Summary
Metabolitt profilering har vært en verdifull ressurs i studiet av stoffskiftet i helse og sykdom. Ved hjelp av normal-faset væskekromatografi koblet til høy-oppløsningsmassespektroskopi med polaritet svitsjing og en hurtig arbeidssyklus beskrives en protokoll for å analysere den polare metabolske Sammensetningen av det biologiske materiale med høy følsomhet, nøyaktighet og oppløsning.
Abstract
Metabolitt profilering har vært en verdifull ressurs i studiet av stoffskiftet i helse og sykdom. Men dagens plattformer har ulike begrensende faktorer, som for eksempel arbeidskrevende prøveforberedelser, lave deteksjonsgrenser, treg skannehastigheter, intensiv metode optimalisering for hver metabolitt, og manglende evne til å måle både positivt og negativt ladede ioner i enkelt eksperimenter. Derfor kan en roman metabolomics protokoll avansere metabolomics studier. Amid-baserte hydrofil kromatografi gjør polar metabolitt analyse uten kjemisk derivatisering. Høyoppløsnings MS ved hjelp av Q-Exactive (QE-MS) har forbedret ione-optikk, økt skannehastighet (256 msek ved oppløsning 70000), og har evnen til å utføre positiv / negativ svitsjing. Ved hjelp av en kald metanolekstraksjon strategi, og kobling av et amid kolonne med QE-MS gir robust deteksjon av 168 målrettede polare metabolitter og tusenvis av ekstra funksjoner samtidig. Daten foredling er utført med kommersielt tilgjengelig programvare på en svært effektiv måte, og ukjente egenskaper trukket ut fra massespektra kan spørres i databaser.
Introduction
Metabolomics, definert som et eksperiment som måler flere metabolitter samtidig, har vært et område med stor interesse. Metabolomics gir en direkte avlesning av molekylær fysiologi og har gitt innsikt i utvikling og sykdom som kreft 1-4. Nukleær magnetisk resonans (NMR) og gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS) er blant de mest brukte instrument 5-9. NMR, spesielt har vært brukt i forsøk fluks ettersom tunge isotop merkede forbindelser, for eksempel 13 C-merkede metabolitter, er NMR-aktive 10,11. Men denne strategien krever relativt høy sample renhet og stor prøvemengde, noe som begrenser dets applikasjoner i metabolomics. I mellomtiden, data samlet inn fra NMR trenger intensiv analyse og sammensatte oppdrag av komplekse NMR spektra er vanskelig. GC-MS har vært mye brukt for polare metabolitter og lipid-studier, men det krever volatile sammensetninds og derfor ofte derivatisering av metabolitter, som noen ganger innebærer kompleks kjemi som kan være tidkrevende og introduserer eksperimentell støy.
Væskekromatografi (LC) som er koplet til trippel kvadrupol massespektrometer bruker den første kvadrupol for å velge de intakte moder ioner, som deretter fragmentert i den andre kvadrupol, mens den tredje kvadrupol brukes til å velge karakteristiske fragmenter eller datterioner. Denne metoden, som registrerer overgangen fra moder ioner til spesifikke datterioner, er betegnet multiple reaksjons overvåkning (MRM). MRM er en veldig følsom, bestemt, og robust metode for både små molekyl og protein kvantifisering 12-15,21. Men gjør MRM har sine begrensninger. For å oppnå høy spesifisitet en MRM metode må bygges for hver metabolitt. Denne metoden består i å identifisere et bestemt fragment og tilsvarende optimert kollisjonsenergi, noe som krever forhånds kjennskap til properties av metabolitter av interesse, for eksempel kjemisk struktur informasjon. Derfor, med visse unntak som involverer den nøytrale tap av vanlige fragmenter, er det ikke mulig å identifisere ukjente metabolitter med denne metoden.
I de senere årene, har høy oppløsning massespektrometri (HRMS) instrumenter blitt utgitt, slik som LTQ-Orbitrap og Exactive serien, QuanTof, og TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS kan tilveiebringe en masse for å lade forholdet (m / z) av intakte ioner innenfor en feil på noen få ppm. Derfor kan en HRMS instrument som opereres av lokalisering av forløper-ioner (dvs. fullt scan modus) få direkte strukturell informasjon fra eksakt masse og den resulterende elementsammensetningen av analytten, og denne informasjonen kan benyttes til å identifisere mulige metabolitter. Faktisk, kan all informasjon om en forbindelse oppnås med en nøyaktig masse, opp til nivået av strukturelle isomerer. Dessuten er en helscan-metoden krever ikke kjennskap til metabolitter og krever ikke fremgangsmåten optimalisering. Dessuten, siden alle ioner med m / z faller ned i frekvensområde kan analyseres, har HRMS tilnærmet ubegrenset kapasitet med hensyn til antallet av metabolitter som kan kvantifiseres i et enkelt løp i forhold til MRM-metoden. HRMS er også sammenlignes med en trippel kvadrupol MRM i kvantitativ kapasitet på grunn av den korte driftssyklus resulterer i en tilsvarende antall datapunkter som kan oppnås i en full MS skanne. Derfor HRMS gir en alternativ tilnærming til kvantitative metabolomics. Nylig har en forbedret versjon av HRMS betegnet Q-Exactive massespektrometri (QE-MS) kan betjenes under veksling mellom positive og negative moduser med tilstrekkelig hurtig syklustider i en enkelt fremgangsmåte, som ekspanderer deteksjonsområdet 19.. Her beskriver vi vår metabolomics strategi ved hjelp av QE-MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av LC-MS-reagenser, Etablering av en Kromatografi Method, og Etablering av Instrument Operating Procedures
- Utarbeidelse av LC Løse
- Forbered 500 ml mobilfaser. A er 20 mM ammoniumacetat og 15 mM ammonium-hydroksid i 3% acetonitril / vann, endelig pH 9,0; og B er 100% acetonitril.
- Løst cap flasken, legg den i et vannbad sonicator, og sonicate i 10 min uten ekstra oppvarming. (Dette trinn er å sikre at alle de ammoniumsalter oppløses fullstendig og at det ikke er noen gjenværende luftbobler.)
- Overfør 250 ml av oppløsningsmidlet til en 250 ml glassflaske for LC-MS bruk, og holde resten ved 4 ° C.
- Klargjør lav masse utvalg kalibreringsløsning. Det er viktig å bruke en tilpasset lav masseområde kalibreringsblanding for metabolomics anvendelser for å sikre at nøyaktige masser blir detektert ved lave molekylvekter.
- Vei 5 mg av begge natriumacetatpufferum fluoroacetate og homovanillic syre og oppløse dem i 5 ml vann for å gi en sluttkonsentrasjon på 1 mg / ml. Oppløs diazinon i metanol for å gi en sluttkonsentrasjon på 10 mg / ml.
- For å fremstille 1 ml negative lav masse kalibreringsløsning, bland 960 ml av termo negative kalibreringsløsning med 20 ml natrium-fluoroaceate og homovanillic syreløsning. For å gjøre en ml positiv lav masse kalibreringsløsning, bland 990 ml av termo positiv kalibreringsløsning og 10 ml diazinon løsning. (Den lave massekalibreringsløsning bør lagres ved 4 ° C og være forberedt frisk hver 2 mnd.)
- Kalibrering av QE-MS til en lav Mass Range
- Før du utfører lav masse range kalibrering, utføre en standard massekalibrering (m / z, 150-2,000) i både positive og negative modi basert på produsentens instruksjoner.
- Når en vanlig massekalibrering passerer, justere frekvensområde til 60-900 m / z i instrument kontrollpaneletog en kilde CID på 25 eV for positiv modus og 35 eV for negative virkemåte benyttes. (Dette vil gi robuste signaler av koffein fragment ion og sulfat-ion. Det frekvensområde her er fast, fordi den siste m / z ikke bør være større enn 15x av utgangs m / z)
- Når ionekilde er stabil, og utfør deretter tilpasset kalibrering. Merk: En stabil kilde er definert som mindre enn 10% av den totale ione strøm variasjon i positiv modus, og mindre enn 15% i negativ modus. De tilpassede ioner kalibrering og tilsvarende m / z er oppført i tabell 1.
- Etablere LC-MS instrumentering for polar metabolitt analyse. LC er koblet til en QE-MS for metabolitt separasjon og deteksjon.
- Utstyre den QE-MS med en oppvarmet electro ionisering probe (H-ESI). Angi de relevante justeringsparametere for sonden som angitt: varmeapparat temperatur, 120 ° C; kappe gass, 30; hjelpegass, 10; spylegass, 3; spray spenning, 3,6 kV forpositiv modus og 2,5 kV for negativ modus. Sett kapillær temperaturen på 320 ° C, og S-objektiv på 55 år.
- Bygg en full scan metode som følger: Full frekvensområde: 60-900 (m / z); oppløsning: 70 000; maksimal injeksjons tid: 200 msek med typiske injeksjon ganger rundt 50 ms; Automatic Gain Control (AGC): 3000000 ioner. Disse innstillingene resultere i en arbeidssyklus på rundt 550 msek for å utføre skanninger i både positiv og negativ modus.
- Etablere kromatografi metoden. Benytter et amid-kolonne (100 x 2,1 mm id, 3,5 mm) for forbindelse separasjon ved romtemperatur 13,15. Den mobile fase A er som beskrevet ovenfor, og mobilfase B er acetonitril. Bruk av en lineær gradient på følgende måte: 0 minutter, 85% B; 1,5 minutter, 85% B, 5.5 min, 35% B; 10 minutter, 35% B, 10,5 min, 35% B, 14,5 min, 35% B, 15 minutter, 85% B, 20 min, 85% B. Strømningshastigheten er 0,15 ml / min 0-10 min, og 15 til 20 min, og 0,3 ml / min 10,5 til 14,5 min.
2. Preparation av Metabolittkonsentrasjoner Samples
- Forbered en utvinning løsemiddel. Bland 40 ml metanol (LC-MS-kvalitet) og 10 ml vann (LC-MS-kvalitet) i et 50 ml rør, og holde det på -80 ° C fryser i minst 1 time før bruk. Merk: Denne prosedyren og trinnene nedenfor kan bli endret for utvinning av biologisk vev og væskeprøver.
- Kulturtykktarmskreft HCT 8 celler i tre 10 cm retter eller 6-brønns plater med full vekst medium, RPMI 1640 supplert med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum og 100 000 enheter / l penicillin og 100 mg / l streptomycin.
- Når cellene nå 80% samløpet, raskt fjerne mediet, og sett formen eller plate på toppen av tørris 13,15. Tilsett 1 ml ekstraksjons-oppløsningsmiddel umiddelbart (80% metanol / vann), og overfører platen til -80 ° C fryser. For en 10 cm plate, tilsett 3 ml ekstraksjons-oppløsningsmiddel til hver brønn. (Se for å fjerne mediet så mye som mulig for å unngå ion undertrykkelse effekt på grunn av gjenværende salter fra medium.)
- La platen i 15 min. Fjern det fra fryseren, og skrape cellene i løsningsmidlet på tørris. Overfør løsningen til 1,7 ml Eppendorf-rør, og sentrifuger med hastigheten på 20 000 x g ved 4 ° C i 10 min. (Forbered celle metabolitter fra tre separate retter å lage tre replikate prøver. Hensikten med å holde to rør, er å ha en som en backup.)
- Overfør supernatanten til to nye Eppendorf-rør, og tørke det i en speed vakuum. Dette tar omtrent 3-6 timer avhengig av hastigheten vakuum benyttes. (Prøvene kan også tørkes over natten under nitrogengass.)
- Etter tørking lagre rør av hver prøve i -80 ° C-fryseren. Når du er klar, rekonstituere en prøve til 20 ml vann (LC-MS grade), og injisere 5 ml til LC-QE-MS for analyse.
Tre. Oppsett av Sample Sequence
- Etter at kalibrering er blitt riktig utført på QE-MS, likevekt LC-kolonnen i 5 minutter med 85% A ved en strømningshastighet på 0,15 ml / min, som er starttilstand av LC-gradient.
- Sett opp prøvesekvensen i tilfeldig rekkefølge. Merk: I denne måte fordeler den svingningene innført ved LC-MS til hver prøve, og sikrer mer nøyaktig sammenligning mellom forskjellige prøver. Hver 6 prøver, tilføre vaske løp, som deler det samme MS-metoden, bortsett fra LC gradient er 95% A i 10 minutter og etterfulgt 5 min kolonne ekvilibrering ved 85% A med en strømningshastighet på 0,15 ml / min ved. Legg tomme prøvene (100% vann) etter hver vask løp å vurdere systemet bakgrunnen og bære over nivåer.
- Lagre sekvensen og når LC kolonnen viser stabilt trykk, rundt 400 psi, starte sekvensen løp. Hvis det ikke er noen andre prøven som skal kjøres etter at denne sekvensen, og deretter legge til en stopp ballen enden av sekvensen, som har en strømningshastighet på 0 ml / min i slutten av gradienten, og velger "standby" etter endt sekvens.
- Å kjøre den samme prøven satt 12 timer etter kalibrering. (Dette har jegs for å evaluere massefeil svingning etter kalibrering.)
4. Post Analyse Instrument Rengjøring og Vedlikehold
- Ved slutten av sekvensen, vaskes kolonnen med 95% A ved en strømningshastighet på 0,2 ml / min i 2 timer, og om nødvendig, å reversere kolonnen før vasking.
- Fjern LC kolonnen og direkte koble LC til ionekilden av en fagforening. Forbered rengjøringsoppløsningsmiddel, vann / metanol / maursyre (v: v: v, 90:10:0.2), sett MS standby-modus, og vaske LC-MS-system ved en strømningshastighet på 0,1 ml / min i 1 time for å fjerne rest utfelt salter eller andre urenheter. Senk strømningshastigheten dersom det er for mye trykket i systemet.
- Sett kapillær temperaturen ved 50 ° C, og fjerne den ion buret. Nøye ta ut ion sveipe kjegle og ione-overføringsrøret etter at kapillær temperaturen synker til 50 ° C. Bruke et grovt maskenett, som for eksempel sandpapir, for å fjerne urenheter er igjen på overflaten av det ion sveipe kjegle.
- Plasser ion overføringrør inn i et 15 ml Falcon rør inneholdende 10 ml 90% vann / metanol med 0,1% maursyre. Etter sonicating røret i vannbad sonikator i 20 minutter, dekanteres løsningsmidlet inne, erstatte det med 10 ml ren methanol og sonicate for ytterligere 20 min. (Om nødvendig, kan en sonikator gjøres ved 40 ° C eller enda høyere temperatur for å oppnå bedre vaskeresultater.)
5. Analyse av LC-MS data
- For å sikre prøven sekvensen går greit, etter å ha fullført de to første prøvene i sekvensen, sjekk topper for ukjente metabolitter. Bruk en csv-fil notering metabolitten navn, nøytral kjemisk formel og deteksjon modus (enten positiv eller negativ), som input filen, og utdatafilen inneholder hentet topper og masse feil i ppm. Hvis toppen formen er unormal eller massen feilen er av mer enn 5 ppm, og deretter resten av sekvensen må stoppes og feilsøking må gjøres.
- På den måten "peak innrettingog ramme utvinning "på kommersielt tilgjengelig programvare. Velg rådata fra LC-MS og gruppere dem. Pick prøvene i midten av kjøre-sekvens som kromatografi referanseprøve for topp innretting. Last en ramme frø med kjente metabolitter for målrettet metabolitter analyse med data som samles inn og den tilsvarende ramme frø.
- Utføre dataanalyse i positiv og negativ modus separat. Bruk standardinnstillingen for andre parametre. Slå av database søkefunksjonen og kjøre arbeidsflyten. Eksportere data behandles som et excel ark som inneholder toppareal for hver ramme. De første sett med rammer tilsvarer de metabolitter i målrettet listen. Merk: For en målrettet metabolitt analysen, er metabolitter informasjon innhentet basert på tidligere studier 13,15.
- For en vilkårlige metabolitt analyse, velge metode for "komponent utvinning". Load tomme prøver for bakgrunnen subtraksjon. Still peak intensitet terskel ent 10 5, m / z bredde på 10 ppm, og signal-til-støy-forhold på 3.
- Bruk menneskelig metabolome database for ukjente forbindelser identifikasjon. Bruk en CV filter for å fjerne komponenter med store CV innen replikere prøver. Manuelt gå gjennom hver komponent og plukke de med veldefinert peak eller relativt stor forskjell i forskjellige prøver typer for databasesøk. Eksportere data med treff i databasen. (Peak justering kunne omgås hvis peak justering score er for lavt.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nøyaktigheten av metabolomics data svært avhengig av LC-QE-MS instrument ytelse. For å vurdere om instrumentet fungerer i god stand, og hvorvidt den metode som er benyttet er riktig, er flere kjent metabolitt LC topper ekstrahert fra den totale ione-kromatografi (TIC), som vist i figur 1.. Polare metabolitter, inkludert aminosyrer, glykolysen mellom , TCA mellomprodukter, nukleotider, vitaminer, ATP, NADP + og så videre har god oppbevaring på kolonne og god peak former i amid kolonne under dagens LC forholdene. I mellomtiden er en massefeiltest utført innen 24 timer etter å ha lav masse kalibrering, som vist i figur 2.. Seks forskjellige konsentrasjoner av prøver i triplikat er kjørt to ganger, etter kalibrering, og hele tidsperioden dekker nesten 24 timer. Massen feilen blir vurdert ved å sammenligne den detekterte m / z til den teoretiske m / z målrettede metabolitter. Her målrettede metabolitter har en m / zsom strekker seg fra 74 (glycin) til 744 (NADP +). Y-aksen representerer her den akkumulerte prosentandel av metabolitter innenfor visse massefeilområde. Den blå kurven viser resultatet 0-12 t, mens den røde farge kurve viser data som er samlet 12 til 24 timer. Figur 2 indikerer klart at mer enn 90% av metabolitter er innen 5 spm masse feil, noe som betyr at den lave masse range kalibreringsmetode utviklet her er tilstrekkelig til å opprettholde 5 ppm massefeil for lav masseområde deteksjon.
En annen sak som skal behandles er følsomheten på instrumentet med dagens metode og oppsett instrument. En seriell fortynning av triplikatprøvene fra 10 cm petriskål ble utført 5 ganger med en fortynningsfaktor på 6, og ender opp med 6 forskjellige konsentrasjoner av prøvene. Disse eksempler representerer mengden av metabolitter ekstrahert fra 10 7, 1,67 x 10 6, 2,78 x 10 5, 4,63 x 10 4 7,72 x 10 3, og 1.29x 10 3 av cellene, henholdsvis. Siden hver konsentrasjon av prøve ble fremstilt i triplikat, er totalt 18 prøver analyseres i LC-QE-MS. En målrettet liste brukes til å vurdere antall metabolitter detekteres på for ulik konsentrasjon av prøven. Resultatet i figur 3 indikerer at det optimale antall målrettede metabolitter detekterte er mellom 2,78 x 10 5 og 1,67 x 10 6 celler, mens 1 x 10 7 celler gir et færre antall detekterte metabolitter, som er på grunn av ion-undertrykkelse effekter. Dette resultatet indikerer at den optimale mengden av celler for å trekke ut for denne analysen er omtrent som for en brønn i en 6-brønns plate.
For vilkårlige metabolitt-analyse, er en CV-cutoff på 20% og en midlere intensitetsverdi av 10 7 som brukes til å filtrere komponenter tabellen. Disse stive CV og gjennomsnittlig intensitet terskelverdiene brukes for denne demonstrasjonen mål. For å bedre reproduserbarhet, kan CV cutoff verdier væreøkes (for eksempel, 30%), mens den gjennomsnittlige intensitetsverdier må reduseres (for eksempel 10 5) til å omfatte flere topper. Etter manuelt sjekke topper, er komponenter med gode figurer valgt og søkte etter i den menneskelige metabolome database. Resultatene er vist i tabell 2.. Tabell 2A viser resultatene fra data innsamlet i positiv modus, mens tabell 2B viser resultater fra negativ modus. Noen av de metabolitter som er identifisert her overlapper med metabolitter i målrettet listen, slik som glutation, prolin og så videre, men i mellomtiden, videre metabolitter fraværende fra det målrettede listen er utforsket, slik som methyglyoxal, som kan være avledet fra glykolyse, og ett -palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholin, som blir detektert i positiv ved en oppholdstid på 3,2 minutter, noe som er en rimelig retensjon for fosfolipider på en amid-kolonnen. En protokoll på vilkårlige metabolitt databasesøk har vært previously rapportert 20.
Figur 1. Eksempler på LC-MS kromatografi topper. Her blir den rekonstruerte kromatografi generert med en massevindu på 10 ppm (m / z ± 5 ppm). X-aksen viser retensjonstiden, mens Y-aksen viser den relative intensitet, og maksimal intensitet som er nevnt ovenfor hver metabolitt. A viser topper detekteres fra positiv modus, mens B viser topper fra negativ modus. for å vise større bilde.
Figur 2. 60;. Evaluering av lav masse range kalibrering Y-aksen er den kumulative andelen av metabolitter med masseregistrering feil innen 5 ppm. X-aksen er massen error range i ppm. Blå og røde kurvene representerer 0-12 timer og 12-24 timer, henholdsvis. Klikk her for å se større bilde.
. Figur 3 Evaluering av prøven mengde -. Antall målrettede metabolitter detekterte versus antallet HCT 8 celler Rød rutene representerer metabolitter detektert i positiv modus, blå sirklene betyr metabolitter måles i negativ modus, og de sorte trekanter er det totale antall av metabolitter fra både positiv og negativ modus. X-aksen viser antall HCT 8 celler.upload/51358/51358fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.
| Standarder | M / Z, positiv modus | M / Z, negativ modus | Nøytral formel | Nøytral masse |
| n-butylamine | 74.096425 | NA | C 4 H 11 N | 73.089149 |
| Koffein fragment | 138.066188 | NA | C 6 H 8 N 3 O | 137.058912 |
| Koffein | 195.087652 | NA | C 8 H 11 N 4 O 2 | 194.080376 |
| Diazinon | 305.108329 | NA | C 12 H 20 N 2 O 3 PS | 304.101053 |
| MRFA peptid | 524.264966 | <td> NAC 23 H 37 N 7 O 5 S | 523,25769 | |
| Fluoroacetate | N / A | 77.004432 | C 2 H 3 FO 2 | 78.011708 |
| Sulfat | N / A | 96.960106 | H 2 SO 4 | 97.967382 |
| Homovanillic syre | N / A | 181.050634 | C 9 H 10 O 4 | 182,05791 |
| Dodecylsulfat | N / A | 265.147906 | C 12 H 26 SO 4 | 266.155182 |
| Taurocholate | N / A | 514.2844 | C 26 H 45 NO 7 S | 515.291676 |
Tabell 1. Lav masse range kalibrering standarder og deres eksakte m / z.
| CSID | Navn | Formula | Monoisotopic Mass | Søk Mass | Feil (ppm) | RT (min) |
| 234 | beta-alanin | C 3 H 7 NO 2 | 89,04800 | 89,04805 | 0,62 | 8,08 |
| 1057 | Sarcosine | C 3 H 7 NO 2 | 89,04768 | 89,04805 | 4,22 | 8,08 |
| 5735 | alanine | C 3 H 7 NO 2 | 89,04768 | 89,04805 | 4,22 | 8,08 |
| 568 | Kreatinin | C 4 H 7 N 3 O | 113,05900 | 113,05889 | 1,00 | 4,41 |
| 128566 | Proline | C 5 H 9 NO 2 | 115,06333 | 115,06338 | 0,41 | 7,54 |
| 6050 | L-(+)-valin | C 5 H 11 NO 2 | 117,07898 | 117,07896 | 0,18 | 7,42 |
| 7762 | Amylnitritt jeg | C 5 H 11 NO 2 | 117,07898 | 117,07896 | 0,18 | 7,42 |
| 135 | 5-amino-valeriansyre | C 5 H 11 NO 2 | 117,07900 | 117,07896 | 0,38 | 7,42 |
| 242 | Trimethylglycine | C 5 H 11 NO 2 | 117,07900 | 117,07896 | 0,38 | 7,42 |
| 911 | Niacinamide | C6H6N2O | 122,04800 | 122,04793 | 0,55 | 2,60 |
| 1091 | Taurin | C 2 H 7 NO 3 S | 125,01466 | 125,01469 | 0,20 | 7.61 |
| 1030 | Pyrrolin hydroksykarboksylsyre | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0,02 | 8.51 |
| 7127 | PCA | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0,02 | 8.51 |
| 90657 | N-Acryloylglycine | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0,02 | 8.51 |
| 388752 | 5-okso-D-Prolin | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0,02 | 8.51 |
| 389257 | 3-hydroksy-3 ,4-dihydro-2H-pyrrol-5-karboksylsyre | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0,02 | 8.51 |
| 8031176 | Pyrrolidonecarboxylic syre | C 5 H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0,03 | 8.51 |
| 5605 | Hydroxyproline | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8,08 |
| 7068 | N-Acetylalanin | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | <td> 131,059015,83 | 8,08 | |
| 79449 | Ac-Ala-OH | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8,08 |
| 89122 | Ethylformylglycine | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8,08 |
| 167744 | l-glutamin-gamma-semialdehyde | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8,08 |
| 388519 | 5-amino-2-oksopentansyre syre | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8,08 |
| 134 | Aminolevulinsyre | C 5 H 9 NO 3 | 131,05800 | 131,05901 </ Td> | 7,70 | 8,08 |
| 9312313 | 3-Hydroxy-L-prolin | C 5 H 9 NO 3 | 131,05800 | 131,05901 | 7,70 | 8,08 |
| 566 | Kreatin | C 4 H 9 N 3 O 2 | 131,06900 | 131,06905 | 0,36 | 8,08 |
| 5880 | L-(+)-Leucine | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0,68 | 6,96 |
| 6067 | L-(+)-isoleucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0,68 | 6,96 |
| 19964 | L-norleucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0,68 | 6,96 </ Td> |
| 388796 | beta-Leucine | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0,68 | 6,96 |
| 548 | Aminokapronsyre | C 6 H 13 NO 2 | 131,09500 | 131,09455 | 3,48 | 6,96 |
| 6031 | L-(-)-Asparagine | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05350 | 132,05348 | 0,10 | 8.31 |
| 109 | Ureidopropionic syre | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05299 | 132,05348 | 3,71 | 8.31 |
| 6026 | L-Ornithine | C 5 H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08988 | 0,02 | 10.37 |
| 64236 | D-Ornitin | C 5 H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08988 | 0,02 | 10.37 |
| 5746 | Glutamin | C 5 H 10 N 2 O 3 | 146,06914 | 146,06900 | 0,93 | 8,25 |
| 128633 | D-Glutamin | C 5 H 10 N 2 O 3 | 146,06914 | 146,06900 | 0,93 | 8,25 |
| 141172 | Ureidoisobutyric syre | C 5 H 10 N 2 O 3 | 146,06914 | 146,06900 | 0,93 | 8,25 |
| 21436 | N-Methyl-<scp> D </ scp>-asparaginsyre | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1,13 | 8,06 |
| 21814 | D-(-)-glutaminsyre | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1,13 | 8,06 |
| 30572 | L-(+)-glutaminsyre | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1,13 | 8,06 |
| 58744 | N-acetyl-L-serin | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1,13 | 8,06 |
| 5907 | L-(-)-metionin | C 5 H 11 NO 2 S | 149,05106 | 149,05095 | 0,70 | 7,39 |
| 6038 | Histidin | C 6 H 9 N 3 O 2 | 155,06947 | 155,06940 | 0,48 8,33 | |
| 5910 | L-(-)-fenylalanin | C 9 H 11 NO 2 | 165,07898 | 165,07887 | 0,63 | 6,60 |
| 1025 | Pyridoksin | C 8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0,80 | 3,24 |
| 4463 | Oxidopamine [USAN: INN] | C 8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0,80 | 3,24 |
| 102750 | 5 - (2-aminoetyl)-Pyrogallol | C 8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0,80 | 3,24 |
| 388394 | Noradrenalin | C 8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0,80 | 3,24 |
| 6082 | L-(+)-arginin | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11144 | 1,39 | 10.77 |
| 64224 | D-Arg | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11144 | 1,39 | 10.77 |
| 780 | heteroauxin | C 10 H 9 NO 2 | 175,06300 | 175,06304 | 0,18 | 2,32 |
| 67261 | Indol-3-acet-aldehyd, 5-hydroksy- | C 10 H 9 NO 2 | 175,06332 | 175,06304 | 1,65 | 2,32 |
| 3574185 | Indol-2-eddiksyre | C 10 H 9 NO 2 | 175,06332 | 175,06304 | 1,65 | 2,32 |
| 5833 | L-(-)-tyrosin | C 9 H 11 NO 3 | 181,07390 | 181,07378 | 0,66 | 7,48 |
| 389285 | 3-amino-3-(4-hydroksyfenyl) propansyre | C 9 H 11 NO 3 | 181,07390 | 181,07378 | 0,66 | 7,48 |
| 13628311 | L-treo-3-phenylserine | C 9 H 11 NO 3 | 181,07390 | 181,07378 | 0,66 | 7,48 |
| 425 | 4-hydroksy-4-(3-pyridyl) butansyre | C 9 H 11 NO 3 | 181,07401 | 181,07378 | 1,25 | 7,48 |
| 13899 | 3 - (1H-indol-3-yl) akrylsyre | C 11 H 9 NO 2 | 187,06332 | 187,06330 | 0,15 | 6,44 |
| 10607876 | Indoleacrylic syre | C 11 H 9 NO 2 | 187,06332 | 187,06330 | 0,15 | 6,44 |
| 389120 | N6, N6, N6-Trimethyl-L-lysin | C 9 H 20 N 2 O 2 | 188,15248 | 188,15221 | 1,45 | 10.87 |
| 388321 | 5 "-S-Methyl-5"-thioadenosine | C 11 H 15 N 5 O 3 S | 297,08957 | 297,08898 | 2,00 | 2,56 |
| 144 | 9 - (5-s-metyl-5-thiopentofuranosyl)-9H-purin-6-amin | C 11 H 15 N 5 O 3 S | 297,09000 | 297,08898 | 3,43 | 2,56 |
| 111188 | Glutation | C 10H 17 N 3 O 6 S | 307,08380 | 307,08345 | 1,14 | 8,02 |
Tabell 2A.
| CSID | Navn | Formula | Monoisotopic Mass | Søk Mass | Feil (ppm) | RT (min) |
| 857 | Methylglyoxal | C 3 H 4 O 2 | 72,02100 | 72,02108 | 1,03 | 7,70 |
| 1057 | Sarcosine | C 3 H 7 NO 2 | 89,04768 | 89,04747 | 2,33 | 8.19 |
| 5735 | alanine | C 3 H 7 NO 2 | 89,04768 | 89,04747 | 2,33 | 8.19 |
| 234 | beta-alanin | C 3 H 7 NO 2 | 89,04800 | 89,04747 | 5.93 | 8.19 |
| 55423 | R-melkesyre | C 3 H 6 O 3 | 90,03169 | 90,03143 | 2,91 | 5,12 |
| 61460 | Hydroksypropionsyre | C 3 H 6 O 3 | 90,03169 | 90,03143 | 2,91 | 5,12 |
| 96860 | L-(+)-melkesyre | C 3 H 6 O 3 | 90,03169 | 90,03143 | 2,91 | 5,12 |
| 592 | Melkesyre | C 3 H 6 O 3 | 90,03200 | 90,03143 | 6,29 | 5,12 |
| 650 | Dihydroksyaceton | C 3 H 6 O 3 | 90,03200 | 90,03143 | 6,29 | 5,12 |
| 731 | Glyseraldehyd | C 3 H 6 O 3 | 90,03200 | 90,03143 | 6,29 | 5,12 |
| 1086 | Svovelsyre | H 2 O 4 S | 97,96738 | 97,96683 | 5,63 | 8.13 |
| 128566 | Proline | C 5 H 9 NO 2 | 115,06333 | 115,06302 | 2,67 | 7.78 |
| 1078 | Succinsyre | C 4 H 6 O 4 | 118,02661 | 118,02630 | 2,66 | 7,72 |
| 466979 | Erythrono-1 ,4-lakton | C4 H 6 O 4 | 118,02661 | 118,02630 | 2,66 | 7,72 |
| 4483398 | D-Erythronic g-lakton | C 4 H 6 O 4 | 118,02661 | 118,02630 | 2,66 | 7,72 |
| 473 | Metylmalonsyre | C 4 H 6 O 4 | 118,02700 | 118,02630 | 5,96 | 7,72 |
| 8527138 | (3S, 4R) -3,4-Dihydroxydihydrofuran-2 (3H)-one | C 4 H 6 O 4 | 118,02700 | 118,02630 | 5,96 | 7,72 |
| 140384 | 2-ketocaproic syre | C 6 H 10 O 3 | 130,06299 | 130,06270 | 2,24 | 2,35 |
| 164251 | Methyloxovaleric syre | C 6 H 10 O 3 | 130,06299 | 130,06270 | 2,24 | 2,35 |
| 388419 | (3S)-3-metyl-2-oksopentansyre syre | C 6 H 10 O 3 | 130,06299 | 130,06270 | 2,24 | 2,35 |
| 15642233 | Ketoleucine | C 6 H 10 O 3 | 130,06299 | 130,06270 | 2,24 | 2,35 |
| 46 | a-okso-b-metylvaleriansyre | C 6 H 10 O 3 | 130,06300 | 130,06270 | 2,36 | 2,35 |
| 69 | Alpha-ketoisocaproic syre | C 6 H 10 O 3 | 130,06300 | 130,06270 | 2,36 | 2,35 |
| 134 | Aminolevulinsyre | 131,05800 | 131,05795 | 0,36 | 8.19 | |
| 9312313 | 3-Hydroxy-L-prolin | C 5 H 9 NO 3 | 131,05800 | 131,05795 | 0,36 | 8.19 |
| 5605 | Hydroxyproline | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 7068 | N-Acetylalanin | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 79449 | Ac-Ala-OH | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 89122 | Ethylformylglycine | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 167744 | l-glutamin-gamma-semialdehyde | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 388519 | 5-amino-2-oksopentansyre syre | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 5880 | L-(+)-Leucine | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3,39 | 7,09 |
| 6067 | L-(+)-isoleucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3,39 | 7,09 |
| 19964 | L-norleucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3,39 | 7,09 |
| 388796 | beta-Leucine | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3,39 | 7,09 |
| 548 | Aminokapronsyre | C 6 H 13 NO 2 | 131,09500 | 131,09419 | 6.18 | 7,09 |
| 109 | Ureidopropionic syre | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05299 | 132,05321 | 1,60 | 8,28 |
| 6031 | L-(-)-Asparagine | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05350 | 132,05321 | 2,21 | 8,28 |
| 6026 | L-Ornithine | C 5 H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08961 | 1,98 | 10.36 |
| 64236 | D-Ornitin | C 5 H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08961 | 1,98 | 10.36 |
| 193317 | L-(-)-eplesyre | C 4 H 6 O 5 | 134,02153 | 134,02130 | 1,72 | 7,95 |
| 510 | (±)-eplesyre | C 4 H 6 O 5 | 134,02200 | 134,02130 | 5,25 | 7,95 |
| 133224 | threonic syre | C 4 H 8 O 5 | 136,03717 | 136,03688 | 2,14 | 7,70 |
| 388628 | 2,3,4-Trihydroxybutanoic syre | C 4 H 8 O 5 | 136,03717 | 136,03688 | 2,14 | 7,70 |
| 2061231 | DL-erythronic syre | C 4 H 8 O 5 | 136,03717 | 136,03688 | 2,14 | 7,70 |
| 21436 | N-Methyl-<scp> D </ scp>-asparaginsyre | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1,16 | 8,05 |
| 21814 | D-(-)-glutaminsyre | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1,16 | 8,05 |
| 30572 | L-(+)-glutaminsyre | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1,16 | 8,05 |
| 58744 | N-acetyl-L-serin | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1,16 | 8,05 |
| 6038 | Histidin | C 6 H 9 N 3 O 2 | 155,06947 | 155,06930 | 1,09 | 8.36 |
| 199 | Allantoin | C 4 H 6 N 4 O 3 | 158,04401 | 158,04387 | 0,88 | 4.76 |
| 6082 | L-(+)-arginin | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11154 | 0,80 | 10.76 |
| 64224 | D-Arg | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11154 | 0,80 | 10.76 |
| 58576 | N-Acetyl-L-asparaginsyre | C 6 H 9 NO 5 | 175,04807 175,04803 | 0,18 | 7.87 | |
| 996 | Pyrophosphoric Acid | H 4 O 7 P 2 | 177,94299 | 177,94331 | 1,79 | 8.42 |
| 5589 | Glukose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 17893 | Mannose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 58238 | . Beta.-D-glucopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 71358 | . Alpha.-D-glucopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 134838 | 3-deoksy-arabino-hexonic syre | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 388332 | L-Sorbopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 388476 | beta-D-galactopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 388480 | . Alpha.-D-Galactopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 388775 | beta-D-Fructofuranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 7,53 | |
| 10239179 | Inositol | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 16736992 | Cis-inositol | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 17216070 | allose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 17216093 | L-Sorbose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 201 | hexopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06300 | 180,06346 | 2,53 | 7,53 |
| 868 | 1,2,3,4,5,6-Cyclohexanhexol | C 6 H 12 O 6 | 180,06300 | 180,06346 | 2,53 | 7,53 |
| 2068 | Teofyllin | C 7 H 8 N 4 O 2 | 180,06473 | 180,06346 | 7,04 | 7,53 |
| 4525 | 1,7-dimetyl-Xanthine | C 7 H 8 N 4 O 2 | 180,06473 | 180,06346 | 7,04 | 7,53 |
| 5236 | Teobromin | C 7 H 8 N 4 O 2 | 180,06473 | 180,06346 | 7,04 | 7,53 |
| 1161 | isositronsyre syre | C 6 H 8 O 7 | 192,02701 | 192,02704 | 0,15 | 8.18 |
| 305 | Citrisk syre | C 6 H 8 O 7 | 192,02699 | 192,02704 | 0,23 | 8.18 |
| 963 | pantotensyre | C 9 H 17 NO 5 | 219,11067 | 219,11049 | 0,84 | 6,72 |
| 6361 | D-pantotensyre | C 9 H 17 NO 5 | 219,11067 | 219,11049 | 0,84 | 6,72 |
| 960 | palmitinsyre | C 16 H 32 O 2 | 256,23999 | 256,24000 | 0,05 | 1,73 |
| 111188 | Glutation | C 10 H 17 N 3 O 6 S | 307,08380 | 307,08339 | 1,35 | 8,03 |
| 388337 | N-acetylneuraminic syre | 309,10599 | 309,10585 | 0,45 | 7,43 | |
| 392681 | N-acetyl-alfa-neuraminsyre | C 11 H 19 NO 9 | 309,10599 | 309,10585 | 0,45 | 7,43 |
| 392810 | Sialinsyre Neu5Ac | C 11 H 19 NO 9 | 309,10599 | 309,10585 | 0,45 | 7,43 |
Tabell 2B.
. Tabell 2. Liste over vilkårlige metabolitter som oppdages i HCT 8 celler (2,78 x 10 5 celler likeverdighet) Tabell 2A og 2B inkluderer komponenter utvinning informasjon:. Oppholdstid, m / z og masse feil, og i mellomtiden, database søkeresultater: Chemspider ID ( CSID), navn, formel, og så videre. Her de analyserte prøvene er likningl til metabolitter utvunnet fra 2,78 x 10 5 celler, og intensiteten terskelen er 1 x 10 7 for å unngå kjedelige resultat for demonstrasjon formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trinn for vellykket metabolitt profilering i celler ved hjelp av denne protokoll er: 1) kontroll av vekstmedium og forsiktig ekstraksjon av cellene; 2) justere LC metode basert på MS-metoden oppsett for å sikre at det er nok (vanligvis minst 10) datapunkter over en topp for kvantifisering; 3) gjør en lav masse kalibrering før du kjører prøver; 4) å injisere ikke mer enn 5 ml for å unngå retensjonstid skiftende og maksimal utvidelse forårsaket av vann; og 5) å fremstille og drive ut prøver for sammenligning på samme batch til batch minimalisere effekter.
Standardene (Tabell 1) valgt her for lav masse utvalg kalibrering er utskiftbare. Enhver kjent forbindelse med et m / z som faller inn i massen frekvensområde, er godt artet i en H-ESI kilde, og er oppløselig i vann, metanol eller acetonitril er skjellig kandidater for kalibreringsstandarder. Det er sterkt anbefalt å lagre all kalibreringsløsninger ent 4 ° C for å stabilisere koffein, og også for å minimere fordampningen av metanol eller acetonitril i kalibreringsløsningen, slik at kalibreringen ytelse kan være mer reproduserbar. Sammenlignet med en vanlig masse rekkevidde, m / z fra 150 til 2000, trenger lav masse utvalg kalibrering gjøres oftere, minst en gang annenhver dag.
Denne arbeidsflyten, fra utvinning løsemiddel, tilberedning løsemiddel, LC mobil fase, til lav masse utvalg kalibrering og MS skanne-serien har blitt optimalisert for å måle polare metabolitter. Dette inkluderer aminosyrer, acetyl aminosyrer, glykolyse pathway mellomprodukter, nukleosider, TCA-syklus mellomprodukter, noe en-karbonmetabolisme pathway mellomprodukter og så videre. Imidlertid modifikasjoner av denne protokoll for andre klasser av metabolittene, slik som koenzym A (CoA)-arter, folater, fosfolipider er mulig. For eksempel, COA er mer stabile i sure betingelser, slik at tilsetning av en syre til 80% metanol / vann vil være til hjelp til å impRove CoA følsomhet. Også COAs og lipider tendens til å ha mye større molekylvekt, og dermed m / z frekvensområde må justeres 60-900 til riktig område som vil dekke disse metabolitter.
Selv om noen av de vilkårlige komponentdatabasesøkeresultater lapper med målrettet listen, er det fortsatt viktig å bygge dette målrettet liste basert på forskning prioritet. Siden metabolitter i målrettet listen er lavere enn den gjennomsnittlige intensitetsterskel, vil informasjon om disse metabolittene fjernes under behandlingen. Den målrettede listen inneholder oppholdstid informasjon, noe som gir oss større trygghet for metabolitt identifisering og kvantifisering. En annen fordel med QE-MS oppsettet er at tandem massespektrometri kan gi rom for ytterligere identifikasjon av metabolitter.
Ett problem forbundet med denne arbeidsflyten er at H-ESI nål insert er følsom for saltinnholdet av prøvene, slik at følsomheten vil bli sterkt nedsatt hvis det finnes store mengder av ikke-flyktige salter. Derfor vil redusere saltinnholdet fra prøver, og rutinemessig rengjøring av kolonnen, og den H-ESI nål innsatsen være nyttig for å sikre en god kvalitet av data og for å øke kolonnens levetid.
I sammendraget, sysselsetter denne protokollen LC-QE-MS for å kunne analysere polare metabolitter fra dyrkede celler, med minimal prøveopparbeidelse trinn og rask datainnsamling. Små endringer i prøvepreparering kan utføres for å skaffe data fra andre biologiske kilder, for eksempel serum og vev. For eksempel, siden ren metanol kan tilsettes til flytende serum tilsatt til å lage en endelig metanolkonsentrasjon på 80% for polare metabolitter ekstraksjon. For vevsprøver blir grundig omrøring og blanding for å oppnå bedre ekstraksjonseffektivitet. Vanligvis 10 ml serum eller1 mg vev er tilstrekkelig for metabolitter analyse. Rådata kan analyseres både i målrettet modus, hvis det er kjente metabolitter i prøvene, og i en un-målrettet måte fulgt av HRMS database søking. HRMS basert metabolomics er fortsatt i en tidlig fase. For fremtidige fremskritt, kan de eksperimentelle teknikker bli ytterligere optimalisert, ekstra metabolitt HRMS informasjon og MS / MS fragmenteringsmønstre vil være nyttige og relevante algoritmer, for eksempel topp justering, peak integrasjon, isotop clustering og så videre, kan forbedre effektiviteten og nøyaktigheten av databehandling. Til syvende og sist, men mange av de spørsmålene som våre lab-adresser i stoffskiftet er begrenset av forsiktig tolkning av data etter behandlingen. Med disse store metabolomics teknikker, blir vi ofte begrenset av vår tolkning av data og evaluering av hypoteser generert. Derfor må alle metabolomics eksperimenter formuleres rundt konkrete spørsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) og Nathaniel Snyder (University of Pennsylvania) for verdifulle diskusjoner om masse kalibrering og databehandling. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold Award Antall R00CA168997. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positive calibration mix | Thermo Scientific | #88323 | It is light sensitive. Store at 4 °C |
| Negative calibration mix | Thermo Scientific | #88324 | Store at 4 °C |
| Diazinon | Sant Cruz Biotechnology | #C0413 | It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C |
| H-ESI needle insert | Fisher Scientific | #1303200 | This could be replaced or cleaned with 5% formic acid/water (remove rubber ring) if clogged. |
| Xbridge amide column | Waters | #186004860 | Guard column is recommend to increase column lifetime. |
References
- Fiehn, O. Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks. Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).
- Mulleder, M., et al. A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology. Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).
- Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).
- Ideker, T., et al. Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network. Science. 292 (5518), 929-934 (2001).
- Jonsson, P., et al. A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS. Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).
- Jonsson, P., et al. High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses. Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).
- Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data. Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).
- Wiklund, S., et al. Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models. Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).
- Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. MetaboMiner--semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids. BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).
- Lu, D., et al. 13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).
- Shen, J., et al. Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).
- Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).
- Locasale, J. W., et al. Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).
- Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).
- Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).
- Ramanathan, R., et al. It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS. Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).
- Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer. Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).
- Michalski, A., et al. Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).
- Michalski, A., et al. Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).
- Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry. UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).
- Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine. Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).
- Want, E. J., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
