Summary
このプロトコルは、 ショウジョウバエにおいてlabellar味覚ニューロンによって発射活動電位応答の細胞外記録を記述する。
Abstract
昆虫の周辺味覚応答は強力な電気生理学的手法を用いて調査することができます。ここで説明する方法は、昆虫の神経系は、その環境における味覚刺激から受ける感覚入力を反映して、研究者が直接かつ定量味覚応答を測定することができます。このプロトコルは、この手法を実行中のすべての重要なステップの概要を説明します。このように必要な機器や記録に適した環境の選択などの電気生理学リグの組み立ての重要なステップは、線引きされています。我々はまた、適切な参照と記録電極を行うことで、記録のために準備する方法について説明し、味物質のソリューション。我々は、詳細に口吻を固定するために、フライにガラス参照電極を挿入することによって昆虫を調製するために使用される方法を記載している。私たちは、砂糖と苦味化合物に反応して味覚ニューロンによって発射電気インパルスの痕跡を示している。プロトコルの態様は、トンであるechnically挑戦し、我々はそのような信号や、システム内の過度のノイズがないこと、および潜在的な解決策として、発生する可能性のあるいくつかの一般的な技術的な課題の広範な記述が含まれています。そのような技術は、時間的に複雑な刺激を送達する送達を刺激する直前に発射背景を観察する、または都合よく水不溶性の味覚化合物を使用できないなどの制約を有する。これらの制限にもかかわらず、（プロトコルで参照マイナーバリエーションを含む）は、この技術は、化合物を味わうために、ショウジョウバエのニューロンの応答を記録するための広く受け入れられた手順の標準です。
Introduction
味覚は、昆虫は、可溶性の化学物質の広大な範囲を検出することを可能にし、栄養価の高い物質の受け入れに重要な役割、または有害または有毒1の拒絶を果たしている。味はまた、フェロモン1-5を検出することにより、配偶者選択において役割を果たしていると考えられている。これらの重要で多様な機能は、感覚系、環境手がかりを、関連する行動出力に変換する方法に昆虫味覚系調査の説得力のある目標ました。
キイロショウジョウバエの味覚系の主要ユニットは味の毛、または感覚子である。分子は、その先端2,6の細孔を経由して感覚子を入力してください。感覚器は唇弁、脚、翼マージン、および咽頭6に見られる。唇弁に、感覚器の数と位置がステレオタイプされている。ロング（L）、中間（I）、ショート（S：3形態的長さに基づいて、感覚器のクラスがあります。 ）7,8を感覚器。各感覚子は2（Iタイプ）または4（L-およびSタイプ）味覚受容ニューロン（GRNs）9のいずれかが含まれます。異なるGRNsは味覚刺激の異なるカテゴリに対応：苦い、砂糖、塩および浸透圧7,10および味覚受容体8,11-13の異なるサブセットを発現する。唯一のIとSタイプの感覚器は苦い応答GRNs 8,10が含まれています。食道下神経節（SOG）へGRNsプロジェクトと味分子によるそれらの活性化は、行動反応6で、その結果、復号化のために、より高い中枢神経系に中継される。ニューロンの比較的少数の分子と行動分析への従順は、 ショウジョウバエの味覚系一般的な味覚システムの調査のための優れたモデルにする。システムは、遺伝的変異またはGAL4-UAS発現システムを介して操作することができる相対的な容易さにも貴重なツール14,15として機能します。
ontent ">これらの感覚器は唇弁の表面から突出しているので、それらは電気生理学のための優れた標的となる。GRNsの焼成は、細胞外記録を用いてモニターすることができる。歴史的には、中に挿入さガラス電極を使用して側壁記録方法ニューロンの活動を記録する感覚子、26が用いられていたが、この方法は実行するのに技術的に困難であり、それは各調製物から長い間記録することが困難であり、その電極と神経細胞の応答を測定する先端記録方法、同時に味物質を提供し、以来、選択肢9,16の方法になっている。これは、 キイロショウジョウバエ 8,10,17,18の味覚系だけでなく、他の昆虫種19〜23の数を調査するために利用されてきた。それが持っている大幅に補償することによって、先端記録方法の主要な欠点の一つを克服tastePROBE増幅器の開発により容易化されてGRN活動電位が過剰に増幅やフィルタリング24ずに記録されることを可能にする基準電極と昆虫感覚子との間に大きな電位差が、。もう一つの重要な開発は、記録電解質25としてtricholineクエン酸を使用することであった。 TCCは浸透圧モル濃度の影響を受けやすいGRNからの応答を抑制し、25を分析する方がはるかに簡単苦いと砂糖味物質によって生成された応答を作り、塩感受性GRNを刺激しない。ここでは、 ショウジョウバエ labellar感覚器の先端記録は現在、カールソンの実験室で行われている方法を説明します。このプロトコルは、ハエを準備する方法は、適当な電気生理学リグを構築する方法を説明しますと、味の録音を実行する方法。我々はこれを使用する際に遭遇する可能性があるショウジョウバエの感覚器のサブセットから録音したいくつかの代表的なデータだけでなく、いくつかの一般的な問題と解決策をも提示テクニック。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
次のプロトコルは、エール大学のすべての動物保護ガイドラインに準拠しています。
1。試薬および器具の準備
- 録音機器のセットアップ（ 図1A）。
- 温度や湿度の大きな変化が無く、また冷蔵庫や遠心分離器などの電気的、機械的ノイズの発生源から分離されているリグのセットアップのための部屋を選択してください。
図1。 （A）記録リグセットアップの概要。実体顕微鏡（a）から（b）の参照電極ホルダー（c）の防振プラットフォーム上に搭載されているが、マイクロマニピュレーターを介して、ヘッドステージの（d）とは反対側のプラットフォームに搭載されている。ハエの調製に向け加湿空気流を送出する出口プラスチックチューブ（e）はまた、Tに搭載されているプラットフォーム彼。ヘッドステージは、PC（時間）に接続されているデジタル収集システム（DAS）から（g）に接続され、増幅器（f）は、接続されている。 （B）の電極および出口管の構成：左の参照電極は、右側の電極と、フライの準備に向け空気流出口管を記録拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。 - 除振台またはプラットフォームの中心にマウント実体顕微鏡。
- 磁気スタンドを使用して、それぞれ、顕微鏡の左右に参照電極/昆虫準備とヘッドステージ/記録電極用マニピュレーターを取り付けます。
- チューブ開口は、フライプレップの位置の方を向いているように配向顕微鏡の後方（ 図1B参照 ）、第3マイクロマニピュレーターにマウント·出口プラスチックチューブ。
- で、可撓性プラスチックチューブを用いてタコメータ出口プラスチックチューブ部分的に水で満たされた真空フラスコへ。フライに向けた出口プラスチックチューブを通して加湿した空気流を発生させる、フラスコ内の水を介してバブル空気に小さな水槽のポンプを接続します。
- 直接調製下記のホワイトカード一枚の紙を介して光を反射させて製剤を照明するために出力を向ける振動台オフ実装光ファイバー光源。光源は、テーブル上に置かないようにしてください。注：ペーパーディスク上に光源を反射するの利点は二つある：それは視覚化する感覚器やすくなり、コントラストが向上し、直接光から生じる製剤の加熱を防止する。
- 供給業者のマニュアルに従ってパーソナルコンピュータにデジタル取得システム（DAS）、およびDASへのプラグtastePROBE増幅器。フットペダルトリガを電源に接続し、ワークスペースの下に配置します。注：電気的に絶縁された壁のアンプ用のソケットおよびDASは非常DESIRですでき。
- 電気ワニ口クリップ、絶縁電線や電気テープの長さを使用してテーブルに金属部品を接続することにより、顕微鏡、マイクロマニピュレータ、および光源を接地してください。電気的に電源プラグを介して接地される接地またはDASを構築するに接続することによって、金属プラットフォームを粉砕した。
- パソコン上で選択したDASのための適切な収集ソフトウェアをインストールします。注：デジタル取得ドライバーは、PC上のオペレーティングシステムと互換性があることを確認してください。
- ソフトウェア増幅（100×10）を構成し、信号フィルタリング、およびサンプリング·レート（少なくとも10キロヘルツ）（典型的には、ベッセルバンドパスフィルタは、100Hz-3、000ヘルツから設定）。注：味覚ニューロンからの信号振幅が0.5 mVの範囲で、典型的であるので、表示スケールは、その視覚化を容易にするように設定されている。注：100 Hzフィルタは無関係な電気ノイズを除外するのに役立つが、それはスパイクの形状を変化させ、高度なスパイクソーティング形態素を行うことができE挑戦。あるいは、1 Hzフィルタを使用することができる。
- 必要に応じて、ファラデーケージは、全振動テーブルの周りに設定することができます。しかしながら、アルミニウム箔の小さなシートは、通常、外部環境又は調査者によって生成されたノイズを低減するのに十分である。
- 温度や湿度の大きな変化が無く、また冷蔵庫や遠心分離器などの電気的、機械的ノイズの発生源から分離されているリグのセットアップのための部屋を選択してください。
- ガラス電極の準備
図2を参照し、記録電極（A）と、基準電極に引き込まガラスキャピラリーの倍率下で破断（B）チップのない写真、及び記録電極（C）。白いバーが2ミリメートルを表しています。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。- リファレンスを引くピペットプラー器具を用いてガラス毛細管から電極。注：ピペットプラープログラムの正確な設定は、機器から機器へ変化します。非常に長い緩やかなテーパーを達成しよう。しかし、十分なために許可しないであろう、電極のテーパー長さの直径はいずれも薄すぎることを確認してください。先端がフライの準備（ 図2Aおよび2B）の前に切断されますので、先端の孔の大きさは重要ではない味覚神経細胞に損傷を与えたり、唾液腺を破裂できた唇弁の固定化、また大きすぎる。
- ピペットプラー装置を使用して、フィラメントとホウケイ酸ガラスキャピラリーからの記録電極を引き出します。参照電極に比べて浅く、テーパ、そして約10〜15ミクロン（ 図2C）28の孔径を達成しよう。
- 味物質のソリューションの準備
- ビードル - ヴィラエフルシリンガーソリューションを使用してください参照電極電解質としてのTiON（B＆E）。 B＆Eの1リットルを作るために、7.5グラムのNaCl、0.35グラムのKCl、および0.279グラムの塩化カルシウムを溶解させる2∙超純水1リットル中の2H 2 O。 -20℃で、より少量を保存する
- 苦味や糖GRN応答が測定される場合、記録電極電解質と味物質溶液25の溶媒として、30mMのクエン酸溶液tricholine（TCC）を使用。水セルの応答が測定される場合に代替的には、1〜3 mMの塩化カリウム溶液を用いることができる。
- 味物質溶液を作製するためには、粉末状で味物質の適切な量を計量し、初期ストック濃度を作るために、TCCに追加する。テストのための所望の濃度を得るために、この最初のストックから、連続希釈液を作るために使用します。注：味物質は、水に容易に溶解しない場合は、エタノールなどの他の溶媒は、初期ストック濃度を作製するために使用することができる。味物質なしのTCCと溶媒の適切な制御ソリューションこの場合に使用されるべきである。
- -20℃での店舗ずつ長期的味物質の化学的特性に応じて、最大で一週間使用を記録するために、4℃で味溶液の1の作業分量に保管してください。
2。 ショウジョウバエの準備
図3。記録ハエの作製。ハエの背側胸部に参照電極の（A）の挿入位置。白矢印は、基準電極を示す。 （B）参照電極の中間位置は：首と頭を通って前進、口吻はまだ拡張されていない。 （C、D）唇弁内側電極の先端部と、口先で最終位置に参照電極とフライ完全に拡張した。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
- 温度と湿度が管理された条件下で増殖させた手入れの行き届いたフライ培養から記録するため、新たに孵化ハエを収集し、記録する前に、それらを新鮮な培養バイアル中の5-10日を熟成。
- フライを準備する前に、15〜30分間氷上で顕微鏡プレートを冷やす。
- このような脊髄針と1ミリリットルの注射器のような直径0.5mmの長い、薄いプラスチックの針を用いて、B＆Eの溶液を用いて埋め戻しガラス参照電極、ゆっくり気泡をタップします。ピンセットを用いてオフチップの少量を破壊し、解剖顕微鏡下で観察し、組織に残りのすべての気泡を引き出す毛細管現象を使用しています。
- スライドB＆気泡を導入しないように注意しながら、基準電極ホルダーのワイヤ上に基準電極をE-満たした。
- 吸引物は、構築されたフライアスピレーターを使用して、P200のピペットチップに飛ぶチューブ、メッシュ、およびピペットチップから、30〜60秒間、アイスバケットと寒さでの29場所。
- 、氷から顕微鏡プレートを取り外し水分を拭き取り、顕微鏡下に位置。優しく顕微鏡プレートにピペットチップの外に飛んでタップします。
注意：ハエは十分に簡単に操作するために、固定化されるべきである。 - 鉗子の他のペアで胸部に安定を保持しながら、低倍率で、優しく、鉗子の1対の前足を削除します。背側を上に向け、その腹側にフライを置きます。注：常に機械的損傷を最小限にするための準備プロセス中にすべての回でピンセットで唇弁に触れないように注意してください。
- 鉗子の1対の場所にフライを保持した状態で、後部背側胸部の正中線に参照電極を挿入します。エントリの推奨角度は、ヘッド（ 図3A）の方向に約45度である。
- 参照electrodを確保フライは、高倍率での顕微鏡下に見えるように粘土とEホルダー。二対の鉗子を用いて基準電極ホルダーに向かってフライをスライドさせて、首と頭を介してガラス電極を操縦角度。注意：すぐにはなくスムーズに動作します。ハエがまだ冷たい（ 図3B）からの固定化されている間は、この手順を完了する方が簡単です。
- ガラス参照電極のさらに下に飛ぶをスライドさせながら、電極の先端が唇弁の中にあると口吻が完全に（ 図3Cおよび3D）に拡張されるまで、慎重に、鉗子の1対の口吻を拡張します。注：これは、ハエを損傷および/または神経細胞を味わい、記録品質に影響を与える可能性がある、口吻組織のどの部分に穴をあけたり、参照電極と唇弁のエッジを膨張しないように注意してください。
3。 Labellar感覚器からの記録
図4。高倍率の下、右の接触のために整列記録電極を使用して左側のフライの準備のハエからの記録。（A）唇弁。 （B）は記録電極と高倍率の下で接触している唇弁上の単一感覚子は、。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
- 常に前に記録プロセス中の任意の機器に触れると除振台またはプラットフォームの金属面に触れて身体の静電気を！注：それは回路を損傷することができますようにヘッドステージに静電荷を提供していない非常に重要です。
- recordinのエアテーブルに搭載されたマイクロマニピュレータへの安全基準電極ホルダーGリグ。ビューの顕微鏡分野では、高倍率（典型的には少なくとも140X）の下で、加湿空気流に沿った唇弁の位置1のローブ。
- 加湿された空気流、コンピュータ、DAS、およびアンプの電源をオンにします。オープンな収集ソフトウェア。
- すすぎ、希望する味物質のガラス記録電極を埋める。
- 少なくとも10倍管を通って少量の水を引くために、シリンジ、プラスチックチューブ28を用いて超純水でガラス記録電極をリンスする。
- 味物質と、少なくとも5回の記録電極を洗浄します。約3分の1の味物質との中間にフル記録電極を記入し、チューブから外します。気泡が存在する場合は、リリースまたは単に電極を補充するためにタップします。
- 気泡を導入しないように迅速かつスムーズにヘッドステージの銀線上に電極をスライドさせます。
- 味物質で満たされた記録電極を持つ単一感覚子を刺激する。
- micromanipuを使う興味のある感覚子と整合記録電極を持ってレギュレータ。
- アンプの取得モードをトリガするためにフットペダルを押してください。
- それは感覚子と記録が開始の先端と接触するまで、慎重にマイクロマニピュレータの微調整つまみで記録電極を進める。
- 1〜2秒後に、電極を取り外します。
- 必要に応じて、他の感覚器とステップ3.5を繰り返します。注：同じ感覚子にプレゼンテーションの間に、少なくとも1分待ってください。長時間にわたって単一の味物質で録音した場合、味物質溶液が乾くこととチップ内の溶液をさらに濃縮さになることがあります。これは、穏やかに毛管作用によって少量の液体を除去するために滑らかな紙でガラス電極の先端を接触させることによって改善することができる。
- 他の味物質への応答を記録するために、新たな味物質を繰り返しステップ3.4と記録電極をすすぎ、負荷。注：徹底的に味物質間の電極を洗浄することはABSである交差汚染を避けるためにolutely不可欠。
- 日付、遺伝子型、および味物質等の情報を識別して、定期的にデータファイルを保存します。注意：これは、データ分析のためのセッションを記録中に味物質の記録文書や各プレゼンテーションの感覚子アイデンティティを保つことが重要です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図5Aは 、砂糖、ショ糖がL感覚子の応答を示している。同じ感覚子は苦味化合物、ベルベリンに応答しません。 図5Bは苦い応答ニューロンが含まれているI型の感覚子は、ショ糖に反応してベルベリンに応じて、より大きな振幅スパイクと、小さな振幅のスパイクが表示されていることを示しています。私はTCCに実質的に応答します（ 図5）が表示されていない感覚器ながらLは、溶媒対照、TCCへの最小限のバックグラウンド応答を表示する感覚器。 labellar GRNsの塩と水の応答の詳細については、広井10をご参照ください。
図5は、野生型ショウジョウバエ labellar応答の代表的トレース（A）のL sensillu 100 mMスクロース（SUC）、1mMのベルベリン（BER）、及び30mMのTCC（B）にm個の応答は、I SUCは、BER、およびTCCに対する応答をsensillar。矢印は、各記録の先頭に発生する接触アーティファクトを示しています。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図6。代表次善の電気生理学的な結果。（A）シグナルの完全な欠如、（B）50/60 Hzの「ノイズ」（C）確率的ノイズ（D）は、単独で焼成機械刺激、ニューロン（E）苦いGRN（白三角）と機械刺激、ニューロン（黒三角）の両方発射。/ www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig6highres.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Labellar感覚器は、形態学的および解剖学的、組織の違いに記録容易性が異なる。時には感覚子は、任意の味物質に正の応答を誘発することが知られている一つでも応答しない。これが発生する頻度は感覚子種類によって異なります。 L個の感覚器は、最も一貫して応答し、その長さのためにアクセスすることが比較的容易である。一般的には、Sの感覚器は、一貫して応答するが、その短い長さや唇弁上の位置は、良好な接触を難しくする。しかしながら、それらはより頻繁に無反応であり、Iは、製剤の角度に応じて、より容易にアクセスすることができる感覚器。任意のフライの準備で、私は感覚器の大部分は、LまたはS感覚器よりも応答しない場合があります。遺伝的背景は、同様に味覚応答の一貫性に影響を与えることができる。導入遺伝子は、GEに影響を与えると推定されるため、たとえば、いくつかのトランスジェニックハエは、野生型より少ない一貫した応答が表示される場合がありますハエのネラール健康。変異型ハエは特にから録音に挑戦している-私たちは、ワットことを観察した。
一つの一般的な技術的な問題は、スパイクが（ 図6A）が観察されていないすなわち信号の欠如である。同じ場で、同じクラスの他の人が反応するかもしれないが、最初に時々ある特定の感覚子は、応答しなくなることがあります。第二に、記録電極または参照電極に気泡が存在してもよい。記録電極が疑われる場合、これは単に除去し、ガラス電極を補充する、穏やかにタッピングし、気泡が存在しないことを確認するための倍率で検査することによって固定することができる。参照電極は、新たなフライで準備をリメイク、気泡を含んでいると疑われる場合は、この問題を解決する最も簡単な方法です。第三に、時には電気信号を搬送するワイヤが確実に接続されない場合があります。第四に、時々受信される電圧信号は、より高いか低いのいずれかであり得るアンプが測定可能な範囲。 tastePROBEアンプを使用する場合は、クリップを上または表示ライトダウンクリップのどちらかがオンになっているかどうかを確認してください。クリップアップインジケータライトが点灯している場合は、途中を超えていないを埋めるように注意しながら、湿気を取り除くために外側を拭く問題を解決しますが、多くの場合、削除し、ガラス参照電極を補充する。ガラス電極の外側の水分が増幅器の範囲外の信号を送信し、電極及び配線の金属ケースとの間の電気的接続を行うことができる。それが問題、またはクリップダウンインジケータランプを解決するために失敗した場合には、システム内の電気的ノイズと戦うために次の段落での提案を検討している。第五に、時にはその場は準備中に死亡または製剤の健康的な外観にもかかわらず、そうでなければ反応しないことがあります。例えば、湿度、温度、年齢、食品の品質、及び微生物叢、ならびにより小さい健康な遺伝的背景などの成長条件が、より高いに寄与しうる「無応答」ハエの割合。最後に、稀に、機器の一部が機能しないかもしれません。ヘッドステージ、増幅器、デジタイザ：シグナルが一貫して達成されておらず、他のすべての可能性が使い果たされている場合には、各機器の機能性を調査する必要があるかもしれない。これを行う最も簡単な方法は、機能的であることが知られているリグから、相互に装置の一部を交換することです。唯一のリグはラボに存在する場合、信号発生器は、電子部品の機能をテストするために使用することができる。
別の一般的な技術的な問題は、味覚刺激（ 図6B-E）に対応して発射神経細胞の活動電位を表すように表示されない観測信号である「ノイズ」のそれである。まず、信号近くの録音機器やその他の機器（ 図6B）から50/60 Hzの電気ノイズに起因する可能性がある。参照電極上に飛行禁止と、直接LYリンゲル溶液の液滴を介して、記録と参照電極を接続し、上ボタンを押すと、アンプのパススルー·モードに入る。ノイズがパススルー信号に観測できる場合、これはおそらくノイズがフライ製剤の外部にあることを意味する。すべてのリグ機器が適切に接地され、そのスズ箔シールドが整っていることを確認してください。ノイズが除去されているかどうか、または追加のコンポーネントを保護するため、近くの機器を外してみてください。第二に、ノイズは確率的（ 図6C）を表示されることがあります。この場合は、50/60 Hzのノイズのための詳細な手順は、まだ実施されるべきである。また、録音機器の様々な成分、特にヘッドステージおよび/またはアンプのプラグを抜くか、交換してみてください。電極が直接接続されているときにノイズが観察されない場合、ソースは、おそらく、フライ製剤そのものである。これは、フライへの損傷を最小限に抑えるように注意しながら、記録のための新しいフライを製造するために、通常は最も単純である。第三に、活性化感覚子（ 図6Dおよび6E）内に含まれる機械感覚ニューロンを観察することができる。感覚子偏向又は記録電極の印加時に曲げられ、又は接触の間にバンプされた場合機械感覚ニューロンを活性化することができる。スパイクは通常、通常機械的破壊、ではない味覚刺激の適用と調整が表示され、その不規則なパターンによる化学感覚スパイクから区別可能である。機械刺激焼成感覚子に記録電極を整列させ、感覚子の先端に接触させる必要があるのみ限り静かに前進させることによって最小化することができる。第四に、「破裂」確率的スパイクが観察されることがあるが、これは神経発火のように表示されますが、高周波数と振幅のものであり、刺激に応答して調整されていない。これは、通常は機器から、フライ準備自体に起因し、参照電極によって神経破壊に起因し得る。</ pの>
第三の一般的な技術的な問題は、感覚子との接続が難しくなる、唇弁を移動させる、製剤がモバイルであることである。まず、フライ調製物は不安定であってもよい。参照電極が正しく配置されていることを確認し、必要に応じて再調整する。第二に、参照電極は、口吻と唇弁の不動を保持するために先端に薄すぎてもよい。フライを準備する前に、先端の長い量を切り離すてみてください。それが十分でない場合、必要に応じて、テーパーがより緩やかであり、直径がわずかに大きくなるように基準電極の形状を変化させるために、ピペットプラー設定を再調整する。第三に、ハエが異常に活性であってもよい。新しいフライと準備をリメイク。
一般的な電気生理学情報とトラブルシューティングのガイダンスについては、軸索ガイド30を参照してください。
このpublicatに概説され、先端記録方法にはいくつかの制限がありますイオン。一つの制限は、それが電解質と共に記録電極に送達されるように、味物質は、水溶性でなければならないことである。 DMSOのような溶媒の使用が可能なフェロモン4といくつかの記録を行っているが、これは、炭化水素化合物との記録の難しさを向上させます。代替的なアプローチは、感覚子のソケットベースから録画を実行するために鋭利なタングステン電極を使用し、又は味物質が記録電極とは独立して送達される両方ともに、感覚子の側壁から録画を実行するためにガラス電極を使用することである26,27。しかしながら、これらの技術は、困難であり、側壁記録は、味覚器官に対してより有害である。別の制限は、スループットが低下味物質溶液（工程3.3プロトコル）を交換するのに必要な時間であり、しばしば嗅覚記録に見られる複雑な刺激パラダイムの使用を制限する。味覚受容ニューロンは、いくつかの多様性を示すスパイク頻度に依存している振幅。この機能は、神経細胞のアイデンティティーの評価を複雑にし、25,31-33高度なスパイクソーティングをより困難にすることができます。一般に嗅覚記録において行われるように加えて、先端ため記録方法の性質の一方は、直前の刺激の送達を基礎発火を記録することはできません。これらの欠点にもかかわらず、先端記録方法は、正常ショウジョウバエおよび他の種8,10,17,19,21-23味符号化の原理の多くを解明するために使用されている。
ここで概説フライ調製技術は、1つの可能なアプローチである。この製造方法においては、関心のある管部感覚子と記録電極の接触を容易にする伸長位置に固定され、基準電極は、動物に挿入される。他の製造方法は、粘土のボールに対する動物の装着との薄いストリップの使用を含む口吻34を固定するためのテープ。組織の安定化及び参照電極配置の基本パラメータが満たされるように確かに限り、他の場所または異なる種からの感覚器は、ほとんど同じようにから録音することができる。例えば、脚感覚器は、わずか35ガラスの縁から脚を扇形に開く、微細な昆虫ピンとSYLGARDコーティングされた顕微鏡スライドにフライの本体を固定してから記録することができる。これは、味覚受容体ニューロンにおけるシグナル伝達を調べるために記録電極を介して感覚器に薬理学的薬剤を送達することができる。これは単に、望ましい結果に最も適しているのアプローチを決定する実験の仕事である。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、JCに（対RD）NRSA博士号を取得する前の補助金1F31DC012985によっておよびNIHの補助金によって支えられ
私たちは便利技術的なアドバイスのための数値をコンパイルする助けのための原稿、博士ライアンヨセフに有益なコメントを博士リネアワイスに感謝し、博士フレデリックマリオン-POLLだろう。また、4のレビューの有益なコメントに感謝したい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150X magnification with long working distance table mount stand |
| Antivibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
| Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5 ml serological pipette for extended range |
| Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5 mm diameter |
| Retort Stand | generic | ||
| Outlet Plastic Tube | generic, 1 cm diameter | ||
| Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
| 500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
| Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
| Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
| White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
| Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
| Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
| Insulated Electrical Wire | Generic | ||
| Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use LabView with NI-6251 |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
| Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10-40X magnification |
| Ice Bucket | Generic | ||
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
| 1 ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
| 10 ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
| Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |
References
- Glendinning, J. I., Jerud, A., Reinherz, A. T. The hungry caterpillar: an analysis of how carbohydrates stimulate feeding in Manduca sexta. The Journal of experimental biology. 210, 3054-3067 (2007).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139, 234-244 (2009).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell reports. 1, 599-607 (2012).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a review. Cell and tissue research. 275, 3-26 (1994).
- Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoological Science. 19, 1009-1018 (2002).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The Molecular and Cellular Basis of Bitter Taste in Drosophila. Neuron. 69, 258-272 (2011).
- Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. Journal of Morphology. 150, 327-341 (1976).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 61, 333-342 (2004).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science (New York, N.Y.). 287, 1830-1834 (2000).
- Cameron, P., Hiroi, M., Ngai, J., Scott, K. The molecular basis for water taste in Drosophila. Nature. 465, 91-95 (2010).
- Croset, V., et al. Ancient protostome origin of chemosensory ionotropic glutamate receptors and the evolution of insect taste and olfaction. PLoS Genet. 6, e1001064 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development (Cambridge, England). 118, 401-415 (1993).
- Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36, 288-292 (2004).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science (New York, N.Y.). 122, 417-418 (1955).
- Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56, 503-516 (2007).
- Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67, 555-561 (2010).
- Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45, 871-876 (1999).
- Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 7281-7287 (2002).
- Sanford, J. L., Shields, V. D., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Die Naturwissenschaften. 100, 269-273 (2013).
- Merivee, E., Must, A., Milius, M., Luik, A. Electrophysiological identification of the sugar cell in antennal taste sensilla of the predatory ground beetle Pterostichus aethiops. J Insect Physiol. 53, 377-384 (2007).
- Popescu, A., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. Journal of comparative physiology. A, Neuroethology. 199, 403-416 (2013).
- Marion-Poll, F., Der Pers, J. V. an Un-filtered recordings from insect taste sensilla. Entomologia Experimentalis et Applicata. 80, 113-115 (1996).
- Wieczorek, H., Wolff, G. The labellar sugar receptor of Drosophila. J. Comp. Physiol. A. Neuroethol Sens. Neural Behav. Physiol. 164, 825-834 (1989).
- Morita, H. Initiation of spike potentials in contact chemosensory hairs of insects. III. D.C. stimulation and generator potential of labellar chemoreceptor of calliphora. Journal of cellular and comparative physiology. 54, 189-204 (1959).
- Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2, e661 (2007).
- Benton, R., Dahanukar, A. Electrophysiological recording from Drosophila taste sensilla. Cold Spring Harbor protocols. 2011, 839-850 (2011).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. , e1725 (2010).
- Axon Instruments. The Axon Guide for Electrophysiology & Biophysics Laboratory Techniques. , (1993).
- Fujishiro, N., Kijima, H., Morita, H. Impulse frequency and action potential amplitude in labellar chemosensory neurones of Drosophila melanogaster. Journal of insect physiology. 30, 317-325 (1984).
- Marion-Poll, F., Tobin, T. R. Software filter for detecting spikes superimposed on a fluctuating baseline. Journal of neuroscience. 37, 1-6 (1991).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem Senses. 28, 671-679 (2003).
- Marion-Poll Lab Website. , Available from: http://taste.versailles.inra.fr/fred (2013).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 56, 139-152 (2003).
