Summary
Dit protocol beschrijft extracellulaire van de actiepotentiaal reacties afgevuurd door labellar smaak neuronen in Drosophila.
Abstract
De perifere smaak respons van insecten kan krachtig worden onderzocht met elektrofysiologische technieken. De hier beschreven methode kan de onderzoeker naar smaak reacties en kwantitatief te meten, als gevolg van de zintuiglijke input dat het zenuwstelsel van een insect ontvangt van smaak prikkels in zijn omgeving. Dit protocol beschrijft alle belangrijke stappen in het uitvoeren van deze techniek. De kritische stappen in het samenstellen van een elektrofysiologie rig, zoals de keuze van de benodigde apparatuur en een geschikte omgeving voor het opnemen, worden afgebakend. We beschrijven ook hoe voor te bereiden voor het opnemen door het maken van de juiste referentie en registrerende elektroden en tastant oplossingen. We beschrijven in detail de werkwijze voor het bereiden van de insecten door insertie van een glazen referentie-elektrode in de vlieg om de slurf immobiliseren. We tonen sporen van de elektrische impulsen afgevuurd door smaak neuronen in reactie op een suiker en een bittere stof. Aspecten van het protocol zijn tp technisch uitdagend en we hebben een uitgebreide beschrijving van een aantal gemeenschappelijke technische problemen die zich kunnen voordoen, zoals het ontbreken van signaal of overmatige ruis in het systeem en mogelijke oplossingen. De techniek heeft beperkingen, zoals het onvermogen om tijdelijk complexe stimuli leveren observeren achtergrond vuren onmiddellijk voorafgaand aan levering stimulus of gebruikt water oplosbare smaak verbindingen gemakkelijk. Ondanks deze beperkingen, deze techniek (inclusief kleine variaties waarnaar in het protocol) is een standaard, algemeen aanvaard voor het opnemen van Drosophila neuronale reacties op verbindingen proeven.
Introduction
Het gevoel van smaak laat een insect tot een breed spectrum van oplosbare stoffen te detecteren en speelt een belangrijke rol in de acceptatie van een voedzame stof, of de afwijzing van een schadelijke of giftige een. Smaak is ook gedacht aan een rol spelen bij partnerkeuze, door de detectie van feromonen 1-5. Deze belangrijke en diverse functies hebben het insect smaak systeem een dwingende doelstelling van onderzoek naar hoe sensorische systemen vertalen omgevingsfactoren in relevante gedrags-uitgangen gemaakt.
De primaire eenheid van de Drosophila melanogaster smaak systeem is de smaak haar of sensillum. Moleculen voer de sensillum via een porie in de punt 2,6. Sensilla zijn te vinden op de lip, de benen, de vleugel marge, en de keelholte 6. Op de lip, is het aantal en de locatie van sensilla stereotiep. Er zijn drie klassen van morfologische sensilla basis van lengte: lange (L), tussenproduct (I) en korte (S ) Sensilla 7,8. Elke sensillum bevat ofwel twee (I-type) of vier (L-en S-type) gustatory receptor neuronen (GRNs) 9. Verschillende GRNs reageren op de verschillende categorieën van de smaak stimuli: bitter, suiker, zout en osmolariteit 7,10 en express verschillende subgroepen van smaak receptoren 8,11-13. Alleen I en S-type sensilla bevatten bitter-responsieve GRNs 8,10. De GRNs project om de subesophageal ganglion (SOG) en hun activering door smaakmoleculen wordt doorgegeven aan de hogere centrale zenuwstelsel voor het decoderen, waardoor een gedragsreactie 6. Het relatief kleine aantal neuronen en de ontvankelijkheid voor moleculaire en gedragsanalyse maken het Drosophila smaak systeem een uitstekend model voor het onderzoek naar smaak in het algemeen. Het relatieve gemak waarmee het systeem kan worden gemanipuleerd via genetische mutatie of de GAL4-UAS expressiesysteem dient ook als een waardevol instrument 14,15.
NHOUD "> Omdat deze sensilla uitsteken uit het oppervlak van de lip, zij zijn uitstekende doelwitten voor elektrofysiologie. het afvuren van de GRNs kan gevolgd worden met extracellulaire. Historisch de zijwand opnamemethode met een glazen elektrode ingebracht in de gebruik sensillum neuronale activiteit opnemen, 26 is gebruikt. Deze methode is technisch moeilijk uit te voeren, en het is lastig om vele van elk preparaat. Het uiteinde-opnamemethode, waarbij de reactie van de neuronen meet met een elektrode die tegelijkertijd levert tastant, sinds de voorkeursmethode 9,16 geworden. Het is gebruikt om de smaak stelsel van Drosophila melanogaster 8,10,17,18 en een aantal andere insectensoorten 19-23 onderzoeken. Het is sterk vergemakkelijkt door de ontwikkeling van de tastePROBE versterker, die een van de belangrijkste nadelen van de tip-opnamemethode overwonnen door te compenseren voorhet grote potentiaalverschil tussen de referentie-elektrode en het insect sensillum, waardoor de GRN actiepotentialen op te nemen zonder al te veel versterking of filtering 24. Een andere belangrijke ontwikkeling was het gebruik van tricholine citraat als de opname elektrolyt 25. TCC onderdrukt reacties van de osmolariteit-gevoelige GRN en niet het stimuleren van het zout-gevoelige GRN, waardoor reacties gegenereerd door bittere en suiker tastants veel gemakkelijker te analyseren 25.Hier beschrijven we hoe tip opname van Drosophila labellar sensilla momenteel wordt uitgevoerd in de Carlson laboratorium. Dit protocol zal uitleggen hoe je een geschikte elektrofysiologie rig, hoe de vlieg te bereiden, en hoe je smaak opnamen uit te voeren vast te stellen. Presenteren we ook enkele representatieve gegevens verkregen door het opnemen van deelverzamelingen van Drosophila sensilla, evenals enkele veelvoorkomende problemen en mogelijke oplossingen die zich kunnen voordoen bij het gebruik van dezetechniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het volgende protocol voldoet aan alle dierlijke zorg richtlijnen van de Yale University.
1. Reagentia en apparatuur voorbereiding
- Opname-apparatuur setup (Figuur 1A).
- Kies een kamer voor rig setup die vrij is van grote schommelingen in temperatuur en vochtigheid en ook geïsoleerd van bronnen van elektrische en mechanische geluiden, zoals koelkasten en centrifuges.
Figuur 1. (A) Overzicht van de opname rig setup. Stereomicroscoop (a) is gemonteerd op anti-vibratie platform (b). Referentie-elektrode houder (c) wordt op het platform tegenover de headstage (d) gemonteerd, via micromanipulators. Een uitlaat plastic buis (e) leveren bevochtigde luchtstroom gericht op de vlieg preparaat ook gemonteerd op thij platform. De headstage is aangesloten op de versterker (f), die is aangesloten op de digitale acquisitiesysteem (DAS) (G), die is verbonden met een PC (h). (B) Configuratie van de elektroden en afvoerbuis:. Referentie-elektrode aan de linkerkant, registratie-elektrode aan de rechterkant, en luchtstroom afvoerbuis gericht op vlieg voorbereiding Klik hier voor grotere afbeelding. - Mount stereomicroscoop naar het centrum van anti-vibratie tafel of platform.
- Bevestig micromanipulators de referentie-elektrode / insecten bereiding en headstage / opname elektrode naar links en rechts van de microscoop, respectievelijk met magnetische stands.
- Zet outlet plastic buis in een derde micromanipulator aan de achterzijde van de microscoop, georiënteerd dat de buis opening gericht is naar locatie fly prep (zie figuur 1B).
- Met behulp van flexibele kunststof buizen, bijtach outlet plastic buis om een thermoskan gedeeltelijk gevuld met water. Sluit een klein aquarium pomp te borrelen lucht door het water in de kolf een vochtige luchtstroom genereren door de uitlaat plastic buis naar de vlieg.
- Mount glasvezel lichtbron van de triltafel, oriënteren de uitgangen aan de voorbereiding verlichten door te reflecteren licht via een stukje witte kaart papier direct onder de bereiding. Zorg ervoor dat de lichtbron niet rust op de tafel. Opmerking: het voordeel reflecteren de lichtbron op een papieren schijf is tweeledig: het verbetert het contrast, waardoor sensilla gemakkelijker te visualiseren, en voorkomt verwarming van het preparaat die zou resulteren uit direct licht.
- Steek tastePROBE versterker in de digitale acquisitie systeem (DAS), en de DAS in een personal computer, volgens leverancier handleiding. Steek voetpedaal trekker in en regelen onder werkruimte. Opmerking: elektrisch geïsoleerde wand aansluitingen voor de versterker en DAS zijn zeer wenselijkstaat.
- Elektrisch gemalen microscoop, micromanipulators, en de lichtbron door metalen componenten aansluit op tafel met behulp krokodillenklemmen en lengtes van geïsoleerde elektrische draad en isolatietape. Elektrisch gemalen metalen platform door verbinding met bouwgrond of DAS, dat is geaard via voeding stekker.
- Installeer de juiste acquisitie software voor de DAS keuze op de personal computer. Opmerking: Zorg dat de digitale overname drivers compatibel zijn met het besturingssysteem op de PC.
- Configureren software amplificatie (10-100x), signaal filtering (meestal een Bessel bandpassfilter ingesteld van 100 Hz-3, 000 Hz), en sampling rate (minstens 10 KHz). Opmerking: Signaal amplitudes van smaak neuronen zijn meestal in de 0.5-2 mV bereik, zodat het display schaal is ingesteld op hun visualisatie te vergemakkelijken. Opmerking: De 100 Hz filter helpt om vreemde elektrische ruis uit te sluiten, maar het verandert de vorm van pieken en kunt geavanceerde spike sorteren mor makene uitdagend. Alternatief kan een 1 Hz filter gebruikt.
- Eventueel kan een kooi van Faraday worden opgezet rond de hele triltafel. Echter, kleine vellen aluminiumfolie zijn meestal voldoende om elk geluid van de externe omgeving of de onderzoeker te beperken.
- Kies een kamer voor rig setup die vrij is van grote schommelingen in temperatuur en vochtigheid en ook geïsoleerd van bronnen van elektrische en mechanische geluiden, zoals koelkasten en centrifuges.
- Glas elektrode Voorbereiding
Figuur 2. Referentienummer en registratie-elektroden. Plaatje onder vergroting van glazen capillairen getrokken in referentie-elektrode, met (A) en zonder (B) tip gebroken en registratie-elektrode (C). Witte balk geeft 2 mm. Klik hier voor grotere afbeelding.- Trek de referentieelektrode uit een glazen capillair met een pipet trekker instrument. Opmerking: De precieze instellingen van de pipet trekker programma zal variëren van instrument tot instrument. Probeer een zeer lange geleidelijke versmalling bereiken. De poriegrootte van de tip is niet cruciaal, omdat de tip zal worden gebroken voor fly voorbereiding (Figuren 2A en 2B), maar zorg ervoor dat de diameter van de taps toelopende lengte van de elektrode is niet te dun, die niet zal zorgen voor voldoende immobilisatie van de lip, maar ook niet te groot, waardoor de smaak neuronen kunnen beschadigen of scheuren de speekselklieren.
- Trek opnemen elektrode uit een borosilicaatglas capillair met gloeidraad met een pipet trekker instrument. Probeer een tapsheid die ondieper is dan dat van de referentie-elektrode en een poriediameter van ongeveer 10-15 urn (figuur 2C) 28 bereiken.
- Tastant oplossingen voorbereiding
- Gebruik Beadle-Ephrussi Ringer oplossingtie (B & E) als de referentie-elektrode elektrolyt. Om een liter van B & E te maken, los 7,5 g NaCl, 0,35 g KCl, en 0.279 g CaCl2 ∙ 2H 2 O in een liter ultrapuur water. WINKEL kleinere porties bij -20 ° C.
- Gebruik 30 mM tricholine citraatoplossing (TCC) de registratie-elektrode en elektrolyt oplosmiddel voor tastant oplossingen 25, indien bittere of suiker GRN responsen te meten. Als alternatief kan 1-3 mM kaliumchloride worden als reacties van het water cel te meten.
- Om tastant oplossingen te maken, weeg juiste hoeveelheid tastant in poedervorm en toe te voegen aan TCC een beginvoorraad concentratie te maken. Gebruik dit om seriële verdunningen maken van deze eerste voorraad om de gewenste concentratie te testen opleveren. Opmerking: Als tastants niet goed oplosbaar in water, een oplosmiddel, zoals ethanol, kan worden gebruikt om eerste voorraadconcentratie maken. Een passende controle oplossing van TCC en oplosmiddel zonder tastantworden in dit geval gebruikt.
- Store porties lange termijn bij -20 ° C. Sla een werkende hoeveelheid van een tastant oplossing bij 4 ° C voor het opnemen gebruik tot een week, afhankelijk van de chemische eigenschappen van tastant.
2. Drosophila Voorbereiding
Figuur 3. Voorbereiding van de vlieg voor de opname. (A) Insertion positie van referentie-elektrode in dorsale thorax van vliegen. De witte pijl geeft de referentie-elektrode. (B) Tussenstand van referentie-elektrode: voortbewogen door nek en hoofd, snuit nog niet verlengd. (C, D) Vlieg met referentie-elektrode in de eindstand met topje van de elektroden in het labellum en slurfvolledig uitgeschoven. Klik hier voor grotere afbeelding.
- Verzamel nieuw eclosed vliegen voor het opnemen van goed onderhouden fly culturen, onder temperatuur-en vochtigheid gecontroleerde omstandigheden geteeld en ouder ze 5-10 dagen in vers kweekflesjes voor de opname.
- Chill microscoop plaat op ijs gedurende 15-30 minuten voor de voorbereiding van vliegen.
- Backfill glas elektrode met B & E oplossing met behulp van een lange, dunne plastic naald van 0,5 mm diameter, zoals een spinale naald en 1 ml spuit en tik zachtjes tegen eventuele luchtbellen. Breek kleine hoeveelheid tip behulp van een tang en gebruik capillaire werking te trekken uit alle resterende bubbels af met een tissue, observeren onder dissectiemicroscoop.
- Slide B & E-gevulde referentie-elektrode op draad van referentie-elektrode houder, zorg luchtbellen te introduceren.
- Aspireren vliegen in een P200 pipet tip, gebruik vlieg aspirator gebouwduit een buis, mesh, en pipet tip; 29 plaats in de ijsemmer en chill gedurende 30-60 sec.
- Verwijder microscoop plaat uit ijs, droog ook deze af, en de positie onder de microscoop. Tik voorzichtig vliegen uit pipetmondstuk op microscoop plaat.
Let op: de vlieg moet voldoende worden geïmmobiliseerd om gemakkelijk te manipuleren. - Onder lage vergroting, verwijder voorzichtig de voorpoten met een pincet, terwijl de thorax stal met de andere pincet. Plaats de vlieg op de buikzijde, dorsale zijde naar boven. Opmerking: Wees altijd voorzichtig om te voorkomen dat het aanraken van de lip met de tang te allen tijde tijdens het bereidingsproces om mechanische schade te minimaliseren.
- Terwijl de vlieg op zijn plaats met een pincet, plaatst u de referentie-elektrode op de middellijn van het achterste dorsale thorax. Voorgestelde hoek van binnenkomst ongeveer vijfenveertig graden in de richting van de kop (figuur 3A).
- Beveilig de verwijzing electrode houder met boetseerklei, zodat de vlieg is zichtbaar onder de microscoop bij een hoge vergrotingsfactor. Manoeuvreren en de hoek van de glazen elektrode door de nek en het hoofd, door het schuiven van de vlieg in de richting van de houder referentie-elektrode gebruik van twee paar tang. Opmerking: Werk snel maar soepel, het is gemakkelijker om deze stap terwijl de vlieg nog geïmmobiliseerd tegen de kou (Figuur 3B).
- Voorzichtig verlengen snuit met een pincet, terwijl glijden de vlieg verderop glas referentie-elektrode, totdat de punt van de elektrode in de lip en de zuigorganen volledig verlengd (Figuren 3C en 3D). Opmerking: Zorg dat u geen deel van de proboscis weefsel niet te doorboren of uitzetten van de rand van de lip met de referentie-elektrode, omdat dit de vlieg kunnen beschadigen en / of smaak neuronen en invloed op de opnamekwaliteit.
3. Opnemen van Labellar sensilla
Figuur 4. Opnemen van vlieg. (A) labellum van vlieg voorbereiding op links met registratie-elektrode uitgelijnd voor contact op rechts, onder hoge vergroting. (B) registratie-elektrode en single sensillum op labellum in contact, onder hoge vergroting. Klik hier voor grotere afbeelding.
- Aard uzelf altijd door het aanraken van het metalen oppervlak van de anti-vibratie tafel of platform voorafgaand aan het aanraken van een apparaat tijdens de opname proces! Opmerking: Het is uiterst belangrijk om geen statische lading te leveren aan de headstage als dat kan het circuit beschadigen.
- Veilige referentie-elektrode houder micromanipulator gemonteerd op lucht tafel van recording rig. Positie een kwab van labellum microscoop gezichtsveld, onder hoge vergroting (meestal minstens 140X), en in lijn met bevochtigde lucht stroom.
- Zet bevochtigde lucht stroom, computer, DAS, en versterker. Open acquisitie software.
- Spoel en vul glas registratie-elektrode met de gewenste tastant.
- Spoel glazen registratie-elektrode met ultrapuur water met behulp van een injectiespuit en plastic buis 28 om kleine hoeveelheden water te trekken door de buis minstens tien keer.
- Spoel registratie-elektrode met tastant minstens vijf keer. Vul registratie-elektrode ongeveer een derde tot de helft vol met tastant en te verwijderen uit een buis. Als er luchtbellen, tikt vrij te geven of gewoon vullen de elektrode.
- Schuif elektrode op zilverdraad van de headstage snel en soepel zodat er geen luchtbellen voeren.
- Stimuleer enkele sensillum met tastant gevuld registratie-elektrode.
- Gebruik de micromanipuLator aan de registratie-elektrode afgestemd sensillum belangstelling te brengen.
- Druk op het voetpedaal om acquisitie modus van de versterker leiden.
- Vooraf de registratie-elektrode met de fijne bedieningsknop van micromanipulator voorzichtig totdat het contact met de tip van sensillum en de opname begint maakt.
- Verwijder elektrode na 1-2 sec.
- Herhaal stap 3.5 met andere sensilla, indien gewenst. Opmerking: Wacht minstens 1 minuut in tussen presentaties aan dezelfde sensillum. Bij opnemen met een tastant voor een langere tijd, kan de tastant oplossing uitdrogen en de oplossing in de top kan geconcentreerder. Dit kan worden verholpen door voorzichtig met de punt van de glaselektrode met glanzend papier om een kleine hoeveelheid vloeistof te verwijderen door capillaire werking.
- Om de antwoorden op een andere tastant opnemen, afspoelen en belasting registratie-elektrode met nieuwe tastant en herhaal stap 3.4. Opmerking: grondig spoelen van de elektrode tussen tastants is absolutely cruciaal om kruisbesmetting te voorkomen.
- Spaar gegevensbestanden periodiek met het identificeren van informatie, zoals datum, genotype, en tastants. Opmerking: Het is belangrijk om een schriftelijke vastlegging van de tastant en sensillum identiteit van elke presentatie tijdens de opname sessie voor data-analyse te houden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 5A toont de respons van een L sensillum een suiker, sucrose. Dezelfde sensillum reageert niet op een bittere stof, berberine. Figuur 5B toont dat een type I sensillum, die een bittere responsieve neuron bevat, geeft grotere amplitude pieken in reactie op berberine en kleinere amplitude pieken in reactie op sucrose. L sensilla een minimale achtergrondniveau op de oplosmiddelcontrole, TCC geven, terwijl ik vrijwel geen reactie op TCC (figuur 5) sensilla weergegeven. Voor meer informatie over zout en water reacties van labellar GRNs, verwijzen wij u naar Hiroi 10.
Figuur 5. Vertegenwoordiger sporen van wild-type Drosophila labellar reacties (A) L sensillu m reactie 100 mM sucrose (SUC), 1 mM berberine (BER), en 30 mM TCC. (B) I sensillar reactie op SUC, BER en TCC. De pijlpunt geeft aan het contact artefact dat optreedt bij het begin van elke opname. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 6. Vertegenwoordiger suboptimale elektrofysiologische resultaten. (A) volledig ontbreken van signaal (B) 50/60 Hz "ruis" (C) stochastische ruis (D) mechanosensorische neuron vuren alleen (E) bittere GRN (open driehoeken) en mechanosensorische neuron ( gevulde driehoeken) beide bakken./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig6highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Labellar sensilla verschillen in het gemak van opname door verschillen in morfologie en anatomische structuur. Soms is een sensillum niet reageert op elke tastants, zelfs een die bekend staat om een positieve reactie uit te lokken. De frequentie waarmee dit gebeurt is afhankelijk sensillum type. L sensilla meest consistent reageren en zijn relatief gemakkelijk te bereiken vanwege hun lengte. In het algemeen, S sensilla consequent reageren, maar hun korte lengte en de positie op de lip goed contact maken uitdagend. Ik sensilla kan gemakkelijker toegankelijk, afhankelijk van de hoek van het preparaat, maar ze zijn vaker reageert. Op een gegeven fly voorbereiding, kan een groter deel van I sensilla reageert dan L of S sensilla zijn. Genetische achtergrond kan invloed hebben op de consistentie van smaak reacties ook. Bijvoorbeeld, kunnen sommige transgene vliegen minder consistente respons dan wild-type weer te geven, vermoedelijk omdat de transgenen van invloed op de general gezondheid van de vlieg. We hebben waargenomen dat w - mutantvliegen zijn bijzonder uitdagend om op te nemen van.
Een gemeenschappelijke technische probleem is het ontbreken van signaal, dwz geen pieken waargenomen (figuur 6A). Eerste, soms een bepaalde sensillum kan niet reageren, terwijl anderen van dezelfde klasse op dezelfde fly kan reageren. Ten tweede kan er een luchtbel in de registratie-elektrode en de referentie-elektrode. Als de registratie-elektrode wordt vermoed, kan dit worden opgelost door simpelweg verwijderen en opnieuw vullen van de glazen elektrode, zachtjes te tikken en inspecteren onder een vergrootglas te garanderen dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Als de referentie-elektrode wordt vermoed dat een luchtbel bevatten, herbouwen van de prep met een nieuwe vlieg is de makkelijkste manier om dit probleem op te lossen. Ten derde, soms de draden die het elektrische signaal mogelijk niet goed aangesloten. Ten vierde, soms het spanningssignaal wordt ontvangen kunnen hoger of lager zijn danhet bereik van de versterker kan meten. Bij gebruik van de tastePROBE versterker, controleren om te zien of een van beide de clip omhoog of omlaag clip lampje brandt. Als de clip omhoog lampje brandt, vaak verwijderen en opnieuw vullen van de glazen referentie-elektrode, terwijl de zorg voor niet meer dan de helft te vullen en af te vegen langs de buitenkant om vocht te verwijderen zal het probleem op te lossen. Vocht aan de buitenkant van de glazen elektrode een elektrische verbinding tussen de metalen behuizing van de elektrode en de draad te maken, het verzenden van het signaal buiten het bereik van de versterker. Als hiermee het probleem, of de clip omlaag lampje te lossen is op, overwegen voorstellen in de volgende paragraaf om elektrische ruis in het systeem te bestrijden. Ten vijfde, soms een vlieg kunnen sterven tijdens de bereiding of anderszins niet reageert ondanks de bereiding van gezonde uitstraling. Groeiomstandigheden, zoals vochtigheid, temperatuur, leeftijd, voedselkwaliteit en microbiota, evenals minder gezonde genetische achtergrond kan bijdragen tot een hogereaandeel van de "reageert" vliegen. Tenslotte zelden, een stuk van de apparatuur kan niet functioneel zijn. Als het signaal wordt steeds niet gehaald en alle andere mogelijkheden zijn uitgeput, kan het nodig zijn om de functionaliteit van elk apparaat te onderzoeken: headstage, versterker, en digitizer. De eenvoudigste manier om dit te doen is om een apparaat te vervangen door een andere van een rig die bekend is functioneel. Indien slechts een tuig aanwezig in een lab is, kan een signaalgenerator gebruikt om de functionaliteit van de elektronische componenten te testen.
Een andere gemeenschappelijke technische probleem is dat van de "ruis" die een waargenomen signaal dat niet lijkt te neuronale actiepotentialen gebakken in reactie op een stimulus smaak (figuren 6B-E) vertegenwoordigen. Ten eerste kan het signaal het gevolg zijn van 50/60 Hz elektrische storing van opname-apparatuur of andere apparatuur in de buurt (figuur 6B). Met geen vlieg op de referentie-elektrode, directly sluit de opname-en referentie-elektroden door een daling van Ringer-oplossing en voer de passthrough-modus op de versterker door te drukken op de knop omhoog. Als ruis waarneembaar op de doorgave signaal, dit waarschijnlijk betekent dat de ruis buiten de vlieg bereiding. Zorg ervoor dat alle tuig apparatuur goed is geaard en dat aluminiumfolie schilden zijn in de plaats. Probeer los te koppelen apparatuur in de buurt om te zien of het geluid wordt geëlimineerd, of afschermen extra componenten. Ten tweede kan de stochastische ruis (figuur 6C) lijken. In dit geval moet de gedetailleerde stappen van 50/60 Hz ruis nog worden uitgevoerd. Daarnaast proberen los te koppelen of de vervanging van verschillende componenten van het controleapparaat, met name de headstage en / of versterker. Als geen geluid wordt waargenomen wanneer de elektroden direct aangesloten bron zal waarschijnlijk een vlieg preparaat zelf. Het is gewoonlijk het eenvoudigste een nieuwe vlieg voor opname bereiden zorg om schade aan de vlieg minimaliseren. Ten derde, activatievan de mechanosensorische neuron opgenomen in de sensillum (figuren 6D en 6E) worden waargenomen. De mechanosensorische neuron kan worden geactiveerd als de sensillum wordt afgebogen of gebogen op verzoek van de registratie-elektrode, of gestoten tijdens het contact. De spikes zijn gewoonlijk onderscheiden van chemosensory spikes hun onregelmatig patroon, die meestal wordt gecoördineerd met de mechanische verbreking niet de toepassing van een smaak stimulus. Mechanosensorische vuren kan worden geminimaliseerd door aanpassing van de registratie-elektrode met de sensillum en oprukkende voorzichtig slechts zo ver als nodig is om contact te maken met de punt van de sensillum. Ten vierde kan stochastische spike "barsten" worden waargenomen, dit lijkt vergelijkbaar met neuronale, maar is van hoge frequentie en amplitude, niet gecoördineerd reactie op een stimulus. Dit resulteert meestal van de vlieg prep zelf niet uit de apparatuur en kan door een zenuw verstoord door de referentie-elektrode. </ P>
Een derde gemeenschappelijke technische probleem is dat de voorbereiding is mobiel, waardoor de lip om te bewegen, welke verbinding met een sensillum bemoeilijkt. Ten eerste kan de vlieg bereiding onstabiel zijn. Controleer of de referentie-elektrode juist is, corrigeer indien nodig. Ten tweede, kan de referentie-elektrode te dun aan het uiteinde van de slurf en labellum onbeweeglijk houden. Probeer het afbreken van een langere bedrag van de tip voor de voorbereiding van de vlieg. Als dat niet voldoende is, stel de pipet trekker instellingen nodig om de vorm van referentie-elektrode veranderen dat de tapsheid geleidelijker en de diameter lichtjes verhoogd. Ten derde kan de vlieg zijn ongewoon actief. Remake van de voorbereiding met een nieuwe vlieg.
Voor algemene informatie elektrofysiologie en probleemoplossing, zie Axon Guide 30.
Er zijn enkele beperkingen aan de tip-opnamemethode die in deze publication. Een beperking is dat het tastant water oplosbaar moet zijn, zoals het wordt geleverd in de registratie-elektrode samen met de elektrolyt. Dit verhoogt de moeilijkheid van opname met koolwaterstofverbindingen, hoewel toepassing van een oplosmiddel zoals DMSO enkele opname gemaakt met feromonen mogelijk 4. Alternatieve benaderingen zijn een geslepen wolfraam elektrode om de opnames te voeren vanaf de sokkel van de sensillum of gebruik een glaselektrode opnamen voeren vanaf de zijwand van de sensillum, waarbij in beide gevallen de tastant onafhankelijk van de registratie-elektrode wordt geleverd 26,27. Echter, deze technieken zijn uitdagend en zijwand opnames zijn schadelijk voor de smaak orgel. Een andere beperking is de hoeveelheid tijd die nodig is om de tastant oplossing (Protocol stap 3.3), waarbij omzet vermindert uitwisselen en beperkt het gebruik van ingewikkelde stimulus paradigma vaak in olfactorische opnamen. Smaak-receptor neuronen vertonen enige variabiliteitamplitude die afhankelijk piekfrequentie. Deze functie kan de beoordeling van neuronale identiteit bemoeilijken en geavanceerde spike sorteren moeilijker 25,31-33. Bovendien, vanwege de aard van de tip-opnamemethode kan niet de basale afvuren opnemen onmiddellijk voorafgaand aan de levering van een stimulus, zoals vaak gebeurt in olfactorische opnamen. Ondanks deze nadelen is de punt-opnamemethode succesvol gebruikt om veel van de principes van smaak codering in Drosophila en andere soorten 8,10,17,19,21-23 helderen.
