Summary
Metabolit profil sağlık ve hastalık metabolizmanın çalışmasında değerli bir varlık olmuştur. Polarizasyon değiştirmesi ve hızlı görev döngüsü ile yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştiğinde normal aşamalı sıvı kromatografisi kullanarak, yüksek hassasiyet, doğruluk ve çözünürlük ile biyolojik madde polar metabolik bileşimini analiz etmek için bir protokol açıklar.
Abstract
Metabolit profil sağlık ve hastalık metabolizmanın çalışmasında değerli bir varlık olmuştur. Ancak, mevcut platformlar gibi emek yoğun numune hazırlama, düşük tespit limitleri, yavaş tarama hızları, her bir metaboliti için yoğun metot optimizasyonu ve olumlu hem ölçmek için yetersizlik ve tek deneylerde negatif yüklü iyonlar gibi farklı sınırlayıcı faktörler var. Bu nedenle, yeni bir metabolomiks protokol metabolomiks çalışmaları ilerlemek olabilir. Amid bazlı hidrofilik kromatografi kimyasal türetme olmaksızın polar metabolit analizi sağlar. Q-Exactive (QE-MS) kullanılarak yüksek çözünürlüklü MS, iyon optik geliştirilmiş tarama hızlarını (çözünürlükte 70,000 256 msn) artmış, ve pozitif / negatif anahtarlama yürüten yeteneğine sahiptir. Soğuk metanol ekstre strateji kullanarak, ve QE-MS ile bir amid sütun bağlanması aynı anda ek özellikler 168 hedef polar metabolitleri ve binlerce sağlam algılanmasını sağlar. Datbir işleme, yüksek verimli bir şekilde ticari olarak temin edilebilen yazılımı ile gerçekleştirilir, ve kütle spektrumları elde edilen bilinmeyen özellikleri veritabanlarında sorgulanabilir.
Introduction
Aynı anda birden fazla metabolitleri ölçen bir deney olarak tanımlanan Metabolomik, yoğun bir ilgi alanı olmuştur. Metabolomik moleküler fizyoloji doğrudan okunmasını sağlar ve kanser 1-4 gibi geliştirme ve hastalık halinde anlayışlar sağladı. Nükleer manyetik rezonans (NMR) ve gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (GC-MS), en yaygın olarak kullanılan araçlar 5-9 arasındadır. NMR, özellikle 13 C etiketli metabolitleri gibi ağır izotop etiketli bileşikleri, tarihi akış deneyleri için kullanılmıştır, 10,11-NMR etkindir. Ancak, bu strateji metabolitler onun uygulamalarını sınırlar, nispeten yüksek saflık ve büyük örnek miktar gerektirir. Bu arada, NMR toplanan verilerin analizi yoğun ve karmaşık NMR spektrumları bileşik atama zordur gerekiyor. GC-MS çok polar metabolitleri ve lipid çalışmaları için kullanılmıştır, ama bu uçucu compoun gerektirirds ve bazen zaman alıcı olabilir karmaşık kimya içerir ve deneysel gürültü tanıttı metabolitleri bu nedenle sık sık türetme,.
Üçüncü dört kutuplu karakteristik fragmanları veya kız iyonları seçmek için kullanılır ise üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi birleştirilmiş sıvı kromatografisi (LC), daha sonra ikinci bir dört kat olarak parçalanmış dokunulmamış ana iyonları, seçme için ilk kuadruple kullanır. Belirli bir kız iyonlarına ana iyonu geçişi kaydeder bu yöntem, çoklu reaksiyon takip işlemi (MRM) olarak adlandırılır. MRM küçük molekül ve protein kantitatif 12-15,21 hem de çok duyarlı, spesifik ve güçlü bir yöntemdir. Ancak, MRM sınırlamaları var. Yüksek özgüllük ulaşmak için MRM yöntemi, her metaboliti için inşa edilmesi gerekmektedir. Bu yöntem, özel bir fragmanının belirlenmesi ve prope ön bilgi gerektirir optimize çarpışma enerjisi, ilgili oluşmaktadırBu tür kimyasal yapı bilgileri gibi ilgilenilen metabolitleri, ve ilgili taraflar. Bu nedenle, ortak parçalarının nötr kaybı ile ilgili bazı özel durumlar dışında, bu yöntem ile bilinmeyen metabolitlerin tespit etmek mümkün değildir.
Son yıllarda, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (HRMS) aletler gibi LTQ-Orbitrap ve Exactive serisi, QuanTof olarak yayımlanan ve TripleTOF 5600 16-18,22 edilmiştir. HRMS birkaç ppm bir hata payı içinde sağlam iyonları oranını (m / z) şarj etmek için bir kütle sağlayabilir. Bu nedenle, tüm ön-madde iyonları (tam tarama modu) tespit edilmesi ile işletilen bir araç HRMS tam kütlesi ve bir analit 'in elde edilen temel bileşiminin doğrudan yapısal bilgi elde edebilir ve bu bilgiler potansiyel metabolitleri tanımlamak için kullanılabilir. Gerçekten de, bir bileşik ile ilgili tüm bilgiler yapısal izomer seviyesine kadar, tam bir kütle ile elde edilebilir. Ayrıca, tam birTarama yöntemi metabolitleri önceki bilgi gerektirmez ve yöntem optimizasyonu gerektirmez. M / z tarama aralığı içine düşen tüm iyonları analiz edilebilir Dahası, HRMS MRM yöntemine göre tek vadede kantifiye edilebilir metabolitlerin sayısı açısından neredeyse sınırsız bir kapasiteye sahiptir. HRMS nedeniyle tarama, tam MS elde edilebilir veri noktaları benzer bir dizi ile sonuçlanan kısa görev döngüsü için, aynı zamanda nicel kapasitede bir üçlü dört kutuplu MRM karşılaştırılabilir. Bu nedenle, HRMS kantitatif metabolitler için alternatif bir yaklaşım sağlar. Son zamanlarda, HRMS geliştirilmiş bir versiyonu (QE-MS) algılama mesafesi 19 genişleten tek bir yöntemle, yeterince hızlı döngü süreleri ile pozitif ve negatif modları arasında geçiş altında ameliyat edilebilir Q-Exactive kütle spektrometresi olarak adlandırılır. Burada QE-MS kullanılarak bizim metabolomiks stratejisini açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. LC-MS Kimyasalları, bir Kromatografi Yöntemi Kuruluş hazırlanması ve Enstrüman Çalışma Usul kurulması
- LC Solventler hazırlanması
- 500 ml mobil faz hazırlayın. Bir 20 mM amonyum asetat ve% 3 oranında asetonitril / su içinde 15 mM amonyum hidroksit, son pH, 9.0; ve B 100% asetonitrildir.
- Gevşek, şişe kapağı bir su banyosu sonikatörde yerleştirin ve ekstra ısıtma olmadan 10 dakika boyunca sonikasyon. (Bu adım, amonyum tuzları, tüm tam olarak çözünmesi ve herhangi bir artık hava kabarcıkları olduğu sağlamaktır.)
- LC-MS kullanım için bir 250 ml cam şişe için bir çözücü, ve 4 ° C 'de kalan tutmak transferi 250 mi
- Düşük kütle aralığı kalibrasyon çözeltisi hazırlayın. O doğru kütleleri düşük molekül ağırlıklarında tespit sağlamak için metabolomiks uygulamalar için özelleştirilmiş bir düşük kütle aralığı kalibrasyon karışımının kullanılması önemlidir.
- Sodi hem de, 5 mg tartılırum fluoroasetat ve homovanillic asit ve 1 mg / ml 'lik bir son konsantrasyon sağlamak için 5 ml su içine çözülür. 10 mg / ml 'lik bir son konsantrasyon sağlamak için, metanol içinde diazinon çözülür.
- Negatif düşük kütle kalibrasyonu çözeltisi 1 ml hazırlamak için, sodyum fluoroaceate ve homovanillic asit solüsyonu, 20 ml termo negatif kalibrasyon çözeltisi 960 ml karıştırın. Pozitif düşük kütle kalibrasyonu çözeltisi 1 ml yapmak için, ısı ayarlama pozitif çözeltisi 990 ml ve 10 mi diazinon çözelti karıştırın. (Düşük kütle kalibrasyonu solüsyon 4 ° C 'de muhafaza edilmelidir ve her 2 ayda bir taze olarak hazırlanmalıdır.)
- Düşük Kütle Aralığı QE-MS Kalibrasyon
- Düşük kütle aralığı kalibrasyonu yapmadan önce, üreticinin talimatlarına göre olumlu ve olumsuz modlarında standart bir kitle kalibrasyon (m / z, 150-2,000) yürütmek.
- Düzenli bir kitle kalibrasyon geçtiğinde, gösterge kontrol panelindeki 60-900 m / z tarama aralığını ayarlamakve pozitif ve negatif mod modu için 35 eV 25 eV kaynağı CID uygulanır. (Bu kafein fragmanı iyon ve sülfat iyonu güçlü sinyaller verecektir. Burada tarama aralığı sabittir, son m / z başlangıç m / z 15x daha büyük olmamalı, çünkü)
- Iyon kaynağı stabil olduktan sonra özel kalibrasyonu gerçekleştirin. Not: Stabil bir kaynak pozitif modda toplam iyon akımı varyasyonun% 10'dan daha az olarak tanımlanır ve negatif modda en az% 15 olduğu. Özel kalibrasyon iyonları ve karşılık gelen m / z Tablo 1 'de listelenmiştir.
- Polar metabolit analizi için LC-MS aletleri kurulması. LC metabolit ayrılması ve keşfi için bir QE-MS kuple edilir.
- Isıtmalı elektrosprey iyonizasyon probu (H-ESI) ile QE-MS donatın. Listelenen prob için ilgili ayar parametrelerini ayarlayın: Isıtıcı sıcaklığı, 120 ° C; kılıf gaz, 30; Yardımcı gaz, 10; Doğal gaz, 3 süpürme; gerilimi, 3.6 kV spreypozitif mod ve negatif mod için 2.5 kV. 55 ° C'de 320 ° C'de kılcal sıcaklık ve S-lens ayarlayın.
- Tam tarama aralığı: aşağıdaki gibi tam bir tarama yöntemi oluşturmak 60-900 (m / z); çözünürlük: 70.000; maksimum enjeksiyon süresi: 50 ms civarında tipik enjeksiyon süreleri ile 200 msn; otomatik kazanç kontrol (AGC): 3,000,000 iyonları. Bu ayarlar hem pozitif hem negatif modda taramaları yürütmek için yaklaşık 550 msn bir görev döngüsü sonuçlanır.
- Kromatografi yöntemi kurmak. Oda sıcaklığında 13,15, bileşik ayrılması için bir sütun amid (100 x 2.1 mm id, 3.5 mm) kullanır. Yukarıda tarif edildiği gibi, mobil faz A ve mobil faz B asetonitrildir. Aşağıdaki gibi lineer bir miktar kullanın: 0 dak,% 85 B; 1.5 dakika,% 85 B, 5.5 dakika,% 35 B; 10 dakika,% 35 B, 10.5 min,% 35 B, 14.5 dak,% 35 B, 15 dakika,% 85 B, 20 dakika,% 85 B Akış hızı 0.15 ml / dk 0-10 dakika ve 15'tir 20 dakika ve 10.5 'den 14.5 dakika, 0.3 ml / dk.'
2. Prmetabolit Numune Ayırma
- Bir ekstraksiyon solventini hazırlayın. 50 ml'lik bir tüp içinde 40 ml metanol (LC-MS sınıf) ve 10 ml su (LC-MS grade) karıştırılmakta ve kullanılmadan önce en az 1 saat boyunca -80 ° C dondurucuda tutun. Not: Bu prosedür ve aşağıdaki adımları biyolojik doku ve sıvı numunelerin çıkarılması için modifiye edilebilir.
- Tam büyüme ortamı ile üç adet 10 cm tabaklar veya 6 oyuklu plakalar içinde kültür kolon kanseri HCT 8 hücreleri, RPMI 1640,% 10 ısı inaktifleştirilmiş Fetal Sığır Serumu ve 100,000 ünite / L penisilin ve 100 mg / L streptomisin ile takviye edilmiştir.
- Hücreler% 80 izdiham ulaştığınızda, hızla orta kaldırmak ve kuru buz 13,15 üstüne yemek ya da plaka koyun. Hemen (% 80 metanol / su) çözücü 1 ml ekstraksiyon ekleyin ve -80 ° C dondurucu plaka transfer. , 10 cm tabak için, her bir göze bir ekstraksiyon çözücüsü 3 ml ekleyin. (Ortam, bakiye tuzları nedeniyle iyon bastırma etkisini önlemek için mümkün olduğu kadar ortadan kaldırmak için deneyin.)
- 15 dakika boyunca plaka bırakın. Dondurucu çıkarın ve kuru buz üzerinde çözücü içine hücreleri kazıyın. 1.7 ml Eppendorf tüplerine transfer çözeltisi ve 10 dakika boyunca 4 ° C'de 20,000 x g hızında santrifüj ile. (Üç suret örnekleri yapmak için üç ayrı yemekler hücre metabolitleri hazırlayın. Iki tüp tutmanın amacı, bir yedek olarak bir tane olduğunu.)
- Iki yeni Eppendorf tüplerine süpernatant aktarın ve bir hızlı vakum içinde kurutun. Bu, kullanılan hızlı vakum bağlı olarak yaklaşık 3-6 saat sürer. (Numuneler, aynı zamanda, azot gazı altında gece boyunca kurutulabilir.)
- -80 ° C derin dondurucuda her numunenin kurutulması, mağaza tüpler sonra. Hazır olduğunda, 20 ml su (LC-MS grade) içine bir örnek tekrar oluşturmak ve analiz için LC-MS QE-5 ml enjekte edilir.
Örnek 3. Sekans. Setup
- Kalibrasyon düzgün QE-MS üzerinde gerçekleştirilmiştir sonra, bir akışta% 85 A'ya, 5 dakika boyunca LC kolon dengeLC gradyanın başlangıç durumdur, 0.15 ml / dakika, oranı.
- Rastgele sırayla örnek sırasını ayarlayın. Not: Bu şekilde, her bir örnek için LC-MS ile tanıtılan dalgalanmaları dağıtır ve farklı numuneler arasında, daha doğru karşılaştırma sağlar. LC gradyan, 10 dakika boyunca% 95 A ve 0.15 ml / dk 'lık bir akış oranı ile% 85 A' da, 5 dakika kolon dengeleme izledi hariç her 6 numuneleri, aynı MS yöntemi paylaşan bir yıkama çalışma, ekleyin. Sistem arka plan değerlendirmek ve seviyeleri üzerinde taşımak için her yıkama çalıştırdıktan sonra boş örnekleri (100% su) ekleyin.
- Dizisini kaydedin ve LC sütun 400 psi civarında istikrarlı basıncını gösterir zamanlar, dizi çalışma başlatmak. Başka bir örnek, bu dizinin sonra çalıştırmak için orada ise bitirdikten sonra, daha sonra gradyan sonunda 0 ml / dk 'lık bir akış hızı olan sekansı sonunda bir durdurma çalıştırmak ekleyin ve "bekleme" tercih sırası.
- Yeniden çalıştırmak aynı örnek kalibrasyon sonrasında 12 saat ayarlayın. (Bu ikalibrasyon sonrasında kitle hata dalgalanmayı değerlendirmek için s.)
4. Mesaj Analizi Enstrüman Temizleme ve Bakım
- Dizinin sonunda, 0.2 saat boyunca 2 ml / dak 'lık bir akış hızında% 95 A ile sütun yıkama ve gerekirse, yıkamadan önce sütun ters.
- LC sütun çıkarın ve doğrudan bir sendika tarafından iyon kaynağına LC bağlayın. Solvent, su / metanol / formik asit temizleme hazırlayın (v: v: v, 90:10:0.2) bekleme modunda MS ayarlamak, ve 0.1 'lik bir akış oranında yıkama LC-MS sistemi ml / dakika, 1 saat boyunca kaldırmak için kalıntı tuzlar ya da diğer yabancı maddeler çökeltilir. Çok fazla sistem basıncı yoksa akış hızını düşürün.
- 50 ° C'de kılcal sıcaklık ayarlama ve iyon kafes çıkarın. Kılcal sıcaklığı 50 ° C'ye düşer sonra dikkatlice iyon süpürme koni ve iyon transferi tüpü çıkarmak Iyon tarama koninin yüzey üzerinde kalan kirleri çıkarmak için, bu tür zımpara gibi kaba bir örgü kullanın.
- Iyon transferi yerleştirin% 0.1 'lik formik asit ile 10 ml% 90 su / metanol ihtiva eden bir 15 ml Falcon tüpü içine tüpü. 20 dakika boyunca bir su banyo sonikatörü içinde sonike tüp sonra, içindeki solvent dekante 10 mi saf metanol ile değiştirin ve 20 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır. (Gerekirse, sonication, 40 ° C ya da daha iyi temizleme sonuçları elde etmek için daha yüksek bir sıcaklıkta yapılabilir.)
LC-MS verileri, 5. Analizi
- Örnek sırasını sağlamak için sırayla ilk iki örnekleri bittikten sonra, bilinmeyen metabolitleri için zirveleri onay, sorunsuz çalışır. Metaboliti isimleri, nötr kimyasal formülü ve algılama modu (pozitif veya negatif), girdi dosyası olarak ve çıktı dosya ayıklanır zirveleri ve ppm kitle hatayı içeren listeleyen bir csv dosyası kullanın. Tepe şekli anormal veya kitle hata fazla 5 ppm kapalıysa, daha sonra dizinin geri kalanı durdurulmuş ve sorun yapılması gereken edilmesi gerekmektedir.
- "Pik hizalama yöntemini seçinve ticari olarak mevcut yazılım üzerinde kare çıkarma ". LC-MS ve grup onlardan ham verileri seçin. Tepe hizalama için kromatografi referans örnek olarak çalıştırmak sekansının ortasında örnekleri almak. Toplanan veriler ile hedeflenen metabolitler analizi ve karşılık gelen çerçeve tohum için bilinen metabolitler içeren bir çerçeve tohum yükleyin.
- Ayrı ayrı pozitif ve negatif modunda veri analizi yapın. Diğer parametreler için varsayılan ayarı kullanın. Veritabanı arama fonksiyonunu kapatın ve iş akışını çalıştırın. Her çerçevenin pik alanı içeren bir excel levha olarak işlenmiş verileri. Çerçeveleri ilk set hedeflenen listesindeki metabolitlere karşılık gelirler. Not: bir hedef metabolit analizi için, metabolitler bilgi önceki çalışmalarda 13,15 göre elde edilir.
- An hedefsiz metabolit analizi için, "bileşen çıkarma" yöntemini seçin. Arka plan çıkarma için boş örnekleri yükleyin. Set tepe yoğunluğu eşikt 10 5, 3 gürültü oranı 10 ppm ve sinyal m / z genişliği.
- Bilinmeyen bileşikler tanımlanması için insan metabolome veritabanı kullan. Tekrar örnekleri içinde büyük özgeçmişleri ile bileşenleri kaldırmak için bir CV filtresi kullanın. El ile her bileşen geçmesi ve iyi tanımlanmış zirve veya veritabanı arama için farklı örnekler türleri nispeten büyük farkı bu almak. Veritabanında hit ile İhracat verileri. (Tepe hizalama puanı çok düşük ise Tepe hizalama bypass olabilir.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metabolomiks verilerin doğruluğu son derece LC-QE-MS cihazı performansına bağlıdır. Gösterge iyi durumda olup olmadığını değerlendirmek için, ve Şekil 1 'de gösterildiği gibi uygulanan yöntem uygun olup olmadığı, bilinen birkaç metabolit LC zirveleri, toplam iyon kromatografisiyle (TIC) elde edilir. Amino asitler de dahil olmak üzere Polar metabolitler, ara maddeleri, glikoliz , TCA ara maddeleri, nükleotitler, vitaminler, böylece ATP, NADP + ve mevcut LC koşullar altında amit sütun sütun ve iyi tepe şekiller iyi tutma sahiptir. Bu arada, bir toplu hata bir test, üç kopya halinde numune 6 farklı konsantrasyonlarda ayarlamadan sonra iki kez çalıştırılır. Şekil 2'de gösterildiği gibi, düşük kütle ayarlamadan sonra 24 saat içinde yapılan ve bütün zaman aralığı yaklaşık 24 saat kapsar. Kütle hata hedef metabolitlerin teorik m / z için tespit m / z karşılaştırılarak değerlendirilir. Burada hedeflenen, bir metabolitler m / z var74 (glisin) (NADP +) 744 arasında değişmektedir. Burada Y ekseni, belirli kütle hata aralığı içinde metabolitlerin birikmiş yüzdesini temsil eder. Kırmızı renkli eğri 12-24 saat toplanan verileri gösterirken, mavi eğri, 0-12 saat arasında sonucunu göstermektedir. 2 açıkça düşük kütle anlamına gelir, metabolitlerin% 90'dan fazla 5 ppm kitle hatası içinde olduğunu gösterir Şekil Burada geliştirilen aralığı kalibrasyon yöntemi, düşük kütle aralığı tespiti için 5 ppm kitle hatayı sürdürmek için yeterlidir.
Ele alınması gereken başka bir konu mevcut yöntem ve alet kurulum ile enstrümanın hassasiyetidir. 10 cm Petri çanağından Üç numune bir seri seyreltme numune 6 farklı konsantrasyonları ile biten 6, bir seyreltme faktörü ile 5 kez yapıldı. Bu örnekler, 10 7 çıkarılan metabolitlerin miktarı, 1.67 x 10 6, 10 5 x 2,78, 4,63 x 10 4, 10 3 x 7,72 ve 1,29 temsil ederx 10 hücre 3, sırasıyla. Örneğin her konsantrasyon, üç kopya halinde hazırlanır için, 18 örnek bir toplam LC-MS QE-analiz edilir. Bir hedef listesi numunenin konsantrasyonu için farklı tespit metabolitlerin sayısını belirlemek için kullanılır. Şekil 3'te sonucu 1 x 10 7 hücre iyon bastırma etkileri nedeniyle tespit metabolitlerinin daha az sayıda, verirken algılanan hedef metabolitlerin uygun sayısı, 5 10 x 10 x 2.78 ila 1.67 6 hücreler olduğunu gösterir. Bu sonuç, bu analiz için çıkarmak için hücrelerin optimal miktarı, 6-çukurlu bir plaka içerisinde kabaca bu bir Kuyunun olduğunu gösterir.
Hedeflenmeyen metabolit analizi için,% 20 bir kesim ve CV 10 7 arasında bir ortalama yoğunluk değeri bileşenlerinin tablo filtrelemek için kullanılır. Bu sert CV ve ortalama yoğunluk eşik değerleri bu gösteri amaçla kullanılır. Tekrarlanabilirlik geliştirmek, CV limit değerleri olabilirortalama yoğunluk değerleri daha tepe eklemek için (örneğin, 10 5) azalmış olması gerekir iken (örneğin,% 30) artmıştır. Sonra elle kontrol zirveleri, iyi şekiller bileşenler seçilir ve insan metabolome veritabanında aranır. Sonuçlar Tablo 2B negatif modda sonuçlarını gösterir iken. Tablo 2A, pozitif modda toplanan verilerden sonuçlarını sıralamaktadır Tablo 2'de gösterilmiştir. Burada tanımlanan metabolitlerin bazıları, glikoliz türetilebilir methyglyoxal, ve 1 gibi glutation, prolin ve benzeri, ancak bu arada, hedef listesine bulunmayan ilave metabolitleri incelenmiştir olarak hedeflenen listesindeki metabolitleri, örtüşen bir amid sütun fosfolipidlerin için makul bir tutma 3.2 dakika arasında bir tutma süresi ile pozitif olarak saptanır-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin,. Hedefsiz metaboliti veritabanı arama konusunda protokol pr olmuştureviously 20 bildirdi.
Şekil 1. LC-MS kromatografisi tepe örnekler. Burada, yeniden kromatografi 10 ppm 'lik bir kütle pencere (m / z ± 5 ppm) ile oluşturulur. B negatif modundan doruklarını gösterir ise X ekseni Y ekseni nispi yoğunluğunu gösterirken, tutma süresini gösterir, ve pik yoğunluğu her metaboliti yukarıda listelenen. A, pozitif modda algılandı doruklarına gösterir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. 60;. Düşük kütle aralığı kalibrasyon Değerlendirilmesi Y ekseni 5 ppm aralığında kütle algılama hatası ile metabolitleri kümülatif yüzdesidir. X ekseni ppm kitle hata aralığıdır. Mavi ve kırmızı eğriler sırasıyla, 0-12 saat ve 12-24 saat temsil eder. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
. Örnek miktarının Şekil 3 Değerlendirilmesi -. HCT sayısı 8 hücreleri karşı tespit hedeflenen metabolitleri sayısı Kırmızı kareler pozitif modda tespit metabolitleri temsil, mavi daireler negatif modda ölçülen metabolitleri demek ve siyah üçgenler hem metabolitlerinin toplam numaraları Pozitif ve negatif mod. X ekseni HCT 8 hücrelerin sayısını göstermektedir.upload/51358/51358fig3highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
| Standartlar | M / Z, pozitif mod | M / Z, negatif mod | Nötr formülü | Nötr kitle |
| n-butilamin | 74.096425 | NA | C 4H 11 N | 73.089149 |
| Kafein fragmanı | 138.066188 | NA | C 6 H 8 N 3 O | 137.058912 |
| Kafein | 195.087652 | NA | C8 H 11 N 4 O 2 | 194.080376 |
| Diazinon | 305.108329 | NA | C 12 H 20 N 2 O 3 PS | 304.101053 |
| MRFA peptid | 524.264966 | <td> NAC 23 H 37 N 7 O 5 S | 523,25769 | |
| Fluoroasetat | N / A | 77.004432 | C2 H 3 FO 2 | 78.011708 |
| Sülfat | N / A | 96.960106 | H 2 SO 4 | 97.967382 |
| Homovanillic asit | N / A | 181.050634 | C 9 H 10 O 4 | 182,05791 |
| Dodesil sülfat | N / A | 265.147906 | C 12 H 26 SO 4 | 266.155182 |
| Taurokolat | N / A | 514.2844 | C 26 H 45 NO 7 S | 515.291676 |
Tablo 1. Düşük kütle aralığı kalibrasyon standartlar ve bunların tam m / z.
| CSID | Isim | Formül | Izotoplu Kütle | Kitle arama | Hata (ppm) | RT (dak) |
| 234 | beta-Alanin | C3 H 7 NO 2 | 89,04800 | 89,04805 | 0.62 | 8.08 |
| 1057 | Sarkosindir | C3 H 7 NO 2 | 89,04768 | 89,04805 | 4.22 | 8.08 |
| 5735 | alanin | C3 H 7 NO 2 | 89,04768 | 89,04805 | 4.22 | 8.08 |
| 568 | Kreatinin | C 4 H 7 N 3 O | 113,05900 | 113,05889 | 1.00 | 4.41 |
| 128566 | Proline | C 5H 9 NO 2 | 115,06333 | 115,06338 | 0.41 | 7.54 |
| 6050 | L-(+)-Valin | C 5H 11 NO 2 | 117,07898 | 117,07896 | 0.18 | 7.42 |
| 7762 | Amil nitrit I | C 5H 11 NO 2 | 117,07898 | 117,07896 | 0.18 | 7.42 |
| 135 | 5-amino valerik asit | C 5H 11 NO 2 | 117,07900 | 117,07896 | 0.38 | 7.42 |
| 242 | Trimethylglycine | C 5H 11 NO 2 | 117,07900 | 117,07896 | 0.38 | 7.42 |
| 911 | Niacinamide | C6H6N2O | 122,04800 | 122,04793 | 0.55 | 2.60 |
| 1091 | Taurin | C2, H 7 NO 3S | 125,01466 | 125,01469 | 0.20 | 7.61 |
| 1030 | Pirrolin hidroksi karbonik asit | C 5H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0.02 | 8.51 |
| 7127 | PCA | C 5H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0.02 | 8.51 |
| 90657 | N-Acryloylglycine | C 5H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0.02 | 8.51 |
| 388752 | 5-Okso-D-prolin | C 5H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0.02 | 8.51 |
| 389257 | 3-Hidroksi-3 ,4-dihidro-2H-pirol-5-karboksilik asit | C 5H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0.02 | 8.51 |
| 8031176 | Pyrrolidonecarboxylic asit | C 5H 7 NO 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0.03 | 8.51 |
| 5605 | Hidroksiprolin | C 5H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5.83 | 8.08 |
| 7068 | N-Acetylalanin | C 5H 9 NO 3 | 131,05824 | <td> 131,059015.83 | 8.08 | |
| 79449 | Ac-Ala-OH | C 5H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5.83 | 8.08 |
| 89122 | Ethylformylglycine | C 5H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5.83 | 8.08 |
| 167744 | L-glutamik-gama-semialdehit | C 5H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5.83 | 8.08 |
| 388519 | 5-Amino-2-okso-pentanoik asit | C 5H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5.83 | 8.08 |
| 134 | Aminolevulinik asit | C 5H 9 NO 3 | 131,05800 | 131,05901 </ Td> | 7.70 | 8.08 |
| 9312313 | 3-hidroksi-L-prolin | C 5H 9 NO 3 | 131,05800 | 131,05901 | 7.70 | 8.08 |
| 566 | Kreatin | C 4 H 9 N 3 O 2 | 131,06900 | 131,06905 | 0.36 | 8.08 |
| 5880 | L-(+)-Lösin | C6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0.68 | 6.96 |
| 6067 | L-(+)-İzolösin | C6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0.68 | 6.96 |
| 19964 | L-norlösin | C6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0.68 | 6.96 </ Td> |
| 388796 | beta-Lösin | C6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0.68 | 6.96 |
| 548 | Aminocaproic asit | C6 H 13 NO 2 | 131,09500 | 131,09455 | 3.48 | 6.96 |
| 6031 | L-(-)-asparagin | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05350 | 132,05348 | 0.10 | 8.31 |
| 109 | Üreidoizobutirik asit | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05299 | 132,05348 | 3.71 | 8.31 |
| 6026 | L-Ornithine | C 5H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08988 | 0.02 | 10.37 |
| 64236 | D-Ornitin | C 5H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08988 | 0.02 | 10.37 |
| 5746 | Glutamin | C 5H 10 N 2 O 3 | 146,06914 | 146,06900 | 0.93 | 8.25 |
| 128633 | D-Glutamin | C 5H 10 N 2 O 3 | 146,06914 | 146,06900 | 0.93 | 8.25 |
| 141172 | Üreidopropiyonik asit | C 5H 10 N 2 O 3 | 146,06914 | 146,06900 | 0.93 | 8.25 |
| 21436 | N-metil-D <scp> </ SCP>-aspartik asit | C 5H 9 NO 4 | 147,05316 | 147.05300 | 1.13 | 8.06 |
| 21814 | D-(-)-Glutamik asit | C 5H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1.13 | 8.06 |
| 30572 | L-(+)-Glutamik asit | C 5H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1.13 | 8.06 |
| 58744 | N-Asetil-L-serin | C 5H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1.13 | 8.06 |
| 5907 | L-(-)-metiyonin | C 5H 11 NO 2S | 149,05106 | 149,05095 | 0.70 | 7.39 |
| 6038 | Histidin | C 6 H 9 N 3 O 2 | 155,06947 | 155,06940 | 0.48 8.33 | |
| 5910 | L-(-)-Fenilalanin | C 9H 11 NO 2 | 165,07898 | 165,07887 | 0.63 | 6.60 |
| 1025 | Piridoksin | C8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0.80 | 3.24 |
| 4463 | Oxidopamine [USAN: INN] | C8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0.80 | 3.24 |
| 102750 | 5 - (2-aminoetil)-Pyrogallol | C8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0.80 | 3.24 |
| 388394 | Norepinefrin | C8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0.80 | 3.24 |
| 6082 | L-(+)-arginin | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11144 | 1.39 | 10.77 |
| 64224 | D-Arg | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11144 | 1.39 | 10.77 |
| 780 | heteroauxin | C 10 H 9 NO 2 | 175,06300 | 175,06304 | 0.18 | 2.32 |
| 67261 | İndol-3-asetaldehit, 5-hidroksi- | C 10 H 9 NO 2 | 175,06332 | 175,06304 | 1.65 | 2.32 |
| 3574185 | İNDOL-2-asetik asit | C 10 H 9 NO 2 | 175,06332 | 175,06304 | 1.65 | 2.32 |
| 5833 | L-(-)-Tirosin | C 9H 11 NO 3 | 181,07390 | 181,07378 | 0.66 | 7.48 |
| 389285 | 3-Amino-3-(4-hidroksifenil) propanoik asit | C 9H 11 NO 3 | 181,07390 | 181,07378 | 0.66 | 7.48 |
| 13628311 | L-treo-3-fenilserin | C 9H 11 NO 3 | 181,07390 | 181,07378 | 0.66 | 7.48 |
| 425 | 4-hidroksi-4-(3-piridil)-bütanoik asit | C 9H 11 NO 3 | 181,07401 | 181,07378 | 1.25 | 7.48 |
| 13899 | 3 - (1H-İndol-3-il)-akrilik asit | C 11H 9 NO 2 | 187,06332 | 187,06330 | 0.15 | 6.44 |
| 10607876 | Indoleacrylic asit | C 11H 9 NO 2 | 187,06332 | 187,06330 | 0.15 | 6.44 |
| 389120 | N6, N6, N6-Trimetil-L-lisin | C 9H 20 N 2 O 2 | 188,15248 | 188,15221 | 1.45 | 10.87 |
| 388321 | 5 "-S-metil-5"-thioadenosine | C 11 H 15 N 5 O 3S | 297,08957 | 297,08898 | 2.00 | 2.56 |
| 144 | 9 - (5-s-metil-5-thiopentofuranosyl)-9H-pürin-6-amin | C 11 H 15 N 5 O 3S | 297,09000 | 297,08898 | 3.43 | 2.56 |
| 111188 | Glutatyon | C 10H 17 N 3 O 6 S | 307,08380 | 307,08345 | 1.14 | 8.02 |
Tablo 2A.
| CSID | Isim | Formül | Izotoplu Kütle | Kitle arama | Hata (ppm) | RT (dak) |
| 857 | Methylglyoxal | C3 H 4 O 2 | 72,02100 | 72,02108 | 1.03 | 7.70 |
| 1057 | Sarkosindir | C3 H 7 NO 2 | 89,04768 | 89,04747 | 2.33 | 8.19 |
| 5735 | alanin | C3 H 7 NO 2 | 89,04768 | 89,04747 | 2.33 | 8.19 |
| 234 | beta-Alanin | C3 H 7 NO 2 | 89,04800 | 89,04747 | 5.93 | 8.19 |
| 55423 | R-laktik asit | C3 H 6 O 3 | 90,03169 | 90,03143 | 2.91 | 5.12 |
| 61460 | Hidroksipropionik asit | C3 H 6 O 3 | 90,03169 | 90,03143 | 2.91 | 5.12 |
| 96860 | L-(+)-laktik asit | C3 H 6 O 3 | 90,03169 | 90,03143 | 2.91 | 5.12 |
| 592 | Laktik asit | C3 H 6 O 3 | 90,03200 | 90,03143 | 6.29 | 5.12 |
| 650 | Dihydroxyacetone | C3 H 6 O 3 | 90,03200 | 90,03143 | 6.29 | 5.12 |
| 731 | Gliseraldehit | C3 H 6 O 3 | 90,03200 | 90,03143 | 6.29 | 5.12 |
| 1086 | Sülfürik asit | H 2 O 4 S | 97,96738 | 97,96683 | 5.63 | 8.13 |
| 128566 | Proline | C 5H 9 NO 2 | 115,06333 | 115,06302 | 2.67 | 7.78 |
| 1078 | Süksinik asit | C 4H 6 O 4 | 118,02661 | 118,02630 | 2.66 | 7.72 |
| 466979 | Erythrono-1 ,4-lakton | C4H 6 O 4 | 118,02661 | 118,02630 | 2.66 | 7.72 |
| 4483398 | Eritronik D-g-lakton | C 4H 6 O 4 | 118,02661 | 118,02630 | 2.66 | 7.72 |
| 473 | Metilmalonik asit | C 4H 6 O 4 | 118,02700 | 118,02630 | 5.96 | 7.72 |
| 8527138 | (3S, 4R) -3,4-Dihydroxydihydrofuran-2 (3H)-on | C 4H 6 O 4 | 118,02700 | 118,02630 | 5.96 | 7.72 |
| 140384 | 2-ketocaproic asit | C6 H 10 3 O | 130,06299 | 130,06270 | 2.24 | 2.35 |
| 164251 | Methyloxovaleric asit | C6 H 10 3 O | 130,06299 | 130,06270 | 2.24 | 2.35 |
| 388419 | (3S)-3-metil-2-okso-pentanoik asit | C6 H 10 3 O | 130,06299 | 130,06270 | 2.24 | 2.35 |
| 15642233 | Ketoleucine | C6 H 10 3 O | 130,06299 | 130,06270 | 2.24 | 2.35 |
| 46 | a-b-Okso-metilvalerik asit | C6 H 10 3 O | 130,06300 | 130,06270 | 2.36 | 2.35 |
| 69 | Alfa-Ketoisokaproik asit | C6 H 10 3 O | 130,06300 | 130,06270 | 2.36 | 2.35 |
| 134 | Aminolevulinik asit | 131,05800 | 131,05795 | 0.36 | 8.19 | |
| 9312313 | 3-hidroksi-L-prolin | C 5H 9 NO 3 | 131,05800 | 131,05795 | 0.36 | 8.19 |
| 5605 | HİDROKSİPROLİN | C 5H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 7068 | N-Acetylalanin | C 5H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 79449 | Ac-Ala-OH | C 5H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 89122 | Ethylformylglycine | C 5H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 167744 | L-glutamik-gama-semialdehit | C 5H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 388519 | 5-Amino-2-okso-pentanoik asit | C 5H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2.23 | 8.19 |
| 5880 | L-(+)-Lösin | C6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3.39 | 7.09 |
| 6067 | L-(+)-İzolösin | C6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3.39 | 7.09 |
| 19964 | L-norlösin | C6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3.39 | 7.09 |
| 388796 | beta-Lösin | C6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3.39 | 7.09 |
| 548 | Aminocaproic asit | C6 H 13 NO 2 | 131,09500 | 131,09419 | 6.18 | 7.09 |
| 109 | Üreidoizobutirik asit | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05299 | 132,05321 | 1.60 | 8.28 |
| 6031 | L-(-)-asparagin | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05350 | 132,05321 | 2.21 | 8.28 |
| 6026 | L-Ornithine | C 5H 12 N 2 O 2 | 132.08987 | 132,08961 | 1.98 | 10.36 |
| 64236 | D-Ornitin | C 5H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08961 | 1.98 | 10.36 |
| 193317 | L-(-)-Malik asit | C 4H 6 O 5 | 134,02153 | 134,02130 | 1.72 | 7.95 |
| 510 | (±)-Malik Asit | C 4H 6 O 5 | 134,02200 | 134,02130 | 5.25 | 7.95 |
| 133224 | treonik asit | C 4 H 8 O 5 | 136,03717 | 136,03688 | 2.14 | 7.70 |
| 388628 | 2,3,4-Trihydroxybutanoic asit | C 4 H 8 O 5 | 136,03717 | 136,03688 | 2.14 | 7.70 |
| 2061231 | DL-eritronik asit | C 4 H 8 O 5 | 136,03717 | 136,03688 | 2.14 | 7.70 |
| 21436 | N-metil-D <scp> </ SCP>-aspartik asit | C 5H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1.16 | 8.05 |
| 21814 | D-(-)-Glutamik asit | C 5H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1.16 | 8.05 |
| 30572 | L-(+)-Glutamik asit | C 5H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1.16 | 8.05 |
| 58744 | N-Asetil-L-serin | C 5H 9 NO 4 | 147.05316 | 147,05299 | 1.16 | 8.05 |
| 6038 | Histidin | C 6 H 9 N 3 O 2 | 155,06947 | 155,06930 | 1.09 | 8.36 |
| 199 | Allantoin | C 4H 6 N 4 O 3 | 158,04401 | 158,04387 | 0.88 | 4.76 |
| 6082 | L-(+)-arginin | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11154 | 0.80 | 10.76 |
| 64224 | D-Arg | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11154 | 0.80 | 10.76 |
| 58576 | N-Asetil-L-Aspartik asit | C6 H 9 NO 5 | 175,04807 175,04803 | 0.18 | 7.87 | |
| 996 | Pirofosforik asit | H 4 O 7 P 2 | 177,94299 | 177,94331 | 1.79 | 8.42 |
| 5589 | Glikoz | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0.41 | 7.53 |
| 17893 | Manoz | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0.41 | 7.53 |
| 58238 | . P-D-glukopiranoz | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0.41 | 7.53 |
| 71358 | . A-D-glukopiranoz | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0.41 | 7.53 |
| 134838 | 3-deoksi-arabino-hexonic asit | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0.41 | 7.53 |
| 388332 | L-Sorbopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0.41 | 7.53 |
| 388476 | beta-D-galaktopiranoz | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0.41 | 7.53 |
| 388480 | . A-D-galaktopiranoz | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0.41 | 7.53 |
| 388775 | beta-D-Fructofuranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0.41 7.53 | |
| 10239179 | Inositol | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0.41 | 7.53 |
| 16736992 | Cis-inositol | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0.41 | 7.53 |
| 17216070 | aloz | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0.41 | 7.53 |
| 17216093 | L-sorboz | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0.41 | 7.53 |
| 201 | hegzopiranoz | C 6 H 12 O 6 | 180,06300 | 180,06346 | 2.53 | 7.53 |
| 868 | 12,3,4,5,6-cyclohexanhexol | C 6 H 12 O 6 | 180,06300 | 180,06346 | 2.53 | 7.53 |
| 2068 | Teofilin | C 7 H 8 N 4 O 2 | 180,06473 | 180,06346 | 7.04 | 7.53 |
| 4525 | 1,7-dimetil-ksantin | C 7 H 8 N 4 O 2 | 180,06473 | 180,06346 | 7.04 | 7.53 |
| 5236 | Teobromin | C 7 H 8 N 4 O 2 | 180,06473 | 180,06346 | 7.04 | 7.53 |
| 1161 | izositrik asit | C 6 H 8 O 7 | 192,02701 | 192,02704 | 0.15 | 8.18 |
| 305 | Cimide asit | C 6 H 8 O 7 | 192,02699 | 192,02704 | 0.23 | 8.18 |
| 963 | pantotenik asit | C 9 H 17 NO 5 | 219,11067 | 219,11049 | 0.84 | 6.72 |
| 6361 | D-pantotenik asit | C 9 H 17 NO 5 | 219,11067 | 219,11049 | 0.84 | 6.72 |
| 960 | palmitik asit | C 16 H 32 O 2 | 256,23999 | 256,24000 | 0.05 | 1.73 |
| 111188 | Glutatyon | C 10 H 17 N 3 O 6 S | 307,08380 | 307,08339 | 1.35 | 8.03 |
| 388337 | N-asetilnöraminik asit | 309,10599 | 309,10585 | 0.45 | 7.43 | |
| 392681 | N-asetil-alfa-nöraminik asit | C 11 19, H NO 9 | 309,10599 | 309,10585 | 0.45 | 7.43 |
| 392810 | Sialik asit Neu5Ac | C 11 19, H NO 9 | 309,10599 | 309,10585 | 0.45 | 7.43 |
Tablo 2B.
. Tablo 2 HCT tespit hedefsiz metabolitlerin Liste 8 hücreleri (2.78 x 10 5 hücre denklik) Tablo 2A ve 2B bileşenleri ekstre bilgileri içerir:. Tutma süresi, m / z ve kütle hata ve bu arada, veritabanı arama sonuçları: ChemSpider ID ( CSID), isim, formül, vb. Burada analiz örnekleri denklemleri vardır2.78 x 10 5 hücre çıkarılan metabolitlere, l, ve yoğunluk eşik gösteri amaç için sıkıcı sonucu önlemek için 1 x 10 7'dir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol kullanılarak hücre başarılı metabolit profil için en önemli adımlar şunlardır: 1) büyütme ortamı ve hücreler dikkatli çıkarma kontrol edilmesi; 2) kantitatif bir tepe üzerinde yeterince (genellikle en az 10) veri noktaları vardır sağlamak için MS yöntemi kurulum dayalı LC yöntemini ayarlanması; 3) örnekleri çalıştırmadan önce düşük kütle kalibrasyonu yapıyor; 4) vites tutma süresini önlemek için en fazla 5 ml enjekte ve zirve genişletilmesi su neden; ve 5) toplu etkilerini en aza indirmek için aynı parti içinde karşılaştırma için numune hazırlama ve çalışıyor.
Standartları düşük kütle aralığı kalibrasyon için buraya seçilen (Tablo 1) değiştirilebilir. Kütle tarama aralığı içine düşen bir m / z bilinen herhangi bir bileşik de bir H-ESI kaynağında davranmış ve kalibrasyon standartları için uygun adaylardır su, metanol ya da asetonitril içinde çözünebilir olmasıdır. Oldukça tüm kalibrasyon çözeltileri a saklamak için tavsiye edilirt, 4 ° C kafein stabilize etmek ve aynı zamanda kalibrasyon performansı daha tekrarlanabilir, böylece kalibrasyon çözelti içinde metanol ya da asetonitril buharlaşmasını en aza indirmek için. 2.000 150 düzenli bir kütle aralığı, m / z ile karşılaştırıldığında, düşük kütle aralığı kalibrasyon her iki gün en az bir kez, daha sık yapılması gerekiyor.
Ekstraksiyon çözücü, sulandırıldıktan çözücü, LC mobil faz, düşük kütle aralığı kalibrasyon ve MS tarama bu iş akışı, aralık polar metabolitleri ölçmek için optimize edilmiştir. Bu çok on amino asit asetil amino asitler, glikoliz yolu ara maddeleri, nükleositler, TCA döngüsü ara ürün, bir tek karbon metabolizması yolu ara ürünleri ve benzeri içerir. Ancak, bu tür Koenzim A (CoA) türleri gibi metabolitlerin diğer sınıfları için bu protokol modifikasyonlar folatlar, fosfolipidler mümkündür. Örneğin, CoA asidik koşullarda daha kararlı olan, yani% 80 metanol / su ile, bir asit ekleme imp için yararlı olacaktırrove CoA duyarlılık. Ayrıca, CoA ve lipidler bu nedenle m / z tarama aralığı 60-900 bu metabolitler kapsayacak uygun bir aralıkta ayarlandı gereken, çok daha büyük bir moleküler ağırlığa sahip olma eğilimindedir.
Hedefsiz bileşen veritabanı bazı arama sonuçlarının hedeflenen liste ile örtüşüyor olsa da, bu araştırma önceliğine göre bu hedef listesi oluşturmak için önemini korumaktadır. Hedeflenen listesindeki metabolitler ortalama yoğunluk eşiğinden daha düşük olduğu için, bu metabolitlerin ile ilgili bilgi işlem sırasında çıkarılır. Hedeflenen listesi bize metabolit tespit ve miktar tayini için daha yüksek bir güven veren tutma süresi bilgileri içerir. QE-MS ayarı ile bir başka avantajı, tandem kütle spektrometresi metabolitlerin daha fazla tanımlanması için izin olabilir.
Bu iş akışı ile ilgili bir konu olduğunu, H-ESI iğne inseuçucu olmayan tuzlarının yüksek miktarda var ise, söz konusu büyük ölçüde tehlikeye gibi oda sıcaklığı, numunelerin tuz içeriğine karşı duyarlıdır. Bu nedenle, örnekler ve sütun ve H-ESI iğne ucun rutin temizlik minimize tuz içeriği iyi kalitede veri sağlamak ve sütunun ömrünü artırmak için yardımcı olacaktır.
Özetle, bu protokol minimum numune hazırlama adımları ve hızlı veri toplama ile başarıyla kültüre hücrelerden polar metabolitleri analiz LC-QE-MS kullanır. Numune hazırlama küçük modifikasyonlar örneğin, serum ve doku gibi diğer biyolojik kaynaklardan veri elde etmek üzere gerçekleştirilebilir. Örneğin, saf metanol sıvı serum ilave edilebilir çünkü polar metabolitleri çıkarılması için% 80 bir son konsantrasyona yapmak için metanol ilave edildi. Doku örnekleri için, sıkı bir karıştırma ve karıştırma daha ekstraksiyon etkinliğini elde etmek için gereklidir. 10 ml serum veya süresi1 mg doku metabolitlerin analizi için yeterlidir. Ham veriler, hedeflenmiş modda hem de analiz edilebilir orada bilinen metabolitleri örneklerde, ve eğer HRMS veritabanı araştırma ve ardından bir un hedefli bir şekilde. HRMS tabanlı metabolomiks erken aşamalarında hala. Gelecekteki gelişmeler için, deneysel teknikleri ayrıca optimize ek metaboliti HRMS bilgi ve MS / MS parçalanma motifleri gibi zirve hizalama, pik entegrasyonu, izotop kümelenme ve böylece, verimliliğini ve doğruluğunu artırabilir gibi yararlı ve ilgili algoritmalar, olacak edilebilir veri işleme. Ancak sonuçta, metabolizma bizim laboratuar adresleri işledikten sonra verilerin dikkatli yorumlanması ile sınırlıdır sorular çok. Bu büyük ölçekli metabolomiks teknikleri ile, sık sık üretilen hipotezlerin veri ve değerlendirme bizim yorumlanması ile sınırlıdır. Bu nedenle, tüm metabolomiks deneyler belirli sorular etrafında formüle gerek yoktur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar kütle kalibrasyon ve veri işleme değerli tartışmalar için Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) ve Nathaniel Snyder (Pennsylvania Üniversitesi) kabul etmek istiyorum. Bu yayında bildirilen Araştırma Ödülü sayısı R00CA168997 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positive calibration mix | Thermo Scientific | #88323 | It is light sensitive. Store at 4 °C |
| Negative calibration mix | Thermo Scientific | #88324 | Store at 4 °C |
| Diazinon | Sant Cruz Biotechnology | #C0413 | It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C |
| H-ESI needle insert | Fisher Scientific | #1303200 | This could be replaced or cleaned with 5% formic acid/water (remove rubber ring) if clogged. |
| Xbridge amide column | Waters | #186004860 | Guard column is recommend to increase column lifetime. |
References
- Fiehn, O. Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks. Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).
- Mulleder, M., et al. A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology. Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).
- Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).
- Ideker, T., et al. Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network. Science. 292 (5518), 929-934 (2001).
- Jonsson, P., et al. A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS. Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).
- Jonsson, P., et al. High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses. Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).
- Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data. Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).
- Wiklund, S., et al. Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models. Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).
- Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. MetaboMiner--semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids. BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).
- Lu, D., et al. 13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).
- Shen, J., et al. Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).
- Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).
- Locasale, J. W., et al. Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).
- Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).
- Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).
- Ramanathan, R., et al. It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS. Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).
- Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer. Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).
- Michalski, A., et al. Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).
- Michalski, A., et al. Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).
- Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry. UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).
- Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine. Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).
- Want, E. J., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
