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Immunology and Infection

Ein Protokoll für die Analyse von Hepatitis-C-Virus-Replikation

Published: June 26, 2014 doi: 10.3791/51362
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Liver Program at Regenerative Medicine Institute, Department of Biomedical Sciences, Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA
* These authors contributed equally

Abstract

Hepatitis-C-Virus (HCV) betrifft 3% der Weltbevölkerung und verursacht schwere Lebererkrankungen wie chronische Hepatitis, Leberzirrhose und Leberzellkarzinom. HCV ist ein umhülltes RNA-Virus aus der Familie Flaviviridae. Strombehandlung nicht wirksam ist und bewirkt, dass nachteilige Nebenwirkungen. Es gibt keine HCV-Impfstoff zur Verfügung. So wird fortgesetzt Aufwand für die Entwicklung eines Impfstoffes und eine bessere Therapie erforderlich. Einem HCV-Zellkultursystems ist kritisch für das Studium verschiedener Stadien der HCV Wachstum einschließlich Viruseintritt, Genom-Replikation, Verpackung und Austritt. In der vorgestellten aktuellen Prozedur verwendeten wir eine Wildtyp-intragenotype 2a chimären Virus, FNX-HCV, und ein rekombinantes FNX-Rluc Virus, eine Renilla-Luciferase-Reportergens um die Virusreplikation zu studieren. Eine menschliche Hepatom-Zelllinie (Huh-7-Basis) wurde für die Transfektion von in vitro transkribierten genomischen HCV-RNAs. Zellfreie Kulturüberstände, Protein-Lysate und total RNA wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Ernte Transfektion HCV Wachstum zu beurteilen. HCV-Genom-Replikation Status wurde durch quantitative RT-PCR und Visualisierung der Gegenwart von HCV-RNA-Doppelstrang ausgewertet. Die HCV-Proteinexpression wurde durch Western-Blot und Immunfluoreszenz unter Verwendung von für HCV-NS3-und NS5A-Proteine ​​Antikörper verifiziert. HCV-RNA-transfizierten Zellen freigesetzt infektiöse Partikel in Kulturüberstand und der Virustiter wurde bestimmt. Luciferase-Assays wurden verwendet, um die Replikationsebene und Infektiosität von HCV-Reporter beurteilen. Zusammenfassend stellen wir verschiedene virologische Tests zur Charakterisierung von verschiedenen Stufen des HCV-Replikationszyklus.

Introduction

Hepatitis-C-Virus (HCV) verursacht Leberzirrhose und Leberkrebs. Es betrifft 170 Millionen Menschen weltweit mit 350.000 Menschen sterben jährlich 1-3. HCV ist ein positiver Strang-RNA-Virus mit einer Genomgröße von 9,6 kb. Das HCV-Genom als ein einzelnes Polyprotein von ca. 3000 Aminosäuren, das proteolytisch durch verschiedene zelluläre und virale Proteasen gespalten, in 10-Polypeptide translatiert wird. HCV-Virus ist der Prototyp der Gattung Hepacivirus und gehört zur Familie der Flaviviridae 4. Bei der Belichtung stellt chronischer HCV-Infektion in 80% der Individuen. Die Infektion ist meist asymptomatisch und rechtzeitige Diagnose kann die therapeutische Intervention zu Leber Verschlechterung verhindern können. Die derzeitige Behandlung nicht optimal sein und kein Impfstoff verfügbar ist 5,6.

Die Ätiologie der Hepatitis C wurde erstmals 1989 7 beschrieben. Studieren HCV-Replikation ist wichtig für die Hepatitis-C-Impfstoff-und Behandlungsforschung, aber es warlang durch das Fehlen eines effizienten Viruskultursystem behindert. Ein molekularer Klon des HCV Infektions wurde gezeigt, bei Schimpansen auf intra-Impfung 8 sein. Anschließend wurden HCV subgenomische Replikon beschrieben, die das virale Genom-Replikation Stufe in einem Zellkultursystem erlaubt 9,10 sezieren. Entdeckung einer Genotyp HCV 2a isolieren JFH-1 (Japanese Fulminante Hepatitis-1), infizieren Zellkultur eröffnet neue Wege für die HCV-Replikation Forschungs 11-13. Genotyp 2a Stamm JFH-1-Basis inter-und intra-und genotypische chimären Viren vom Genotyp 1 HCV Infektions basierend Kultursysteme sind auch 14 bis 18 erhältlich.

Wir haben erfolgreich JFH-1-Stamm-und HCV-intragenotype 2a chimären Virus verwendet, um die hochauflösenden funktionellen Profilierung Karte von Proteindomänen und cis-aktiven RNA-Elemente 19,20 zu erhalten. Demnach beschreiben wir eine effektive Kultursystem routinemäßig verwendet, die ermöglichtStudium der verschiedenen Stadien des HCV-Replikationszyklus und Wirt-Pathogen-Interaktion. Wir präsentieren virologische Untersuchungen auf virale Genom-Replikation und de novo Infektiosität von HCV intragenotype 2a und einem Renilla-Luciferase Reporter basierend HCV beurteilen.

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Protocol

Ein allgemeiner Überblick über das Protokoll ist in Fig. 1 dargestellt.

1. Cells

  1. Vorbereitung vollständige Wachstumsmedium, das 10-15% fötalem Rinderserum (FBS), 10 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 10 mM Hepes, Penicillin (100 Einheiten / ml), Streptomycin (100 mg / ml) und 2 mM L-Glutamin enthält.
  2. Pflegen Huh-7.5.1-Zellen in 13 komplette Wachstumsmedium, das die oben genannten Ergänzungen für in-vitro-Analyse von Hepatitis-C-Virusreplikationszyklus.
  3. Kultur Virusstämme in Huh-7.5.1-Zellen mit den angegebenen Wachstumsmedium ergänzt bei 37 ° C mit 5% CO 2.

2. Viren und Plasmid-Konstrukte

  1. Erzeugen, die komplementäre DNA (cDNA)-Form von HCV-RNA und klonen in einen Plasmidvektor für einfache genetische Manipulation. Hinweis: Die Entdeckung der japanischen fulminante Hepatitis 1, JFH-1 (HCV Genotyp 2a), Isolat HCV kritisch für Forschung gewesen undin erster Linie verwendet, um die HCV-Replikationszyklus 11-13 studieren. Inter-und intragenotypic chimären Viren basierend auf JFH-1 HCV sind häufig in Forschungs 14-18 verwendet. Konstruktion von synthetischen intragenotype 2a chimären Virus, FNX-HCV und einem monocistronischen chimären Reporterstamm wurde zuvor 19 und konstruktive Details sind nicht Gegenstand dieses Protokolls beschrieben.
  2. Verwenden Sie die pFNX-HCV intragenotype 2a Virus als es enthält eine 5'-NTR-, Struktur-Regionen und P7, und ein Teil der NS2 nicht-strukturellen Regionen (Nukleotide 1-2878) des J6CF Elternstamm (NCBI Zugangsnummer. AF177036), als sowie die nicht-strukturellen Komponenten des JFH-1-Virusstamm (NCBI Zugangsnummer. AB047639). Hinweis: FNX-HCV wurde basierend auf der Sequenz von Jc1 intragenotype 2a chimären HCV synthetisiert zuvor berichtet 15.
  3. Generieren Sie eine monocistronischen chimären Reporter virales Konstrukt, das pFNX-Rluc, auf der Grundlage der pFNX-HCV-Stamm (oben in Schritt 2.2), indem Sie einen Renilla Luciferase-Gen zwischen der 5 'NTR und Core-Gen (nt zwischen 388 und 389). Anschließend verbinden Sie das Luciferase-Gen-Gen-und Kern dieses Konstrukts mit einem Maul-und Klauenseuche-Virus 2A (F2A) Peptidsequenz, die als Spaltsignal funktionieren würde.
  4. Ingenieur die RNA-Polymerase-Null (Pol-) virales Konstrukt entweder mit dem pFNX-HCV oder pFNX-Rluc viralen Hintergrund. Ersetzen die katalytischen Reste NS5B Polymerase GDD (aa 2759-2761; nt 8615-8623), der eine dieser viralen Rückgrat mit AAG Aminosäureresten.

3. In-vitro-HCV-RNA-Transkription

  1. Verwenden Sie ein intragenotype 2a chimären Virus FNX-HCV und HCV-FNX Pol null (Pol-) HCV für die Bewertung der viralen Replikation (Abbildung 2A).
  2. Linearisieren die viralen Plasmide mit XbaI Restriktionsenzym und dann mit Mungobohnennuclease um glatte Enden zu erzeugen behandeln. Reinigung der verdauten Plasmide durch Anionenaustauschchromatographie. Überprüfen Sie die Integrität of Das linearisierte Plasmid indem DNA-Gelelektrophorese (Fig. 2B) Agarose.
  3. Übertragen Sie die linearisierte Plasmide mit Hilfe der viralen T7-RNA-Polymerase.
  4. Reinige den neu synthetisierten DNase behandelte RNA unter Verwendung eines RNA-Reinigungs-Kits.
  5. Überprüfen Sie, ob die RNA-Produktion durch Agarose-Gelelektrophorese (Abbildung 2C).
  6. Quantifizierung der RNA durch Spektrophotometrie.
  7. Lagern Sie den erzeugten RNA in -80 ° C in 10 ug Arbeits Aliquots. Hinweis: Um die Veränderung der RNA-Qualität innerhalb der einzelnen Versuchsplanung zu minimieren durch Transkription aller RNA für jede Virusprobe und Kontrolle zugleich.

4. HCV-RNA-Transfektion und Probenentnahme

  1. Ernten Sie die Huh-7.5.1-Zellen mit Trypsin.
  2. Um Zellen, Zentrifuge spülen und resuspendieren Suspension zweimal mit kaltem niedrigen Serum-Medien. Resuspendieren der Zellen in Medien mit niedrigem Serumgehalt 1 x 10 7 Zellen pro ml beträgt.
  3. Mischen Sie insgesamt 10 & #956; g transkribierte Virus-RNA mit 400 ul der resuspendierten Zellen (4 × 10 6 Zellen) in einer 0,4-cm-Elektroporationsküvette transferiert. Transfektion von Zellen mittels Elektroporation bei 270 V, 100 Ω und 950 uF.
  4. Resuspendieren der Elektroporation Zellen in 10 ml Vollwachstumsmedium mit 15% FBS. Hinweis: Erhöhte Überlebensfähigkeit von Zellen elektroporiert wird gesehen, wenn die Huh-7.5.1-Zellen wurden in 15% fötalem Rinderserum kultiviert.
  5. Platte, die Zellen in beiden T-25-Kolben (~ 1,2 × 10 6 Zellen pro Kolben) und 48-Well-Platten (1 × 10 4 Zellen pro Vertiefung) für jede der folgenden Zeitpunkten: 4, 48 und 96 Stunden.
  6. Ersetzen Sie die Medien bei 4-8 Stunden nach der Transfektion mit frischem ergänzten Wachstumsmedium mit 10% FBS, um abgestorbene Zellreste aus den kultivierten Flaschen und Platten entfernen.
  7. Erntezellkulturüberständen an den 48, 96 h Zeitpunkte und Entfernen von Zelltrümmern von gesammelten Proben durch Zentrifugation der Zellen bei 1500 UpM für 10 min bei 4 º C.
  8. Bewahren Sie die zellfreien Überstände bei -80 º C. Lyse der Zellen, die für Protein-und RNA-Analyse durch Western-Blot und Reverse Transkription-PCR quantitativ zu den angegebenen Zeitpunkten.

5. Reverse Transkription-quantitative PCR (RT-qPCR) für die Beurteilung der HCV-Genom-Kopien

  1. Führen eine Zwei-Schritt-RT-qPCR die genomische HCV-RNA Kopienzahl zu bestimmen.
  2. Revers transkribieren 1 ug zelluläre Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase und eines Primers spezifisch für HCV-sense-Strang, der 5 'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3') bindet, oder ein Primer, die spezifisch für Haushaltsgens Peptidylprolyl Isomerase G (R ppig : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '). Auch Reverse Transkription FNX-HCV-RNA (in Schritt 3 erzeugte) bekannter Genomkopien (10. Januar-10. September Standard) mit HCV-Sense-Strang Primer.
  3. Führen Sie qPCR unter Verwendung von 50 ng der resultierenden cDNA transkribiert mit spezifischen HCV-Primer (JFH RTQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') und DNA-Bindung grüne Farbstoff, der qPCR Super-Mix. Führen qPCR für Housekeeping-Gen sowie ppig (ppig Primer F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; ppig R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') Anmerkung: Für die Berechnung der genauen intrazellulären HCV-RNA-Ebene über die Stichproben verwenden zellulären Housekeeping-Gen, ppig , Expressionsniveau (Ct-Zyklus) für die Normalisierung. Verwenden Sie die Kopienzahl des FNX-HCV-Genom als Standard für die Bestimmung der Kopienzahl.
  4. Verwenden Sie die folgenden Bedingungen bei der Ausführung von qPCR auf HCV-RNA-Kopienzahl zu bestimmen: 95 ° C für 15 Sekunden und 60   º C für 30 Sekunden (40 Zyklen) mit Echtzeit-PCR-System.
  5. Siehe Fig. 3A und 3B für die Genomreplikation Ergebnisse.

6. Western Blot-Analyse zum Nachweis von HCV-Protein-Expression (Fig. 3C)

  1. Verwenden Zelllysate from Virus-RNA bei 96 Stunden nach der Transfektion für Protein-Western-Blot-Analyse transfiziert.
  2. Lösen das Zelllysat unter Verwendung von SDS-PAGE und Transfer auf Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran.
  3. Blockieren der Membran mit einer Blockierungslösung, enthaltend 5% Magermilch, 0,2% Tween 20 in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
  4. Inkubation der Membran mit primären monoklonalen Maus-Antikörper NS3 (1 von 1.000 Verdünnung) und beta-Aktin (1 in 5000 Verdünnung).
  5. Hinzufügen Ziege-anti-Maus-IgG, das mit Meerrettich-Peroxidase (1 in 5.000 verdünnt) konjugiert und durch Chemolumineszenz nachzuweisen.

7. Immunfluoreszenz-Assay (IFA)

  1. Beheben die HCV-infizierten und transfizierten Zellen unter Verwendung von Methanol für 30 min bei -20 º C für Immunfluoreszenz-Assay.
  2. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und Block mit IFA Blockierungspuffer.
  3. Verwenden polyklonalen Kaninchen anti-NS5A in erster Linie Antikörper oder monoklonalen Maus-Anti-DSR (freundlicherweise von Dr. Dasgupta, UCLA Verfügung gestellt)NA J2 Antikörper bei einer Verdünnung von 1:200 (1 ug / ml) und Inkubation für 5 h bis über Nacht bei 4 º C.
  4. Dreimal nach dem primären Antikörper Waschen der Zellen mit PBS.
  5. Hinzufügen Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundär 488 polyklonalen Antikörper oder Ziege-anti-Maus-IgG-Sekundär 594 polyklonalen Antikörper in einer 1:1000 Verdünnung (1 ug / ml) und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur.
  6. Waschen der Zellen mit PBS dreimal und Fleckenkerne mit Hoechst-Farbstoff und Ansicht mit Fluoreszenzmikroskop (Fig. 3D).

8. Mess Virus Titer

  1. Platte naiv Huh-7.5.1-Zellen bei etwa 3 x 10 3 Zellen / Well unter Verwendung eines 96-Well-Platte. Am nächsten Tag, führen das 10-fache serielle Verdünnungen der zellfreien Kulturüberstand von HCV-RNA-transfizierten Zellen mit Wachstumsmedium geerntet und in dreifacher Ausfertigung auf impfen Huh-7.5.1-Zellen.
  2. Fix-Zellen bei 72 Stunden nach der Infektion mit Methanol (30 min bei -20
  3. Verwenden Sie die höchste Verdünnung, die für die NS5A positive Foci zählen und berechnen die durchschnittliche Anzahl der Schwerpunkt Bildungseinheit (FFU) pro Milliliter. Siehe Abbildung 4 für die HCV-Titer.

9. Renilla Luciferase Reporter Assay für virale Genom-Replikation und Infektiosität

  1. Für die Beurteilung viralen Genomreplikation, Platte HCV-RNA-Elektroporation Huh-7.5.1-Zellen in dreifacher Ausfertigung in 48-Well-Platten (1 x 10 4 Zellen / well).
  2. Lyse die Zellen mit 75 ul der passiven Lyse-Puffer an der 6 h, 48 h und 96 h nach der Transfektion.
  3. Schaukeln Sie die Platten vorsichtig für 15 Minuten bei Raumtemperatur und bei -80 º C.
  4. Zur Messung der Renilla-Luciferase-Enzymaktivität, die Protein-Lysat auftauen und Renilla-Luciferase-Assay-Reagenzien auf Raumtemperatur.
  5. In 20 ul Proteinlysat pro Vertiefung einer 96-wel l weiße Lumineszenz Platte und legen Sie die Platte in einem Luminometer.
  6. Pipettieren von 100 ul Renilla Luciferase-Assay-Reagenz (Coelenterazin Substrat + Puffer) pro Vertiefung und nach einer 2 Sek. vor, lesen Verzögerung; integrieren, das emittierte Licht für 10 Sekunden.
  7. Mittelwert und Standardabweichung für jede Probe aus den Luciferase-Werte der biologischen Triplikaten und unterziehen die Daten einer statistischen Analyse (Abbildung 5).
  8. Zur Beurteilung Infektiosität inokulieren 500 ul zellfreier Überstand aus HCV-RNA-transfizierten Zellen für die angegebenen Zeitpunkten (48 h und 96 h) in dreifacher Ausfertigung in 48-Well-Platten auf naiven Huh-7.5.1-Zellen erhalten.
  9. Ersetzen Sie die viralen Inokulum mit 500 ml frisches Medium pro Well nach 6 Stunden nach der Infektion.
  10. Lyse der Zellen bei 48 Stunden nach der Infektion und nach Renilla-Luciferase-Assay, wie in Schritten von 8,2 bis 8,7 (Fig. 5) beschrieben.
itel "> 10. Statistische Analyse

  1. Die Fehlerbalken in den Diagrammen zeigen die Standardabweichungen (SD). Die P-Werte wurden mit dem ungepaarten t-Test berechnet.

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Representative Results

Hepatitis C-Virus ist ein RNA-Virus ist. Somit zur genetischen Manipulation Zweck hat die genomische HCV-cDNA in einen bakteriellen Plasmid-Vektor kloniert. Ein T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz wurde unmittelbar vor dem 5'-Ende des HCV-Genoms eingeführt. Eine allgemeine Übersicht der HCV-Analyse-Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt. Um genomische HCV-RNA mit präziser 3-Ende erzeugen, wird das HCV-Genom-Plasmid, das mit XbaI Restriktionsenzym und die erzeugte Einzelstrangüberhang wurde mit Mungbohnen-Nuklease Verdauung stumpf geschnitten . Die Qualität des linea HCV Plasmid wurde durch Agarose-Gelelektrophorese (Fig. 2B) beurteilt. Das HCV-DNA wurde T7-RNA-Polymerase in vitro Transkription vermittelte unterworfen und die resultierende RNA ergab ein einziges Produkt mit 9,6 Kilobasen (Fig. 2C).

Wir testeten die Wachstumskinetik eines intragenotype 2a HCV (Abbildung60, 3). Die Huh-7.5.1-Zellen wurden mit in vitro transkribierten RNA von Wildtyp (WT) und Polymerase null Viren elektroporiert. Wir untersuchten die viralen Genomreplikation Sinne von RT-qPCR. Ergebnisse zeigten, dass die WT-Virus repliziert das Genom effizient (3A und 3B). Das Wildtyp zeigte 2.59 log höhere Genomreplikation im Vergleich zu der Pol-Virus. Der WT-Virus produziert das NS3-Protein (3C), die in viralen Proteinspaltung (Protease-Aktivität) beteiligt ist, und Genom-Replikation (Helikase Aktivität). Auch die WT Virus exprimiert NS5A-Protein, wie durch Immunfluoreszenz-Test (3D) bewertet. NS5A-Protein ist Teil der HCV-RNA-Replikase-Komplex. Virale Genomreplikation zu visualisieren, prüften wir die Gegenwart von doppelsträngigen (ds) HCV-RNA unter Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch dsRNA. Während HCV-Genom-Amplifikation ist die Sense-Strang-RNA-cAntisense-Genom opied, wodurch die doppelsträngige RNA-Zwischenprodukte sind in der infizierten Zellplasmas vorhanden. Das NS5A-Protein und dsRNA Zusammenarbeit lokalisiert im Zytoplasma (3D) von WT transfizierten Zellen hindeutet, die aktive virale Replikation. Zusammengenommen ist die WT-Virus fest aktive Replikation in transfizierten Huh-7.5.1-Zellen.

Fortschritte in HCV Forschung war aufgrund des Fehlens von einem infektiösen Zellkultursystem beschränkt. Die Entdeckung JFH-1-Stamm von HCV und die anschließende Charakterisierung von chimären Laborstämme konnten wir die gesamte HCV-Replikationszyklus in der Zellkultur zu untersuchen, einschließlich Viruseintritt, RNA-Translation, RNA-Replikation und die Bildung infektiöser Virusnachkommen. Um die HCV-Titer und de novo-Infektiosität zu beurteilen, beimpft man die Zellkulturüberstände von HCV-RNA-transfizierten Zellen gewonnen. Die HCV-Infektion wurde durch Nachweis der HCV-Protein NS5A visualisiert und berechnetder virale Titer durch Auszählen der Infektionsherde (Abbildung 4). Wir als isoliert Cluster von Zellen (über 2 Zellen) positiv für NS5A als Einzel Fokus. Die Ergebnisse zeigten, dass die WT-Virus ist ansteckend und produziert über 10 4 Schwerpunkte bildenden Einheiten / ml infektiöse Partikel.

Außerdem haben wir einen Reporter HCV-Virus beherbergen, Renilla-Luciferase (Rluc) Reporter-Gen (5A). Ein Reporter HCV kann zum Testen große Anzahl von Mutanten-Viren als auch für High-Content-Screening-Assays verwendet werden. Hier präsentieren wir die Beurteilung der Wachstums Phänotypen von WT-und Pol-Reporter Viren. Wenn das virale Genom repliziert, würde die Luciferase-Aktivität nach der Transfektion Überstunden erhöhen. Die erhöhten Genomreplikation Niveaus von einer höheren Luciferase-Aktivität abgeleitet werden. Daher stellt indirekt die Luciferase-Aktivität der Messung der Höhe der Genom-Replikation. Die aus WT-oder Pol-vi geerntet Lysatenral RNA transfizierten Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten wurden für die Luciferase-Aktivitäten getestet. Bei 6 h nach der Transfektion sowohl WT-und Pol-Viren hatten ähnliche Luciferase-Aktivitäten, was auf ähnliche Eingangspegel des RNA transfiziert, die übersetzt worden waren (5B). Jedoch bei 48 h und 96 h nach der Transfektion zeigten die WT-Virus im Vergleich zu dem Pol-Virus-Genom-Replikation erhöht Ebenen. Auch die WT Virus produziert virale NS3-Protein durch Western-Blot-Analyse (Abbildung 5C) verifiziert. Anschließend testeten wir die Infektiosität von WT-und Pol-Reporter Viren durch Impfen naiven Huh-7.5.1-Zellen mit den zellfreien Überstände von 48 h und 96 h nach der transfizierten Zellkulturen gesammelt. Die Pol-Virus gehabt Basisebene Luciferase-Aktivität, während die WT-Virus hatte 2-3 Protokoll höhere Replikation der von Pol-Reporter-Virus (5D). Die Ergebnisse zeigen, dass wir eine robuste HCV Infektions Zelle kul re System.

Figur 1
Abbildung 1. Allgemeine Gliederung der HCV-Replikation Analyse-Workflow. Linearisierter HCV-Plasmid-Konstrukt, das T7-RNA-Polymerase-Promotor (T7P), die in-vitro-Transkription unterzogen. Das gereinigte HCV-RNA-Genom in Huh-7.5.1-Zellen elektroporiert und in Kolben und 48-Well-Platte plattiert. Bei 4 h, 48 h und 96 h nach der Transfektion werden die zelluläre RNA und Kulturüberständen aus den Kolben entnommen. Die Zellen aus 48-Well-Platte werden für die Ernte Proteinlysats verwendet und für Immunfluoreszenz-Assay festgelegt. Genom-Kopienzahl-Analyse mittels RT-qPCR, Western-Blot-und Mess virale Titer sind getan, um die HCV-Replikation zu beurteilen.

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2. Herstellung von genomischen HCV-RNA durch in vitro-Transkription von Plasmid-DNAs konstruiert. A) Genomische Organisation der J6CF/JFH-1 intragenotype 2a chimären Viren, FNX-HCV und HCV FNX-Pol null. Der Stamm J6CF Region (5'-NTR, Teil NS2) in dunkelgrau und dem JFH-1-Stamm-Bereich (Teil NS2 zu 3'NTR) dargestellt ist hellgrau angezeigt. NS5B Polymerase katalytischen Domäne Mutation (GDD zu AAG) ist mit einem Stern. B) Schritte bei der Erzeugung linearisierte Plasmid HCV beteiligt angezeigt. Gel Bild zeigt die linearisierte, stumpf ended Plasmid durch XbaI und Mungbohnen-Nuklease Verdauung produziert DNAs, bereit für in-vitro-Transkription. 0,8% Agarosegel wurde zur Lösung des DNA verwendet. C) Gel-Bild zeigt die genomische HCV-RNA durch in vitro-Transkription unter Verwendung der T7-RNA-Polymerase-System hergestellt. WT: Wildtyp; Pol-: Polymerase-null; M:Markierung.

Fig. 3
3. Bewertung des Wachstums Phänotypen von HCV Konstrukten. A) Auswertung der Genomreplikation Kinetik der Wildtyp (WT) und Polymerase-null (Pol-) Viren. Die Genom-Kopienzahlen von sense-RNA-Strang durch RT-qPCR bewertet werden im Balkendiagramm dargestellt. Die viralen Genomkopien von Pol-Virus gesunken anzeigt replikationsdefizient Phänotyp. B über den Zeitraum) Relative Genomreplikation Niveau der Wildtyp-HCV ist, dass der Pol-Virus. C) Western-Blot-Analyse der HCV-Proteinexpression verglichen. HCV-Protein NS3 erkannt und beta-Aktin als Zellkontrolle. D) Immunfluoreszenz-Assay zur Untersuchung von Virusreplikation verwendet. Bei 96 Stunden nach der Elektroporation wurden die Zellen fixiert und imm zogenunostaining HCV-NS5A-Protein und doppelsträngiger RNA (ds RNA), einem Marker für die HCV-RNA-Replikationszwischenprodukte. Die Kerne wurden mit Hoechst-Färbung (Maßstabsbalken 50 um) visualisiert. hpt:. Stunden nach der Transfektion Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fig. 4
Abbildung 4. Untersuchung der Infektiosität von Wildtyp-HCV-und Mess Virustiter. A) Naive Huh-7.5.1-Zellen wurden zur Infektion Studien verwendet. Der zellfreie Überstand bei 48 und 96 h nach der Transfektion (hpt) von HCV-RNA wurden gesammelt, um das 10-fache Reihenverdünnung unterzogen und zu den Zellen in einer Platte mit 96 Vertiefungen in dreifacher Ausführung. 72 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen fixiert und für HCV NS5A Protein immun. Die Zellen mit NS5A positive Färbung (rot) sind mit einem Virus infiziert. Zur Beurteilung Foci Forming Unit (FFU) wurden die positive Foci bei der höchsten Verdünnung gezählt. Repräsentative Platten von Bildern gezeigt (Maßstab 100 um). B) Mittelwerte und Standardabweichungen von viralen Titer in FFU pro Milliliter sind in der Grafik dargestellt. Die Polymerase-Nullmutante nicht produzieren infektiöse Partikel. WT: Wildtyp; Pol-:. Polymerase null Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5
Abbildung 5. Auswertung der Genom-Replikation und Infektiosität von HCV-Reporter. A) Eine Karikatur intragenotype 2a Reporter chimären Virus wird vorgestellt. Die Renilla-Luciferase-Gen eingefügt Inframe zwischen 5 'NTR und Kern B). Die Genomreplikation Kinetik der Wildtyp-und Mutanten-Pol-Reporter Viren in den angegebenen Zeitpunkten nach der Transfektion wird in der Grafik dargestellt. Protein-Lysate wurden bei 6 h, 48 h und 96 h Zeitpunkte für die Messung Renilla Luciferase enzymatische Aktivität geerntet. Der Mittelwert und die Standardabweichung von Dreifach Renilla-Luciferase-Werte (RLV) für jedes Virus berechnet sind in dem Diagramm. C) Western-Blot-Panel zeigt die HCV-NS3-Protein-Expression dargestellt. Ein von NS3 primären Antikörper nachgewiesen unspezifische Antigen wirkt als Ladekontrolle. Wildtyp (WT)-Reporter-Virus produziert hohe NS3-Protein. D) Analyse der Infektiosität des Virus. Naive Huh-7.5.1-Zellen wurden mit dem zellfreien Überstand von transfizierten Kultur bei 48 h und 96 h Zeitpunkten erhalten geimpft. Wurden Renilla Luciferase-Aktivitäten von infizierten Zellen bei 48 Stunden nach der Infektion gemessen.Mittelwerte mit Standardabweichung werden in dem Diagramm gezeigt. Die Pol-Reporter-Virus infizierten Zellen hatten nur Hintergrundniveau der Luciferase-Aktivität, während WT-Reporter-Virus zeigte hohe Infektiosität.

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Discussion

Diese Darstellung beschreibt ein Verfahren zum Analysieren des Hepatitis-C-Virus-Replikationszyklus. HCV ist ein humanes Pathogen und die vorgeschriebene Biosafety-Protokoll müssen strikt eingehalten werden. Infektiöse HCV-Zellkultursysteme wurden zuvor 11-13,16,17 beschrieben. Es gibt nur wenige wichtige Punkte zu implementieren, wenn wir nach dem Protokoll dargestellt. Erstens, von hoher Bedeutung ist es, gute Qualität von intakten voller Länge viralen genomischen RNA für nachgeschaltete Studien. Die Eingangs Plasmid, das virale cDNA zu linearisiert und sorgfältig geglättet werden. Die Mungobohnen-Nuklease verwendet, um die XbaI-Überhang stumpf ist eine nicht-spezifische Nuklease und verlängerte Inkubation führt zur Beschädigung oder Verschlechterung des 3'-Ende des viralen Genoms führt. Die Nuclease ist sofort nach der angegebenen Inkubationszeit 30 min durch Phenol-Chloroform-Extraktion oder Anionenaustausch-Säulenreinigung entfernt werden. Gel Extraktion von Nuklease behandelt DNA kann nicht empfohlen werden, da dieEnzym bei der Gelelektrophorese Prozess aktiv.

Für die anschließende in vitro RNA-Transkription Schritte, in der Regel wird man auch nehmen Breitspektrum Vorsichtsmaßnahmen zur Minimierung der Ribonuklease (RNase) Verunreinigungen. Alle Reagenzien und Materialien verwendet werden, sollten kostenlos RNase werden. Um qualitativ hochwertige genomische RNA mit Mindest RNA-Strangbrüche zu erzeugen, müssen die RNA auf weniger körperliche Belastung durch die Vermeidung von harten Wirbeln und wiederholte Pipettieren während der Reinigung und nachgelagerten Behandlungsschritten unterzogen werden. Nach Abschluss der RNA-Transkription, haben die Eingangs Plasmid-DNA-Vorlagen zur transkribierten RNA-Mix durch DNase (RNase frei) Behandlung entfernt werden. Unvollständige Entfernung kann in Übertragung von Plasmid-DNA in transfizierten Zellen führen und beeinflussen die absolute Quantifizierung der Genomkopienzahl von replizierten viralen RNA. Daher verwenden DNase-Enzym in einer Konzentration von 1 Einheit pro Mikrogramm DNA sowie mit zusätzlichen 15 min Inkubation bei 37 DNase º C kannhelfen. Die transkribierte RNA kann entweder durch Phenol-Chloroform-Extraktion oder Anionenaustauschersäule gereinigt werden. Sorgfalt sollte ausgeübt werden, um Kontamination von Phenol oder andere Reagenzien zu der gereinigten RNA-Probe, die cytotoxisch sein und stören molekularer Assays zu vermeiden.

Zur Elektroporation Zwecke weist die gereinigte RNA in RNase-freiem Wasser gelöst, steril sein. Wenn das RNA-Pellet ist schwierig zu lösen, Erhitzen der Probe auf 65 º C für 5 min wird helfen. Sobald die Transkription beendet ist, ist es wichtig, um die RNA unmittelbar in 10 ug Arbeits Aliquots in RNase-freiem Wasser bei -80 º C hergestellt speichern Der Zweck der Aliquots einer wiederholten Gefrier / Tau-vermittelten RNA-Abbau zu vermeiden. Für eine konsistente experimentellen Ergebnisse wird empfohlen, alle Proben und Kontrollen in der gleichen Zeit zu transkribieren. Hochwertige RNA wird für eine höhere Virustiter Ausbeute empfohlen. Zur Transfektion von genomischen HCV-RNA-, Polymer-und Lipidbasis Transfektionsmittel auch be 21,22 verwendet.

Virale und Wirtsfaktoren stark beeinflussen die Wachstums Kinetik der HCV-Stämmen. Menschen Hepatom-Zelllinie (Huh-7)-Derivate-7.5 Huh, Huh-7.5.1 und Huh7-Lunet Zelllinien werden in der Regel für die Bewertung virale Wachstum 11-13,15 verwendet. Der Spitzenvirusproduktion von JFH-1-Stamm in Huh7-Zellen Lunet ist bei 3-4 Tage nach der Transfektion, während in Huh-7.5.1-Zellen es auf 21 Tage nach der Transfektion 13,15 ist. Die intragenotype 2a chimären Virus FNX-HCV mit nicht-strukturellen Gene von JFH-1-Stamm hat Peak-Titer bei 4 Tage nach der Transfektion in Huh-7.5.1-Zellen 19,20. Für virale Produktion von in vitro transkribierten RNA, bevorzugt frühen Passage menschlichen Hepatom-Zelllinie. Virusproduktion wird während der Verwendung Huh-7.5.1-Zellen über Gang Nummer 20 deutlich reduziert. Um erhöhte Zelllebensfähigkeit nach der Elektroporation zu gewährleisten, aufgetaut Huh-7.5.1-Zellen einen zweiwöchigen Erholungszeit erlaubt, bevor ein Experiment und maiin 12% -15% FBS ntained. Zusammen mit diesem Kriterium Resuspension der Zellen in Wachstumsmedium, enthaltend 15% FBS unmittelbar nach der Elektroporation erhöht die Zellüberleben, die eine bessere Virusproduktion. Nach der ersten 8 Stunden Zeitpunkt werden die Zellen dann in Medium, das 10% FBS eingeschaltet. Um den Übertrag Zelltrümmer zu minimieren, wird die Viruskulturüberstand nach Zentrifugation und Filtration über 4 Mikrometer-Filter unterzogen. Die unkonzentriert oder konzentrierte Virusüberstände aliquotiert und in -80 º C für weitere in vitro-und in vivo-Experimenten. Diese Vorsichtsmaßnahmen können Forscher und Anregungen für die erfolgreiche Durchführung der Analyse der HCV-Replikationszyklus zu helfen.

Eine weitere Variante des HCV-Reporter, die ein Marker-Gen birgt wie fluoreszierende Protein und einer sezernierten Form von Gaussia-Luciferase (Gluc) für HCV Forschung 18,23,24 beschrieben. Für Forscher, die sich auf die Untersuchung HCVGenomreplikation, ist HCV-Genom-Unter Replikon (ohne die Gene Kern NS2) ein wertvolles Werkzeug 9,10. HCV-Replikons sind nicht-infektiöse, benötigen somit weniger Bio-Sicherheitsbestimmungen und einfacher, mit im Vergleich zu den Infektionszellkultur HCV und klinischen Isolaten zu arbeiten. HCV mangelhaft in NS5B Polymerase-Aktivität ist eine kritische Kontrolle für das Studium HCV-Replikationszyklus 11,12. HCV fehlen Hüllglykoproteine ​​(Delta E1E2) oder p7-NS2 Aktivität kann nützlich Steuerungen für Studien mit HCV-Eintrag, Virionmorphogenese und Ausstieg 12,19,25-27 sein.

Bezüglich Einschränkungen, die derzeit die infektiösen Zellkultursystem ist nur für HCV Genotyp 1 und 2. Authentische virale Stämme zur Genotypen 3 bis 6, die in der Lage ist in der Zellkultur noch effizienter zu wachsen, identifiziert werden. Intergenotypic rekombinanten Viren sind sinnvolle Alternativen zum Studium Replikationszyklus der verschiedenen Genotypen. Replication zuständigen chimären Virus harboring Kern NS2 Region von Genotypen 1 bis 7 und Rest der Sequenz von JFH-1 Genotyp 2a Genoms wurden beschrieben 15,18. Eine weitere Einschränkung ist, dass die Virusausbeute JFH-1 und dessen Derivat chimären Stämme im Bereich von 3. Oktober - 6. Oktober pro ml, die im Vergleich zu anderen RNA-Viren wie Polio und Influenza relativ niedrig ist. HCV-Stamm mit robustem Wachstum entwickelt werden muss. Zukünftige Untersuchung beinhaltet die Nutzung des Reporter-HCV für Hochdurchsatz-Screening-Bibliothek potente antivirale Medikamente zu identifizieren und konzentrieren sich auf die Entwicklung von Impfstoff-Kandidaten zu verhindern, dass HCV-Infektion.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Fisher Scientific 10-017-CV
Non essential amino acid Fisher Scientific MT25025CI
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red Life Technologies 11058-021
Huh-7.5.1 The Scripps Research Institute The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center
Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null)  Cedars-Sinai Medical Center The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. 
XbaI New England Biolabs Inc. R0145S
Mung Bean Nuclease New England Biolabs Inc. M0250S
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System Promega P1320
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 mm) Bioexpress E-5010-4
Gene Pulser Xcell Total System Bio-Rad 165-2660
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 Life Technologies A11008
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
PVDF membrane package Bio-Rad 162-0263
Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk Bio-Rad 170-6404XTU
Tween-20 Bio-Rad 170-6531XTU
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] Abcam ab65407
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] Abcam ab13830
Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP)  Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents  GE Healthcare Life Sciences RPN2236
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
ViiA 7 real-time PCR system Life Technologies NA
Renilla Luciferase Assay System kit Promega E2810
RNase-Free DNase Promega M6101
GloMax-Multi Detection System (Luminometer) Promega

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References

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Ren, S., Contreras, D., Arumugaswami, V. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (88), e51362, doi:10.3791/51362 (2014).

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