De vlieg bereidingstechniek hier geschetst is slechts een mogelijke aanpak. Bij deze bereidingswijze de slurf is bevestigd in een uitgerekte positie om contact van de registratie-elektrode met sensillum van belang te vergemakkelijken en de referentie-elektrode in het dier ingebracht. Andere bereidingswijzen omvatten de montage van het dier een bolletje boetseerklei en het gebruik van dunne reepjestape om de slurf 34 repareren. Zo lang als de fundamentele parameters van weefsel stabilisatie en vindplaats elektrodeplaatsing voldaan, sensilla andere locaties of verschillende soorten kunnen worden opgenomen van op vrijwel dezelfde manier. Bijvoorbeeld, kan been sensilla worden opgenomen van door de vaststelling van het lichaam van een vlieg om een Sylgard gecoate microscoop dia met fijne insect pinnen, wijd te spreiden de benen over de rand van het glas iets 35. Het is mogelijk om farmacologische middelen te leveren aan de sensilla via de registratie-elektrode om signaaltransductie te onderzoeken in de smaak receptor neuronen. Het is gewoon een taak van experimenteren om te bepalen welke aanpak het beste werkt voor het gewenste resultaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een NRSA predoctoral subsidie 1F31DC012985 (RD) en door NIH subsidies aan JC
We willen graag Dr Linnea Weiss bedanken voor nuttig commentaar op het manuscript, dr. Ryan Joseph om hulp samenstellen cijfers, en Dr Frederic Marion-Poll voor nuttig technisch advies. We willen ook graag de behulpzame reacties van vier beoordelaars erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150X magnification with long working distance table mount stand |
| Antivibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
| Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5 ml serological pipette for extended range |
| Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5 mm diameter |
| Retort Stand | generic | ||
| Outlet Plastic Tube | generic, 1 cm diameter | ||
| Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
| 500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
| Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
| Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
| White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
| Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
| Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
| Insulated Electrical Wire | Generic | ||
| Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use LabView with NI-6251 |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
| Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10-40X magnification |
| Ice Bucket | Generic | ||
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
| 1 ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
| 10 ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
| Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |
References
- Glendinning, J. I., Jerud, A., Reinherz, A. T. The hungry caterpillar: an analysis of how carbohydrates stimulate feeding in Manduca sexta. The Journal of experimental biology. 210, 3054-3067 (2007).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139, 234-244 (2009).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell reports. 1, 599-607 (2012).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a review. Cell and tissue research. 275, 3-26 (1994).
- Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoological Science. 19, 1009-1018 (2002).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The Molecular and Cellular Basis of Bitter Taste in Drosophila. Neuron. 69, 258-272 (2011).
- Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. Journal of Morphology. 150, 327-341 (1976).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 61, 333-342 (2004).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R.
- Cameron, P., Hiroi, M., Ngai, J., Scott, K. The molecular basis for water taste in Drosophila. Nature. 465, 91-95 (2010).
- Croset, V., et al. Ancient protostome origin of chemosensory ionotropic glutamate receptors and the evolution of insect taste and olfaction. PLoS Genet. 6, e1001064 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development (Cambridge, England). 118, 401-415 (1993).
- Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36, 288-292 (2004).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science (New York, N.Y.). 122, 417-418 (1955).
- Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56, 503-516 (2007).
- Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67, 555-561 (2010).
- Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45, 871-876 (1999).
- Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 7281-7287 (2002).
- Sanford, J. L., Shields, V. D., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Die Naturwissenschaften. 100, 269-273 (2013).
- Merivee, E., Must, A., Milius, M., Luik, A. Electrophysiological identification of the sugar cell in antennal taste sensilla of the predatory ground beetle Pterostichus aethiops. J Insect Physiol. 53, 377-384 (2007).
- Popescu, A., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. Journal of comparative physiology. A, Neuroethology. 199, 403-416 (2013).
- Marion-Poll, F., Der Pers, J. V. an Un-filtered recordings from insect taste sensilla. Entomologia Experimentalis et Applicata. 80, 113-115 (1996).
- Wieczorek, H., Wolff, G. The labellar sugar receptor of Drosophila. J. Comp. Physiol. A. Neuroethol Sens. Neural Behav. Physiol. 164, 825-834 (1989).
- Morita, H. Initiation of spike potentials in contact chemosensory hairs of insects. III. D.C. stimulation and generator potential of labellar chemoreceptor of calliphora. Journal of cellular and comparative physiology. 54, 189-204 (1959).
- Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2, e661 (2007).
- Benton, R., Dahanukar, A. Electrophysiological recording from Drosophila taste sensilla. Cold Spring Harbor protocols. 2011, 839-850 (2011).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. , e1725 (2010).
- Axon Instruments. The Axon Guide for Electrophysiology & Biophysics Laboratory Techniques. , (1993).
- Fujishiro, N., Kijima, H., Morita, H. Impulse frequency and action potential amplitude in labellar chemosensory neurones of Drosophila melanogaster. Journal of insect physiology. 30, 317-325 (1984).
- Marion-Poll, F., Tobin, T. R. Software filter for detecting spikes superimposed on a fluctuating baseline. Journal of neuroscience. 37, 1-6 (1991).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem Senses. 28, 671-679 (2003).
- Marion-Poll Lab Website. , Available from: http://taste.versailles.inra.fr/fred (2013).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 56, 139-152 (2003).
