmak için gerekli olduğu gibi sadece kadar yavaşça ilerleyen minimize edilebilir. Dördüncü olarak, "patlama" stokastik başak gözlemlenebilir, bu nöronal ateşleme benzer görünür, fakat yüksek frekans ve amplitüdü olan, bir uyarıcı tepki olarak koordineli değildir. Bu genelde donanımları, sinek hazırlık kendisinden sonuçları ve referans elektrot tarafından bozulan sinir nedeniyle olabilir. </ P>

Üçüncü ortak teknik bir sorun hazırlık labellum bir Sensillum zor ile bağlantı yapar, hareket neden cep olmasıdır. İlk olarak, sinek hazırlık kararsız olabilir. Referans elektrot doğru yerleştirildiğinden emin olun ve gerekirse yeniden ayarlayın. İkincisi, referans elektrot burnumun ve labellum hareketsiz tutmak için ucunda çok ince olabilir. Sinek hazırlamadan önce ucu uzun bir miktar kopma sahipsiniz. Yeterli değilse, referans elektrotunun şeklini değiştirmek için gerektiği gibi, pipet çekici ayarlarını, şev daha kademeli ve çapı hafifçe artar öyle ki. Üçüncü olarak, sinek alışılmadık aktif olabilir. Yeni bir sinek ile hazırlık Remake.

Genel elektrofizyoloji bilgi ve daha fazla sorun giderme rehberlik için, Akson Kılavuz 30 bakın.

Bu publicat belirtilen uç-kayıt yöntemiyle birkaç sınırlamalar vardıriyon. Tek sınırlama, elektrolit ile birlikte bir kayıt elektrotu teslim olduğu gibi tat yoğunluğu arttırıcı madde, suda çözünür olmasıdır. DMSO gibi bir çözücünün kullanılması mümkün feromon 4 ile bazı kayıt yapılmış olmasına rağmen, bu, hidrokarbon bileşikleri ile kayıt zorluk artar. Alternatif yaklaşımlar Sensillum soket tabanından kayıtları gerçekleştirmek için keskin bir tungsten elektrot kullanarak, ya da tat yoğunluğu arttırıcı madde bir kayıt elektrotu bağımsız olarak teslim her ikisi de, Sensillum yan duvarından kayıt yapmak için bir cam elektrot kullanmak için olan 26,27. Ancak, bu teknikler zorlu ve yan duvar kayıtları tadı organa daha zararlı olan. Başka bir sınırlama hacmini azaltır tat yoğunluğu arttırıcı madde solüsyonu (Protokol adım 3.3), alışverişi için gereken zaman miktarıdır ve genellikle koku kayıtlarında görülen karmaşık uyarıcı paradigmaların kullanımını sınırlar. Tat reseptör nöronlar değişkenlik gösterirlergenlik bu başak frekansına bağlıdır. Bu özellik, nöronal kimlik değerlendirmesini karmaşık ve gelişmiş başak 25,31-33 daha zor sıralama yapabilirsiniz. Yaygın koku kayıtları yapılır Buna ek olarak, çünkü uç-kayıt yönteminin doğasının bir, hemen önce bir uyaranın teslim bazal ateş kayıt olamaz. Bu dezavantajları rağmen, tip-kayıt yöntemi başarılı bir şekilde Drosophila ve diğer türler 8,10,17,19,21-23 tat kodlama ilkeleri birçok aydınlatmak için kullanılmıştır.

Burada özetlenen sinek hazırlama tekniği sadece olası bir yaklaşımdır. Bu hazırlama yöntemi olarak hortum ilgilenilen Sensillum ile kayıt elektrot temas kolaylaştırmak için uzun bir pozisyonda sabitlenir, ve referans elektrotu, hayvana sokulur. Diğer hazırlama yöntemleri modelleme kil bir topu hayvanın montaj ve ince şeritler kullanımını içerirburnumun 34 düzeltmek için bant. Gerçekten de, uzun doku stabilizasyonu ve referans elektrot yerleştirme temel parametreleri karşılandığı gibi, başka yerlerde ya da farklı türlerden Sensilla çok aynı şekilde kaydedilebilir. Örneğin, bacak Sensilla hafifçe 35 camın kenarından bacaklarını eğimlendirme, ince böcek iğneli bir Sylgard kaplı mikroskop lamı bir sineğin vücudunu sabitleme tarafından kaydedilebilir. Bu tat reseptör nöronlarda sinyal transdüksiyonunu araştırmak için bir kayıt elektrotu ile Sensilla için farmakolojik maddelerin verilmesi mümkündür. Bu sadece istenen sonuç için en iyi hangi yaklaşım belirlemek için deney bir görevdir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma (RD) bir NRSA predoctoral hibe 1F31DC012985 tarafından ve JC NIH hibe tarafından desteklenen

