Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En protokol til at analysere Hepatitis C virus Replication

Published: June 26, 2014 doi: 10.3791/51362
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Liver Program at Regenerative Medicine Institute, Department of Biomedical Sciences, Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA
* These authors contributed equally

Abstract

Hepatitis C virus (HCV) påvirker 3% af verdens befolkning og forårsager alvorlige leversygdomme, herunder kronisk hepatitis, cirrhose og hepatocellulært carcinom. HCV er en kappebærende RNA-virus, der tilhører familien Flaviviridae. Nuværende behandling ikke er fuldt effektiv og forårsager bivirkninger. Der er ingen HCV-vaccine til rådighed. Således vedvarende indsats er påkrævet for at udvikle en vaccine og bedre behandling. En HCV cellekultur-system er afgørende for at studere forskellige stadier af HCV vækst, herunder viral indgang, genomreplikation, emballering og påstigning. I den nuværende fremgangsmåde fremlagt, vi anvendte en vildtype intragenotype 2a kimære virus, FNX-HCV og en rekombinant FNX-Rluc virus bærer et Renilla-luciferase-reportergen for at undersøge virusreplikation. En human hepatomacellelinie (Huh-7-baseret) blev anvendt til transfektion af in vitro-transkriberet HCV genomiske RNA'er. Cellefrie kultursupernatanter, proteinlysater og total RNA blev høstet på forskellige tidspunkter efter transfektion til at vurdere HCV-vækst. HCV-genomet replikation status blev vurderet ved kvantitativ RT-PCR og visualisere tilstedeværelsen af ​​HCV dobbeltstrenget RNA. HCV protein udtryk blev bekræftet ved Western blot og immunofluorescensassays anvender antistoffer specifikke for HCV NS3 og NS5A proteiner. HCV-RNA-transficerede celler frigivet infektiøse partikler i dyrkningssupernatanten, og den virale titer blev målt. Luciferaseassays blev benyttet til at vurdere replikation niveau og infektivitet af reporter HCV. Afslutningsvis præsenterer vi forskellige virologiske analyser til karakterisering af forskellige stadier af HCV-replikation cyklus.

Introduction

Hepatitis C virus (HCV) forårsager skrumpelever og leverkræft. Det påvirker 170 millioner mennesker på verdensplan med 350.000 mennesker dør hvert år 1-3. HCV er et positiv-strenget RNA-virus med et genom størrelse på 9,6 kb. HCV-genomet er oversat som en enkelt polyprotein på ~ 3.000 aminosyrerester, proteolytisk spaltes af forskellige cellulære og virale proteaser i 10 polypeptider. HCV er prototypen virus i slægten Hepacivirus og tilhører familien Flaviviridae 4. Ved eksponering HCV etablerer kronisk infektion i 80% af individerne. Infektionen er oftest asymptomatisk og rettidig diagnose kan tillade terapeutisk intervention for at forhindre leveren forringelse. Nuværende behandling er suboptimal og ingen vaccine er tilgængelig 5,6.

Ætiologien af hepatitis C blev først beskrevet i 1989 7.. Studere HCV-replikation er vigtigt for hepatitis C-vaccine og behandling forskning, men det havde væretlænge hæmmet af manglen på en effektiv viral kultur system. En molekylær klon af HCV blev vist at være smitsomme i chimpanser upon intrahepatisk podning 8. Efterfølgende blev HCV Subgenomiske replikoner beskrevet som tillod at dissekere det virale genom replikation fase i et cellekultursystem 9,10. Opdagelsen af en genotype 2a HCV isolere JFH-1 (japansk Fulminant hepatitis-1), er i stand til at inficere cellekultur åbnet nye muligheder for HCV-replikation forskning 11-13. Genotype 2a stamme JFH-1 baseret inter-og intra-genotypiske kimære virus og genotype 1 HCV baserede smitsomme kultur systemer er tilgængelige samt 14-18.

Vi har med succes brugt JFH-1 stamme og HCV intragenotype 2a kimære virus at opnå høj opløsning funktionelle profilering kort af protein domæner og cis-virkende RNA elementer 19,20. Ifølge dette, her beskriver vi en effektiv dyrkningssystem rutinemæssigt anvendes, der tilladerstudere forskellige stadier af HCV replikationscyklussen og vært-patogen interaktion. Vi præsenterer virologiske assays for at vurdere viral genom replikation og de ​​novo-infektivitet intragenotype 2a HCV og en Renilla luciferase baseret reporter HCV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En generel beskrivelse af protokollen er illustreret i figur 1..

