Abstract
丙型肝炎病毒（HCV）影响世界人口的3％，并导致严重的肝脏疾病，包括慢性肝炎，肝硬化和肝细胞癌。丙型肝炎病毒是属于黄病毒科的包膜RNA病毒。目前的治疗是不充分有效的，并导致不利的副作用。没有丙型肝炎病毒疫苗可用。因此，需要开发一种疫苗和更好的治疗持续的努力。的HCV细胞培养体系是研究HCV生长的不同阶段，包括病毒进入，基因组复制，包装和出口的关键。在当前的程序提出，我们用野生型intragenotype 2a中的嵌合病毒，FNX-HCV和重组FNX-的Rluc病毒携带的Renilla荧光素酶报道基因来研究病毒的复制。一个人肝癌细胞株（Huh-7型）用于体外转录转染丙型肝炎病毒基因组RNA的。无细胞培养物上清液，蛋白裂解液和叔OTAL核糖核酸收获的不同时间点转染后，以评估HCV生长。丙型肝炎病毒基因组的复制状态是由定量RT-PCR和可视化HCV的存在双链RNA进行评估。丙型肝炎病毒蛋白的表达，用特异性HCV NS3和NS5A蛋白的抗体，Western blot和免疫荧光试验验证。感染性颗粒释放到培养上清液中和病毒滴度的HCV RNA转染的细胞进行测定。荧光素酶检测被用于评估记者丙型肝炎病毒的复制水平和传染性。总之，我们提出的各种病毒学检测表征丙型肝炎病毒复制周期的不同阶段。
Introduction
丙型肝炎病毒（HCV）导致肝硬化和肝癌。它影响1.7亿人在全球拥有35万人，每年死于1-3。 HCV是正链RNA病毒为9.6 kb的基因组大小。 HCV基因组被翻译成的〜3000氨基酸残基被蛋白水解由各种细胞和病毒蛋白酶裂解成10多肽的单个蛋白。 HCV是原型病毒属中的肝炎病毒，属于黄病毒科 4。曝光后，建立了丙型肝炎病毒慢性感染者中80％的个体。这种感染大多是无症状的，及时的诊断可以允许治疗性干预，以防止肝恶化。目前的治疗是不理想的，没有疫苗可用5,6。
丙型肝炎的病因在1989年7年首次描述。学习丙型肝炎病毒复制是丙型肝炎的疫苗和治疗研究的重要，但它一直由缺少一种有效的病毒培养体系的长期阻碍。丙型肝炎病毒的分子克隆被证明是在感染后肝内接种8只黑猩猩。随后，HCV亚基因组复制子进行了说明，其中允许解剖病毒基因组的复制阶段中的细胞培养系统9,10。一个基因型2a丙型肝炎病毒的发现隔离JFH-1（日本暴发性肝炎-1），能够感染细胞培养中打开丙型肝炎病毒复制的研究11-13新途径。基因型2a株JFH-1基于跨内和基因型嵌合病毒基因型1丙型肝炎病毒感染的基础培养体系可作为以及14-18。
我们已成功地使用JFH-1株和HCV intragenotype 2a中的嵌合病毒，得到蛋白质结构域和顺式作用RNA元件19,20的高分辨率官能剖析图。根据这一点，我们在这里描述的有效培养系统经常使用的，允许研究HCV复制周期和宿主 - 病原体相互作用的不同阶段。我们目前的病毒学检测，以评估病毒基因组的复制和intragenotype 2A丙型肝炎病毒和海肾萤光素酶报告基于 丙型肝炎病毒新发感染。
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Protocol
该协议的一个大致轮廓示于图1。
1。细胞
- 制备包含10〜15％的胎牛血清（FBS），10mM的非必需氨基酸，10mM的HEPES，青霉素（100单位/ ml），链霉素（100毫克/毫升），和2mM L-谷氨酰胺的完全生长培养基。
- 在包含用于体外分析丙型肝炎病毒复制周期的上述补充完全生长培养基维持咦-7.5.1细胞13。
- 培养的病毒株在Huh-7.5.1细胞用指定的补充生长培养基，在37℃，5％的CO 2。
2，病毒和质粒构建
- 产生的互补DNA（cDNA）形式的HCV RNA，并克隆至为便于基因操作的质粒载体。注：日本的暴发性肝炎1的发现，JFH-1（基因型2a丙型肝炎病毒），隔离一直为HCV研究的关键，并且是主要用于研究丙型肝炎病毒复制周期11-13。根据JFH-1 HCV间和intragenotypic嵌合病毒常用于研究14-18。合成intragenotype 2A嵌合病毒，FNX-HCV，和一个单顺反子嵌合记者株的构建先前19和施工细节超出了本协议的范围被描述。
- 使用pFNX - HCV intragenotype 2a中的病毒，因为它包含一个5'NTR，结构区和P7和NS2的非结构区的一部分（核苷酸1到2878）的J6CF亲本菌株（NCBI登录号AF177036）的，如以及JFH-1病毒株（NCBI登录号AB047639）的非结构部件。注：合成FNX-HCV的基础上，JC1 intragenotype 2A嵌合HCV以前的序列15日报道。
- 产生单顺反子的嵌合记者病毒构建体中，pFNX-的Rluc的基础上，pFNX-HCV株（以上步骤2.2）通过插入A R5'NTR和核心基因（新台币之间的388和389）之间enilla荧光素酶基因。接着，用口蹄疫病毒2A（F2A）的肽序列，这将作为一个卵裂信号连接的荧光素酶基因和该构建体的核心基因。
- 工程师RNA聚合酶空（POL-）病毒构建使用无论是pFNX-HCV或pFNX，在Rluc病毒的背景。更换NS5B聚合酶催化残基，GDD（AA 2759年至2761年; nt的8615-8623）任一这些病毒骨架与AAG氨基酸残基的。
3， 在体外 HCV RNA转录
- 使用intragenotype 2A嵌合病毒FNX-HCV和FNX-HCV聚合酶空（POL-）对丙型肝炎病毒复制（ 图2A）的评价。
- 线性化病毒质粒用XbaI限制性内切酶，然后用绿豆核酸酶，产生平末端处理。通过阴离子交换层析纯化经消化的质粒。验证完整性Øf通过对DNA的琼脂糖凝胶电泳（ 图2B）的线性化的质粒。
- 用T7-RNA聚合酶转录的线性化病毒质粒。
- 净化使用RNA纯化试剂盒新合成的DNA酶处理的RNA。
- 通过琼脂糖凝胶电泳（ 图2C）验证RNA的生产。
- 用分光光度法定量的RNA。
- 存储所生成的RNA在-80℃下在10微克工作等分试样。注意：要通过转录RNA的一切对每个病毒样本和控制，同时每个实验的设计中尽量减少RNA质量的变化。
4，丙型肝炎病毒RNA的转染和样品采集
- 使用胰蛋白酶收获的Huh-7.5.1细胞。
- 冲洗细胞，离心并用冷低血清培养基悬浮两次暂停。重悬的细胞在低血清培养基中以每毫升1×10 7个细胞。
- 混合总共10＆＃956;克的转录病毒RNA在一个0.4厘米电穿孔杯中加入400μl重悬的细胞（4×10 6个细胞）。通过电穿孔在270 V转染的细胞中，100Ω和950μF。
- 重悬的电穿孔的细胞在10ml完全生长培养基含15％FBS中。注：电穿孔的细胞的生存力增加被认为是当的Huh-7.5.1细胞在15％胎牛血清中培养。
- 镀在两个T-25培养瓶中（〜1.2×10 6每烧瓶中的细胞）和48孔板（1×10 4个，每孔细胞）为下列每个时间点的细胞：4，48和96小时。
- 有10％FBS更换介质在4-8小时转染后用新鲜补充的生长介质，以从培养瓶和板去除死细胞碎片。
- 收获细胞培养物上清液在48中，96小时的时间点，并从采集的样品通过细胞离心4去除细胞碎片在1,500 rpm离心10分钟 ºC。
- 存储该无细胞上清液于-80℃。裂解细胞用于蛋白和RNA的分析用Western印迹和逆转录 - 定量聚合酶链反应在指定的时间点。
5，反转录定量PCR（RT-qPCR的），以评估丙型肝炎病毒基因组复制
- 执行两步RT-qPCR的确定HCV基因组RNA的拷贝数。
- 反转录1使用逆转录酶和其结合5'NTR（JFH RTQ注：5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'）具体为HCV义链的引物细胞总RNA微克或特异于持家基因肽基异构酶G（PPIG R A引物：5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3'）。还逆转录使用HCV义链引物的已知基因组拷贝（10月1日至十月九日标准）的FNX-HCV RNA（在步骤3中生成的）。
- 开展定量PCR用50纳克导致转录的cDNA用HCV特异性引物（JFH RTQF：5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ记：5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'）和DNA结合含有定量PCR超级混合绿色染料。进行定量PCR的看家基因PPIG以及（PPIG引物F：5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3'; PPIG R：5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3'）注：为了计算准确的细胞内HCV RNA水平跨越样品，用细胞看家基因，PPIG ，表达水平扫描（CT周期）进行归一化。使用FNX-HCV基因组的拷贝数作为拷贝数测定标准。
- 使用以下条件时，运行定量PCR来确定HCV RNA拷贝数：95ºC为15秒和60 ºC为30秒（40个循环），使用实时PCR系统。
- 参见图3A和图3B为基因组复制的结果。
6，Western印迹分析检测的HCV蛋白的表达（图3C）
- 用细胞裂解液FROM病毒RNA转染96小时后转染蛋白免疫印迹分析。
- 使用SDS-PAGE，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，解决了细胞裂解物。
- 用含5％脱脂乳，0.2％吐温20的磷酸盐缓冲盐水（PBS）封闭液阻断膜。
- 孵育膜与初级小鼠单克隆抗体NS3（1千稀释）和β-肌动蛋白（1 5000稀释）。
- 添加山羊抗小鼠IgG缀合至辣根过氧化物酶（1 5000稀释）和通过化学发光检测。
7，免疫荧光法（IFA）
- 用甲醇30分钟-20ºC的免疫荧光法修复HCV感染和转染的细胞。
- 用PBS洗细胞3次，用IFA阻断缓冲液阻断。
- 用兔多克隆抗NS5A主要抗体或鼠单克隆抗-DSR（由达斯古普塔博士，加州大学洛杉矶分校友情提供）NA抗体J2的稀释度为1:200（1微克/毫升）并孵育5小时至过夜，4 ºC。
- 初级抗体后，3次，用PBS洗涤细胞。
- 添加山羊抗兔IgG-488多克隆第二抗体或山羊抗小鼠IgG-594多克隆第二抗体以1:1000的稀释度（1微克/毫升），并孵育1小时，在室温下进行。
- 用PBS使用荧光显微镜（ 图3D）应用Hoechst染料和视图3倍和染色细胞核洗细胞。
8，测量病毒滴度
- 板幼稚的Huh-7.5.1细胞以约3×10 3个细胞/井使用一个96孔板中。第二天，进行无细胞培养上清液中使用的生长培养基的HCV RNA转染的细胞中收获的10倍系列稀释液，并一式三份接种到的Huh-7.5.1细胞。
- 用甲醇（30分钟，在-20℃固定细胞72小时后的感染
- 使用的最高稀释度来计算的NS5A阳性病灶和每毫升计算焦点形成单元的平均数目（FFU）。参见图4为HCV滴度。
9。 海肾萤光素酶报告基因检测为病毒基因组复制和传染性
- 用于评价病毒基因组的复制，板的HCV RNA电穿孔的Huh-7.5.1细胞一式三份在48孔板（1×10 4个细胞/孔）。
- 裂解的细胞与75微升被动裂解缓冲液中在6小时，48小时和96小时后转染。
- 摇动板轻轻地为15分钟，在室温下储存于-80℃。
- 来测量海肾荧光素酶活性，解冻的蛋白质裂解物和海肾萤光素酶测定试剂至室温。
- 加入20微升每孔蛋白裂解液96-WEL的 L白色发光板并将板光度计。
- 分配100μl的海肾荧光素酶测定试剂（腔肠素底物+缓冲液中），每孔并经过2秒预读取的延迟;结合所发出的光10秒。
- 从一式三份生物的萤光素酶值计算出平均值和标准偏差对每个样品和经受的数据进行统计分析（ 图5）。
- 用于评估感染性，接种500微升无细胞上清液从HCV RNA转染的细胞在指定的时间点（48小时和96小时），一式三份在48孔板中获得到幼稚的Huh-7.5.1细胞。
- 用500μl新鲜培养基后，每井6小时后更换感染病毒接种。
- 溶胞物与步骤8.2至8.7（ 图5）中所述的细胞在48小时后的感染和受海肾萤光素酶测定。
- 在该图中的误差棒表示标准偏差（SD）。对P值的计算采用非配对t检验。
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Representative Results
丙型肝炎病毒是一种RNA病毒。因此，对于遗传操作的目的，所述HCV基因组cDNA已被克隆到细菌质粒载体。甲T7 RNA聚合酶启动子序列立即被引入HCV基因组的5'末端之前。 HCV的分析工作流程的一般概述示于图1，生成HCV基因组RNA具有精确的3'末端含有质粒HCV基因组被切割用 XbaⅠ限制性内切酶和所产生的单链突出端补平用绿豆核酸酶消化。线性化的质粒的HCV的质量通过琼脂糖凝胶电泳（ 图2B）进行评估。中的HCV DNA进行T7 RNA聚合酶体外转录介导，将所得的RNA在9.6千碱基（ 图2C），得到一个单一的产品。
我们测试的intragenotype 2A丙型肝炎病毒（ 图中的生长动力学60，3）。本的Huh-7.5.1细胞用体外转录的野生型（WT）和聚合酶空病毒的RNA。我们通过RT-qPCR的评估病毒检测基因组的复制。结果表明，野生型病毒复制的基因组中有效（ 图3A和3B）。野生型表现出基因组复制一到三个日志更高的水平相比，波尔病毒的。对WT病毒产生的NS3蛋白（ 图3C）是参与病毒蛋白裂解（蛋白酶活性）表示，和基因组的复制（解旋酶活性）。还对WT病毒表达的NS5A蛋白的评估，免疫荧光测定法（ 图3D）。 NS5A蛋白是HCV RNA复制酶复合物的一部分。以可视化病毒基因组的复制，我们使用抗体特异性识别双链RNA检测的双链（DS）的HCV RNA的存在。在HCV基因组扩增，正义链RNA为copied到反义基因组，从而所述双链RNA中间体是存在于被感染细胞的细胞质。 NS5A蛋白和dsRNA的共定位在WT转染的细胞表明活性病毒复制的细 胞的细胞质中（ 图3D）。综合来看，WT病毒建立活跃复制的转染的Huh-7.5.1细胞。
在HCV的研究进展已经由于缺乏感染性细胞培养系统的限制。的JFH-1株的HCV和允许我们探讨整个HCV复制周期中的细胞培养，包括病毒进入，RNA翻译，RNA的复制和传染性病毒的子代的形成嵌合实验室菌株随后表征的发现。为了评估HCV滴度和从头传染性，我们从接种丙型肝炎病毒RNA转染的细胞收获的细胞培养上清液。丙型肝炎病毒感染是可视化通过检测HCV NS5A蛋白和计算病毒滴度通过计数在感染病灶（ 图4）。我们认为细胞的分离集群（超过2细胞）阳性NS5A作为一个单一的焦点。结果表明，野生型病毒是感染性和生产超过10 4灶形成感染性颗粒的单位/ ml。
我们还建立了丙型肝炎病毒的记者窝藏海肾萤光素酶（在Rluc）报告基因（ 图5A）。有记者丙型肝炎病毒可用于测试大量的突变病毒，以及针对高内涵筛选分析。在这里，我们提出的WT和波尔，记者病毒的生长表型的评估。如果病毒基因组复制，荧光素酶活性将增加加班后转染。增加基因组的复制水平，可以推断，从增加的萤光素酶活性。因此，荧光素酶活性间接提供了基因组复制水平的测量。从WT或波尔-VI收获裂解液拉尔的RNA转染的细胞在指定的时间点进行了测试萤光素酶活性。在6小时转染后，WT和波尔-病毒具有相似的荧光素酶活性，表明已翻译（ 图5B）转染RNA的类似的输入电平。然而，在48小时和96小时转染后，在野生型病毒表现出较波尔病毒的增加的基因组的复制水平。此外，野生病毒产生病毒NS3蛋白作为验证通过Western印迹分析（ 图5C）。随后，我们通过接种幼稚的Huh-7.5.1细胞从48小时和96小时后转染的细胞培养物中收集无细胞的上清液测试WT和波尔 - 报道的病毒的感染性。在波尔病毒有基层荧光素酶活性，而野生病毒有2-3日志更高层次的复制到波尔-记者病毒（ 图5D）的。结果表明，我们有一个强大的丙型肝炎病毒感染的细胞丘尔重新系统。
图1：丙型肝炎病毒复制的分析工作流程大致轮廓。线性化含有T7 RNA聚合酶启动子（T7P）进行体外转录丙型肝炎病毒质粒构建。纯化的HCV RNA基因组被电穿孔入的Huh-7.5.1细胞并接种于培养瓶和48孔培养板。在4小时，48小时，和96小时转染后，细胞RNA和培养物上清液从培养瓶中收获。从48孔板中的细胞被用于收获蛋白质裂解物和固定用于免疫荧光测定法。通过RT-qPCR的基因组拷贝数分析，Western印迹法，测定病毒滴度完成评估HCV的复制。
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图2。生产的丙型肝炎病毒基因组RNA的体外转录构建质粒DNA。的J6CF/JFH-1 intragenotype 2A嵌合病毒，FNX-HCV和FNX-HCV聚合酶空A）基因组的组织。 J6CF株的区域（5'NTR至NS2的一部分）以深灰色和JFH-1株的区域（NS2到3'NTR的一部分）所示的被显示为浅灰色。 NS5B聚合酶催化结构域突变（GDD为AAG）是用星号表示。 二）参与生成线性丙型肝炎病毒质粒的步骤。凝胶图为线性化，钝端的质粒由XbaⅠ和绿豆核酸酶消化产生的DNA，准备用于体外转录。 0.8％的琼脂糖凝胶进行用于解析该DNA。℃）凝胶图像描绘用T7 RNA聚合酶系统通过体外转录产生的HCV基因组的RNA。 WT：野生型;波尔 - 聚合酶空; M：标记。
图3。评估HCV构建体的生长表型。 A）评估野生型（WT）和聚合酶空（POL-）病毒的基因组复制动力学。之义RNA链通过RT-qPCR的评估基因组拷贝数都在条形图。波尔病毒的病毒基因组拷贝下降了一段时间内，指示复制缺陷型B）的野生型HCV相对基因组的复制水平相比，波尔病毒丙型肝炎病毒蛋白的表达。 三）Western blot分析的。 HCV NS3蛋白检测和β-肌动蛋白被用作便携式控制D）为调查病毒复制的免疫荧光测定法。在96小时后的电穿孔的细胞固定并进行IMMunostaining对HCV NS5A蛋白和双链RNA（DS RNA），一个标记为HCV RNA复制中间体。的细胞核可视化用Hoechst染色（比例尺为50μm）。 HPT：小时转染后请点击这里查看该图的放大版本。
图4。审查的野生型HCV的感染性和测量病毒滴度。 A）朴素的Huh-7.5.1细胞用于感染的研究。在48和96小时后转染HCV RNA的酶（hpt），收集无细胞的上清液进行10倍连续稀释，并加入到细胞中，在96孔板中一式三份。 72小时感染后，将细胞固定，并进行免疫染色对HCV NS5A蛋白。细胞与NS5A阳性染色（红色）用病毒感染。用于评估疫源地形成单位（FFU），在最高稀释度的阳性病灶进行计数。图像的代表面板显示（比例尺为100μm）。B）的平均值和病毒滴度的标准偏差在每毫升FFU示于图中。聚合酶无效突变体没有产生感染颗粒。 WT：野生型; POL-：聚合酶空请点击此处查看该图的放大版本。
图5。评价基因组的复制和报道的HCV的感染性。 A）intragenotype 2A嵌合记者病毒的卡通呈现。 海肾荧光素酶基因是插入infram5'NTR和核心B）野生型和聚合酶突变记者病毒在指示的时间的基因组的复制动力学指向转染后之间e的曲线图所示。蛋白裂解物收获的6小时，48小时和96，用于测量海肾荧光素酶的活性小时的时间点。均值和一式三份海肾萤光素酶值（RLV），每种病毒计算的标准偏差都在图中C）的 Western印迹面板显示HCV NS3蛋白的表达。由NS3主要抗体检测的非特异性抗原作为内参。野生型（WT）记者病毒产生NS3蛋白的高水平D）病毒的感染性分析。幼稚的Huh-7.5.1细胞接种与从转染的培养在48小时和96小时的时间点得到的无细胞的上清液。感染细胞的海肾荧光素酶活性测定在48小时后的感染。与标准偏差的平均值示于图中。在波尔 - 记者病毒感染的细胞具有荧光素酶活性只有背景水平，而WT记者病毒感染表现出高水平。
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Discussion