Biz yardım derleme rakamlar için el yazması, Dr Ryan Joseph yararlı yorumlar için Dr Linnea Weiss teşekkür etmek istiyorum, ve yardımcı teknik danışmanlık için Dr Frederic Marion-Anket olacaktır. Biz de dört yorumcular yararlı yorumlar kabul etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo Zoom Microscope Olympus SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 capable of ~150X magnification with long working distance table mount stand
Antivibration Table Kinetic Systems BenchMate2210
Micromanipulators Narishige NMN-21
Magnetic stands ENCO Model #625-0930
Reference Electrode Holder Harvard Apparatus ESP/W-F10N Can be mounted on 5 ml serological pipette for extended range
Silver Wire World Precision Instruments AGW1510 0.3-0.5 mm diameter
Retort Stand generic
Outlet Plastic Tube generic, 1 cm diameter
Flexible Plastic Tubing Nalgene 8000-0060 VI grade 1/4 in internal diameter 
500 ml Conical Flask generic, with side arm
Aquarium Pump Aquatic Gardens Airpump 2000
Fiber Optic Light Source Dolan-Jenner Industries Fiber-Lite 2100
White Card/Paper Whatman 1001-110
Digital Acquisition System Syntech IDAC-4 Alternative: National Instruments NI-6251  
Headstage Syntech DTP-1 Tasteprobe
Tasteprobe Amplifier Syntech DTP-1 Tasteprobe
Alligator Clips Grainger 1XWN7 Any brand is fine
Insulated Electrical Wire Generic
Gold Connector Pins World Precision Instruments 5482
Personal Computer Dell Vostro Check for compatibility with digital acquisition system and software
Acquisition Software Syntech Autospike Autospike works with IDAC-4; alternatively, use LabView with NI-6251
Aluminum Foil and/or Faraday Cage Electromagnetic noise shielding
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Pipette Puller Sutter Instrument Company Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller
Beadle and Ephrussi Ringer Solution See recipe in protocol section
Tricholine citrate, 65%  Sigma T0252-100G
Stereomicroscope Olympus VMZ 1x-4x Capable of 10-40X magnification
Ice Bucket Generic
p200 Pipette Tips Generic
Spinal Needle Terumo SN*2590
1 ml Syringe Beckton-Dickenson 301025
Fly Aspirator Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh
Modeling Clay Generic
Forceps Fine Science Tools By Dumont 11252-00 #5SF (super-fine tips)
10 ml Syringe Beckton-Dickinson 301029
Plastic Tubing Tygon R-3603

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glendinning, J. I., Jerud, A., Reinherz, A. T. The hungry caterpillar: an analysis of how carbohydrates stimulate feeding in Manduca sexta. The Journal of experimental biology. 210, 3054-3067 (2007).
  2. Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139, 234-244 (2009).
  3. Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
  4. Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell reports. 1, 599-607 (2012).
  5. Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
  6. Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a review. Cell and tissue research. 275, 3-26 (1994).
  7. Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoological Science. 19, 1009-1018 (2002).
  8. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The Molecular and Cellular Basis of Bitter Taste in Drosophila. Neuron. 69, 258-272 (2011).
  9. Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. Journal of Morphology. 150, 327-341 (1976).
  10. Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 61, 333-342 (2004).
  11. Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science (New York, N.Y.). 287, 1830-1834 (2000).
  12. Cameron, P., Hiroi, M., Ngai, J., Scott, K. The molecular basis for water taste in Drosophila. Nature. 465, 91-95 (2010).
  13. Croset, V., et al. Ancient protostome origin of chemosensory ionotropic glutamate receptors and the evolution of insect taste and olfaction. PLoS Genet. 6, e1001064 (2010).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development (Cambridge, England). 118, 401-415 (1993).
  15. Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36, 288-292 (2004).
  16. Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science (New York, N.Y.). 122, 417-418 (1955).
  17. Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56, 503-516 (2007).
  18. Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67, 555-561 (2010).
  19. Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45, 871-876 (1999).
  20. Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 7281-7287 (2002).
  21. Sanford, J. L., Shields, V. D., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Die Naturwissenschaften. 100, 269-273 (2013).
  22. Merivee, E., Must, A., Milius, M., Luik, A. Electrophysiological identification of the sugar cell in antennal taste sensilla of the predatory ground beetle Pterostichus aethiops. J Insect Physiol. 53, 377-384 (2007).
  23. Popescu, A., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. Journal of comparative physiology. A, Neuroethology. 199, 403-416 (2013).
  24. Marion-Poll, F., Der Pers, J. V. an Un-filtered recordings from insect taste sensilla. Entomologia Experimentalis et Applicata. 80, 113-115 (1996).
  25. Wieczorek, H., Wolff, G. The labellar sugar receptor of Drosophila. J. Comp. Physiol. A. Neuroethol Sens. Neural Behav. Physiol. 164, 825-834 (1989).
  26. Morita, H. Initiation of spike potentials in contact chemosensory hairs of insects. III. D.C. stimulation and generator potential of labellar chemoreceptor of calliphora. Journal of cellular and comparative physiology. 54, 189-204 (1959).
  27. Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2, e661 (2007).
  28. Benton, R., Dahanukar, A. Electrophysiological recording from Drosophila taste sensilla. Cold Spring Harbor protocols. 2011, 839-850 (2011).
  29. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. , e1725 (2010).
  30. Axon Instruments. The Axon Guide for Electrophysiology & Biophysics Laboratory Techniques. , (1993).
  31. Fujishiro, N., Kijima, H., Morita, H. Impulse frequency and action potential amplitude in labellar chemosensory neurones of Drosophila melanogaster. Journal of insect physiology. 30, 317-325 (1984).
  32. Marion-Poll, F., Tobin, T. R. Software filter for detecting spikes superimposed on a fluctuating baseline. Journal of neuroscience. 37, 1-6 (1991).
  33. Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem Senses. 28, 671-679 (2003).
  34. Marion-Poll Lab Website. , Available from: http://taste.versailles.inra.fr/fred (2013).
  35. Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 56, 139-152 (2003).

Tags

Nörobilim Sayı 84, Böcek tat nöron elektrofizyoloji labellum hücre dışı kayıt labellar tat Sensilla
Elektrofizyolojik Kayıt<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Sensilla Taste
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Delventhal, R., Kiely, A., Carlson,… More

Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla. J. Vis. Exp. (84), e51355, doi:10.3791/51355 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter