Summary
इस प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला में labellar स्वाद न्यूरॉन्स द्वारा चलाई कार्रवाई संभावित प्रतिक्रिया के कोशिकी रिकॉर्डिंग का वर्णन करता है.
Abstract
कीड़ों की परिधीय स्वाद प्रतिक्रिया शक्तिशाली electrophysiological तकनीकों के साथ जांच की जा सकती है. यहाँ वर्णित विधि शोधकर्ता कीट तंत्रिका तंत्र अपने वातावरण में स्वाद उत्तेजनाओं से मिलने वाले संवेदी इनपुट को दर्शाती है, सीधे और मात्रात्मक स्वाद प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल इस तकनीक के प्रदर्शन में सभी महत्वपूर्ण कदम की रूपरेखा. इस तरह के आवश्यक उपकरण और रिकॉर्डिंग के लिए एक उपयुक्त वातावरण के चयन के रूप में एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग, संयोजन में महत्वपूर्ण कदम, चित्रित कर रहे हैं. हम भी उपयुक्त संदर्भ और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड बनाकर रिकॉर्डिंग के लिए तैयार करने के लिए कैसे का वर्णन है, और tastant समाधान. हम विस्तार में सूंड स्थिर करने के क्रम में मक्खी में एक गिलास संदर्भ इलेक्ट्रोड की प्रविष्टि द्वारा कीट तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता विधि का वर्णन. हम एक चीनी और एक कड़वा परिसर के जवाब में स्वाद न्यूरॉन्स द्वारा चलाई बिजली के उद्यमी के निशान दिखाते हैं. प्रोटोकॉल के पहलुओं टी रहे हैंechnically चुनौती है और हम इस तरह के संकेत या प्रणाली में अत्यधिक शोर की कमी है, और संभावित समाधान के रूप में सामना किया जा सकता है कि कुछ आम तकनीकी चुनौतियों का एक व्यापक विवरण शामिल हैं. तकनीक ऐसी है, अस्थायी परिसर उत्तेजनाओं देने प्रसव प्रोत्साहन के लिए तुरंत पहले फायरिंग पृष्ठभूमि निरीक्षण, या सुविधापूर्वक जल अघुलनशील स्वाद यौगिकों का उपयोग करने में असमर्थता के रूप में सीमाओं की है. इन सीमाओं के बावजूद, (प्रोटोकॉल में संदर्भित मामूली बदलाव भी शामिल है) इस तकनीक, यौगिकों स्वाद के लिए ड्रोसोफिला neuronal प्रतिक्रियाओं की रिकॉर्डिंग के लिए मोटे तौर पर स्वीकार किए जाते हैं प्रक्रिया एक मानक है.
Introduction
स्वाद की भावना एक कीट घुलनशील रसायनों का एक विशाल रेंज का पता लगाने के लिए अनुमति देता है और एक पौष्टिक पदार्थ की स्वीकृति में एक महत्वपूर्ण भूमिका है, या एक हानिकारक या जहरीले एक की अस्वीकृति निभाता है. स्वाद भी फेरोमोन 1-5 का पता लगाने के माध्यम से, दोस्त चयन में एक भूमिका निभा सोचा है. इन महत्वपूर्ण और विविध कार्यों संवेदी प्रणाली पर्यावरण cues प्रासंगिक व्यवहार outputs में अनुवाद कैसे में कीट स्वाद प्रणाली जांच की एक सम्मोहक लक्ष्य बनाया है.
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर स्वाद प्रणाली की प्राथमिक इकाई स्वाद बाल, या Sensillum है. अणु इसकी टिप 2,6 पर एक ताकना के माध्यम से Sensillum दर्ज करें. Sensilla labellum, पैर, पंख मार्जिन, और ग्रसनी 6 पर पाए जाते हैं. Labellum पर, sensilla की संख्या और स्थान टकसाली है. लंबी (एल), मध्यवर्ती (आई), और छोटी (एस: तीन रूपात्मक लंबाई के आधार पर sensilla के वर्गों रहे हैं ) 7,8 sensilla. प्रत्येक Sensillum दो (मैं प्रकार) या चार (एल और एस प्रकार) स्वाद रिसेप्टर न्यूरॉन्स (GRNs) 9 या तो होता है. विभिन्न GRNs स्वाद उत्तेजनाओं की विभिन्न श्रेणियों का जवाब: कड़वा, चीनी, नमक और परासारिता 7,10 और स्वाद रिसेप्टर्स 8,11-13 के विभिन्न सबसेट व्यक्त करते हैं. केवल मैं और एस प्रकार sensilla कड़वा उत्तरदायी GRNs 8,10 होते हैं. Subesophageal नाड़ीग्रन्थि (एसओजी) और स्वाद अणुओं से उनके सक्रियण को GRNs परियोजना एक व्यवहार प्रतिक्रिया 6, जिसके परिणामस्वरूप डिकोडिंग के लिए उच्च केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए रिले की जाती है. न्यूरॉन्स की संख्या अपेक्षाकृत छोटे और आणविक और व्यवहार विश्लेषण करने ज़िम्मा ड्रोसोफिला स्वाद प्रणाली सामान्य रूप में स्वाद प्रणालियों की जांच के लिए एक शानदार मॉडल बना. प्रणाली आनुवंशिक उत्परिवर्तन या GAL4-यूएएस अभिव्यक्ति प्रणाली के माध्यम से हेरफेर किया जा सकता है जिसके साथ रिश्तेदार आसानी भी एक महत्वपूर्ण उपकरण 14,15 के रूप में कार्य करता है.