1. Celler

  1. Forbered komplet vækstmedium, der indeholder 10-15% føtalt bovint serum (FBS), 10 mM ikke-essentielle aminosyrer, 10 mM Hepes, penicillin (100 enheder / ml), streptomycin (100 mg / ml) og 2 mM L-glutamin.
  2. Vedligehold Huh-7.5.1 celler 13 i komplette vækst medier indeholder de ovennævnte tillæg for in vitro-analyse af hepatitis C virus replikation cyklus.
  3. Kultur virusstammer i Huh-7.5.1-celler med det specificerede suppleret vækstmedier ved 37 ° C med 5% CO2.

2.. Virus og plasmidkonstruktioner

  1. Generere den komplementære DNA (cDNA)-formen af ​​HCV-RNA og klone det i en plasmidvektor til at lette genetisk manipulation. Bemærk: Opdagelsen af ​​den japanske fulminant hepatitis 1, JFH-1 (genotype 2a HCV) isolere har været kritisk for HCV forskning og erprimært anvendes til at studere HCV-replikationscyklus 11-13. Inter-og intragenotypic kimære vira baseret på JFH-1 HCV er almindeligt anvendt i forskning 14-18. Opførelse af syntetisk intragenotype 2a kimære virus, FNX-HCV og en monocistronisk kimære reporter stamme blev beskrevet tidligere 19 og konstruktionsdetaljer er uden for rammerne af denne protokol.
  2. Brug pFNX-HCV intragenotype 2a virus, da det indeholder en 5'NTR, strukturelle regioner og P7 og en del af NS2 ikke-strukturelle regioner (nukleotider 1-2878) i J6CF forældrenes stamme (NCBI tiltrædelse no. AF177036), som samt de ikke-strukturelle komponenter af JFH-1-virus-stamme (NCBI accession no. AB047639). Bemærk: FNX-HCV blev syntetiseret baseret på sekvensen af JC1 intragenotype 2a kimære HCV tidligere rapporterede 15.
  3. Generere en monocistronisk kimært reporter viral konstruktion medfører, pFNX-Rluc baseret på pFNX-HCV-stamme (ovenfor i trin 2.2) ved at indsætte et Renilla luciferasegenet mellem 5'-NTR og kerne-genet (mellem nt 388 og 389). Efterfølgende tilslutte luciferasegen og kerne gen af ​​denne konstruktion ved hjælp af en mund-og klovsyge-virus 2A (F2A) peptidsekvens, der ville arbejde som en kavalergang signal.
  4. Ingeniør RNA polymerase-nul (Pol) viral konstruktion ved hjælp af enten pFNX-HCV eller pFNX-Rluc viral baggrund. Udskift NS5B polymerase katalytiske rester, GDD (aa 2759-2761, nt 8615-8623), af en af ​​disse virale backbones med AAG aminosyrerester.

3. In vitro HCV-RNA Transskription

  1. Brug en intragenotype 2a kimære virus FNX-HCV og FNX-HCV Pol null (Pol) HCV til evaluering af viral replikation (figur 2A).
  2. Linearisere de virale plasmider med Xbal-restriktionsenzym og derefter behandle med mungbønnenuklease til dannelse af stumpe ender. Renses de spaltede plasmider ved anionbytningskromatografi. Verificere integritet of det lineariserede plasmid ved at underkaste DNA agarosegelelektroforese (figur 2B).
  3. Transskribere lineariserede virale plasmider anvendelse af T7-RNA-polymerase.
  4. Renses nysyntetiserede DNase-behandlet RNA under anvendelse af et RNA-oprensningskit.
  5. Kontroller RNA produktion ved agarosegelelektroforese (figur 2C).
  6. Kvantificere RNA ved spektrofotometri.
  7. Opbevar genererede RNA i -80 ° C i 10 ug arbejder alikvoter. Bemærk: For at minimere variation af RNA kvalitet inden for de enkelte eksperimentelle design ved at transskribere alle RNA til hver viral prøve og kontrol på samme tid.

