Summary
Detta protokoll beskriver cellulära inspelning av aktionspotentialen svar eldas med labellar smak nervceller i Drosophila.
Abstract
Den perifera smaksvar insekter kan kraftfullt undersökas med elektrofysiologiska metoder. Den metod som beskrivs här gör det möjligt för forskare att mäta smak svar direkt och kvantitativt, vilket speglar den sinnesintryck att insekten nervsystemet får från smak stimuli i sin omgivning. Detta protokoll beskriver alla viktiga steg i att utföra denna teknik. De kritiska stegen i montering ett elektrofysiologi riggen, till exempel val av nödvändig utrustning och en lämplig miljö för inspelning, avgränsas. Vi beskriver också hur man förbereder för inspelning genom lämpliga referens-och registreringselektroderna, och tastant lösningar. Vi beskriver i detalj den metod som används för att framställa insekten genom införande av en glasreferenselektrod i farten för att immobilisera snabel. Vi visar spår av de elektriska impulserna som eldas med smak neuroner som svar på ett socker och en bitter föreningen. Aspekterna av protokollet är ttekniskt sett utmanande och vi inkluderar en omfattande beskrivning av några vanliga tekniska problem som kan uppstå, till exempel brist på signal eller mycket brus i systemet, och möjliga lösningar. Tekniken har begränsningar, såsom en oförmåga att leverera tidsmässigt komplexa stimuli, observera bakgrunds bränning omedelbart före stimulans leverans, eller använda vattenolösliga smak föreningarna enkelt. Trots dessa begränsningar, denna teknik (inklusive mindre variationer som refereras i protokollet) är en standard, allmänt accepterat förfarande för registrering av Drosophila neuronala svar att smaka föreningar.
Introduction
Den smaks gör en insekt att upptäcka ett stort utbud av lösliga kemikalier och spelar en viktig roll i mottagandet av en näringsrik substans, eller ett avslag på en skadlig eller giftig en. Smaken är också tänkt att spela en roll i mate urval, genom detektion av feromoner 1-5. Dessa viktiga och olika funktioner har gjort det insekts smaken systemet ett övertygande mål för utredning av hur sensoriska system översätter miljö ledtrådar till relevanta beteende utgångar.
Den primära enhet av Drosophila melanogaster smak systemet är smaken hår, eller sensillum. Molekyler in i sensillum via en por på sin spets 2,6. Sensilla påträffas på labellum, benen, vingmarginal och svalget 6. På labellum är antalet och placeringen av sensilla stereotypa. Det finns tre morfologiska klasser av sensilla baserat på längd: den långa (L), mellan (I) och korta (S ) Sensilla 7,8. Varje sensillum innehåller antingen två (I-typ) eller fyra (L-och S-typ) smakreceptor neuroner (GRNs) 9. Olika GRNs svarar på olika typer av smak stimuli: bitter, socker, salt och osmolaritet 7,10 och uttrycka olika undergrupper av smakreceptorer 8,11-13. Bara jag och S-typ sensilla innehåller bitter-lyhörd GRNs 8,10. Den GRNs projektet till subesophageal ganglion (SOG) och deras aktivering av smakmolekyler förmedlas till högre centrala nervsystemet för avkodning, vilket resulterar i ett beteende svar 6. Det relativt lilla antalet nervceller och mottaglighet för molekylär och beteendeanalys gör Drosophila smaken systemet en utmärkt modell för utredning av smak system i allmänhet. Den relativa lätthet med vilken systemet kan manipuleras via genetisk mutation eller GAL4-UAS expressionssystem fungerar också som ett värdefullt verktyg 14,15.
ontent "> Eftersom dessa sensilla skjuta ut från ytan av den labellum, gör de utmärkta mål för elektrofysiologi. Bränningen av de GRNs kan övervakas med användning av extracellulära inspelning. Historiskt sidoväggen registreringsmetod, som använder en glaselektrod införd i sensillum att spela in neuronal aktivitet, 26 som har använts. Det är dock tekniskt krävande att utföra denna metod, och det är svårt att spela in under längre från varje preparat. Spetsen-inspelningsmetod, som mäter svaret av neuroner med en elektrod som samtidigt levererar en tastant, har sedan dess blivit den metod som före 9,16. Det har använts för att undersöka smaken systemet Drosophila melanogaster 8,10,17,18 samt ett antal andra insektsarter 19-23. Den har i hög grad underlättats genom utvecklingen av tastePROBE förstärkare, som övervann en av de stora nackdelarna med spets-inspelningsmetod genom att kompensera förden stora potentialskillnad mellan referenselektrod och insekts sensillum, vilket gör att GRN aktionspotentialer som skall spelas utan överdriven förstärkning eller filtrering 24. En annan viktig utveckling var användningen av trikolincitrat som inspelnings elektrolyt 25. TCC trycker svaren från osmolariteten känsliga GRN och stimulerar inte saltkänslig referensnumret, vilket svar som genereras av bittra och socker tastants mycket lättare att analysera 25.Här beskriver vi hur spets inspelning av Drosophila labellar sensilla för närvarande utförs i Carlson laboratoriet. Detta protokoll kommer att förklara hur man kan skapa en lämplig elektrofysiologi rigg, hur man förbereder i farten, och hur man utför smak inspelningar. Vi presenterar även några representativa uppgifter som erhållits genom att spela in från delmängder av Drosophila sensilla, samt några vanliga problem och möjliga lösningar som kan uppstå vid användning av dennateknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande protokoll uppfyller alla riktlinjer djurvård av Yale University.
1. Reagens och utrustning Förberedelse
- Inspelningsutrustning installation (Figur 1A).
- Välj ett rum för rigg inställning som är fri från stora variationer i temperatur eller luftfuktighet och även isolerats från källor av elektrisk och maskinbuller, till exempel kylskåp och centrifuger.
Figur 1. (A) Översikt över inspelning rigg setup. Stereomikroskop (a) är monterad på vibrationsdämpande plattform (b). Referenselektrodhållare (c) är monterad på plattformen mittemot huvudsteg (d), via micromanipulators. En utlopps plaströr (e) att fram befuktad luftströmmen riktas mot flugan preparatet är också monterad på than plattform. Den huvudsteg är anslutet till förstärkaren (f), som är ansluten till den digitala inhämtningssystemet (DAS) (g), vilken är ansluten till en PC (h). (B) Konfiguration av elektroder och utloppsrör. Referenselektrod till vänster, inspelning elektrod till höger, och luftströmmen utloppsröret riktat mot fluga förberedelse Klicka här för att visa en större bild. - Mount stereomikroskop till mitten av antivibrationsbord eller plattform.
- Fäst mikromanipulatorer för referenselektrod / insekt förberedelse och huvudsteg / inspelnings elektroden till vänster och höger om mikroskopet, respektive, med användning av magnetiska montrar.
- Mount utlopp plaströr i ett tredje mikromanipulator på baksidan av mikroskopet, orienterad så att rörets öppning pekar mot läget av fluga prep (se figur 1b).
- Med hjälp av flexibla plaströr, vidtach utlopp plaströr till en vakuumflaska partiellt fylld med vatten. Anslut ett litet akvarium pump för att bubbla luft genom vatten i kolven, vilket genererar en fuktig luftström genom utlopps plaströr mot farten.
- Montera fiberoptisk ljuskälla från vibrationsbord, orientera utgångarna för att belysa beredningen genom att reflektera ljus via en bit vitt kort papper direkt under beredningen. Se till att ljuskällan inte vilar på bordet. Anm: förmån för reflekterande ljuskällan på en pappersskiva är två-faldig: det förbättrar kontrasten, vilket gör sensilla lättare att visualisera, och det förhindrar uppvärmning av preparatet, som skulle resultera från direkt ljus.
- Plug tastePROBE förstärkare in i den digitala inhämtningssystemet (DAS), och DAS in i en persondator, enligt leverantörens manual. Anslut fotpedal trigger i och ordna i arbetsyta. OBS: Elektriskt isolerade vägguttag för förstärkaren och DAS är mycket önskvärtstånd.
- Elektriskt malda mikroskop, micromanipulators, och ljuskällan genom att ansluta metallkomponenter till tabell med krokodilklämmor och längder av isolerad elektrisk tråd och eltejp. Elektriskt jord metall plattform genom att koppla till att bygga mark-eller DAS, som är jordad via nätsladden ur vägguttaget.
- Installera lämplig förvärvs mjukvara för DAS val på den personliga datorn. OBS: Se till att de digitala förvärvs drivrutinerna är kompatibla med operativsystemet på datorn.
- Konfigurera programvara amplifiering (10-100x), signalfiltrering (typiskt en Bessel-bandpassfiltret inställt från 100 Hz-3 000 Hz), och samplingsfrekvens (minst 10 kHz). Anm: signalamplituder från gustatory neuroner är typiskt i 0,5-2 mV, så displayen skala är inställd för att underlätta deras visualisering. Obs: 100 Hz filtret hjälper till att utesluta ovidkommande elektriskt brus, men det ändrar formen på spikar och kan göra avancerade spik sortering more utmanande. Alternativt kan användas en 1 Hz-filtret.
- Eventuellt kan en Faradays bur sättas upp runt hela vibrationsbordet. Men små ark aluminiumfolie räcker vanligtvis för att minska eventuella buller från den yttre miljön eller utredare.
- Välj ett rum för rigg inställning som är fri från stora variationer i temperatur eller luftfuktighet och även isolerats från källor av elektrisk och maskinbuller, till exempel kylskåp och centrifuger.
- Glaselektrod Förberedelse
Figur 2. Referens-och registreringselektroderna. Photograph under förstoring av glaskapillärer dras in referenselektrod, med (A) och utan (B) spets bruten, och inspelningen elektroden (C). Vit stapel representerar 2 mm. Klicka här för att visa en större bild.- Dra referensenelektrod av glas kapillär med hjälp av en pipett avdragare instrument. OBS: De exakta inställningar pipetten avdragare programmet kommer att variera från instrument till instrument. Försök att uppnå en mycket lång gradvis avsmalning. Porstorleken på spetsen är inte avgörande eftersom spetsen kommer att brytas innan beredning flugan (fig. 2A och 2B), men se till att diametern av den avsmalnande längden av elektroden varken är för tunn, som inte kommer att ge tillräcklig immobilisering av labellum, inte heller för stor, vilket kan skada de smak nervceller eller brista spottkörtlarna.
- Dra inspelning elektrod från en borosilikatglas kapillär med glödtråd med hjälp av en pipett avdragare instrument. Försök att uppnå en avsmalning som är grundare än den för referenselektrod, och en pordiameter av omkring 10 till 15 | im (figur 2C) 28.
- Tastant lösningar förberedelse
- Använd Beadle-Ephrussi Ringers lösningning (B & E) som referenselektrod elektrolyten. För att göra en liter B & E, lös upp 7,5 g NaCl, 0,35 g KCl, och 0,279 g CaCl2 ∙ 2 H2O i en liter ultrarent vatten. Förvara små alikvoter vid -20 ° C.
- Använd 30 mM trikolincitrat lösning (TCC) som inspelnings elektroden elektrolyt och vätska till tastant lösningar 25, om bittra eller socker GRN svaren är som ska mätas. Alternativt kan 1-3 mM kaliumkloridlösning användas om svaren av vattnet cellen skall mätas.
- För att göra tastant lösningar, väga lämplig mängd tastant i pulverform och lägga till TCC för att göra en första aktiekoncentration. Använd detta för att göra serieutspädningar från denna första lager för att ge den önskade koncentrationen för att testa. Obs: Om tastants ej lätt löser sig i vatten, ett annat lösningsmedel, såsom etanol, kan användas för att göra initiala förrådskoncentration. En lämplig kontroll lösning av TCC och vätska utan tastantbör användas i detta fall.
- Förvara alikvoter lång sikt vid -20 ° C. Förvara en arbets alikvot av ett tastant lösning vid 4 ° C för att spela in i upp till en vecka, beroende på de kemiska egenskaperna hos tastant.
2. Drosophila Förberedelse
Figur 3. Beredning av flugan för inspelning. (A) Införposition referenselektrod i rygg bröstkorg av fluga. Den vita pilen indikerar referenselektroden. (B) Mellanläge referenselektrod: avancerade genom nacke och huvud, men ändå inte snabel förlängas. (C, D) Flyg med referenselektrod i slutläge med spetsen på elektroden inne labellum, och snabelfullt utdragen. Klicka här för att visa en större bild.
- Samla nyligen eclosed flugor för inspelning från välskötta flyga kulturer, odlade under temperatur-och fuktkontrollerade förhållanden, och åldras dem 5-10 dagar i färskt odlingsflaskor innan du spelar in.
- Chill mikroskop plattan på is i 15-30 minuter innan du förbereder fluga.
- Återfyllning glas referenselektrod med B & E-lösning med användning av en lång, tunn plast nål av 0,5 mm diameter, såsom en spinal nål och 1 ml spruta och knacka försiktigt ut eventuella bubblor. Bryt liten mängd tips av med pincett och använda kapillärkraften för att dra ut alla återstående bubblor med en vävnad, observera i dissekera mikroskop.
- Slide B & E-fyllda referenselektrod på tråd av referenselektrodhållare, se till att inte införa luftbubblor.
- Sug flyga in i en P200 pipett spets, med hjälp av fluga aspirator byggtfrån slangar, mesh, och pipettspetsen, 29 plats i ishink och kyla för 30-60 sek.
- Ta mikroskop platta från is, torka av all fukt, och position under mikroskop. Knacka försiktigt flyga ur pipettspetsen på mikroskopplatta.
Notera: flugan ska vara tillräckligt immobiliserade att manipulera enkelt. - Under låg förstoring, försiktigt bort frambenen med en pincett, medan du håller bröstkorgen stabil med den andra pincett. Placera flugan på ventrala sidan, ryggsidan uppåt. Obs: Var alltid noga med att undvika att röra vid labellum med pincett under hela förberedelseprocessen för att minimera mekaniska skador.
- Håll flugan på plats med en pincett, sätt i referenselektrod vid mittlinjen för den bakre ryggbröstkorgen. En föreslagen ingångsvinkeln är ungefär fyrtiofem grader, i riktning mot huvudet (figur 3A).
- Säkra referens Electrode hållare med modellera så att flugan syns under mikroskop med hög förstoring. Manöver-och vinkel glaselektroden genom halsen och huvudet, genom att glida i farten mot referenselektrodhållaren med användning av två par av pincett. OBS: Arbeta snabbt men smidigt, det är lättare att slutföra det här steget när flugan är fortfarande orörlig från kylan (Figur 3B).
- Sträcker försiktigt snabel med en pincett, medan glid flugan längre ned på glasreferenselektrod, till dess att spetsen på elektroden är inuti labellum och det snabelliknande organet är helt utsträckt (figurerna 3C och 3D). OBS: Se till att inte punktera någon del av snabel vävnaden eller distend kanten på labellum med referenselektrod, eftersom det kan skada farten och / eller smak neuroner och påverka inspelningskvalitet.
3. Inspelning från Labellar sensilla
Figur 4. Inspelning från fluga. (A) labellum av flyg preparatet på vänster med inspelning elektrod anpassad för kontakt på höger, under hög förstoring. (B) inspelning elektrod och enkel sensillum på labellum i kontakt, under hög förstoring. Klicka här för att visa en större bild.
- Alltid röra vid metallytan av anti-vibrationsbord eller plattform innan vidröra någon utrustning under inspelning process! OBS: Det är oerhört viktigt att inte avge en statisk laddning på huvudsteg eftersom det kan skada kretsarna.
- Säker referenselektrodhållare till mikromanipulator monterad på luftbord av recording rigg. Placera en lob av labellum i mikroskop synfält, under hög förstoring (normalt minst 140X), och i linje med fuktad luft ström.
- Aktivera fuktad luft ström, dator, DAS, och förstärkare. Öppna förvärv programvara.
- Skölj och fyll glaset inspelningen elektroden med önskad tastant.
- Skölj glas inspelningen elektroden med ultrarent vatten med hjälp av en spruta och plaströr 28 till drar små mängder vatten genom röret åtminstone tio gånger.
- Skölj inspelningen elektroden med tastant minst fem gånger. Fyll inspelning elektrod ungefär en tredjedel till hälften fullt med tastant och ta bort från slangen. Om det finns luftbubblor trycker du för att släppa eller helt enkelt fylla på elektroden.
- Skjut elektroden på silvertråd av huvudsteg snabbt och smidigt för att inte införa luftbubblor.
- Stimulera enda sensillum med tastant fyllda inspelningen elektroden.
- Använd micromanipulator att bringa inspelningen elektroden inriktad med sensillum av intresse.
- Tryck på pedalen för att utlösa förvärvsläge hos förstärkaren.
- Advance inspelningen elektroden med vredet för finjustering av mikromanipulator försiktigt tills den kommer i kontakt med spets sensillum och inspelningen börjar.
- Avlägsna elektrod efter 1-2 sek.
- Upprepa steg 3,5 med andra sensilla, om så önskas. OBS: Vänta minst 1 minut i mellan presentationer till samma sensillum. Vid inspelning med en enda tastant under en förlängd tidsperiod, kan tastant lösningen torka ut och lösningen i spetsen kan bli mer koncentrerad. Detta kan åtgärdas genom att försiktigt bringa spetsen av glaselektrod med blank papper för att avlägsna en liten mängd vätska genom kapillärverkan.
- För att spela in svaren på en annan tastant, skölj och last inspelningen elektroden med nya tastant och upprepa steg 3.4. OBS: Grundligt sköljning av elektroden mellan tastants är absolutely avgörande för att undvika korskontaminering.
- Spara datafiler regelbundet med identifierande information, t.ex. datum, genotyp, och tastants. OBS: Det är viktigt att behålla en utskrift av tastant och sensillum identiteten för varje presentation under inspelning session för dataanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 5A visar responsen hos en L sensillum till ett socker, sackaros. Samma sensillum reagerar inte en bitter förening visar berberin. Figur 5B som en I-typ sensillum, som innehåller en bitter mottaglig neuron, visar större amplitud spikar som svar på berberin och mindre amplitud spikar som svar på sackaros. L sensilla visa en minimal bakgrundsresponsen till lösningsmedelskontroll, TCC, medan jag sensilla visa praktiskt taget inget svar på TCC (Figur 5). För mer information om salt-och vatten svar labellar GRNs hänvisas till Hiroi 10.
Figur 5. Representativa spår av vildtyp Drosophila labellar responser (A) L sensillu m svar på 100 mM sackaros (SUC), 1 mM berberine (BER), och 30 mM TCC. (B) Jag sensillar svar på SUC, BER, och TCC. Pilspetsen visar utgångs artefakt som sker i början av varje inspelning. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 6. Representativa suboptimala elektrofysiologiska resultat. (A) total avsaknad av signal (B) 50/60 Hz "brus" (C) stokastiskt brus (D) mechanosensory neuron bränning ensam (E) bitter GRN (öppna trianglar) och mechanosensory neuron ( fyllda trianglar) både bränning./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig6highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Labellar sensilla varierar i lättheten att inspelning beroende på skillnader i morfologi och anatomisk organisation. Ibland kan en sensillum inte svarar på några tastants, även en som är känd för att framkalla en positiv respons. Den frekvens med vilken detta sker beror på sensillum typen. L sensilla är mest konsekvent lyhörda och är relativt lätta att komma åt på grund av sin längd. I allmänhet S sensilla är genomgående reagerar, men deras korta längd och position på labellum får god kontakt utmanande. Jag sensilla kan nås lättare, beroende på vinkeln av preparatet, men de är mer ofta inte svarar. På en given fluga förberedelse, får en större andel av jag sensilla inte svarar än L eller S sensilla. Genetisk bakgrund kan påverka konsistensen av smaksvar också. Exempelvis kan vissa transgena flugor visar mindre konsistenta svar än vildtypen, förmodligen därför att transgenerna påverka GEneral hälsa av flugan. Vi har observerat att w - muterade flugor är särskilt utmanande att spela in från.
Ett vanligt tekniskt problem är brist på signal, dvs inga spikar observeras (Figur 6A). Först, ibland en viss sensillum kanske inte svarar, medan andra i samma klass på samma fluga kan svara. För det andra kan det finnas en luftbubbla i inspelningen elektroden eller referenselektroden. Vid misstanke om inspelningen elektroden, kan det fastställas genom att helt enkelt ta bort och påfyllning av glaselektrod, knacka försiktigt och inspektion under förstoring för att se till att inga bubblor. Om man misstänker referenselektroden att innehålla en luftbubbla, göra om prep med en ny fluga är det enklaste sättet att lösa problemet. För det tredje, ibland trådarna som bär den elektriska signalen kanske inte ordentligt ansluten. För det fjärde, ibland spänningssignal tas emot kan bli både högre eller lägre änintervallet förstärkaren kan mäta. Om du använder tastePROBE förstärkaren, kontrollera om antingen klippet upp eller klipp ner indikatorlampan är på. Om klippet upp indikatorlampan lyser, ofta avlägsna och påfyllning av glasreferenselektrod, samtidigt som man fyller inte mer än halvvägs och torka av utsidan för att avlägsna fukt kommer att lösa problemet. Fukt på utsidan av glaselektrod kan göra en elektrisk förbindelse mellan metallhöljet hos elektroden och viran, sänder signalen utanför intervallet hos förstärkaren. Om det inte löser problemet, eller klippet ner indikatorlampan på, överväga förslag i följande stycke för att bekämpa elektriskt brus i systemet. Femte, ibland en fluga kan dö under beredning eller på annat sätt inte svarar trots att förbereda hälsosamma utseende. Tillväxtförhållandena, såsom fuktighet, temperatur, ålder, livsmedelskvalitet, och mikroorganismer, såväl som ett mindre hälso genetisk bakgrund skulle kunna bidra till en högreAndelen "inte svarar" flugor. Slutligen, i sällsynta fall, kan en utrustning vara icke-funktionell. Om signalen är konsekvent inte uppnås och alla andra möjligheter är uttömda, kan det vara nödvändigt att undersöka funktionaliteten i varje exemplar av utrustningen: huvudsteg, förstärkare, och digitaliserare. Det enklaste sättet att göra detta är att ersätta en del av utrustningen med en annan från en rigg som är känt för att vara funktionella. Om endast en rigg är närvarande i ett laboratorium, kan en signalgenerator användas för att testa funktionaliteten av de elektroniska komponenterna.
En annan gemensam teknisk fråga är den om "buller", som är en observerad signal som inte verkar representera neuronala aktionspotentialer avfyras som svar på en luktintrycket stimulus (figur 6B-E). För det första kan signalen bli följden av 50/60 Hz elektriskt brus från färdskrivare eller annan utrustning i närheten (Figur 6B). Med ingen fluga på referenselektrod, direktly ansluta inspelnings-och referenselektroder genom en droppe av Ringers lösning och ange passthrough-läget på förstärkaren genom att trycka på upp-knappen. Om buller är observerbar på passthrough signalen, detta sannolikt innebär att bullret är utanför flugan preparatet. Se till att all rigg utrustning är ordentligt jordad och att tennfolieskydd är på plats. Försök att koppla ur närliggande utrustning för att se om det buller elimineras, eller skärma ytterligare komponenter. För det andra kan det uppstå brus stokastiska (figur 6C). I detta fall bör de åtgärder som beskrivs för 50/60 Hz brus fortfarande genomföras. Dessutom, försök att koppla ur eller byta ut olika komponenter i färdskrivaren, särskilt huvudsteg och / eller förstärkare. Om inget buller observeras när elektroderna är direkt anslutna, är källan sannolikt flugan preparatet i sig. Det är oftast enklast att förbereda en ny fluga för inspelning, var noga med att minimera skador på flugan. Tredje, aktiveringav mechanosensory neuron som finns i sensillum (figur 6D och 6E) kan observeras. Den mechanosensory neuron kan aktiveras om sensillum böjs eller böjd på ansökan av inspelningen elektroden, eller stöts under kontakt. Spikarna kan i regel skiljas från chemosensory spikes av deras oregelbundet mönster, som vanligtvis visas samordnas med mekanisk sönderdelning inte tillämpningen av en gustatory stimulus. Mechanosensory bränning kan minimeras genom att rikta inspelningen elektroden med sensillum och avancera försiktigt bara så långt som är nödvändigt för att få kontakt med spetsen på sensillum. För det fjärde kan stokastiska spik "spricker" observeras, detta verkar liknar neuronaktivitet, men är av hög frekvens och amplitud, inte samordnat svar på ett stimulus. Detta resulterar vanligen från flugan prep själv, inte från utrustningen, och kan bero på en nerv störs av referenselektrod. </ P>
Ett tredje gemensamt tekniskt problem är att beredningen är mobil, vilket orsakar att labellum att röra sig, vilket gör samband med en sensillum svårt. För det första kan i farten beredningen vara instabil. Kontrollera att referenselektrod är rätt placerad, och justera vid behov. För det andra, kan referenselektroden vara alltför tunn vid spetsen för att hålla det snabelliknande organet och labellum orörliga. Försök att bryta en längre mängd av tips innan förbereda flugan. Om detta inte är tillräckligt, justera avdragararmarna inställningar pipett som behövs för att ändra formen på referenselektrod så att avsmalningen är mer gradvis och diametern ökas något. För det tredje, kan farten vara ovanligt aktiva. Remake beredningen med en ny fluga.
För allmän elektro information och mer felsökning vägledning, se Axon Guide 30.
Det finns några begränsningar för spets-inspelningsmetod som beskrivs i detta publicatjon. En begränsning är att den tastant måste vara vattenlösliga, när den levereras i inspelningen elektroden tillsammans med elektrolyten. Detta ökar svårigheten att spela in med kolväteföreningar, även om användningen av ett lösningsmedel som DMSO har gjort vissa inspelning med feromoner möjliga 4. Alternativa tillvägagångssätt är att använda en vass volframelektrod för att utföra de inspelningar från uttaget basen av sensillum eller använder en glaselektrod för att göra inspelningar från sidoväggen av den sensillum, i båda av vilka tastant avges oberoende av den registrerande elektroden 26,27. Men dessa tekniker är utmanande och sidoväggs inspelningar är mer skadliga för smaken orgel. En annan begränsning är den tid som krävs för att byta ut tastant lösningen (Protokoll steg 3,3), vilket minskar genomströmning, och begränsar användningen av komplicerade stimulans paradigm ofta ses i lukt inspelningar. Smakreceptor nervceller uppvisar vissa variationeri amplitud som är beroende av spik frekvens. Denna funktion kan försvåra bedömningen av neuronal identitet och göra avancerade spik sortering svårare 25,31-33. Dessutom, på grund av arten av spets-inspelningsmetod kan man inte spela in den basala bränning omedelbart före leveransen av ett stimulus, som görs vanligtvis i lukt inspelningar. Trots dessa nackdelar, har spets-inspelningsmetod med framgång använts för att belysa många av principerna för smak kodning i Drosophila och andra arter 8,10,17,19,21-23.
Flugan förberedelse teknik som beskrivs här är bara en möjlig strategi. I detta framställningsförfarande det snabelliknande organet är fixerat i ett utsträckt läge för att underlätta kontakt mellan den registrerande elektroden med sensillum av intresse, och referenselektroden är införd i djuret. Andra framställningsmetoder inkluderar monteringen av djuret till en boll av modellera och användningen av tunna remsor avtejp för att fixera snabel 34. Ja, så länge som de grundläggande parametrarna i vävnad stabilisering och referenselektrodplacering är uppfyllda, kan spelas in sensilla på andra platser eller från olika arter från i stort sett samma sätt. Till exempel, kan spelas in benet sensilla från genom att fixera kroppen av en fluga till en sylgard belagda objektglas med fin insekt stift, splaying benen utanför kanten av glaset en aning 35. Det är möjligt att leverera farmakologiska medel till sensilla via lagringselektrod för att undersöka signalomvandling i smakreceptor neuroner. Det är helt enkelt en uppgift för experiment för att avgöra vilken metod som fungerar bäst för det önskade resultatet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en NRSA predoctoral bidrag 1F31DC012985 (till RD) och NIH bidrag till JC
Vi vill tacka Dr Linnea Weiss för värdefulla kommentarer på manuskriptet, Dr Ryan Joseph för att få hjälp att sammanställa siffror, och Dr Frederic Marion-Poll för bra teknisk rådgivning. Vi vill också tacka för de hjälpsamma kommentarer från fyra granskare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150X magnification with long working distance table mount stand |
| Antivibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
| Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5 ml serological pipette for extended range |
| Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5 mm diameter |
| Retort Stand | generic | ||
| Outlet Plastic Tube | generic, 1 cm diameter | ||
| Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
| 500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
| Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
| Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
| White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
| Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
| Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
| Insulated Electrical Wire | Generic | ||
| Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use LabView with NI-6251 |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
| Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10-40X magnification |
| Ice Bucket | Generic | ||
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
| 1 ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
| 10 ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
| Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |
References
- Glendinning, J. I., Jerud, A., Reinherz, A. T. The hungry caterpillar: an analysis of how carbohydrates stimulate feeding in Manduca sexta. The Journal of experimental biology. 210, 3054-3067 (2007).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139, 234-244 (2009).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell reports. 1, 599-607 (2012).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a review. Cell and tissue research. 275, 3-26 (1994).
- Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoological Science. 19, 1009-1018 (2002).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The Molecular and Cellular Basis of Bitter Taste in Drosophila. Neuron. 69, 258-272 (2011).
- Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. Journal of Morphology. 150, 327-341 (1976).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 61, 333-342 (2004).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science (New York, N.Y.). 287, 1830-1834 (2000).
- Cameron, P., Hiroi, M., Ngai, J., Scott, K. The molecular basis for water taste in Drosophila. Nature. 465, 91-95 (2010).
- Croset, V., et al. Ancient protostome origin of chemosensory ionotropic glutamate receptors and the evolution of insect taste and olfaction. PLoS Genet. 6, e1001064 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development (Cambridge, England). 118, 401-415 (1993).
- Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36, 288-292 (2004).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science (New York, N.Y.). 122, 417-418 (1955).
- Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56, 503-516 (2007).
- Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67, 555-561 (2010).
- Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45, 871-876 (1999).
- Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 7281-7287 (2002).
- Sanford, J. L., Shields, V. D., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Die Naturwissenschaften. 100, 269-273 (2013).
- Merivee, E., Must, A., Milius, M., Luik, A. Electrophysiological identification of the sugar cell in antennal taste sensilla of the predatory ground beetle Pterostichus aethiops. J Insect Physiol. 53, 377-384 (2007).
- Popescu, A., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. Journal of comparative physiology. A, Neuroethology. 199, 403-416 (2013).
- Marion-Poll, F., Der Pers, J. V. an Un-filtered recordings from insect taste sensilla. Entomologia Experimentalis et Applicata. 80, 113-115 (1996).
- Wieczorek, H., Wolff, G. The labellar sugar receptor of Drosophila. J. Comp. Physiol. A. Neuroethol Sens. Neural Behav. Physiol. 164, 825-834 (1989).
- Morita, H. Initiation of spike potentials in contact chemosensory hairs of insects. III. D.C. stimulation and generator potential of labellar chemoreceptor of calliphora. Journal of cellular and comparative physiology. 54, 189-204 (1959).
- Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2, e661 (2007).
- Benton, R., Dahanukar, A. Electrophysiological recording from Drosophila taste sensilla. Cold Spring Harbor protocols. 2011, 839-850 (2011).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. , e1725 (2010).
- Axon Instruments. The Axon Guide for Electrophysiology & Biophysics Laboratory Techniques. , (1993).
- Fujishiro, N., Kijima, H., Morita, H. Impulse frequency and action potential amplitude in labellar chemosensory neurones of Drosophila melanogaster. Journal of insect physiology. 30, 317-325 (1984).
- Marion-Poll, F., Tobin, T. R. Software filter for detecting spikes superimposed on a fluctuating baseline. Journal of neuroscience. 37, 1-6 (1991).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem Senses. 28, 671-679 (2003).
- Marion-Poll Lab Website. , Available from: http://taste.versailles.inra.fr/fred (2013).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 56, 139-152 (2003).