इन sensilla labellum की सतह से बहर "क्योंकि ontent>, वे इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए उत्कृष्ट लक्ष्य बनाते हैं. GRNs की फायरिंग कोशिकी रिकॉर्डिंग उपयोग पर नजर रखी जा सकती है. ऐतिहासिक, में डाला कांच इलेक्ट्रोड का उपयोग करता है जो बगल की दीवार रिकॉर्डिंग विधि, Sensillum neuronal गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए, 26 इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, इस विधि को करने के लिए तकनीकी रूप से चुनौती दे रहा है, और यह लंबे समय से प्रत्येक तैयारी से के लिए रिकॉर्ड करने के लिए मुश्किल है. एक इलेक्ट्रोड के साथ न्यूरॉन्स की प्रतिक्रिया जो उपाय टिप रिकॉर्डिंग विधि, कि एक साथ एक tastant बचाता है, क्योंकि चुनाव 9,16 का तरीका बन गया है. यह ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर 8,10,17,18 का स्वाद प्रणाली के साथ ही अन्य कीट प्रजातियों 19-23 की संख्या की जांच करने के लिए उपयोग किया गया है. यह है बहुत लिए compensating द्वारा टिप रिकॉर्डिंग विधि के प्रमुख कमियां में से एक overcame जो tastePROBE एम्पलीफायर का विकास, द्वारा सुविधा किया गयाGRN कार्रवाई क्षमता अत्यधिक प्रवर्धन या फ़िल्टरिंग 24 बिना दर्ज करने की अनुमति संदर्भ इलेक्ट्रोड और कीट Sensillum के बीच बड़े संभावित अंतर,. एक अन्य महत्वपूर्ण विकास रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोलाइट के रूप में 25 tricholine साइट्रेट का उपयोग किया गया था. टीसीसी परासारिता संवेदनशील GRN से प्रतिक्रियाओं को दबा है और 25 का विश्लेषण करने के लिए बहुत आसान कड़वा और चीनी tastants द्वारा उत्पन्न प्रतिक्रियाओं बनाने, नमक के प्रति संवेदनशील GRN को प्रोत्साहित नहीं करता है.यहाँ हम ड्रोसोफिला labellar sensilla की नोक रिकॉर्डिंग वर्तमान में कार्लसन प्रयोगशाला में किया जाता है वर्णन कैसे. इस प्रोटोकॉल एक उपयुक्त इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी कैसे उड़ान भरने को तैयार करने के लिए रिग,, और कैसे स्वाद रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के लिए स्थापित करने के लिए समझाना होगा. इस का उपयोग करते समय हम भी ड्रोसोफिला sensilla के सबसेट है, साथ ही कुछ आम समस्याएं और सामना हो सकता है कि संभावित समाधानों से रिकॉर्डिंग से प्राप्त की कुछ प्रतिनिधि डेटा पेशतकनीक.
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Protocol
निम्नलिखित प्रोटोकॉल येल विश्वविद्यालय के सभी जानवरों की देखभाल के दिशा निर्देशों के अनुरूप है.
1. अभिकर्मकों और उपकरण तैयारी
- रिकॉर्डिंग उपकरण सेटअप (चित्रा 1 ए).
- तापमान या नमी में बड़े बदलाव की स्वतंत्र और भी इस तरह के रेफ्रिजरेटर और सेंट्रीफ्यूज के रूप में बिजली और यांत्रिक शोर, के स्रोतों से अलग है कि रिग स्थापना के लिए एक कमरे का चयन करें.
चित्रा 1. रिकॉर्डिंग रिग सेटअप के (ए) अवलोकन. Stereomicroscope (एक) micromanipulators के माध्यम से, (ख). संदर्भ इलेक्ट्रोड धारक (ग) headstage (घ) के सामने मंच पर मुहिम शुरू की है विरोधी कंपन मंच पर मुहिम शुरू की है. मक्खी तैयारी के निर्देश पर humidified हवा धारा पहुंचाने एक दुकान प्लास्टिक ट्यूब (ई) भी टी पर मुहिम शुरू की हैमंच वह. headstage एक पीसी (ज) से जुड़ा है, जो डिजिटल अधिग्रहण प्रणाली (दास) (जी) से जुड़ा है, जो एम्पलीफायर (च), से जुड़ा है. इलेक्ट्रोड और आउटलेट ट्यूब (बी) विन्यास:. संदर्भ बाईं तरफ इलेक्ट्रोड, सही पर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड, और मक्खी तैयारी के निर्देश पर हवा धारा आउटलेट ट्यूब बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें. - विरोधी कंपन तालिका या मंच के केंद्र के लिए माउंट stereomicroscope.
- चुंबकीय खड़ा का उपयोग क्रमश खुर्दबीन के बाएँ और दाएँ, के संदर्भ इलेक्ट्रोड / कीट तैयारी और headstage / रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए micromanipulators देते हैं.
- ट्यूब उद्घाटन मक्खी तैयार करने के स्थान की ओर इशारा किया है कि इस तरह उन्मुख खुर्दबीन के पीछे, (चित्रा 1 बी देखें) के लिए एक तिहाई micromanipulator में माउंट आउटलेट प्लास्टिक ट्यूब.
- पर, लचीले प्लास्टिक टयूबिंग का उपयोगआंशिक रूप से पानी से भरे एक वैक्यूम फ्लास्क को tach आउटलेट प्लास्टिक ट्यूब. मक्खी की ओर आउटलेट प्लास्टिक ट्यूब के माध्यम से एक humidified हवा धारा पैदा करने, फ्लास्क में पानी के माध्यम से बुलबुला हवा के लिए एक छोटा सा मछलीघर पंप से कनेक्ट करें.
- सीधे तैयारी के नीचे सफेद कार्ड कागज के एक टुकड़े के माध्यम से प्रकाश को दर्शाती द्वारा तैयारी रोशन करने के लिए outputs orienting कंपन मेज से माउंट फाइबर ऑप्टिक प्रकाश स्रोत,. प्रकाश स्रोत की मेज पर आराम नहीं करता है सुनिश्चित करें. नोट: एक कागज डिस्क पर प्रकाश स्रोत को दर्शाती के लाभ दो गुना है: यह कल्पना करने के लिए sensilla आसान बनाने, इसके विपरीत में सुधार, और यह प्रत्यक्ष प्रकाश से नतीजा होगा कि तैयारी के ताप से बचाता है.
- आपूर्तिकर्ता पुस्तिका के अनुसार, डिजिटल अधिग्रहण प्रणाली (दास), और एक पर्सनल कंप्यूटर में दास में tastePROBE एम्पलीफायर प्लग करें. में पैर पेडल ट्रिगर प्लग और कार्यक्षेत्र के तहत की व्यवस्था. नोट: विद्युत पृथक दीवार एम्पलीफायर के लिए कुर्सियां और दास अत्यधिक Desir हैंसक्षम.
- विद्युत मगरमच्छ क्लिप और अछूता बिजली के तार और बिजली के टेप की लंबाई का उपयोग कर तालिका में धातु घटकों को जोड़ने के द्वारा माइक्रोस्कोप, micromanipulators, और प्रकाश स्रोत जमीन. विद्युत जमीन या बिजली की आपूर्ति प्लग के माध्यम से आधारित है जो दास, के निर्माण के लिए जोड़ने के द्वारा धातु मंच जमीन.
- पर्सनल कंप्यूटर पर चुनाव के दास के लिए उपयुक्त अधिग्रहण सॉफ्टवेयर स्थापित करें. नोट: डिजिटल अधिग्रहण ड्राइवरों पीसी पर ऑपरेटिंग सिस्टम के साथ संगत कर रहे हैं सुनिश्चित करें.
- सॉफ्टवेयर प्रवर्धन (10 100x) विन्यस्त करें, संकेत फ़िल्टरिंग, और नमूना दर (कम से कम 10 kHz) (आमतौर पर एक बेसल bandpass फिल्टर 100 हर्ट्ज-3, 000 हर्ट्ज से सेट). नोट: स्वाद न्यूरॉन्स से संकेत आयाम 0.5-2 एम वी रेंज में आम तौर पर कर रहे हैं, तो प्रदर्शन पैमाने उनके दृश्य की सुविधा के लिए निर्धारित है. नोट: 100 हर्ट्ज फिल्टर बाहरी बिजली के शोर को बाहर करने में मदद करता है, लेकिन, यह spikes के आकार में परिवर्तन और उन्नत कील छँटाई mor कर सकते हैंई चुनौती दे. वैकल्पिक रूप से, एक 1 हर्ट्ज फिल्टर इस्तेमाल किया जा सकता है.
- वैकल्पिक रूप से, एक फैराडे पिंजरे पूरे कंपन मेज के चारों ओर स्थापित किया जा सकता. हालांकि, एल्यूमीनियम पन्नी के छोटे चादरें आमतौर पर बाहरी वातावरण या अन्वेषक द्वारा उत्पन्न किसी भी शोर कम करने के लिए पर्याप्त हैं.
- तापमान या नमी में बड़े बदलाव की स्वतंत्र और भी इस तरह के रेफ्रिजरेटर और सेंट्रीफ्यूज के रूप में बिजली और यांत्रिक शोर, के स्रोतों से अलग है कि रिग स्थापना के लिए एक कमरे का चयन करें.
- कांच इलेक्ट्रोड तैयारी
चित्रा 2. संदर्भ और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड. (ए) के साथ, संदर्भ इलेक्ट्रोड में खींच लिया कांच capillaries की वृद्धि के तहत और टूट (बी) के टिप के बिना फोटोग्राफ, और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (सी). सफेद पट्टी 2 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.- संदर्भ खींचोएक विंदुक खींचने साधन का उपयोग कर एक गिलास केशिका से इलेक्ट्रोड. नोट: विंदुक खींचने कार्यक्रम की सटीक सेटिंग्स साधन से साधन करने के लिए अलग अलग होंगे. एक बहुत लंबे क्रमिक घटना को प्राप्त करने का प्रयास करें. हालांकि, पर्याप्त के लिए अनुमति नहीं दी जाएगी, जो इलेक्ट्रोड का पतला लंबाई का व्यास न तो बहुत पतली है बनाना; टिप मक्खी तैयारी (आंकड़े 2A और 2 बी) से पहले टूट जाएगा क्योंकि नोक पर छेद के आकार महत्वपूर्ण नहीं है स्वाद न्यूरॉन्स को नुकसान या लार ग्रंथियों टूटना सकता है जो labellum के स्थिरीकरण, और न ही बहुत बड़े,.
- एक विंदुक खींचने साधन का उपयोग कर फिलामेंट के साथ एक borosilicate ग्लास केशिका से रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड खींचो. संदर्भ इलेक्ट्रोड की तुलना में shallower है कि एक घटना है, और लगभग 10-15 माइक्रोन (चित्रा -2) 28 के एक ताकना व्यास को प्राप्त करने का प्रयास करें.
- Tastant समाधान तैयारी
- गिर्जे का चौकीदार-Ephrussi घंटी समाधान का प्रयोग करेंtion (बी एंड ई) संदर्भ इलेक्ट्रोड इलेक्ट्रोलाइट के रूप में. बी और ई से एक लीटर बनाने के लिये 7.5 छ NaCl, 0.35 ग्राम KCl, और 0.279 ग्राम CaCl भंग 2 ∙ ultrapure पानी की एक लीटर में 2H 2 हे. -20 डिग्री सेल्सियस पर छोटे aliquots स्टोर
- कड़वा या चीनी GRN प्रतिक्रियाओं को मापा जा रहे हैं, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड इलेक्ट्रोलाइट और tastant समाधान 25 के लिए विलायक के रूप में 30 मिमी tricholine साइट्रेट समाधान (टीसीसी) का प्रयोग करें. पानी सेल की प्रतिक्रियाओं को मापा जा रहे हैं, तो वैकल्पिक रूप से, 1-3 मिमी पोटेशियम क्लोराइड समाधान किया जा सकता है.
- Tastant समाधान बनाने के पाउडर के रूप में tastant की उचित मात्रा में वजन और एक प्रारंभिक शेयर एकाग्रता बनाने के लिए टीसीसी को जोड़ें. परीक्षण के लिए वांछित एकाग्रता उपज के लिए इस प्रारंभिक स्टॉक से धारावाहिक dilutions बनाने के लिए इसका उपयोग करें. नोट: tastants आसानी से पानी में भंग नहीं करते हैं, इथेनॉल जैसे एक और विलायक, प्रारंभिक स्टॉक एकाग्रता बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक उचित नियंत्रण टीसीसी के समाधान और tastant बिना विलायकइस मामले में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
- -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर aliquots दीर्घकालिक Tastant के रासायनिक गुणों पर निर्भर करता है, के लिए एक सप्ताह के लिए उपयोग की रिकॉर्डिंग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक tastant समाधान में से एक काम कर विभाज्य स्टोर.