4.. HCV-RNA Transfektion og Prøvetagning

  1. Høste Huh-7.5.1-celler ved hjælp af trypsin.
  2. At skylle celler, centrifuge og resuspender suspension to gange med koldt lavt serum medier. Resuspender celler i lavt serum medier på 1 x 10 7 celler pr ml.
  3. Bland alt 10 & #956 g af transkriberet virus-RNA med 400 pi af resuspenderede celler (4 x 10 6 celler) i en 0,4 cm elektroporeringskuvette. Transficere celler via elektroporering ved 270 V, 100 Ω, og 950 uF.
  4. Gensuspendér elektroporerede celler i 10 ml komplet vækst medier med 15% FBS. Bemærk: Øget overlevelsesevne elektroporerede celler ses, når Huh-7.5.1-celler blev dyrket i 15% føtalt bovint serum.
  5. Plate cellerne i både T-25-kolber (~ 1,2 x 10 6 celler pr kolbe) og plader med 48 brønde (1 x 10 4 celler per brønd) for hvert af de følgende tidspunkter: 4, 48 og 96 timer.
  6. Udskift medierne på 4-8 timer efter transfektion med frisk suppleret vækstmedium med 10% FBS for at fjerne døde cellerester fra de dyrkede kolber og plader.
  7. Harvest cellekultursupernatanter ved 48, 96 hr tidspunkter og fjerne celleaffald fra indsamlede prøver ved centrifugering af cellerne ved 1.500 rpm i 10 min ved 4 º C.
  8. Opbevar cellefrie supernatanter ved -80 ° C. Lyserer cellerne for protein-og RNA-analyse ved Western blot og revers transkription-kvantitativ PCR ved de angivne tidspunkter.

5.. Omvendt transkription-kvantitativ PCR (RT-qPCR) at vurdere HCV Genome Kopier

  1. Udfør en totrins-RT-qPCR at bestemme HCV-genomiske RNA kopiantal.
  2. Reverse transskribere 1 ug totalt cellulært RNA under anvendelse af revers transkriptase og en primer specifik for HCV sense streng, der binder til 5'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') eller en primer specifik for husholdning gen peptidylprolyl-isomerase G (PPIG R : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '). Også omvendt transskribere FNX-HCV-RNA (genereret i trin 3), i kendte genom kopier (januar 10-SEPTEMBER 10 standard) ved hjælp af HCV-sense-streng primer.
  3. Udføre qPCR ved hjælp af 50 ng af den resulterende transskriberede cDNA ved hjælp af specifikke HCV-primere (JFH RTQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') og DNA bindende grønt farvestof indeholdende qPCR super mix. Udføre qPCR til husholdning gen PPIG samt (primere PPIG F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; PPIG R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') Bemærk: Til beregning nøjagtig intracellulære HCV-RNA-niveau på tværs af prøver, brug cellulær husholdning gen, PPIG , udtryk niveau (Ct cyklus) til normalisering. Bruge den kopi nummer FNX-HCV genomet som standard for det antal kopier beslutsomhed.
  4. Brug følgende betingelser, når du kører qPCR at bestemme HCV-RNA kopi nummer: 95 º C i 15 sekunder og 60   º C i 30 sekunder (40 cykler) ved hjælp af real-time PCR-system.
  5. Se figur 3A og 3B genomreplikation resultater.

6.. Western blotting-analyse til påvisning af HCV Protein Expression (figur 3C)

  1. Brug cellelysater frabout viralt RNA transficeret ved 96 timer efter transfektion for protein western blotting-analyse.
  2. Løse cellelysatet ved hjælp af SDS-PAGE og overførsel til polyvinylidendifluorid (PVDF) membran.
  3. Bloker membranen ved hjælp af en blokerende opløsning indeholdende 5% skummetmælk, 0,2% Tween 20 i phosphatbufret saltvand (PBS).
  4. Inkuberes membranen med primære muse-monoklonalt antistof NS3 (1 i 1000 fortynding) og beta-actin (1 i 5000 fortynding).
  5. Tilføj gede-anti-muse-IgG konjugeret til peberrodsperoxidase (1 i 5000 fortynding) og påvisning ved kemiluminescens.

7.. Immunofluorescensassay (IFA)

  1. Fastgør HCV-inficerede og transficerede celler under anvendelse af methanol i 30 minutter ved -20 ° C i immunofluorescensanalyse.
  2. Vask cellen tre gange med PBS og blokere med IFA blokeringsbuffer.
  3. Brug kanin polyklonalt anti-NS5A primært antistof (venligst leveret af Dr. Dasgupta, UCLA) eller muse-monoklonalt anti-DSRNA antistof J2 ved en fortynding på 1:200 (1 ug / ml) og inkuberes i 5 timer til natten over ved 4 º C.
  4. Vask cellerne tre gange med PBS efter den primære antistof.
  5. Tilføj gede-anti-kanin-IgG-488 polyklonalt sekundært antistof eller gede anti-mus IgG-594 polyklonalt sekundært antistof ved en 1:1000 fortynding (1 ug / ml) og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
  6. Vask cellerne med PBS tre gange og pletter kerner hjælp Hoechst farvestof og visning med fluorescerende mikroskop (figur 3D).

8.. Måling virustiter

  1. Plate naive Huh-7.5.1-celler på ca 3 x 10 3 celler / brønd ved hjælp af en 96-brønds plade. Den næste dag, udføre 10-fold seriefortyndinger af cellefri kultursupernatant høstet fra HCV RNA transficerede celler under anvendelse af vækstmedier podes in triplo på Huh-7.5.1-celler.
  2. Lave celler ved 72 timer efter infektion under anvendelse af methanol (30 minutter ved -20
  3. Brug den højeste fortynding til at tælle for NS5A positive foci og beregne det gennemsnitlige antal formeenhed fokus (FFU) per milliliter. Se figur 4 for HCV titer.

9.. Renilla Luciferase Reporter Assay til Viral genomreplikation og smitteevne

  1. For at vurdere, virale genom replikation, plade HCV-RNA-elektroporeres Huh-7.5.1-celler i tre eksemplarer i 48-brønds plader (1 x 10 4 celler / brønd).
  2. Lyse cellerne med 75 ul af passiv lysisbuffer på 6 timer, 48 timer og 96 timer efter transfektion.
  3. Rock pladerne forsigtigt i 15 minutter ved stuetemperatur og opbevares ved -80 º C.
  4. Til måling af Renilla luciferase enzymatisk aktivitet, optø proteinlysat og Renilla luciferase assayreagenser til stuetemperatur.
  5. Tilsæt 20 ul proteinlysat pr brønd af en 96-wel l hvid luminescence plade og placere pladen i et luminometer.
  6. Dispensér 100 ul Renilla luciferaseassayet reagens (coelenterazin substrat + buffer) pr godt, og efter en 2 sek pre-read forsinkelse; integrere det udsendte lys i 10 sek.
  7. Beregn middelværdi og standardafvigelse for hver prøve fra luciferase værdier af biologiske tredobbelte og underkaste data til statistisk analyse (figur 5).
  8. Til vurdering af infektivitet, pode 500 pi cellefrie supernatant opnået fra HCV-RNA-transficerede celler for de angivne tidspunkter (48 hr 96 hr) i tre eksemplarer på naive Huh-7.5.1-celler i 48-brønds plader.
  9. Udskift den virale inokulum med 500 pi frisk medium per brønd efter 6 timer efter infektion.
  10. Lyse cellerne ved 48 timer efter infektion og underlagt Renilla luciferase assay som beskrevet i trin fra 8,2 til 8,7 (fig. 5).
FSNIT "> 10. Statistisk analyse

  1. Fejlsøjlerne i graferne angiver standardafvigelser (SD). P-værdier blev beregnet ved den uparrede t-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hepatitis C-virus er et RNA-virus. Således genmanipulation formål har HCV cDNA blevet klonet ind i en bakteriel plasmidvektor. En T7-RNA-polymerase-promoter sekvens blev indført umiddelbart før 5'-enden af ​​HCV-genomet. En generel oversigt over HCV analyse workflow er præsenteret i figur 1.. At generere HCV genomisk RNA med præcis 3 'ende er HCV genomet indeholdende plasmid skåret med XbaI restriktionsenzym og den genererede enkeltstrengede overhæng blev sløvet med mungbønnenuklease fordøjelse . Kvaliteten af det lineariserede HCV plasmid blev vurderet ved agarosegelelektroforese (figur 2B). HCV-DNA blev udsat for T7 RNA-polymerase-medieret in vitro-transkription, og den resulterende RNA viste et enkelt produkt på 9,6 kilobase (figur 2C).

Vi testede vækstkinetik af en intragenotype 2a HCV (figur60, 3). De Huh-7.5.1-celler blev elektroporeret med in vitro-transkriberet RNA fra vildtype (WT) og polymerase null virus. Vi vurderede den virale fornuft genomreplikation ved RT-qPCR. Resultaterne indikerede, at WT virus replikeres genomet effektivt (figur 3A og 3B). Vildtype udviste 1-3 log højere genomreplikation sammenlignet med Pol-virus. WT virus producerer NS3-proteinet (figur 3C), som er involveret i viral protein spaltning (proteaseaktivitet), og genomreplikation (helicase-aktivitet). Også WT virus udtrykte NS5A protein som vurderet ved immunofluorescensassay (figur 3D). NS5A protein er en del af den HCV-RNA-replicase kompleks. At visualisere virale genom replikation, undersøgte vi tilstedeværelsen af ​​dobbeltstrenget (ds) HCV-RNA ved anvendelse af et antistof, som specifikt genkender dsRNA. Under HCV-genomet amplifikation den forstand RNA er copied til anti-sense genomet dermed dobbeltstrengede RNA mellemprodukter er til stede i den inficerede celle cytoplasma. NS5A protein og dsRNA co-lokaliserer i det cellulære cytoplasma (figur 3D) af WT transficerede celler, hvilket antyder aktiv viral replikation. Tilsammen WT virus etablerede aktiv replikation i transficerede Huh-7.5.1-celler.

Fremskridt i HCV forskning var blevet begrænset på grund af mangel af en smitsom cellekultur-system. Opdagelsen af ​​JFH-1 stamme af HCV og den efterfølgende karakterisering af kimære laboratoriestammer tilladt os at undersøge hele HCV replikationscyklussen i cellekultur, herunder viral indgang, RNA oversættelse, RNA replikation og dannelse af infektiøs virussygdom afkom. For at vurdere HCV titer og de ​​novo-infektivitet, vi podet celle-dyrkningssupernatanterne høstet fra HCV-RNA-transficerede celler. HCV-infektion blev visualiseret ved påvisning af HCV NS5A protein og beregnetvirustiteren ved at tælle det infektiøse foci (fig. 4). Vi overvejede isoleret klynge af celler (over 2 celler) positive for NS5A som en enkelt fokus. Resultaterne indikerede, at WT virus er smitsom og producerer mere end 10 4 foci dannende enheder / ml infektiøs partikel.

Vi har også etableret en HCV reportervirus huser Renilla luciferase (Rluc) reporter genet (figur 5A). En reporter HCV kan anvendes til afprøvning af store antal mutante vira såvel som for højt indhold screeningsassays. Her præsenterer vi en vurdering af vækst-fænotyper af WT og Pol-reporter vira. Hvis det virale genom replikeres, vil luciferaseaktiviteten øge overtid efter transfektion. De øgede genomreplikation niveauer kan udledes øget luciferaseaktivitet. Derfor luciferaseaktiviteten indirekte giver måling af niveauet af genom replikation. Lysaterne høstet fra WT eller Pol viral RNA transficerede celler på angivne tidspunkter blev testet for Luciferaseaktiviteterne. Ved 6 timer efter transfektion, både WT og Pol-virus havde lignende Luciferaseaktiviteterne angivelse lignende indgangsniveau transficeret RNA, som var blevet oversat (figur 5B). Men på 48 timer og 96 timer efter transfektion, udviste WT virus øget genomreplikation niveauer sammenlignet med Pol-virus. Også WT producerede virus viral NS3-protein, som verificeret ved Western blotting-analyse (figur 5C). Derefter testede vi infektivitet af WT og Pol reporter virus ved podning af naive Huh-7.5.1-celler med de cellefrie supernatanter opsamlet fra 48 timer og 96 timer efter-transficerede cellekulturer. Pol-virus havde basis-niveau luciferaseaktivitet, hvorimod WT virus havde 2-3 log højere niveau af replikation som i Pol-reporter virus (figur 5D). Resultaterne viser, at vi har en robust HCV smitsom celle kultu re system.

Figur 1
Figur 1.. Overordnet skitse af HCV-replikation analyse workflow lineariseret HCV-plasmid konstruktion indeholdende T7 RNA-polymerase-promotor (T7P) udsat for in vitro-transskription.. Det oprensede HCV-RNA-genomet er elektroporeret ind Huh-7.5.1-celler og udpladet i kolber og 48-brønds plade. Ved 4 timer, 48 timer og 96 timer efter transfektion, er den cellulære RNA og dyrkningssupernatanter høstet fra kolber. Cellerne fra 48-brønds plade udnyttes til høst proteinlysat og er fastgjort til immunofluorescens assay. Genom kopital analyse af RT-qPCR er Western blotting og måling virustiter gjort for at vurdere HCV-replikation.