此图描述了用于分析丙型肝炎病毒复制循环的方法。丙型肝炎病毒是一种人类病原体和规定的生物安全议定书将必须严格遵守。感染性HCV细胞培养系统之前已经11-13,16,17说明。有下列图示的协议，当我们实现几个关键点。首先，它是非常重要，以有完整的全长病毒基因组RNA质量好于下游的研究。输入质粒携带的病毒cDNA要进行线性化处理，并仔细减弱。的绿豆核酸酶来生硬的Xba I位悬是一种非特异性核酸酶和延长温育将导致病毒基因组的3'末端的损坏或退化。核酸酶已被指定的温育30分钟以酚 - 氯仿提取或阴离子交换柱纯化后，立即取出。凝胶提取核酸酶处理的DNA可能不会被推荐为酶是活跃在电泳过程。
体外转录RNA的后续步骤，一般，一会还采取广谱的预防措施，尽量减少核糖核酸酶（RNA酶）的污染。所有使用的试剂和材料应无RNA酶的。为了生成高质量的基因组RNA具有最小的RNA链的断裂，该RNA必须通过避免纯化和下游处理步骤中苛刻的涡流和反复移液经受更少的物理应力。 RNA转录完成后，将输入的质粒DNA模板具有从转录的RNA的混合通过DNA酶（RNA酶）处理，以除去。完全去除可能导致质粒DNA的遗留到转染细胞，影响的复制病毒RNA基因组的绝对拷贝数的定量分析。因此，使用DNA酶酶在DNA每微克1单元也具有37的DNase孵育额外15分钟的浓度 ºC可帮助。转录的RNA可以通过苯酚 - 氯仿萃取或离子交换柱进行纯化。应当谨慎行事，以避免酚或其他试剂的残留，以纯化的RNA样品，可以是细胞毒性和干扰分子检测。
用于电穿孔的目的，将纯化的RNA具有溶解在无RNase的灭菌水。如果RNA沉淀难以溶解，将样品加热到65°C下5分钟会有所帮助。一旦转录完成后，在10微克于-80℃。制造的无RNA酶的水分装在紧接存储核糖核酸是很重要将等份的目的是为了防止重复的冷冻/解冻介导的RNA的降解。对于一致的实验结果，建议抄写在同一时间，所有样品和对照。高品质的RNA被推荐为一个较高的病毒滴度产量。用于转染HCV基因组RNA，聚合物和基于脂质的转染试剂可以是be一起使用的21,22。
病毒和宿主因素极大地影响丙型肝炎病毒菌株的生长动力学。人肝癌细胞株（Huh-7）衍生物的Huh-7.5，的Huh-7.5.1和的Huh7-Lunet细胞系通常用于评价病毒生长11-13,15。峰病毒生产的JFH-1株中的Huh7-Lunet细胞是在3-4天转染后，而在Huh-7.5.1细胞是第21天转染后13,15。该intragenotype 2a中嵌合病毒FNX - HCV具有非结构基因由JFH-1株具有峰值滴度，以4天转染后在Huh-7.5.1细胞19,20。对于病毒生产的体外转录RNA，早日通过人肝癌细胞系是首选。病毒性生产而使用的Huh-7.5.1细胞在传代次数的20显著减少。为了确保电后增加细胞的生存能力，解冻的Huh-7.5.1细胞被允许了两个星期的恢复时间进行实验和迈前ntained在12％-15％FBS。随着该标准，含有15％FBS的电穿孔后，立即将细胞在生长培养基中重悬增加细胞存活允许更好的病毒生产。第8小时的时间点后，该细胞，然后切换到含10％FBS的介质。为了尽量减少结转细胞碎片，病毒培养物上清液通过4微米的过滤器进行离心和过滤。未浓缩或浓缩的病毒上清液等分并储存在-80 ºC为进一步在体外和体内实验。这些预防措施和建议，可以帮助研究人员成功地进行丙肝病毒的复制周期的分析。
记者HCV的另一个变化是怀有的标记基因如荧光蛋白和Gaussia萤光素酶（GLUC）的分泌形式被描述为HCV研究18,23,24。研究人员重点研究丙型肝炎病毒基因组的复制，HCV亚基因组复制子（缺乏核心基因和NS2）是一个有价值的工具9,10。丙型肝炎病毒复制子的非感染性，因此需要较少的生物安全法规，更容易与相比，感染细胞培养及丙型肝炎病毒临床分离工作。丙型肝炎病毒缺乏NS5B聚合酶的活性是一个关键控制为研究丙型肝炎病毒复制周期11,12。丙型肝炎病毒缺乏包膜糖蛋白（三角洲E1E2），或P7-NS2的活动可以是有用的控件涉及HCV进入，病毒粒子形态和出口12,19,25-27研究。
至于限制，目前的感染细胞培养系统仅用于HCV基因型1和2提供正宗病毒株属于基因型3〜6，有能力在细胞培养高效成长仍有待确定的。 Intergenotypic重组病毒是研究不同基因型的复制周期有用的替代品。复制能力的嵌合病毒harbori纳克核心NS2区从基因型1到7和JFH-1基因型2a基因组中的序列的其余部分被描述15,18。另一个限制是，病毒产量JFH-1和它的衍生物的嵌合菌株是在3月 10日至6月十日每毫升，相比于其他的RNA病毒，如脊髓灰质炎和流感这是相对低的范围内。丙型肝炎病毒株生长健壮有待开发。将来的调查包括使用记者丙型肝炎病毒的高通量文库筛选，以确定有效的抗病毒药物，并专注于开发候选疫苗用于预防HCV感染。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Non essential amino acid | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red | Life Technologies | 11058-021 | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center | |
| Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) | Cedars-Sinai Medical Center | The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. | |
| XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145S | |
| Mung Bean Nuclease | New England Biolabs Inc. | M0250S | |
| T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Electroporation Cuvette (4 mm) | Bioexpress | E-5010-4 | |
| Gene Pulser Xcell Total System | Bio-Rad | 165-2660 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| PVDF membrane package | Bio-Rad | 162-0263 | |
| Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531XTU | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] | Abcam | ab65407 | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] | Abcam | ab13830 | |
| Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents | GE Healthcare Life Sciences | RPN2236 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| ViiA 7 real-time PCR system | Life Technologies | NA | |
| Renilla Luciferase Assay System kit | Promega | E2810 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| GloMax-Multi Detection System (Luminometer) | Promega |
References
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