Summary
Metabolite profilering har været et værdifuldt aktiv i studiet af stofskiftet i sundhed og sygdom. Ved hjælp af normal-faset væskekromatografi koblet til høj opløsning massespektrometri med polaritet skift og en hurtig arbejdscyklus beskriver vi en protokol til at analysere polære metaboliske sammensætning af biologisk materiale med høj følsomhed, nøjagtighed og opløsning.
Abstract
Metabolite profilering har været et værdifuldt aktiv i studiet af stofskiftet i sundhed og sygdom. Men nuværende platforme har forskellige begrænsende faktorer, såsom arbejdskraftintensive prøve præparater, lave detektionsgrænser, langsomme scan hastigheder, intensiv metode optimering for hver metabolit, og den manglende evne til at måle både positivt og negativt ladede ioner i enkelte eksperimenter. Derfor kunne en roman metabolomics protokol rykke metabolomics studier. Amid-baserede hydrofile kromatografi muliggør polær metabolit analyse uden nogen kemisk derivatisering. Høj opløsning MS ved hjælp af Q-Exactive (QE-MS) har forbedret ion optik, øget scanningshastigheder (256 msek hos opløsning 70.000), og har evnen til at udføre positiv / negativ omskiftning. Ved hjælp af en kold methanolekstraktion strategi og koble et amid søjle med QE-MS giver robust detektion af 168 målrettede polære metabolitter og tusindvis af ekstra funktioner samtidigt. Daten behandlingen foretages med kommercielt tilgængeligt software på en meget effektiv måde, og ukendte features ekstraheret fra massespektrene kan forespørges i databaser.
Introduction
Metabolomics, defineret som et eksperiment, der måler flere metabolitter samtidigt, har været et område for intens interesse. Metabolomics giver en direkte udlæsning af molekylær fysiologi og har givet indsigt i udvikling og sygdom som kræft 1-4. Kernemagnetisk resonans (NMR) og gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS) er blandt de mest almindeligt anvendte instrumenter 5-9. NMR, især har været anvendt til flux eksperimenter, da tung isotop mærkede forbindelser, såsom 13C mærkede metabolitter, er NMR-aktive 10,11. Men denne strategi kræver relativt høj prøve renhed og stor stikprøve mængde, hvilket begrænser dens anvendelse i metabolomics. I mellemtiden, data indsamlet fra NMR har brug for intensiv analyse og sammensatte tildeling af komplekse NMR-spektre er vanskelig. GC-MS har været meget anvendt til polære metabolitter og lipid undersøgelser, men det kræver flygtig compounDS og derfor ofte derivatisering af metabolitter, som undertiden involverer komplekse kemi, der kan være tidskrævende og introducerer eksperimentel støj.
Væskekromatografi (LC) koblet til tripel kvadrupol massespektrometri bruger den første kvadrupol for udvælgelse af de intakte moderioner, som derefter fragmenteret i den anden kvadrupol, mens den tredje kvadrupol bruges til at vælge karakteristiske fragmenter eller datterioner. Denne metode, som registrerer overgangen fra moderioner specifikke datterioner, der betegnes multipel reaktion overvågning (MRM). MRM er en meget følsom, specifik og robust metode til både lille molekyle og protein kvantificering 12-15,21. MRM har dog sine begrænsninger. For at opnå høj specificitet et MRM metode skal bygges for hver metabolit. Denne metode består i at identificere en specifik fragment og tilsvarende optimeret kollision energi, som kræver forudgående kendskab til properties af metabolitter af interesse, såsom kemiske struktur information. Derfor, med nogle undtagelser, der omfatter det neutrale tab af fælles fragmenter, er det ikke muligt at identificere ukendte metabolitter med denne metode.
I de senere år har høj opløsning massespektrometri (HRMS) instrumenter blevet frigivet, såsom LTQ-orbitrap og Exactive serie, QuanTof og TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS kan give en masse til ladningsforhold (m / z) af intakte ioner inden for en fejl på nogle få ppm. Derfor kan et HRMS instrument betjent ved at detektere alle precursor ioner (dvs. fuld scan mode) få direkte strukturel information fra den nøjagtige masse og den deraf elementært sammensætning af analysanden, og denne information kan bruges til at identificere potentielle metabolitter. Faktisk kan alle oplysninger om en forbindelse opnås med en nøjagtig masse, op til niveauet af strukturelle isomerer. Også en fuldscan metode kræver ikke forudgående kendskab til metabolitter og ikke kræver metode optimering. Da alle ioner med m / z falder i scanning rækkevidde kan analyseres, HRMS har en næsten ubegrænset kapacitet i form af antallet af metabolitter, som kan kvantificeres i et enkelt løb i forhold til MRM metoden. HRMS kan også sammenlignes med en tredobbelt quadrupol MRM i kvantitativ kapacitet på grund af den korte arbejdscyklus resulterer i et sammenligneligt antal datapunkter, der kan opnås i en fuld MS scanning. Derfor HRMS giver en alternativ metode til kvantitative metabolomics. For nylig, en forbedret version af HRMS betegnes Q-Exactive massespektrometri (QE-MS) kan drives under skift mellem positive og negative tilstande med tilstrækkelig hurtig cyklustider i en enkelt metode, som udvider detekteringsområde 19. Her beskriver vi vores metabolomics strategien under anvendelse af QE-MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Udarbejdelse af LC-MS reagenser, Etablering af en Chromatography Method, og Etablering af Instrument Operating Procedures
- Fremstilling af LC Opløsningsmidler
- Forbered 500 ml mobile faser. A er 20 mM ammoniumacetat og 15 mM ammoniumhydroxid i 3% acetonitril / vand, endelig pH 9,0; og B er 100% acetonitril.
- Løst låg på flasken, som anbringes i et vandbad sonicator, og sonikeres i 10 min uden ekstra opvarmning. (Dette trin er at sikre, at alle ammoniumsaltene opløses fuldstændigt, og at der ikke er nogen resterende luftbobler.)
- Overfør 250 ml opløsningsmiddel til en 250 ml glasflaske for LC-MS brug, og holder resten ved 4 ° C.
- Forbered lav masse rækkevidde kalibreringsopløsning. Det er vigtigt at anvende en tilpasset kalibrering blanding lav masse interval for metabolomics applikationer at sikre, at nøjagtige masserne påvist i lave molekylvægte.
- 5 mg både Sodi afvejesum fluoroacetate og homovanillinsyre og opløse dem i 5 ml vand for at lave en endelig koncentration på 1 mg / ml. Opløs diazinon i methanol at foretage en endelig koncentration på 10 mg / ml.
- For at forberede 1 ml negativ lav masse kalibreringsopløsning, blandes 960 ml thermo negativ kalibreringsopløsning med 20 ml natrium fluoroaceate og homovanillinsyre løsning. For at gøre 1 ml positiv lav masse kalibreringsopløsning, blandes 990 ml thermo positiv kalibreringsopløsning og 10 ml diazinon løsning. (Den lave masse kalibreringsopløsning skal opbevares ved 4 ° C og fremstilles frisk hver 2 måneder.)
- Kalibrering af QE-MS til en lav masseinterval
- Før udførelse lav masse rækkevidde kalibrering, foretage en standard masse kalibrering (m / z, 150-2,000) i både positive og negative tilstande baseret på producentens anvisninger.
- Når en almindelig massekalibrering passerer justere scanning rækkevidde på 60-900 m / z på instrumentets kontrolpanelog en kilde CID på 25 eV for positiv tilstand og 35 eV for negativ tilstand er anvendt. (Dette vil give robuste signaler koffein fragmention og sulfation. Skanneområdet her er fast, fordi den sidste m / z ikke bør være større end 15x af udgangsmaterialet m / z)
- Når ionkilden er stabil, og udfør derefter den tilpassede kalibrering. Bemærk: En stabil kilde er defineret som mindre end 10% af den totale ionstrøm variation i positiv modus, og mindre end 15% i negativ modus. Den tilpassede kalibrering ioner og tilsvarende m / z er angivet i tabel 1.
- Etablere LC-MS instrumentering til polær metabolit analyse. LC er koblet til en QE-MS for metabolit separation og detektion.
- Udstyre QE-MS med en opvarmet elektrosprayionisering sonde (H-ESI). Indstil de relevante tuning parametre for sonden som anført: varmer temperatur, 120 ° C; kappe gas, 30; ekstra gas, 10; feje gas, 3; spray spænding, 3,6 kV forpositiv tilstand og 2,5 kV i negativ modus. Indstil kapillær temperatur ved 320 ° C, og S-linse 55.
- Byg en fuld scanning metode som følger: Full scan: 60 til 900 (m / z); opløsning: 70.000; maksimal indsprøjtning tid: 200 ms med typiske indsprøjtning gange omkring 50 msek; automatisk gain kontrol (AGC): 3.000.000 ioner. Disse indstillinger resulterer i et normeret forbrug på omkring 550 ms at udføre scanninger i både positiv og negativ tilstand.
- Etablere kromatografi metoden. Ansæt en amid søjle (100 x 2,1 mm id, 3,5 mm) til sammensatte separation ved stuetemperatur 13,15. Den mobile fase A er som beskrevet ovenfor, og den mobile fase B er acetonitril. Brug af en lineær gradient som følger: 0 min, 85% B; 1,5 min, 85% B, 5.5 min, 35% B; 10min, 35% B, 10.5 min, 35% B, 14.5 min, 35% B, 15 min, 85% B og 20 min, 85% B. Flowhastigheden er 0,15 ml / min 0 og 10 min og 15 til 20 min, og 0,3 ml / min 10,5-14,5 min.
2. Preparation af metabolit Prøver
- Forbered en solventekstraktion. Bland 40 ml methanol (LC-MS klasse) og 10 ml vand (LC-MS) i en 50 ml rør, og holde det i -80 ° C fryseren i mindst 1 time før brug. Bemærk: Denne procedure og nedenstående trin kan ændres til udvinding af biologisk væv og væskeprøver.
- Kultur tyktarmskræft HCT 8 celler i tre 10 cm skåle eller plader med 6 brønde med fuld vækstmedium, RPMI 1640 suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum og 100.000 enheder / L penicillin og 100 mg / l streptomycin.
- Når cellerne når 80% konfluens, hurtigt at fjerne mediet, og placer fadet eller plade på toppen af tøris 13,15. Tilsæt 1 ml ekstraktionsopløsningsmiddel samme (80% methanol / vand), og overfører pladen til -80 ° C fryser. For en 10 cm skål, tilsættes 3 ml ekstraktionsopløsningsmiddel til hver brønd. (Forsøg at fjerne mediet så meget som muligt for at undgå ion undertrykkelse effekt på grund restsaltene fra mediet.)
- Lad pladen i 15 min. Fjern den fra fryseren, og skrabe cellerne i opløsningsmidlet på tøris. Opløsningen overføres til 1,7 ml Eppendorf-rør og centrifugeres med en hastighed på 20.000 xg ved 4 ° C i 10 min. (Forbered celle metabolitter fra tre separate retter at gøre tre udtages. Formålet med at holde to rør er at have en som en sikkerhedskopi.)
- Supernatanten overføres til to nye Eppendorf-rør, og tør dem i en hastighed vakuum. Det tager omkring 3-6 hr afhængigt af hastigheden vakuum anvendes. (Prøverne kan også tørres natten over under nitrogen gas.)
- Efter tørring, gemme rør af hver prøve i -80 ° C fryseren. Når du er klar, rekonstruere en prøve i 20 ml vand (LC-MS-kvalitet), og injicere 5 ml til LC-QE-MS for analyse.
3.. Opsætning af Sample Sequence
- Når kalibreringen er korrekt udført på QE-MS, ligevægt LC kolonne i 5 min med 85% A ved et flowhastighed på 0,15 ml / min, hvilket er den begyndende tilstand af LC-gradient.
- Opsæt prøven sekvens i tilfældig rækkefølge. Bemærk: På denne måde fordeler udsving indført ved LC-MS til hver prøve og sikrer en mere nøjagtig sammenligning mellem forskellige prøver. Hvert 6 prøver, tilføje en vask løb, som deler den samme MS-metode, bortset LC gradient er 95% A i 10 minutter efterfulgt af en 5 min kolonne ækvilibrering ved 85% A med en strømningshastighed på 0,15 ml / min. Tilføj blindprøver (100% vand) efter hver vask køre for at vurdere systemets baggrund og bære over niveauer.
- Gem sekvens og når LC kolonne viser stabilt tryk, omkring 400 psi, starter sekvensen løb. Hvis der ikke er nogen anden prøve skal køres efter denne sekvens, og derefter tilføje et stop løb enden af sekvensen, som har en strømningshastighed på 0 ml / min i slutningen af gradienten og vælg "standby" efter endt sekvens.
- Re-køre den samme prøve-sæt 12 timer efter en kalibrering. (Dette vil jegs at vurdere masse fejl udsving efter en kalibrering.)
4.. Indlæg Analyse Instrument Rengøring og vedligeholdelse
- Ved slutningen af sekvensen søjlen, vaskes med 95% A ved en strømningshastighed på 0,2 ml / min i 2 timer, og om nødvendigt, kolonnen omvendt før vask.
- Fjern LC søjlen og direkte forbinde LC til ionkilden af en fagforening. Forbered rensevæske, vand / methanol / myresyre (v: v: v, 90:10:0,2), sæt MS på standby, og vask LC-MS-system med en strømningshastighed på 0,1 ml / min i 1 time for at fjerne den resterende udfældede salte eller andre urenheder. Sænk strømningshastighed, hvis der er for meget systemtryk.
- Indstil kapillær temperatur ved 50 ° C, og fjern ion bur. Forsigtigt tage ud ion feje kegle og ionoverførsel glasset efter kapillær temperaturen falder til 50 ° C. Brug en ru mesh, såsom sandpapir, for at fjerne urenheder efterladt på overfladen af ion sweep kegle.
- Placer ionoverførselrøret i et 15 ml Falcon-rør indeholdende 10 ml 90% vand / methanol med 0,1% myresyre. Efter sonicating glasset i et vandbad sonicator i 20 min, dekanteres opløsningsmidlet inde, erstatte det med 10 ml ren methanol og sonikeres for en anden 20 min. (Hvis det er nødvendigt, kan sonikeringen gøres på 40 ° C eller en endnu højere temperatur for at opnå bedre rengøring resultater.)
5. Analyse af LC-MS data
- For at sikre prøven sekvens kører problemfrit, efter endt de to første prøver i den rækkefølge, tjek toppe for ukendte metabolitter. Brug en csv-fil notering metabolit navne, neutral kemiske formel og afsløring mode (enten positiv eller negativ), som input-fil, og output-filen indeholder udvundet toppe og masse fejl i ppm. Hvis topform er unormal eller massen fejl er forskudt med mere end 5 ppm, derefter resten af sekvensen skal stoppes og fejlfinding skal gøres.
- Vælg den metode til "peak justeringog ramme udvinding "på kommercielt tilgængelig software. Vælg rådata fra LC-MS og gruppere dem. Pick prøver i midten af kørslen sekvensen som kromatografi referenceprøve for peak justering. Upload et stel frø herunder kendte metabolitter for målrettede metabolitter analyse med data og den tilhørende ramme frø.
- Udføre dataanalyse i positiv og negativ tilstand separat. Brug standardindstillingen for andre parametre. Sluk for database søgefunktion og køre arbejdsgangen. Eksporter de behandlede data som et excel ark, som indeholder topareal af hver ramme. Det første sæt af billeder svarer til metabolitter i målrettet liste. Bemærk: Ved en målrettet metabolit analyse, opnås de metabolitter oplysninger baseret på tidligere undersøgelser 13,15.
- For en ikke-målrettede metabolit analyse, vælge metode "komponent udvinding". Load blindprøver for baggrundssubtraktion. Indstil topintensiteten tærskel ent 10 5 m / z bredde på 10 ppm og signal-støj-forhold på 3 til.
- Brug menneskelig metabolomet database for ukendte forbindelser identifikation. Brug et CV filter til at fjerne komponenter med store CV'er inden der udtages. Manuelt gå igennem hver enkelt komponent og vælge dem med veldefineret spids eller relativt stor forskel i forskellige prøver typer for database søgning. Eksport af data med hits i databasen. (Peak tilpasning kunne omgås hvis toppen alignmentscore er for lav.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nøjagtigheden af metabolomics data meget afhænger af LC-QE-MS instrument performance. For at vurdere, om instrumentet fungerer i god stand, og om den anvendte metode er korrekt, er der flere kendte metabolit LC toppe udvundet fra samlede ionkromatografi (TIC), som vist i fig. 1. Polar metabolitter, herunder aminosyrer, glycolyse mellemprodukter , TCA mellemprodukter, nukleotider, vitaminer, ATP, NADP + og så videre har god opbevaring om søjlen og god Topformerne i amid kolonnen under de nuværende LC forhold. I mellemtiden er en masse fejl test udført inden for 24 timer efter lav masse kalibrering, som illustreret i figur 2. 6 forskellige koncentrationer af prøver i tre eksemplarer køres to gange efter kalibrering og hele tidsinterval dækker næsten 24 timer. Massen fejl vurderes ved at sammenligne det detekterede m / z til den teoretiske m / z målrettede metabolitter. Her målrettede metabolitter har en m / zi området fra 74 (glycin) til 744 (NADP +). Y-aksen her repræsenterer den akkumulerende procentdel af metabolitter inden for visse masse fejl rækkevidde. Den blå kurve viser resultatet 0-12 timer, mens den røde kurve viser de indsamlede 12-24 hr data. Figur 2 viser tydeligt, at mere end 90% af metabolitter inden for 5 ppm masse fejl, hvilket betyder lav masse rækkevidde kalibrering metode udviklet her er tilstrækkeligt til at opretholde 5 ppm masse fejl for lav detektion masseområdet.
Et andet spørgsmål, der skal behandles, er følsomheden af instrumentet med den nuværende metode og instrument setup. En seriefortynding af tredobbelte prøver fra 10 cm petriskål blev udført 5 gange med en fortyndingsfaktor på 6, ender med 6 forskellige koncentrationer af prøver. Disse prøver repræsenterer mængden af metabolitter udvundet fra 10 7, 1,67 x 10 6, 2,78 x 10 5, 4,63 x 10 4, 7,72 x 10 3 og 1,29x 10 3 celler. Da hver koncentration af prøve er udarbejdet i tre eksemplarer, der er i alt 18 prøver analyseret i LC-QE-MS. En målrettet liste bruges til at vurdere antallet af metabolitter detekteret på til forskellige koncentration af prøve. Resultatet i figur 3 viser, at det optimale antal målrettede metabolitter detekteret er mellem 2,78 x 10 5 og 1,67 x 10 6 celler, mens 1 x 10 7 celler giver et færre antal påviste metabolitter, hvilket skyldes ion undertrykkelse effekter. Dette resultat indikerer, at den optimale mængde af celler til at udtrække til denne analyse er omtrent som en brønd i en 6-brønds plade.
For målrettede metabolit analyse, er et CV cutoff på 20% og en gennemsnitlig intensitet på 10 7 bruges til at foretage komponenter bordet. Disse stive CV og den gennemsnitlige intensitet tærskelværdier anvendes til denne demonstration mål. For at forbedre reproducerbarheden kan CV cutoffværdier væreøges (for eksempel 30%), mens der skal reduceres (for eksempel 10 5) til at omfatte flere toppe den gennemsnitlige intensitet værdier. Efter manuel kontrol toppe, er komponenter med gode figurer udvalgt og søgt efter i den menneskelige metabolomet databasen. Resultaterne er vist i tabel 2.. Tabel 2A præsenterer resultaterne fra data indsamlet i positiv modus, og tabel 2B viser resultaterne fra negativ modus. Nogle af de identificerede metabolitter her overlapper metabolitter i målrettet liste, såsom glutathion, prolin og så videre, men i mellemtiden, yderligere metabolitter fraværende fra den målrettet liste er udforsket, såsom methyglyoxal, der kan udledes af glykolyse og 1 -palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin, som detekteres i positiv med en retentionstid på 3,2 minutter, hvilket er en rimelig tilbageholdelse af phospholipider på et amid kolonne. En protokol om målrettede metabolit databasesøgning har været PReviously indberettet 20.
Fig. 1. Eksempler på LC-MS kromatografi toppe. Her er rekonstruerede chromatografi genereret med en masse vindue på 10 ppm (m / z ± 5 ppm). X-aksen viser opholdstiden, mens Y-aksen viser den relative intensitet, og den maksimale intensitet er anført ovenfor hver metabolit. A viser toppe detekteret fra positiv-mode, mens B viser toppe fra negativ tilstand. Klik her for at se større billede.
Figur 2. 60. Evaluering af lavt masseinterval kalibrering Y-aksen er den kumulative procentdel af metabolitter med massedetektion fejl inden for 5 ppm. X-aksen er massen fejlmargin i ppm. Blå og røde kurver viser 0-12 timer og 12-24 timer, hhv. Klik her for at se større billede.
. Figur 3. Vurdering af prøvemængde -. Antal målrettede metabolitter detekteret versus antallet af HCT 8 celler røde firkanter repræsenterer metabolitter detekteret i positiv tilstand, blå cirkler betyder metabolitter målt i negativ tilstand, og de sorte trekanter er det samlede antal af metabolitter fra både positiv og negativ modus. X-aksen viser antallet af HCT 8 celler.upload/51358/51358fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.
| Standarder | M / Z, positiv modus | M / Z, negativ modus | Neutral formel | Neutral masse |
| n-butylamin | 74.096425 | NA | C 4 H 11 N | 73.089149 |
| Koffein fragment | 138.066188 | NA | C 6 H 8 N 3 O | 137.058912 |
| Koffein | 195.087652 | NA | C 8 H 11 N 4 O 2 | 194.080376 |
| Diazinon | 305.108329 | NA | C 12 H 20 N 2 O 3 PS | 304.101053 |
| MRFA peptid | 524.264966 | <td> NAC 23 H 37 N 7 O 5 S | 523,25769 | |
| Fluoroacetate | N / A | 77.004432 | C 2 H 3 FO 2 | 78.011708 |
| Sulfat | N / A | 96.960106 | H 2 SO 4 | 97.967382 |
| Homovanillinsyre | N / A | 181.050634 | C 9 H 10 O 4 | 182,05791 |
| Dodecylsulfat | N / A | 265.147906 | C 12 H 26 SO 4 | 266.155182 |
| Taurocholat | N / A | 514.2844 | C 26 H 45 NO 7 S | 515.291676 |
Tabel 1.. Standarder Lav masseinterval kalibrering og deres nøjagtige m / z.
| CSID | Navn | Formula | Monoisotopic Mass | Søg Mass | Fejl (ppm) | RT (min) |
| 234 | beta-alanin | C 3 H 7 NO 2 | 89,04800 | 89,04805 | 0,62 | 8.08 |
| 1057 | Sarkosin | C 3 H 7 NO 2 | 89,04768 | 89,04805 | 4.22 | 8.08 |
| 5735 | alanin | C 3 H 7 NO 2 | 89,04768 | 89,04805 | 4.22 | 8.08 |
| 568 | Kreatinin | C 4 H 7 N 3 O | 113,05900 | 113,05889 | 1.00 | 4.41 |
| 128.566 | Proline | C 5 H 9 NO 2 | 115,06333 | 115,06338 | 0,41 | 7.54 |
| 6050 | L-(+)-valin | C 5 H 11 NO 2 | 117,07898 | 117,07896 | 0.18 | 7,42 |
| 7762 | Amylnitrit I | C 5 H 11 NO 2 | 117,07898 | 117,07896 | 0.18 | 7,42 |
| 135 | 5-amino-valerianesyre | C 5 H 11 NO 2 | 117,07900 | 117,07896 | 0,38 | 7,42 |
| 242 | trimethylglycin | C 5 H 11 NO 2 | 117,07900 | 117,07896 | 0,38 | 7,42 |
| 911 | Niacinamid | C6H6N2O | 122,04800 | 122,04793 | 0.55 | 2,60 |
| 1091 | Taurin | C 2 H 7 NO 3 S | 125,01466 | 125,01469 | 0.20 | 7.61 |
| 1030 | Pyrrolin hydroxycarboxylsyre | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0.02 | 8.51 |
| 7127 | PCA | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0.02 | 8.51 |
| 90.657 | N-Acryloylglycine | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0.02 | 8.51 |
| 388.752 | 5-oxo-D-prolin | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0.02 | 8.51 |
| 389.257 | 3-hydroxy-3 ,4-dihydro-2H-pyrrol-5-carboxylsyre | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0.02 | 8.51 |
| 8031176 | Pyrrolidonecarboxylic syre | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0.03 | 8.51 |
| 5605 | Hydroxyprolin | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8.08 |
| 7068 | N-Acetylalanin | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | <td> 131,059015,83 | 8.08 | |
| 79.449 | Ac-Ala-OH | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8.08 |
| 89122 | Ethylformylglycine | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8.08 |
| 167.744 | L-glutaminsyre-y-semialdehyd | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8.08 |
| 388.519 | 5-amino-2-oxopentansyre | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8.08 |
| 134 | Aminolevulinsyre | C 5 H 9 NO 3 | 131,05800 | 131,05901 </ Td> | 7,70 | 8.08 |
| 9312313 | 3-hydroxy-L-prolin | C 5 H 9 NO 3 | 131,05800 | 131,05901 | 7,70 | 8.08 |
| 566 | Kreatin | C 4 H 9 N 3 O 2 | 131,06900 | 131,06905 | 0,36 | 8.08 |
| 5880 | L-(+)-leucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0,68 | 6,96 |
| 6067 | L-(+)-Isoleucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0,68 | 6,96 |
| 19964 | L-norleucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0,68 | 6,96 </ Td> |
| 388.796 | beta-leucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0,68 | 6,96 |
| 548 | Aminocapronsyre | C 6 H 13 NO 2 | 131,09500 | 131,09455 | 3,48 | 6,96 |
| 6031 | L-(-)-asparagin | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05350 | 132,05348 | 0.10 | 8.31 |
| 109 | Ureidopropionic syre | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05299 | 132,05348 | 3,71 | 8.31 |
| 6026 | L-ornithin | C 5 H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08988 | 0.02 | 10.37 |
| 64236 | D-ornithin | C 5 H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08988 | 0.02 | 10.37 |
| 5746 | Glutamin | C 5 H 10 N 2 O 3 | 146,06914 | 146,06900 | 0,93 | 8.25 |
| 128.633 | D-glutamin | C 5 H 10 N 2 O 3 | 146,06914 | 146,06900 | 0,93 | 8.25 |
| 141.172 | Ureidoisobutyric syre | C 5 H 10 N 2 O 3 | 146,06914 | 146,06900 | 0,93 | 8.25 |
| 21436 | N-Methyl-<scp> D </ SCP>-asparaginsyre | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1.13 | 8.06 |
| 21814 | D-(-)-Glutaminsyre | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1.13 | 8.06 |
| 30572 | L-(+)-glutaminsyre | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1.13 | 8.06 |
| 58744 | N-acetyl-L-serin | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1.13 | 8.06 |
| 5907 | L-(-)-methionin | C 5 H 11 NO 2 S | 149,05106 | 149,05095 | 0.70 | 7.39 |
| 6038 | Histidin | C 6 H 9 N 3 O 2 | 155,06947 | 155,06940 | 0,48 8,33 | |
| 5910 | L-(-)-phenylalanin | C 9 H 11 NO 2 | 165,07898 | 165,07887 | 0,63 | 6,60 |
| 1025 | Pyridoxin | C 8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0.80 | 3.24 |
| 4463 | Oxidopamine [USAN: INN] | C 8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0.80 | 3.24 |
| 102750 | 5 - (2-aminoethyl)-Pyrogallol | C 8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0.80 | 3.24 |
| 388.394 | Noradrenalin | C 8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0.80 | 3.24 |
| 6082 | L-(+)-arginin | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11144 | 1.39 | 10.77 |
| 64224 | D-Arg | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11144 | 1.39 | 10.77 |
| 780 | heteroauxin | C 10 H 9 NO 2 | 175,06300 | 175,06304 | 0.18 | 2,32 |
| 67261 | Indol-3-acetaldehyd, 5-hydroxy- | C 10 H 9 NO 2 | 175,06332 | 175,06304 | 1.65 | 2,32 |
| 3574185 | Indol-2-EDDIKESYRE | C 10 H 9 NO 2 | 175,06332 | 175,06304 | 1.65 | 2,32 |
| 5833 | L-(-)-tyrosin | C 9 H 11 NO 3 | 181,07390 | 181,07378 | 0,66 | 7.48 |
| 389.285 | 3-Amino-3-(4-hydroxyphenyl) propansyre | C 9 H 11 NO 3 | 181,07390 | 181,07378 | 0,66 | 7.48 |
| 13628311 | L-threo-3-phenylserin | C 9 H 11 NO 3 | 181,07390 | 181,07378 | 0,66 | 7.48 |
| 425 | 4-hydroxy-4-(3-pyridyl) smørsyre | C 9 H 11 NO 3 | 181,07401 | 181,07378 | 1.25 | 7.48 |
| 13899 | 3 - (1H-indol-3-yl) acrylsyre | C 11 H 9 NO 2 | 187,06332 | 187,06330 | 0.15 | 6.44 |
| 10607876 | Indolacrylsyre | C 11 H 9 NO 2 | 187,06332 | 187,06330 | 0.15 | 6.44 |
| 389.120 | N6, N6, N6-trimethyl-L-lysin | C 9 H 20 N 2 O 2 | 188,15248 | 188,15221 | 1.45 | 10.87 |
| 388.321 | 5 "-S-methyl-5"-thioadenosine | C 11 H 15 N 5 O 3 S | 297,08957 | 297,08898 | 2.00 | 2,56 |
| 144 | 9 - (5-s-methyl-5-thiopentofuranosyl)-9H-purin-6-amin | C 11 H 15 N 5 O 3 S | 297,09 tusind | 297,08898 | 3,43 | 2,56 |
| 111.188 | Glutathion | C10H 17 N 3 O 6 S | 307,08380 | 307,08345 | 1.14 | 8.02 |
Tabel 2A.
| CSID | Navn | Formula | Monoisotopic Mass | Søg Mass | Fejl (ppm) | RT (min) |
| 857 | Methylglyoxal | C 3 H 4 O 2 | 72,02100 | 72,02108 | 1.03 | 7,70 |
| 1057 | Sarkosin | C 3 H 7 NO 2 | 89,04768 | 89,04747 | 2,33 | 8.19 |
| 5735 | alanin | C 3 H 7 NO 2 | 89,04768. | 89,04747 | 2,33 | 8.19 |
| 234 | beta-alanin | C 3 H 7 NO 2 | 89,04800 | 89,04747 | 5,93 | 8.19 |
| 55423 | R-mælkesyre | C 3 H 6 O 3 | 90,03169 | 90,03143 | 2,91 | 5.12 |
| 61460 | Hydroxypropionsyre | C 3 H 6 O 3 | 90,03169 | 90,03143 | 2,91 | 5.12 |
| 96860 | L-(+)-mælkesyre | C 3 H 6 O 3 | 90,03169 | 90,03143 | 2,91 | 5.12 |
| 592 | Mælkesyre | C 3 H 6 O 3 | 90,03200 | 90,03143 | 6.29 | 5.12 |
| 650 | Dihydroxyacetone | C 3 H 6 O 3 | 90,03200 | 90,03143 | 6.29 | 5.12 |
| 731 | Glyceraldehyd | C 3 H 6 O 3 | 90,03200 | 90,03143 | 6.29 | 5.12 |
| 1086 | Svovlsyre | H 2 O 4 S | 97,96738 | 97,96683 | 5.63 | 8.13 |
| 128.566 | Proline | C 5 H 9 NO 2 | 115,06333 | 115,06302 | 2,67 | 7.78 |
| 1078 | Ravsyre | C 4 H 6 O 4 | 118,02661 | 118,02630 | 2,66 | 7.72 |
| 466.979 | Erythrono-1 ,4-lacton | C4 H 6 O 4 | 118,02661 | 118,02630 | 2,66 | 7.72 |
| 4483398 | D-erythronsyre g-lacton | C 4 H 6 O 4 | 118,02661 | 118,02630 | 2,66 | 7.72 |
| 473 | Methylmalonsyre | C 4 H 6 O 4 | 118,02700 | 118,02630 | 5.96 | 7.72 |
| 8527138 | (3S, 4R) -3,4-Dihydroxydihydrofuran-2 (3H)-on | C 4 H 6 O 4 | 118,02700 | 118,02630 | 5.96 | 7.72 |
| 140.384 | 2-ketocaproic syre | C 6 H 10 O 3 | 130,06299 | 130,06270 | 2,24 | 2.35 |
| 164251 | Methyloxovaleric syre | C 6 H 10 O 3 | 130,06299 | 130,06270 | 2,24 | 2.35 |
| 388.419 | (3S)-3-methyl-2-oxopentansyre | C 6 H 10 O 3 | 130,06299 | 130,06270 | 2,24 | 2.35 |
| 15642233 | Ketoleucine | C 6 H 10 O 3 | 130,06299 | 130,06270 | 2,24 | 2.35 |
| 46 | a-oxo-b-methylvalerianesyre | C 6 H 10 O 3 | 130,06300 | 130,06270 | 2,36 | 2.35 |
| 69 | Alfa-ketoisocaproic syre | C 6 H 10 O 3 | 130,06300 | 130,06270 | 2,36 | 2.35 |
| 134 | Aminolevulinsyre | 131,05800 | 131,05795 | 0,36 | 8.19 | |
| 9312313 | 3-hydroxy-L-prolin | C 5 H 9 NO 3 | 131,05800 | 131,05795 | 0,36 | 8.19 |
| 5605 | Hydroxyprolin | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2,23 | 8.19 |
| 7068 | N-Acetylalanin | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2,23 | 8.19 |
| 79.449 | Ac-Ala-OH | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2,23 | 8.19 |
| 89122 | Ethylformylglycine | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2,23 | 8.19 |
| 167.744 | L-glutaminsyre-y-semialdehyd | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2,23 | 8.19 |
| 388.519 | 5-amino-2-oxopentansyre | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2,23 | 8.19 |
| 5880 | L-(+)-leucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3,39 | 7.09 |
| 6067 | L-(+)-Isoleucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3,39 | 7.09 |
| 19964 | L-norleucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3,39 | 7.09 |
| 388.796 | beta-leucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3,39 | 7.09 |
| 548 | Aminocapronsyre | C 6 H 13 NO 2 | 131,09500 | 131,09419 | 6.18 | 7.09 |
| 109 | Ureidopropionic syre | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05299 | 132,05321 | 1.60 | 8.28 |
| 6031 | L-(-)-asparagin | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05350 | 132,05321 | 2.21 | 8.28 |
| 6026 | L-ornithin | C 5 H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08961 | 1,98 | 10.36 |
| 64236 | D-ornithin | C 5 H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08961 | 1,98 | 10.36 |
| 193317 | L-(-)-æblesyre | C 4 H 6 O 5 | 134,02153 | 134,02130 | 1,72 | 7,95 |
| 510 | (±)-æblesyre | C 4 H 6 O 5 | 134,02200 | 134,02130 | 5.25 | 7,95 |
| 133.224 | threonsyre | C 4 H 8 O 5 | 136,03717 | 136,03688 | 2.14 | 7,70 |
| 388.628 | 2,3,4-Trihydroxybutanoic syre | C 4 H 8 O 5 | 136,03717 | 136,03688 | 2.14 | 7,70 |
| 2061231 | DL-erythronsyre syre | C 4 H 8 O 5 | 136,03717 | 136,03688 | 2.14 | 7,70 |
| 21436 | N-Methyl-<scp> D </ SCP>-asparaginsyre | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1.16 | 8.05 |
| 21814 | D-(-)-Glutaminsyre | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1.16 | 8.05 |
| 30572 | L-(+)-glutaminsyre | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1.16 | 8.05 |
| 58744 | N-acetyl-L-serin | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1.16 | 8.05 |
| 6038 | Histidin | C 6 H 9 N 3 O 2 | 155,06947 | 155,06930 | 1.09 | 8.36 |
| 199 | Allantoin | C 4 H 6 N 4 O 3 | 158,04401 | 158,04387 | 0,88 | 4.76 |
| 6082 | L-(+)-arginin | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11154 | 0.80 | 10.76 |
| 64224 | D-Arg | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11154 | 0.80 | 10.76 |
| 58576 | N-acetyl-L-asparaginsyre | C 6 H 9 NO 5 | 175,04807 175,04803 | 0.18 | 7,87 | |
| 996 | Pyrophosphorsyre | H 4 O 7 P 2 | 177,94299 | 177,94331 | 1,79 | 8.42 |
| 5589 | Glukose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 17893 | Mannose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 58238 | . Beta.-D-glucopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 71358 | . Alpha.-D-glucopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 134.838 | 3-deoxy-arabino-hexonic syre | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 388332 | L-sorbopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 388476 | beta-D-galactopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 388.480 | . Alpha.-D-galactopyranoseenhed | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 388.775 | beta-D-fructofuranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 7,53 | |
| 10239179 | Inositol | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 16736992 | Cis-inositol | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 17216070 | allose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 17216093 | L-sorbose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 201 | hexopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06300 | 180,06346 | 2,53 | 7,53 |
| 868 | 1,2,3,4,5,6-Cyclohexanhexol | C 6 H 12 O 6 | 180,06300 | 180,06346 | 2,53 | 7,53 |
| 2068 | Theophyllin | C 7 H 8 N 4 O 2 | 180,06473 | 180,06346 | 7.04 | 7,53 |
| 4525 | 1,7-dimethyl-xanthin | C 7 H 8 N 4 O 2 | 180,06473 | 180,06346 | 7.04 | 7,53 |
| 5236 | Theobromin | C 7 H 8 N 4 O 2 | 180,06473 | 180,06346 | 7.04 | 7,53 |
| 1161 | isocitronsyre | C 6 H 8 O 7 | 192,02701 | 192,02704 | 0.15 | 8.18 |
| 305 | Citrisk syre | C 6 H 8 O 7 | 192,02699 | 192,02704 | 0,23 | 8.18 |
| 963 | pantothensyre | C 9 H 17 NO 5 | 219,11067 | 219,11049 | 0,84 | 6.72 |
| 6361 | D-pantothensyre | C 9 H 17 NO 5 | 219,11067 | 219,11049 | 0,84 | 6.72 |
| 960 | palmitinsyre | C 16 H 32 O 2 | 256,23999 | 256,24 tusind | 0.05 | 1,73 |
| 111.188 | Glutathion | C 10 H 17 N 3 O 6 S | 307,08380 | 307,08339 | 1.35 | 8.03 |
| 388.337 | N-acetylneuraminsyre | 309,10599 | 309,10585 | 0.45 | 7,43 | |
| 392.681 | N-acetyl-alfa-neuraminsyre | C 11 H 19 NO 9 | 309,10599 | 309,10585 | 0.45 | 7,43 |
| 392.810 | Sialinsyre Neu5Ac | C 11 H 19 NO 9 | 309,10599 | 309,10585 | 0.45 | 7,43 |
Tabel 2B.
. Tabel 2 Liste over målrettede metabolitter detekteret i HCT 8 celler (2,78 x 10 5 celler ækvivalens) Tabel 2A og 2B omfatter komponenter udvinding oplysninger:. Retentionstid, m / z og masse fejl, og i mellemtiden, database søgeresultater: Chemspider id ( CSID), navn, formel, og så videre. Her analyserede prøver er ligningl til metabolitter udvundet fra 2,78 x 10 5 celler, og tærsklen intensitet er 1 x 10 7 for at undgå kedelige resultat for demonstration formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske skridt for en vellykket metabolit profilering i celler ved hjælp af denne protokol er: 1) at styre mediet vækst og omhyggelig udvinding af cellerne; 2) justering af LC metode baseret på MS metode setup til at sikre, at der er nok (normalt mindst 10) datapunkter på tværs af et højdepunkt for kvantificering; 3) gør en lav masse kalibrering før kører prøver; 4) at indsprøjte mere end 5 ml for at undgå retentionstid skiftende og topforbredning forårsaget af vand; og 5) at forberede og kører prøver til sammenligning i samme parti for at minimere batch effekter.
De standarder (tabel 1) er valgt her for lav masse rækkevidde kalibrering er indbyrdes udskiftelige. Enhver kendt forbindelse med en m / z, der falder i massen scanningsområde er velopdragen i en H-ESI kilde, og er opløseligt i vand, methanol eller acetonitril er rimelig kandidater til kalibreringsstandarder. Det anbefales stærkt at gemme alle standardopløsningerne ent 4 ° C for at stabilisere koffein og også for at minimere fordampning af methanol eller acetonitril i kalibreringsopløsningen så kalibreringen ydeevne kan være mere reproducerbar. Sammenlignet med en almindelig masseinterval, m / z fra 150 til 2.000, der skal gøres mere hyppigt, mindst en gang hver to dage lavt masseinterval kalibrering.
Denne arbejdsproces, fra udvinding opløsningsmiddel, rekonstitution opløsningsmiddel, LC mobil fase til lav masse rækkevidde kalibrering og MS skanneområde er blevet optimeret til at måle polære metabolitter. Dette omfatter aminosyrer, acetyl aminosyrer, glykolyse pathway mellemprodukter, nukleosider, TCA cyklus mellemprodukter, nogle ene-carbon stofskifte pathway mellemprodukter og så videre. Men ændringer af denne protokol for andre klasser af metabolitter, såsom coenzym A (CoA) arter, folater, er mulige phospholipider. For eksempel CoA er mere stabil under sure betingelser, så tilsætning af en syre til 80% methanol / vand vil være nyttigt at impRove CoA følsomhed. Også CoA og lipider tendens til at have meget store molekylvægte, og dermed m / z scanning rækkevidde skal justeres fra 60 til 900 til den rigtige område, som vil omfatte disse metabolitter.
Selv om nogle af de ikke-målrettede komponent database søgeresultater overlapper med målrettet liste, er det stadig vigtigt at bygge denne målrettet liste baseret på den prioriterede forskning. Siden metabolitter i målrettet liste er lavere end den gennemsnitlige intensitet tærskel vil oplysninger om disse metabolitter fjernes under behandlingen. Den målrettede liste omfatter opholdstid information, som giver os større tillid til identifikation og kvantificering metabolit det. En yderligere fordel med QE-MS opsætning er, at tandem massespektrometri kan give mulighed for yderligere identifikation af metabolitter.
Et problem forbundet med denne arbejdsproces er, at H-ESI nål insert er følsom over for indholdet af prøverne salt, da følsomheden vil blive stærkt kompromitteret, hvis der er store mængder af ikke-flygtige salte. Derfor vil minimere saltindhold fra prøver, og rutinemæssig rengøring af kolonnen og H-ESI nål insert være nyttigt at sikre en god kvalitet af data og øge kolonnens levetid.
Sammenfattende denne protokol beskæftiger LC-QE-MS med held analysere polære metabolitter fra dyrkede celler, med minimal prøveforberedelse trin og erhvervelse hurtig data. Små ændringer i prøveforberedelse kan udføres for at opnå data fra andre biologiske kilder såsom serum og væv. For eksempel, da ren metanol kan føjes til flydende serum tilføjet for at gøre en endelig methanol koncentration til 80% for polære metabolitter ekstraktion. For vævsprøver, er stringent omrøring og blanding kræves for at opnå en bedre ekstraktion. Normalt 10 ml serum eller1 mg væv er tilstrækkelig til metabolitter analyse. De rå data kan analyseres både i målrettet tilstand, hvis der er kendte metabolitter i prøverne, og i en un-målrettet måde efterfulgt af HRMS databasesøgning. HRMS baseret metabolomics er stadig i sin vorden. For fremtidige fremskridt, kan de eksperimentelle teknikker optimeres yderligere, ekstra metabolit HRMS information og MS / MS fragmenteringsmønstre vil være nyttige og relevante algoritmer, såsom peak justering, peak integration, isotop klyngedannelse og så videre, kan forbedre effektiviteten og nøjagtigheden af databehandling. Men i sidste ende, mange af de spørgsmål, som vores lab adresser i stofskiftet er begrænset ved omhyggelig tolkning af data efter forarbejdning. Med disse store metabolomics teknikker, bliver vi ofte begrænset af vores fortolkning af data og vurdering af hypoteser genereret. Derfor behøver alle metabolomik eksperimenter formuleres omkring specifikke spørgsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) og Nathaniel Snyder (University of Pennsylvania) for værdifulde diskussioner om masse kalibrering og databehandling. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold Award nummer R00CA168997. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positive calibration mix | Thermo Scientific | #88323 | It is light sensitive. Store at 4 °C |
| Negative calibration mix | Thermo Scientific | #88324 | Store at 4 °C |
| Diazinon | Sant Cruz Biotechnology | #C0413 | It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C |
| H-ESI needle insert | Fisher Scientific | #1303200 | This could be replaced or cleaned with 5% formic acid/water (remove rubber ring) if clogged. |
| Xbridge amide column | Waters | #186004860 | Guard column is recommend to increase column lifetime. |
References
- Fiehn, O. Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks. Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).
- Mulleder, M., et al. A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology. Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).
- Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).
- Ideker, T., et al. Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network. Science. 292 (5518), 929-934 (2001).
- Jonsson, P., et al. A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS. Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).
- Jonsson, P., et al. High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses. Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).
- Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data. Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).
- Wiklund, S., et al. Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models. Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).
- Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. MetaboMiner--semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids. BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).
- Lu, D., et al. 13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).
- Shen, J., et al. Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).
- Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).
- Locasale, J. W., et al. Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).
- Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).
- Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).
- Ramanathan, R., et al. It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS. Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).
- Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer. Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).
- Michalski, A., et al. Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).
- Michalski, A., et al. Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).
- Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry. UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).
- Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine. Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).
- Want, E. J., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