1362fig2highres.jpg "width =" 400 "/>
Figur 2. Fremstilling af HCV-genomiske RNA'er in vitro transkription af konstruerede plasmid DNA'er. A) Genomisk organisering af J6CF/JFH-1 intragenotype 2a kimære virus, FNX-HCV og FNX-HCV Pol null. Den J6CF stammen region (5'NTR til en del af ns2) er afbildet i mørkegrå og JFH-1-stammen region (del af NS2 til 3'NTR) vises i lysegrå. NS5B polymerase katalytiske domæne mutation (GDD til AAG) er angivet med en stjerne. B) Trin involveret i at generere lineariseret HCV plasmid. Gel billede viser det lineariserede, stumpendede plasmid-DNA'er fremstillet ved XbaI og mungbønnenuklease fordøjelse, klar til in vitro-transkription. 0,8% agarosegel blev anvendt for at løse DNA. C) Gel billede afbilder HCV-genomiske RNA'er produceret ved in vitro-transkription under anvendelse af T7-RNA-polymerase-systemet. WT: vildtype; Pol: Polymerase null; M:markør.

Figur 3
Figur 3.. Vurdering af vækst fænotyper af HCV konstruktioner. A) Evaluering af genom replikation kinetik af vildtype (WT) og polymerase null (Pol) virus. Numrene genom kopi af fornuft RNA-streng vurderes ved RT-qPCR præsenteres i søjlediagrammet. De virale genom kopier af Pol virus faldt i løbet af den periode, der angiver replikationsdeficient fænotype. B) Relativ genomreplikation niveau af vildtype-HCV sammenlignet med Pol-virus. C) Western blot-analyse af HCV-protein-ekspression. Detekteres HCV protein NS3 og beta-actin anvendes som en cellulær kontrol. D) Immunofluorescens assay til undersøgelse af viral replikation. Ved 96 timer efter elektroporering blev cellerne fikseret og udsat for immunostaining for HCV NS5A protein og dobbeltstrenget RNA (ds RNA), en markør for HCV-RNA replikation mellemprodukter. Kernerne blev visualiseret med Hoechst farve (Scale bar 50 um). HPT:. timer efter transfektion Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Fig. 4. Undersøgelse infektivitet af vildtype-HCV og måling af virustiter. A) Naive Huh-7.5.1-celler blev anvendt til infektion studier. Den cellefrie supernatant opsamlet ved 48 og 96 timer efter transfektion (HPT) af HCV-RNA blev udsat for 10-fold seriefortynding og tilsat til cellerne i en 96-brønds plade in triplo. 72 timer efter infektion blev cellerne fikseret og immunfarvet for HCV NS5A protein. Cellerne med NS5A positiv farvning (rød) er inficeret med virus. Til vurdering Foci Forming Unit (FFU), blev den positive foci på højeste fortynding tælles. Repræsentative paneler af billederne er vist (Skala bar 100 mM). B) Middelværdier og standardafvigelser af viral titer i FFU per milliliter er vist i grafen. Polymerase nulmutant ikke producere infektiøse partikler. WT: vildtype; Pol:. Polymerase null Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5.. Evaluering genom replikation og infektivitet af reporter HCV. A) en tegneserie af intragenotype 2a kimære reportervirus præsenteres. Den Renilla luciferasegen indsættes inframe mellem 5'NTR og kerne. b) genom replikation kinetik vildtype og Pol mutant reporter virus på angivne tidspunkter efter transfektion er vist i grafen. Proteinlysater blev høstet ved 6 timer, 48 timer og 96 timer tidspunkter for måling Renilla luciferase enzymatiske aktivitet. Middelværdien og standardafvigelse beregnet ud fra tredobbelte Renilla luciferase værdier (RLV-CX) for hvert virus er vist i grafen. C) Western blotting panel viser HCV-NS3-protein-ekspression. Et ikke-specifikt antigen påvises ved NS3 primære antistof fungerer som en loading kontrol. Vildtype-(WT) reporterviruset producerer højt NS3-proteinet. D) Analyse af virusinfektivitet. Naive Huh-7.5.1-celler blev podet med cellefrie supernatant opnået fra transficerede kultur på 48 timer og 96 timers tidspunkter. Renilla Luciferaseaktiviteterne af inficerede celler blev målt ved 48 timer efter infektion.Middelværdier med standardafvigelse er vist i grafen. Pol-reporter virusinficerede celler havde kun baggrundsniveau af luciferaseaktivitet, hvorimod WT reportervirus udstillet højt infektivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne illustration beskriver en fremgangsmåde til analyse af hepatitis C virus replikationscyklus. HCV er et humant patogen og den foreskrevne protokol om biosikkerhed skal følges nøje. Smitsomme HCV cellekultur systemer er blevet beskrevet tidligere 11-13,16,17. Der er nogle afgørende punkter, vi gennemfører, når du følger den illustrerede protokol. Først, er det af stor betydning at have en god kvalitet af intakt fuld længde viralt genomisk RNA for downstream studier. Input plasmid, der bærer den virale cDNA skal lineariseret og stumpendet omhyggeligt. Mung-bønne-nuclease anvendes til at sløve XbaI overhæng er en ikke-specifik nuklease og langvarig inkubation vil resultere i beskadigelse eller nedbrydning af 3'-enden af virusgenomet. Nukleasen skal fjernes umiddelbart efter den angivne 30 minutters inkubation ved phenol-chloroform-ekstraktion eller anionbyttersøjle oprensning. Gel ekstraktion af nuklease behandlede DNA kan ikke anbefales som denenzym er aktiv under gelelektroforese proces.

Til den efterfølgende in vitro RNA transskription trin, generelt, vil man også tage forholdsregler bredspektrede til minimering ribonuclease (RNase) forurening. Alle reagenser og materialer skal RNase gratis. For at generere høj kvalitet genomisk RNA med mindst RNA-streng pauser, RNA skal underkastes mindre fysisk stress ved at undgå barske hvirvelblanding og gentagen pipettering under oprensning og efterfølgende håndteringstrin. Efter afslutning af RNA-transkription, input plasmid DNA-templates skal fjernes fra transkriberet RNA blanding af DNase (RNase frit) behandling. Ufuldstændig fjernelse kan resultere i overførsel af plasmid-DNA ind i transficerede celler og påvirker kvantificeringen af ​​absolutte genomkopi antal replikeret viralt RNA. Derfor bruger DNase enzymet ved en koncentration på 1 enhed pr mikrogram DNA og også have ekstra 15 min DNase inkubation ved 37 º C kanhjælpe. Det transkriberede RNA kan oprenses ved enten phenol-chloroform ekstraktion eller anionbyttersøjle. Forsigtighed bør udvises for at undgå overførsel af phenol eller andre reagenser til den rensede RNA prøven, som kan være cytotoksiske og forstyrre molekylære analyser.

For elektroporation formål, det oprensede RNA skal opløses i RNase-frit sterilt vand. Hvis RNA-pelleten er vanskeligt at opløse, opvarmning af prøven til 65 ° C i 5 minutter vil hjælpe. Når transskription er afsluttet, er det vigtigt at opbevare RNA straks 10 ug arbejder alikvoter fremstillet i RNase frit vand ved -80 ° C. Formålet med portioner er at forhindre gentagne fryse / tø medieret RNA-nedbrydning. For konsistente eksperimentelle resultater, anbefales det at transskribere alle prøver og kontroller på samme tid. Højkvalitets RNA anbefales til en højere virustiter udbytte. Til transfektion af HCV genomisk RNA, polymer-og lipidbaserede transfektion midler kan også be brugte 21,22.

Virale og vært faktorer have stor indflydelse på vækstkinetik af HCV-stammer. Human hepatoma-cellelinie (Huh-7) derivater Huh-7.5 er Huh-7.5.1 og Huh7-Lunet cellelinjer almindeligvis anvendes til evaluering af virusvækst 11-13,15. Den maksimale virale produktion af JFH-1-stamme i Huh7-Lunet celler på 3-4 dage efter transfektion, mens der i Huh-7.5.1 celler, det er 21 dage efter transfektion 13,15. Den intragenotype 2a kimære virus FNX-HCV med ikke-strukturelle gener fra JFH-1-stamme har peak titer på 4 dage efter transfektion i Huh-7.5.1-celler 19,20. For viral produktion fra in vitro-transkriberet RNA, er tidlig passage human hepatoma cellelinie foretrækkes. Viral produktion er reduceret betydeligt, mens du bruger Huh-7.5.1-celler i løbet af passage nummer 20. At sikre øget celle overlevelsesevne efter elektroporation, optøede Huh-7.5.1 celler er tilladt en to ugers restitutionsperiode før gennemføre et eksperiment og Maintained i 12% -15% FBS. Sammen med dette kriterium, resuspension af cellerne i vækstmedier indeholdende 15% FBS umiddelbart efter elektroporation øger cellernes overlevelse giver mulighed for bedre viral produktion. Efter de første 8 timers tidspunkt cellerne skiftede derefter til medium indeholdende 10% FBS. For at minimere fremførsel celleaffald er den virale, kultursupernatant underkastet centrifugering og filtrering gennem 4 mikron filter. Ikke-koncentreret eller koncentrerede virale supernatanter alikvoteres og opbevares i -80 º C til yderligere in vitro og in vivo eksperimenter. Disse forholdsregler og forslag kan hjælpe forskere for en vellykket udførelse af analyse af HCV-replikation cyklus.