2. ड्रोसोफिला तैयारी
चित्रा 3. रिकॉर्डिंग के लिए उड़ान भरने की तैयारी. मक्खी के पृष्ठीय छाती में संदर्भ इलेक्ट्रोड की (ए) निवेशन स्थिति. सफेद तीर संदर्भ इलेक्ट्रोड को इंगित करता है. (बी) के संदर्भ इलेक्ट्रोड के मध्यवर्ती स्थिति: गर्दन और सिर के माध्यम से उन्नत, सूंड अभी तक नहीं बढ़ाया. (सी, डी) labellum अंदर इलेक्ट्रोड की नोक, और सूंड के साथ अंतिम स्थिति में संदर्भ इलेक्ट्रोड के साथ उड़नापूरी तरह से बढ़ा. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
- तापमान और आर्द्रता नियंत्रित परिस्थितियों में उगाया अच्छी तरह से बनाए रखा मक्खी संस्कृतियों, से रिकॉर्डिंग के लिए नव eclosed मक्खियों लीजिए, और रिकॉर्डिंग से पहले ताजा संस्कृति शीशियों में 5-10 दिनों उन्हें उम्र.
- मक्खी तैयार करने से पहले 15-30 मिनट के लिए बर्फ पर माइक्रोस्कोप प्लेट शांत रहो.
- धीरे बैकफ़िल कांच संदर्भ में इस तरह के एक रीढ़ की हड्डी में सुई और 1 मिलीलीटर सिरिंज के रूप में 0.5 मिमी व्यास की एक लंबी, पतली प्लास्टिक सुई का उपयोग करते हुए बी और ई समाधान के साथ इलेक्ट्रोड और किसी भी बुलबुले बाहर नल. संदंश का उपयोग बंद टिप की छोटी राशि तोड़ और खुर्दबीन विदारक तहत देख, एक ऊतक के साथ शेष सभी बुलबुले बाहर आकर्षित करने के लिए केशिका क्रिया का उपयोग करें.
- स्लाइड बी और वायु बुलबुले परिचय नहीं, देखभाल करने के संदर्भ इलेक्ट्रोड धारक के तार पर संदर्भ इलेक्ट्रोड ई भरा.
- महाप्राण बनाया मक्खी वातशोषक का उपयोग कर, एक P200 विंदुक टिप में उड़ान भरनेट्यूबिंग से, जाल, और पिपेट टिप, 30-60 सेकंड के लिए बर्फ बाल्टी और ठंड में 29 जगह.
- , बर्फ से माइक्रोस्कोप थाली निकालें किसी भी नमी पोंछ, और खुर्दबीन के नीचे स्थिति. धीरे माइक्रोस्कोप की थाली पर पिपेट टिप से बाहर उड़ान भरने के लिए नल.
नोट: मक्खी पर्याप्त आसानी से हेरफेर करने के लिए स्थिर हो जाना चाहिए. - संदंश के अन्य जोड़ी के साथ छाती स्थिर जबकि पकड़े कम वृद्धि के तहत, धीरे, संदंश की एक जोड़ी के साथ forelegs हटा दें. पृष्ठीय पक्ष का सामना कर अपने उदर पक्ष पर मक्खी स्थिति. नोट: हमेशा यांत्रिक क्षति को कम करने के लिए तैयार करने की प्रक्रिया के दौरान हर समय संदंश के साथ labellum को छू से बचने के लिए सावधान रहना होगा.
- संदंश की एक जोड़ी के साथ जगह में मक्खी धारण करते हुए, पीछे पृष्ठीय छाती के midline पर संदर्भ इलेक्ट्रोड डालने. प्रवेश का एक सुझाव दिया कोण सिर (चित्रा 3) की दिशा में लगभग पैंतालीस डिग्री है.
- संदर्भ Electrod सुरक्षितमक्खी उच्च वृद्धि पर खुर्दबीन के नीचे दिखाई दे रहा है कि इस तरह के क्ले मॉडलिंग के साथ ई धारक. संदंश के दो जोड़े का उपयोग संदर्भ इलेक्ट्रोड धारक की ओर उड़ फिसलने से, गर्दन और सिर के माध्यम से कांच इलेक्ट्रोड पैंतरेबाजी और कोण. नोट: जल्दी लेकिन सुचारू रूप से काम, मक्खी अभी भी ठंडा (3B चित्रा) से स्थिर है, जबकि यह इस चरण को पूरा करने के लिए आसान है.
- आगे कांच संदर्भ इलेक्ट्रोड नीचे उड़ फिसलने जबकि इलेक्ट्रोड की नोक labellum अंदर है और सूंड पूरी तरह से (आंकड़े -3 सी और 3 डी) बढ़ा दिया है जब तक धीरे, संदंश की एक जोड़ी के साथ सूंड विस्तार. नोट: इस मक्खी को नुकसान पहुंचा और / या न्यूरॉन्स स्वाद और रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है, सूंड ऊतक के किसी भी भाग पंचर या संदर्भ इलेक्ट्रोड के साथ labellum के किनारे तान देना नहीं ख्याल रखना.
3. Labellar Sensilla से रिकॉर्डिंग
उच्च वृद्धि के तहत सही पर संपर्क के लिए गठबंधन रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के साथ छोड़ दिया पर मक्खी तैयारी की चित्रा 4. मक्खी से रिकॉर्डिंग. (ए) labellum. (बी) रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड और उच्च वृद्धि के तहत संपर्क में labellum पर एकल Sensillum,. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
- हमेशा के लिए प्रक्रिया की रिकॉर्डिंग के दौरान किसी भी उपकरण को छूने के लिए विरोधी कंपन तालिका या मंच की धातु की सतह को छू द्वारा खुद जमीन! नोट: यह circuitry कि नुकसान पहुंचा सकता है के रूप में headstage करने के लिए एक स्थिर प्रभार देने के लिए नहीं अत्यंत महत्वपूर्ण है.
- Micromanipulator से सुरक्षित संदर्भ इलेक्ट्रोड धारक recordin की हवा मेज पर घुड़सवारजी रिग. उच्च वृद्धि (आमतौर पर कम से कम 140X) के तहत देखने की खुर्दबीन क्षेत्र में labellum की स्थिति एक पालि,, और humidified हवा धारा के साथ लाइन में.
- Humidified हवा धारा, कंप्यूटर, दास, और एम्पलीफायर पर मुड़ें. ओपन अधिग्रहण सॉफ्टवेयर.
- कुल्ला और वांछित tastant साथ कांच रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड भरें.
- ट्यूब में कम से कम दस बार के माध्यम से पानी की छोटी मात्रा में खींचने के लिए एक सिरिंज और प्लास्टिक टयूबिंग 28 का उपयोग करके ultrapure पानी के साथ कांच रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड कुल्ला.
- Tastant के साथ कम से कम पांच बार रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड कुल्ला. लगभग एक तिहाई tastant साथ आधे रास्ते पूरी रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड भरें और टयूबिंग से हटा दें. हवा बुलबुले हैं, तो रिहा या बस इलेक्ट्रोड भर के लिए नल.
- हवा बुलबुले परिचय नहीं के रूप में इतनी जल्दी और आसानी से headstage के चांदी के तार पर इलेक्ट्रोड स्लाइड.
- Tastant से भरे रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के साथ एकल Sensillum उत्तेजित.
- Micromanipu का प्रयोग करेंब्याज की Sensillum के साथ गठबंधन रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड लाने के लिए lator.
- एम्पलीफायर का अधिग्रहण मोड ट्रिगर करने के लिए पैर पेडल प्रेस.
- यह Sensillum और रिकॉर्डिंग शुरू की टिप के साथ संपर्क में आता है, जब तक ध्यान से micromanipulator के ठीक नियंत्रण दस्ता के साथ रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड अग्रिम.
- 1-2 सेकंड के बाद इलेक्ट्रोड निकालें.
- अगर वांछित, अन्य sensilla साथ 3.5 कदम दोहराएँ. नोट: एक ही Sensillum को प्रस्तुतियों के बीच में कम से कम 1 मिनट रुको. समय की एक लम्बी अवधि के लिए एक एकल tastant साथ रिकॉर्डिंग, तो tastant समाधान बाहर शुष्क कर सकते हैं और टिप में समाधान अधिक केंद्रित हो सकता है. यह धीरे केशिका क्रिया द्वारा तरल पदार्थ की एक छोटी राशि निकालने के लिए चिकनी कागज के साथ कांच इलेक्ट्रोड की नोक से संपर्क करके उपचार किया जा सकता है.
- , एक और tastant के लिए प्रतिक्रियाओं को दर्ज कुल्ला और नया tastant साथ लोड रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड और 3.4 कदम दोहराने के लिए. नोट: अच्छी तरह tastants के बीच इलेक्ट्रोड rinsing ABS हैपार संक्रमण से बचने के लिए olutely महत्वपूर्ण.
- ऐसी तारीख, जीनोटाइप, और tastants के रूप में जानकारी, पहचान के साथ समय समय पर डेटा फ़ाइलों को सहेजें. नोट: यह डेटा विश्लेषण के लिए रिकॉर्डिंग सत्र के दौरान tastant और प्रत्येक प्रस्तुति के Sensillum पहचान के एक प्रश्न के लिखित रिकॉर्ड रखने के लिए महत्वपूर्ण है.
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Representative Results
चित्रा 5A एक चीनी, सुक्रोज के लिए एक एल Sensillum की प्रतिक्रिया से पता चलता है. एक ही Sensillum एक कड़वा परिसर का जवाब नहीं है, berberine. चित्रा 5 ब एक कड़वा उत्तरदायी न्यूरॉन होता है जो एक मैं प्रकार Sensillum, berberine के जवाब में बड़ा आयाम spikes, और सुक्रोज के जवाब में छोटे आयाम spikes प्रदर्शित करता है कि पता चलता है. मैं टीसीसी के लिए वास्तव में कोई प्रतिक्रिया (चित्रा 5) प्रदर्शित sensilla जबकि एल, विलायक नियंत्रण, टीसीसी के लिए एक न्यूनतम पृष्ठभूमि प्रतिक्रिया प्रदर्शित sensilla. Labellar GRNs की नमक और पानी की प्रतिक्रियाओं पर अधिक जानकारी के लिए, Hiroi 10 देखें.
चित्रा 5. जंगली प्रकार ड्रोसोफिला labellar प्रतिक्रियाओं के प्रतिनिधि निशान (ए) एल sensillu 100 मिमी sucrose (जैस), 1 मिमी berberine (हिट), और 30 मिमी टीसीसी. (बी) एम. प्रतिक्रिया मैं सफलता, दिसंबर, और टीसीसी के जवाब sensillar. Arrowhead प्रत्येक रिकॉर्डिंग की शुरुआत में होता है कि संपर्क विरूपण साक्ष्य इंगित करता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 6. प्रतिनिधि suboptimal electrophysiological परिणाम है. (ए) संकेत के पूर्ण अभाव (बी) 50/60 हर्ट्ज "शोर" (सी) स्टोकेस्टिक शोर (डी) अकेले (ई) कड़वा GRN (खुला त्रिकोण) और mechanosensory न्यूरॉन (फायरिंग mechanosensory न्यूरॉन गोलीबारी दोनों त्रिकोण) भर दिया./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig6highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
Labellar sensilla कारण आकारिकी और संरचनात्मक संगठन में मतभेद की रिकॉर्डिंग के आराम में भिन्नता है. कभी कभी एक Sensillum, किसी भी tastants के लिए एक सकारात्मक प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना करने के लिए जाना जाता है कि एक भी जवाब नहीं है. यह तब होता है, जिसके साथ आवृत्ति Sensillum प्रकार पर निर्भर करता है. एल sensilla सबसे लगातार उत्तरदायी हैं और वजह से उनकी लंबाई का उपयोग करने के लिए अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं. सामान्य तौर पर, एस sensilla लगातार उत्तरदायी हैं, लेकिन उनकी छोटी लंबाई और labellum पर स्थिति अच्छी संपर्क चुनौतीपूर्ण बना. मैं तैयारी की कोण पर निर्भर करता है, और अधिक आसानी से पहुँचा जा सकता है sensilla, लेकिन, वे अधिक बार अनुत्तरदायी हैं. किसी भी मक्खी तैयार करने पर, मैं sensilla का एक बड़ा अनुपात एल या एस sensilla से अनुत्तरदायी हो सकता है. आनुवंशिक पृष्ठभूमि के रूप में अच्छी तरह से स्वाद प्रतिक्रियाओं की निरंतरता को प्रभावित कर सकते हैं. Transgenes जीई को प्रभावित संभव है, क्योंकि उदाहरण के लिए, कुछ ट्रांसजेनिक मक्खियों, जंगली प्रकार से भी कम समय में लगातार प्रतिक्रियाओं प्रदर्शित कर सकता हैमक्खी के नेरल स्वास्थ्य. उत्परिवर्ती मक्खियों विशेष रूप से रिकॉर्ड करने की चुनौती दे रहे हैं - हम w कि मनाया है.
कोई spikes (चित्रा 6A) मनाया जाता है यानी एक आम तकनीकी समस्या, संकेत की कमी है. एक ही मक्खी पर है कि एक ही वर्ग के अन्य लोगों के जवाब हो सकता है, जबकि पहले, कभी कभी एक विशेष Sensillum, अनुत्तरदायी हो सकता है. दूसरा, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड या संदर्भ इलेक्ट्रोड में एक हवाई बुलबुले हो सकता है. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड संदिग्ध है, यह बस को हटाने और कांच इलेक्ट्रोड refilling, धीरे दोहन और कोई बुलबुले मौजूद हैं सुनिश्चित करने के लिए वृद्धि के तहत निरीक्षण से तय किया जा सकता है. संदर्भ इलेक्ट्रोड एक नई उड़ान भरने के साथ प्रस्तुत करने का एक बार फिर परदे, एक हवाई बुलबुले को रोकने के लिए संदिग्ध है इस समस्या को हल करने के लिए सबसे आसान तरीका है. तीसरा, कभी कभी बिजली के संकेत ले जाने तारों सुरक्षित रूप से नहीं जोड़ा जा सकता है. चौथा, कभी कभी प्राप्त हो रही वोल्टेज संकेत से अधिक या कम भी हो सकता हैएम्पलीफायर उपाय कर सकते हैं रेंज. TastePROBE एम्पलीफायर का उपयोग करते हैं, तो क्लिप या सूचक प्रकाश नीचे क्लिप या तो पर है देखने के लिए जाँच. क्लिप सूचक प्रकाश पर है, तो आधे रास्ते से अधिक नहीं भरने की देखभाल और नमी को दूर करने के लिए बाहर नीचे पोंछते समस्या का समाधान होगा, जबकि अक्सर, हटाने और कांच संदर्भ इलेक्ट्रोड refilling. कांच इलेक्ट्रोड के बाहर पर नमी एम्पलीफायर की सीमा से बाहर संकेत भेजने, इलेक्ट्रोड और तार के धातु के मामले के बीच एक बिजली के कनेक्शन बना सकते हैं. कि मुद्दा, या क्लिप नीचे सूचक प्रकाश को हल करने में विफल रहता है पर, व्यवस्था में बिजली के शोर से निपटने के लिए निम्नलिखित पैराग्राफ में सुझावों पर विचार कर रहा है. पांचवां, कभी कभी एक मक्खी की तैयारी के दौरान मर जाते हैं या तैयारी के स्वस्थ उपस्थिति के बावजूद अन्यथा अनुत्तरदायी है हो सकता है. ऐसे आर्द्रता, तापमान, आयु, भोजन की गुणवत्ता, और microbiota, साथ ही एक कम स्वस्थ आनुवंशिक पृष्ठभूमि के रूप में विकास की स्थिति, एक उच्च करने के लिए योगदान कर सकता"अनुत्तरदायी" मक्खियों का अनुपात. अन्त में, शायद ही कभी, उपकरणों का एक टुकड़ा nonfunctional हो सकता है. Headstage, एम्पलीफायर, और digitizer: संकेत लगातार हासिल नहीं किया जा रहा है और अन्य सभी संभावनाओं को समाप्त कर दिया गया है, तो यह उपकरण का एक टुकड़ा की कार्यक्षमता की जांच के लिए आवश्यक हो सकता है. ऐसा करने के लिए सबसे आसान तरीका है कार्यात्मक हो जाता है कि एक रिग से दूसरे के साथ उपकरणों का एक टुकड़ा जगह है. केवल एक रिग एक प्रयोगशाला में मौजूद है, तो एक संकेत जनरेटर इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों की कार्यक्षमता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
एक अन्य आम तकनीकी मुद्दा एक स्वाद प्रोत्साहन (आंकड़े 6B-ई) के जवाब में गोली चलाई neuronal कार्रवाई क्षमता का प्रतिनिधित्व करने के लिए प्रकट नहीं होता है कि एक मनाया संकेत है जो "शोर" का है. सबसे पहले, संकेत पास रिकॉर्डिंग उपकरण या अन्य उपकरण (चित्रा 6B) से 50/60 हर्ट्ज विद्युत शोर से हो सकता है. संदर्भ इलेक्ट्रोड पर कोई मक्खी, प्रत्यक्ष साथly घंटी समाधान की एक बूंद के माध्यम से रिकॉर्डिंग और संदर्भ इलेक्ट्रोड कनेक्ट और ऊपर का बटन दबाकर एम्पलीफायर पर पासथ्रू मोड में प्रवेश. शोर पासथ्रू संकेत पर नमूदार है, तो यह संभावना शोर मक्खी तैयारी के लिए बाहरी है कि इसका मतलब है. सभी रिग उपकरण ठीक से जमीन और उस टिन पन्नी ढाल जगह में हैं सुनिश्चित करें. शोर समाप्त हो रहा है, तो देखते हैं, या अतिरिक्त घटकों को ढाल पास उपकरण unplugging की कोशिश करो. दूसरा, शोर स्टोकेस्टिक (चित्रा 6C) दिखाई दे सकते हैं. इस मामले में, 50/60 हर्ट्ज शोर के लिए विस्तृत चरण अभी शुरू किया जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, रिकॉर्डिंग उपकरण के विभिन्न घटकों, विशेष रूप से headstage और / या एम्पलीफायर unplugging या बदलने का प्रयास करें. इलेक्ट्रोड सीधे जुड़े हुए हैं जब कोई शोर से मनाया जाता है, तो स्रोत होने की संभावना मक्खी तैयारी ही है. यह उड़ान भरने के नुकसान को कम करने के ख्याल रख रही है, रिकॉर्डिंग के लिए एक नया मक्खी तैयार करने के लिए आमतौर पर सबसे सरल है. तीसरा, सक्रियणSensillum भीतर निहित mechanosensory न्यूरॉन (आंकड़े 6D और 6E) देखा जा सकता है. Sensillum हटाया हुआ या रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के आवेदन पर तुला, या संपर्क के दौरान टकरा रहा है अगर mechanosensory न्यूरॉन सक्रिय किया जा सकता है. spikes उनके अनियमित पैटर्न, द्वारा chemosensory spikes से आमतौर पर साफ़ कर रहे हैं आमतौर पर यांत्रिक विघटन, नहीं एक स्वाद उत्तेजना के आवेदन के साथ समन्वय दिखाई देता है. Mechanosensory फायरिंग Sensillum साथ रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड aligning और Sensillum की टिप के साथ संपर्क बनाने के लिए आवश्यक है के रूप में केवल जहाँ तक धीरे आगे बढ़ कर कम किया जा सकता है. चौथा, "फटा" स्टोकेस्टिक कील मनाया जा सकता है, इस neuronal फायरिंग के समान दिखाई देता है, लेकिन उच्च आवृत्ति और आयाम की है, एक उत्तेजना के जवाब में समन्वित नहीं. यह आमतौर पर नहीं उपकरण से, मक्खी तैयार करने से ही यह परिणाम है, और संदर्भ इलेक्ट्रोड से बाधित एक तंत्रिका के कारण हो सकता है. </ P>
एक तीसरा आम तकनीकी मुद्दे तैयारी labellum एक Sensillum मुश्किल के साथ संबंध बनाता है, जो करने के लिए कदम है, जिससे मोबाइल है कि है. सबसे पहले, मक्खी तैयारी अस्थिर हो सकता है. संदर्भ इलेक्ट्रोड सही ढंग से तैनात है कि जाँच करें, और यदि आवश्यक हो तो बदल डालना. दूसरा, संदर्भ इलेक्ट्रोड सूंड और labellum स्थिर आयोजित करने की नोक पर भी पतली हो सकती है. मक्खी तैयार करने से पहले टिप की एक लंबी राशि को तोड़ने की कोशिश करो. कि पर्याप्त नहीं है, तो संदर्भ इलेक्ट्रोड का आकार बदलने के लिए जरूरत के रूप में, पिपेट खींचने सेटिंग्स बदल डालना शंकु अधिक क्रमिक है और व्यास थोड़ी वृद्धि हुई है कि इस तरह के. तीसरा, मक्खी असामान्य रूप से सक्रिय हो सकता है. एक नई उड़ान भरने के साथ तैयारी रीमेक.
जनरल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी जानकारी और अधिक समस्या निवारण मार्गदर्शन के लिए, एक्सॉन गाइड 30 को देखें.
इस PUBLICAT में उल्लिखित टिप रिकॉर्डिंग विधि के लिए कुछ सीमाएं हैंआयन. एक सीमा है कि यह इलेक्ट्रोलाइट के साथ रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड में वितरित किया जाता है के रूप में tastant, पानी में घुलनशील होना चाहिए. DMSO तरह एक विलायक का उपयोग संभव फेरोमोन 4 के साथ कुछ रिकॉर्डिंग बना दिया है, हालांकि यह हाइड्रोकार्बन यौगिकों के साथ रिकॉर्डिंग की कठिनाई बढ़ जाती है. वैकल्पिक तरीकों Sensillum की सॉकेट आधार से रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के लिए एक तेज टंगस्टन इलेक्ट्रोड का उपयोग, या tastant रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड का स्वतंत्र रूप से वितरित किया जाता है जो दोनों में, Sensillum की ओर दीवार से रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के लिए एक कांच इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए कर रहे हैं 26,27. हालांकि, इन तकनीकों चुनौती दे रहे हैं और एक ओर दीवार रिकॉर्डिंग स्वाद अंग को अधिक हानिकारक हैं. एक और सीमा throughput कम कर देता है जो tastant समाधान (प्रोटोकॉल कदम 3.3), के आदान प्रदान के लिए आवश्यक समय की राशि है, और अक्सर घ्राण रिकॉर्डिंग में देखा जटिल उत्तेजना मानदंड के उपयोग की सीमा. स्वाद रिसेप्टर न्यूरॉन्स कुछ परिवर्तनशीलता प्रदर्शनआयाम में है कि कील आवृत्ति पर निर्भर है. यह सुविधा neuronal पहचान का आकलन जटिल और उन्नत कील 25,31-33 अधिक मुश्किल छँटाई कर सकते हैं. सामान्यतः घ्राण रिकॉर्डिंग में किया जाता है इसके अलावा, क्योंकि टिप रिकॉर्डिंग विधि की प्रकृति में से एक, तुरंत पहले एक प्रोत्साहन के वितरण के लिए बेसल फायरिंग रिकॉर्ड नहीं कर सकते. इन कमियों के बावजूद, टिप रिकॉर्डिंग विधि सफलतापूर्वक ड्रोसोफिला और अन्य प्रजातियों 8,10,17,19,21-23 में स्वाद कोडिंग के सिद्धांतों के कई स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
यहाँ रेखांकित मक्खी तैयारी तकनीक सिर्फ एक संभव दृष्टिकोण है. इस विधि तैयारी में सूंड ब्याज की Sensillum साथ रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के संपर्क की सुविधा के लिए एक विस्तारित स्थिति में तय हो गई है, और संदर्भ इलेक्ट्रोड जानवर में डाला जाता है. अन्य तैयार करने के तरीकों क्ले मॉडलिंग की एक गेंद को जानवर के बढ़ते और पतली स्ट्रिप्स का उपयोग शामिल हैसूंड 34 को ठीक करने के लिए टेप. दरअसल, जब तक ऊतक स्थिरीकरण और संदर्भ इलेक्ट्रोड नियुक्ति के बुनियादी मानकों से मुलाकात कर रहे हैं, जैसा कि अन्य स्थानों में या अलग अलग प्रजातियों से sensilla बहुत ही रास्ते में से दर्ज किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, पैर sensilla थोड़ा 35 कांच के किनारे से पैर splaying, ठीक कीट पिन के साथ एक Sylgard लेपित खुर्दबीन स्लाइड के लिए एक मक्खी के शरीर फिक्सिंग से दर्ज किया जा सकता है. यह स्वाद रिसेप्टर न्यूरॉन्स में संकेत पारगमन की जांच के लिए रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के माध्यम से sensilla को औषधीय एजेंटों वितरित करने के लिए संभव है. यह बस वांछित परिणाम के लिए सबसे अच्छा काम करता है जो दृष्टिकोण निर्धारित करने के लिए प्रयोग की एक काम है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम (आरडी) के लिए एक एनआरएसए predoctoral अनुदान 1F31DC012985 द्वारा और जे.सी. लिए एनआईएच अनुदान द्वारा समर्थित किया गया
हम मदद के संकलन के आंकड़े के लिए पांडुलिपि, डॉ. रयान यूसुफ पर सहायक टिप्पणियों के लिए डॉ. Linnea वेइस का शुक्रिया अदा करना, और सहायक तकनीकी सलाह के लिए डॉ. फ्रेडरिक मैरियन चुनाव होगा. हम भी चार समीक्षकों की उपयोगी टिप्पणी को स्वीकार करना होगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150X magnification with long working distance table mount stand |
| Antivibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
| Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5 ml serological pipette for extended range |
| Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5 mm diameter |
| Retort Stand | generic | ||
| Outlet Plastic Tube | generic, 1 cm diameter | ||
| Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
| 500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
| Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
| Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
| White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
| Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
| Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
| Insulated Electrical Wire | Generic | ||
| Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use LabView with NI-6251 |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
| Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10-40X magnification |
| Ice Bucket | Generic | ||
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
| 1 ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
| 10 ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
| Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |
References
- Glendinning, J. I., Jerud, A., Reinherz, A. T. The hungry caterpillar: an analysis of how carbohydrates stimulate feeding in Manduca sexta. The Journal of experimental biology. 210, 3054-3067 (2007).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139, 234-244 (2009).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell reports. 1, 599-607 (2012).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a review. Cell and tissue research. 275, 3-26 (1994).
- Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoological Science. 19, 1009-1018 (2002).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The Molecular and Cellular Basis of Bitter Taste in Drosophila. Neuron. 69, 258-272 (2011).
- Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. Journal of Morphology. 150, 327-341 (1976).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 61, 333-342 (2004).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science (New York, N.Y.). 287, 1830-1834 (2000).
- Cameron, P., Hiroi, M., Ngai, J., Scott, K. The molecular basis for water taste in Drosophila. Nature. 465, 91-95 (2010).
- Croset, V., et al. Ancient protostome origin of chemosensory ionotropic glutamate receptors and the evolution of insect taste and olfaction. PLoS Genet. 6, e1001064 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development (Cambridge, England). 118, 401-415 (1993).
- Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36, 288-292 (2004).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science (New York, N.Y.). 122, 417-418 (1955).
- Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56, 503-516 (2007).
- Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67, 555-561 (2010).
- Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45, 871-876 (1999).
- Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 7281-7287 (2002).
- Sanford, J. L., Shields, V. D., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Die Naturwissenschaften. 100, 269-273 (2013).
- Merivee, E., Must, A., Milius, M., Luik, A. Electrophysiological identification of the sugar cell in antennal taste sensilla of the predatory ground beetle Pterostichus aethiops. J Insect Physiol. 53, 377-384 (2007).
- Popescu, A., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. Journal of comparative physiology. A, Neuroethology. 199, 403-416 (2013).
- Marion-Poll, F., Der Pers, J. V. an Un-filtered recordings from insect taste sensilla. Entomologia Experimentalis et Applicata. 80, 113-115 (1996).
- Wieczorek, H., Wolff, G. The labellar sugar receptor of Drosophila. J. Comp. Physiol. A. Neuroethol Sens. Neural Behav. Physiol. 164, 825-834 (1989).
- Morita, H. Initiation of spike potentials in contact chemosensory hairs of insects. III. D.C. stimulation and generator potential of labellar chemoreceptor of calliphora. Journal of cellular and comparative physiology. 54, 189-204 (1959).
- Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2, e661 (2007).
- Benton, R., Dahanukar, A. Electrophysiological recording from Drosophila taste sensilla. Cold Spring Harbor protocols. 2011, 839-850 (2011).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. , e1725 (2010).
- Axon Instruments. The Axon Guide for Electrophysiology & Biophysics Laboratory Techniques. , (1993).
- Fujishiro, N., Kijima, H., Morita, H. Impulse frequency and action potential amplitude in labellar chemosensory neurones of Drosophila melanogaster. Journal of insect physiology. 30, 317-325 (1984).
- Marion-Poll, F., Tobin, T. R. Software filter for detecting spikes superimposed on a fluctuating baseline. Journal of neuroscience. 37, 1-6 (1991).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem Senses. 28, 671-679 (2003).
- Marion-Poll Lab Website. , Available from: http://taste.versailles.inra.fr/fred (2013).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 56, 139-152 (2003).