En anden variation af reporter HCV, som huser et markørgen såsom fluorescerende protein og en udskilt form af Gaussia luciferase (Gluc) er beskrevet for HCV forskning 18,23,24. For forskere med fokus på at undersøge HCVgenomreplikation, HCV sub-genomisk replikon (mangler generne kerne til ns2) er et værdifuldt redskab 9,10. HCV replicon er ikke-infektiøse, og dermed kræver mindre bio-sikkerhedsbestemmelser og nemmere at arbejde med i forhold til den smitsomme cellekultur HCV og kliniske isolater. HCV mangler NS5B polymerase aktivitet er et kritisk kontrolpunkt for at studere HCV-replikation cyklus 11,12. HCV mangler kappeglycoproteiner (delta E1E2), eller P7-NS2 aktivitet kan være nyttige kontroller for undersøgelser med HCV indrejse, virionmorfogenese og afstigning 12,19,25-27.

Med hensyn til begrænsninger, i øjeblikket den smitsomme cellekultur-system er kun tilgængelig for HCV genotype 1 og 2. Autentiske virusstammer tilhører genotyper 3 til 6, som er i stand til at vokse effektivt i cellekultur endnu ikke identificeret. Intergenotypic rekombinante vira er nyttige alternativer til at studere replikationscyklus af forskellige genotyper. Replikationskompetent kimære virus Harboring kerne til ns2 region fra genotyperne 1 til 7 og resten af sekvensen fra JFH-1 genotype 2a genom blev beskrevet 15,18. En anden begrænsning er, at det virale udbytte JFH-1 og dets derivater kimære stammer er i området fra marts 10-Juni 10 per ml, som er relativt lav i forhold til andre RNA-vira, såsom polio og influenza. HCV stamme med solid vækst skal udvikles. Fremtidig undersøgelse omfatter brug af reporter HCV til high-throughput screening af biblioteket for at identificere potente antivirale og fokusere på at udvikle vaccinekandidater til forebyggelse af HCV-infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Fisher Scientific 10-017-CV
Non essential amino acid Fisher Scientific MT25025CI
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red Life Technologies 11058-021
Huh-7.5.1 The Scripps Research Institute The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center
Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null)  Cedars-Sinai Medical Center The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. 
XbaI New England Biolabs Inc. R0145S
Mung Bean Nuclease New England Biolabs Inc. M0250S
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System Promega P1320
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 mm) Bioexpress E-5010-4
Gene Pulser Xcell Total System Bio-Rad 165-2660
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 Life Technologies A11008
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
PVDF membrane package Bio-Rad 162-0263
Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk Bio-Rad 170-6404XTU
Tween-20 Bio-Rad 170-6531XTU
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] Abcam ab65407
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] Abcam ab13830
Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP)  Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents  GE Healthcare Life Sciences RPN2236
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
ViiA 7 real-time PCR system Life Technologies NA
Renilla Luciferase Assay System kit Promega E2810
RNase-Free DNase Promega M6101
GloMax-Multi Detection System (Luminometer) Promega

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
  2. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
  3. Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
  4. Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).
  5. Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
  6. Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
  7. Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
  8. Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
  9. Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
  10. Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
  11. Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
  12. Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
  13. Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
  14. Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
  15. Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
  16. Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
  17. Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
  18. Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
  19. Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
  20. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
  21. Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
  22. Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
  23. Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
  24. Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
  25. Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
  26. Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
  27. Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).

Tags

Smitsomme Sygdomme Hepatitis C virus HCV Tumor-virus hepatitis C skrumpelever leverkræft hepatocellulært carcinom
En protokol til at analysere Hepatitis C virus Replication
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ren, S., Contreras, D.,… More

Ren, S., Contreras, D., Arumugaswami, V. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (88), e51362, doi:10.3791/51362 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter