Abstract
וירוס הפטיטיס C (HCV) משפיע על 3% מאוכלוסיית העולם של וגורם למחלות חמורות בכבד כולל צהבת כרונית, שחמת הכבד, וקרצינומה hepatocellular. HCV הוא נגיף RNA אפף השייכת למשפחה Flaviviridae. טיפול הנוכחי אינו יעיל באופן מלא וגורם לתופעות לוואי שליליות. אין חיסון HCV זמין. לפיכך, מאמץ המשיך נדרש לפיתוח חיסון וטיפול טוב יותר. מערכת תרבית תאי HCV היא קריטית ללימוד שלבים שונים של צמיחת HCV כוללים כניסת ויראלי, שכפול הגנום, אריזה, ויציאה. בהליך הנוכחי שהוצג, השתמשנו וירוס 2a intragenotype פראי מסוג chimeric, FNX-HCV, ווירוס רקומביננטי FNX-Rluc נושא גן כתב לוציפראז Renilla ללמוד את שכפול הנגיף. שורת תאי hepatoma אדם (מבוסס הא-7) שימשה עבור transfection של במבחנה עיבד RNAs גנומית HCV. supernatants תא ללא תרבות, lysates חלבון ולאRNA סך נקצרו בזמן שונים מציין שלאחר transfection להעריך צמיחת HCV. מעמד שכפול הגנום HCV הוערך על ידי RT-PCR ופעמים תקועים RNA לדמיין את הנוכחות של HCV. ביטוי חלבון HCV אומת על ידי מבחני כתם וimmunofluorescence מערביים באמצעות נוגדנים ספציפיים לחלבוני HCV NS3 וNS5A. תאי transfected RNA HCV שוחררו חלקיקים זיהומיות לsupernatant התרבות וכייל הנגיף נמדדו. מבחני לוציפראז נוצלו כדי להעריך את רמת השכפול והדבקה של HCV כתב. לסיכום, אנו מציגים מבחני virological שונים לאפיון שלבים שונים של מחזור השכפול של HCV.
Introduction
וירוס הפטיטיס C (HCV) גורם לשחמת כבד וסרטן כבד. זה משפיע 170 מיליון אנשים ברחבי העולם עם 350,000 אנשים מתים מדי שנה 1-3. HCV הוא נגיף RNA גדיל חיובי עם גודל הגנום של 9.6 kb. הגנום HCV מתורגם כמו polyprotein יחיד של ~ 3,000 שאריות חומצת אמינו שהוא ביקע proteolytically ידי פרוטאזות נגיפיות סלולריות שונות ל10 פוליפפטידים. HCV הוא נגיף אב הטיפוס בסוג Hepacivirus ושייך למשפחה של 4 Flaviviridae. עם החשיפה, HCV קובע זיהום כרוני ב80% מהאנשים. הזיהום הוא בעיקר ללא תסמינים בזמן אבחון יכול לאפשר התערבות טיפולית כדי למנוע הידרדרות בכבד. טיפול הנוכחי הוא הכי מוצלח ואין חיסון זמין 5,6.
אטיולוגיה של הפטיטיס C תוארה לראשונה בשינה 1989 7. לימוד שכפול HCV חשוב לחיסון הצהבת מסוג C ומחקר טיפול, אבל זה היההקשו עוד על ידי חוסר של מערכת תרבות ויראלי יעילה. שיבוט מולקולרי של HCV הוצג להיות מידבק שבימפנזים על חיסון intrahepatic 8. בהמשך לכך, replicons HCV תת גנומי תוארו, שאיפשר לנתח את שלב שכפול הגנום הנגיפי ב9,10 מערכת תרבית תאים. גילוי של HCV גנוטיפ 2 א לבודד JFH-1 (הפטיטיס-1 המוחלט של התפקודי היפני), מסוגל להדביק תא תרבות פתח אפיקים חדשים למחקר שכפול HCV 11-13. מתח 2a גנוטיפ JFH-1 וירוסי chimeric בין ותוך genotypic וHCV גנוטיפ 1 מערכות מבוססות תרבות זיהומיות המבוססות זמינות גם כן 14-18.
אנחנו השתמשנו בהצלחה זן JFH-1 ווירוס chimeric 2a intragenotype HCV לך את מפת האפיון פונקציונלי ברזולוציה הגבוהה של תחומים חלבון וcis-מתנהגים אלמנטים RNA 19,20. לפי זה, כאן אנו מתארים מערכת תרבות יעילה בשימוש באופן שיגרתי המאפשרתלומד שלבים שונים של מחזור שכפול HCV והאינטראקציה המאכסן לפתוגן. אנו מציגים מבחני virological להעריך שכפול הגנום נגיפי וinfectivity נובו דה של HCV 2a intragenotype וHCV כתב מבוסס לוציפראז Renilla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מתווה כללית של הפרוטוקול מתואר באיור 1.
1. תאים
- הכן תקשורת צמיחה מלאה שמכילה 10-15% בסרום שור העובר (FBS), 10 חומצות אמינו חיוניות מ"מ, 10 HEPES מ"מ, פניצילין (100 יחידות / מיליליטר), סטרפטומיצין (100 מ"ג / מיליליטר), ו2 מ"מ L-גלוטמין.
- לשמור על הא-7.5.1 תאים 13 בתקשורת צמיחה מלאה המכילה תוספים מעל לניתוח במבחנה של מחזור שכפול נגיפי צהבת מסוג C.
- זנים נגיפיים תרבות הא-7.5.1 תאים עם צוינה תקשורת צמיחה בתוספת ב-C ° 37 עם 5% CO 2.
2. וירוס והבונה פלסמיד
- ליצור את הצורה המשלימה DNA (cDNA) של HCV RNA ולשכפל אותו לוקטור פלסמיד על מנת להקל על מניפולציה גנטית. הערה: גילוי הצהבת המוחלטת של התפקודי היפני 1, JFH-1 (HCV גנוטיפ 2 א), לבודד כבר קריטי למחקר HCV והואבעיקר שימוש ללמוד 11-13 מחזור השכפול של HCV. וירוסי chimeric אינטר וintragenotypic מבוססים על HCV JFH-1 נמצאים בשימוש נפוץ במחקר 14-18. בנייה של וירוס 2a intragenotype הסינתטי chimeric, FNX-HCV, ומתח כתב chimeric monocistronic תוארה בעבר 19 ובניית פרטים הם מעבר להיקף של פרוטוקול זה.
- השתמש בוירוס 2a intragenotype pFNX-HCV כפי שהוא מכיל 5'NTR, אזורים מבניים וP7, וחלק מהאזורים שאינם מבניים NS2 (נוקלאוטידים 1-2,878) של הזן ההורי J6CF (הצטרפות צמח השדה לא. AF177036), כפי גם הרכיבים שאינם מבניים של זן JFH-1 הנגיפי (הצטרפות צמח השדה לא. AB047639). הערה: FNX-HCV היה מסונתז המבוסס על הרצף של HCV chimeric 2a intragenotype JC1 שדווח בעבר 15.
- ליצור מבנה monocistronic chimeric כתב ויראלי, pFNX-Rluc, המבוסס על זן pFNX-HCV (לעיל בשלב 2.2) על ידי החדרת Rגן בלוציפראז enilla בין 5 'NTR וגן הליבה (בין NT 388 ו389). בהמשך לכך, חבר את הגן בלוציפראז וגן ליבה של מבנה זה באמצעות 2A הפה וטלפי וירוס מחלת רצף (F2A) פפטיד, שיפעל כאות מחשוף.
- מהנדס הקונסטרוקציה נגיפית פולימראז-null RNA (Pol-) או באמצעות pFNX-HCV או על רקע ויראלי pFNX-Rluc. החלף את שאריות קטליטי פולימראז NS5B, GDD (aa 2759-2761; nt 8615-8,623), של אחד מעמודי תווך ויראליים עם שאריות חומצת אמינו AAG.
3. שעתוק במבחנה RNA HCV
- השתמש בנגיף HCV-FNX chimeric 2a intragenotype וnull FNX-HCV Pol HCV (Pol-) להערכה של שכפול נגיפי (איור 2 א).
- Linearize פלסמידים ויראלי עם אנזים הגבלת XbaI ולאחר מכן לטפל עם nuclease שעועית מונג כדי ליצור קצוות קהים. לטהר את פלסמידים מתעכלים על ידי כרומטוגרפיה אניון-Exchange. לוודא את התקינות of לינארית פלסמיד על ידי חשיפת הדנ"א לagarose ג'ל אלקטרופורזה (איור 2).
- לתמלל פלסמידים נגיפיים לינארית באמצעות פולימראז T7-RNA.
- לטהר את RNA שטופלה DNase מסונתז החדש באמצעות ערכת טיהור RNA.
- ודא ייצור RNA על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose (איור 2 ג).
- לכמת את הרנ"א על ידי ספקטרופוטומטר.
- אחסן את RNA שנוצר ב-80 מעלות צלזיוס ב10 מיקרוגרם aliquots עובדים. הערה: כדי למזער את הווריאציה של איכות RNA בתוך כל עיצוב ניסיוני על ידי תמלול כל RNA עבור כל דגימה ובקרה נגיפיות באותו הזמן.
4. HCV RNA Transfection ואוסף דוגמאות
- לקצור את הא-7.5.1 התאים באמצעות טריפסין.
- כדי לשטוף את התאים, צנטריפוגה ו resuspend ההשעיה פעמיים עם תקשורת בסרום נמוכה קרה. Resuspend התאים בתקשורת בסרום נמוך ב1 x 10 7 תאים לכל מיליליטר.
- מערבבים בסך הכל 10 & #956; גרם של רנ"א הנגיפי עיבד עם 400 μl של תאי resuspended (4 x 10 6 תאים) בקובט electroporation 0.4-סנטימטר. Transfect התאים באמצעות electroporation ב270 V, 100 Ω, ו950 μF.
- Resuspend תאי electroporated ב10 מיליליטר תקשורת צמיחה להשלים עם FBS 15%. הערה: הישרדות מוגברת של תאי electroporated נתפס כאשר הא-7.5.1 התאים בתרבית ב15% שור סרום עוברי.
- פלייט התאים בשני T-25 צלוחיות (~ 1.2 x 10 6 תאים לכל בקבוק) וצלחות 48 היטב (1 x 10 4 תאים לכל היטב) לכל אחת מנקודות הזמן הבאות: 4, 48 ו96 שעה.
- החלף את המדיה ב4-8 לאחר transfection שעה עם תקשורת צמיחה בתוספת טרי עם 10% FBS כדי להסיר שאריות תאים מתות מהצלוחיות וצלחות תרבית.
- supernatants תרבית תאי קציר ב48, 96 נקודות זמן שעה ולהסיר פסולת הסלולר מדגימות שנאספו על ידי צנטריפוגה תאים ב1,500 סל"ד 10 דקות ב 4 º C.
- אחסן את supernatants התא ללא ב -80 º C. Lyse התאים לחלבון וניתוח הרנ"א על ידי כתם מערבי ולהפוך PCR שעתוק כמותית בנקודות הזמן שצוינו.
5. הפוך תמלול-PCR (RT-qPCR) להערכת עותקי HCV הגנום
- בצע שני שלבים RT-qPCR כדי לקבוע את מספר עותק RNA הגנומי HCV.
- לתעתק הפוך 1 מיקרוגרם של רנ"א הסלולרי הכולל באמצעות טרנסקריפטאז הפוך ופריימר ספציפי לגדיל תחושת HCV שנקשר ל5'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ") או פריימר ספציפי לisomerase peptidylprolyl גן המשק G (PPIG R : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 "). גם להפוך לתמלל FNX-HCV RNA (שנוצר בשלב 3) של עותקים ידועים הגנום (1 אוקטובר - 9 אוקטובר סטנדרטי) באמצעות פריימר גדיל תחושת HCV.
- לבצע qPCR באמצעות 50 ננוגרם של cDNA עיבד וכתוצאה מכך שימוש בפריימרים ספציפיים HCV (JFH RTQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ") וה-DNA מחייב צבע ירוק המכיל תערובת סופר qPCR. בצע qPCR לPPIG גן המשק, כמו גם (פריימרים PPIG F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; PPIG R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 ") הערה: לחישוב רמת RNA HCV תאיים מדויקת על פני דגימות, השתמש גן משק סלולארי, PPIG , רמת ביטוי (מחזור CT) לנורמליזציה. השתמש במספר העותק של הגנום FNX-HCV כתקן לקביעת מספר עותקים.
- השתמש בתנאים הבאים בעת הרצת qPCR לקבוע עותק RNA HCV מספר: 95 º C ל15 שניות ו60 º C במשך 30 שניות (40 מחזורים) שימוש במערכת ה-PCR בזמן אמת.
- ראה 3A דמויות ו3B לתוצאות שכפול הגנום.
6. מערבי ניתוח סופג לזיהוי ביטוי חלבון HCV (איור 3 ג)
- השתמש fr lysates התארנ"א הנגיפי אום transfected ב96 ההודעה hr transfection לניתוח מערבי סופג חלבון.
- לפתור את lysate התא באמצעות SDS-PAGE והעברה לdifluoride polyvinylidene קרום (PVDF).
- חסום את הממברנה באמצעות פתרון חסימה המכיל חלב דל שומן 5%, 0.2% Tween 20 בופר פוספט (PBS).
- דגירה הממברנה עם נוגדן חד שבטי עכבר העיקרי NS3 (1 ב1,000 דילול) ובטא אקטין (1 ב5,000 דילול).
- הוספת IgG אנטי עכבר העז מצומדת לחזרה peroxidase (1 ב5,000 דילול) ולזהות על ידי chemiluminescence.
7. Immunofluorescence Assay (IFA)
- תקן את התאים וtransfected נגוע HCV באמצעות מתנול למשך 30 דקות במעלות צלזיוס -20 עבור assay immunofluorescence.
- שטוף את התא עם PBS שלוש פעמים ולחסום עם IFA חסימת מאגר.
- השתמש polyclonal ארנב נגד NS5A נוגדנים בעיקר (בתנאי בחביבות על ידי ד"ר Dasgupta, UCLA) או עכבר חד שבטי אנטי DSRJ2 NA נוגדנים בדילול של 1:200 (1 מיקרוגרם / מיליליטר) ו דגירה במשך 5 שעות לשעת 4 בלילה º C.
- לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים לאחר שהנוגדן הראשוני.
- הוסף נוגדן עז נגד ארנב IgG-488 polyclonal משנית או עז אנטי עכבר IgG-594 נוגדנים משני polyclonal בדילול 1:1,000 (1 מיקרוגרם / מיליליטר) ו דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
- שטוף תאים עם PBS שלוש פעמים וגרעיני כתם באמצעות צבע Hoechst ולהציג באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 3D).
8. כייל נגיף מדידה
- הא-7.5.1 תאים נאיביים פלייט תאים בכ 3 x 10 3 / גם באמצעות צלחת 96 היטב. למחרת, לבצע דילולים סדרתי של פי 10 של supernatant תרבות תא ללא נקטף מן תאי transfected RNA HCV באמצעות תקשורת צמיחה ולחסן בשלושה עותקים על הא-7.5.1 תאים.
- תקן את התאים ב72 לאחר זיהום שעות באמצעות מתנול (ל30 דקות ב -20
- השתמש בדילול הגבוה ביותר לספור למוקדים החיוביים NS5A ולחשב את המספר הממוצע של יחידה ויוצרת מוקד (FFU) למיליליטר. ראה איור 4 לכייל HCV.
9. Renilla בלוציפראז כתב Assay עבור ויראלי הגנום שכפול וInfectivity
- להערכת שכפול נגיפי הגנום, הא-7.5.1-תאי electroporated RNA HCV הצלחת בשלושה עותקים בצלחות 48 היטב (1 x 10 4 תאים / טוב).
- Lyse התאים עם 75 μl של חיץ תמוגה הפסיבי בשעה 6, 48 שעות, ו96 לאחר transfection שעה.
- רוק הצלחות בעדינות ל15 דקות בטמפרטורת החדר ולאחסן ב -80 º C.
- כדי למדוד את הפעילות האנזימטית לוציפראז Renilla, להפשיר lysate החלבון וריאגנטים assay לוציפראז Renilla לטמפרטורת חדר.
- הוסף 20 μl של lysate חלבון לכל טוב של 96-wel צלחת הארה לבנה ליטר ולמקם את הצלחת בluminometer.
- לוותר של מגיב assay לוציפראז Renilla (מצע coelenterazine + חיץ) לכל טוב ולאחר עיכוב מראש לקרוא 2 שניות 100 μl; לשלב את האור הנפלט ל10 שניות.
- לחשב את הממוצע וסטיית התקן עבור כל דגימה מערכי לוציפראז של triplicates הביולוגי ולהכפיף את הנתונים לניתוח סטטיסטי (איור 5).
- להערכת infectivity, לחסן 500 μl של supernatant תא ללא המתקבל מתאי transfected RNA HCV לנקודות שצוינו הזמן (48 שעות ו96 hr) בשלושה עותקים על הא-7.5.1 תאים נאיביים בצלחות 48 היטב.
- החלף את הבידוד הנגיפי עם 500 μl של מדיום חדש לכל גם אחרי 6 שעות שלאחר זיהום.
- Lyse התאים ב48 שעות שלאחר זיהום וכפוף לassay לוציפראז Renilla כמתואר בשלבי 8.2-8.7 (איור 5).
- הברים השגיאה בגרפים מצביעים על סטיות תקן (SD). ערכי P חושבו על ידי מבחן t מזווג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נגיף הפטיטיס C הוא וירוס RNA. כך למטרה מניפולציה גנטית, cDNA גנומי HCV כבר משובט לתוך וקטור פלסמיד חיידקים. רצף אמרגן RNA פולימראז T7 הוצג מייד לפני סוף '5 של הגנום HCV. מתווה כללית של עבודה ניתוח HCV מוצגת באיור 1. כדי לייצר RNA הגנומי HCV עם הסוף מדויק 3 ', הגנום HCV המכיל פלסמיד הוא חתך עם אנזים הגבלת Xba אני והסככה חד גדילים שנוצרה הייתה קהה עם עיכול nuclease שעועית מונג . איכות פלסמיד HCV ינארית הוערכה על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose (איור 2). HCV-DNA היה נתון לפולימראז T7-RNA בתיווך בשעתוק במבחנה ורנ"א וכתוצאה מכך הניב מוצר יחיד ב9.6 kilobase (איור 2 ג).
בדקנו קינטיקה הצמיחה של HCV 2a intragenotype (איור60: 3). הא-7.5.1 תאי electroporated עם RNA עיבד במבחנה של wild-type (WT) והווירוסים null פולימראז. הערכנו את שכפול הגנום תחושה הנגיפי על ידי RT-qPCR. תוצאות הצביעו על כך שווירוס WT לשכפל את הגנום ביעילות (3A דמויות ו3B). Wild-type הציג רמה 02:59 יומן גבוהה יותר של שכפול הגנום בהשוואה לזו של פול וירוס. וירוס WT מייצר חלבון NS3 (איור 3 ג) כי הוא מעורב במחשוף נגיפי חלבון (פעילות פרוטאז), ושכפול הגנום (פעילות helicase). גם וירוס WT הביע חלבון NS5A כפי שהוערך על ידי assay Immunofluorescence (איור 3D). חלבון NS5A הוא חלק ממכלול replicase RNA HCV. כדי להמחיש את שכפול הגנום נגיפי, בדקנו את נוכחותו של RNA (DS) פעמיים תקועים HCV באמצעות נוגדן שדווקא מכיר dsRNA. במהלך ההגברה הגנום HCV, גדיל RNA תחושה הוא גopied להגנום אנטי תחושה, ובכך ביניים RNA פעמיים התקועים נמצאים בציטופלסמה של התאים הנגוע. חלבון NS5A וdsRNA שיתוף localizes בציטופלסמה הסלולרית (איור 3D) של תאי transfected WT המצביעים על השכפול הנגיפי הפעיל. יחדיו, וירוס WT הוקם שכפול פעיל בHuh-7.5.1 תאי transfected.
התקדמות במחקר HCV הייתה מוגבלת בשל היעדר מערכת תרבית תאים זיהומיות. הגילוי של זן JFH-1 של HCV והאפיון הבא של זני המעבדה chimeric אפשרו לנו לחקור את מחזור שכפול HCV השלם בתרבית תאים, כולל כניסת ויראלי, תרגום רנ"א, שכפול RNA וההיווצרות של צאצאים ויראלית מדבקים. כדי להעריך את כייל HCV וinfectivity נובו דה, אנחנו מחוסן supernatants תרבית התאים שנקטפו מן תאי transfected RNA HCV. זיהום HCV היה דמיינו ידי גילוי חלבון NS5A HCV ומחושבכייל נגיף על ידי ספירת מוקדי זיהומיות (איור 4). אנחנו נחשבים אשכול מבודד של תאים (מעל 2 תאים) חיובי לNS5A כמוקד אחד. התוצאות הצביעו על כך שווירוס WT הוא מדבק ומייצר מעל 10 4 מוקדי יצירת יחידות / מיליליטר של חלקיקים מזהמים.
אנחנו גם הקמנו נגיף HCV כתב מחסה לוציפראז Renilla (Rluc) גן כתב (איור 5 א). HCV כתב יכול לשמש לבדיקת מספר רב של וירוסים שעברו מוטציה, כמו גם למבחני מיון גבוה תוכן. כאן אנו מציגים את הערכת פנוטיפים צמיחה של WT ווירוסים Pol-כתב. אם הגנום הנגיפי משכפל, פעילות לוציפראז תגדיל הודעה שעות נוספות transfection. ניתן להסיק רמות שכפול הגנום עלו מ פעילות לוציפראז מוגברת. לפיכך, פעילות לוציפראז בעקיפין מספקת המדידה של הרמה של שכפול הגנום. Lysates נקטף מן WT או Pol-viתאי transfected RNA RAL בנקודות זמן שצוינו נבדקו לפעילות לוציפראז. בשעת 6 בשעות שלאחר transfection, שני WT וPol-וירוסים היו פעילות לוציפראז דומה, המצביעים על רמת קלט דומה של RNA transfected שתורגם (איור 5). עם זאת ב48 שעות ו96 לאחר transfection שעות, וירוס WT הציג ד רמות גבוהה שכפול הגנום בהשוואה לזה של פול וירוס. כמו כן, וירוס WT מיוצר חלבון NS3 נגיפי כמאומת על ידי ניתוח סופג המערבי (איור 5 ג). בהמשך לכך, בדקנו את ההדבקה של WT ווירוסים Pol-כתב ידי inoculating הא-7.5.1 תאים נאיביים עם supernatants התא ללא נאסף מ48 שעות ו96 תרביות תאים-transfected הודעה שעה. היה לי Pol וירוס פעילות לוציפראז ברמת בסיס, ואילו וירוס WT רמת 2-3 יומן גבוהה יותר של שכפול לזה של וירוס Pol-כתב (איור 5D). תוצאות מראות שיש לנו cultu תא חזקה HCV מדבקת מחדש של מערכת.
איור 1. מתווה כללית של עבודה ניתוח שכפול HCV. ינארית מבנה פלסמיד המכיל HCV אמרגן T7 רנ"א פולימרז (T7p) נתון לשעתוק במבחנה. הגנום RNA HCV המטוהרים הוא electroporated לתוך הא-7.5.1 תאים ומצופים בצלוחיות וצלחת 48 היטב. ב 4 שעות, 48 שעות, ו96 לאחר transfection שעה, RNA הסלולרי וsupernatants התרבות נקצרים מן צלוחיות. התאים מצלחת 48 היטב מנוצלים לlysate חלבון קצירה והם קבועים עבור assay Immunofluorescence. ניתוח הגנום עותק מספר על ידי RT-qPCR, כייל נגיף סופג ומדידה מערבי נעשים כדי להעריך את שכפול HCV.
"Width =" 1362fig2highres.jpg 400 "/>
איור 2. הפקה של RNAs גנומית HCV ידי שעתוק במבחנה של DNAs פלסמיד שנבנה. א) ארגון הגנום של וירוסי 2a intragenotype J6CF/JFH-1 chimeric, FNX-HCV וnull Pol FNX-HCV. אזור זן J6CF (5'NTR לחלק מNS2) מתואר באפור כהה ואזור JFH-1 המתח (חלק מNS2 ל3'NTR) מוצג בצבע אפור בהיר. מוטציה תחום קטליטי פולימראז NS5B (GDD לAAG) מסומנת בכוכבית. ב ') צעדים מעורבים ביצירת פלסמיד HCV לינארית. תמונת ג'ל מציגה את DNAs לינארית, הבוטה הסתיים פלסמיד המיוצר על ידי Xba אני ועיכול nuclease שעועית מונג, מוכן לשעתוק במבחנה. 0.8% agarose ג'ל שימש לפתרון ה-DNA. C תמונת ג'ל) מתארת את RNAs גנומית HCV המיוצר על ידי שעתוק במבחנה באמצעות מערכת RNA פולימראז T7. WT: wild-type; Pol-: null פולימראז; M:סמן.
איור 3. הערכת פנוטיפים הצמיחה של מבני HCV. א) הערכת קינטיקה שכפול הגנום של wild-type (WT) וnull פולימראז וירוסים (Pol-). מספרי עותק הגנום של גדיל RNA תחושה שהוערך על ידי RT-qPCR מוצגים בגרף העמודות. עותקי הגנום הנגיפי של Pol-וירוס ירדו מעל פרק הזמן המציין פנוטיפ חסר השכפול. ב ') ברמת שכפול הגנום יחסית של HCV הפראי מסוגו בהשוואה לזה של פול וירוס. C) ניתוח כתם מערבי של ביטוי חלבון HCV. חלבון HCV NS3 הוא זוהה וביתא אקטין משמש כביקורת סלולרית. ד) assay Immunofluorescence לחקירת שכפול נגיפי. ב96 לאחר electroporation שעה התאים היו קבועים ונתון IMMunostaining לחלבון NS5A HCV ופעמים תקועים RNA (DS-RNA), סמן עבור ביניים שכפול RNA HCV. הגרעינים היו דמיינו עם כתם Hoechst (בר סולם 50 מיקרומטר). HPT:. שעות שלאחר transfection אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. בחינת ההדבקה של HCV wild-type ו מדידת כייל נגיף. א) בתאים הנאיביים הא-7.5.1 שימשו למחקרי זיהום. Supernatant התא ללא נאסף ב48 ו96 שעות שלאחר transfection (ח.פ.) של HCV RNA היו נתונים לדילול סדרה פי 10 והוסיף לתאים בצלחת 96 היטב בשלושה עותקים. 72 שעות שלאחר זיהום, התאים היו קבועים וimmunostained לחלבון NS5A HCV. התאים עם Nמכתים S5A חיובי (אדום) נגועים בוירוס. להערכת יחידת יצירת מוקדים (FFU), המוקדים החיוביים בדילול הגבוה ביותר נספרו. לוחות נציג של תמונות מוצגים (סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר). B) ערכים ממוצע וסטיות תקן של כייל הנגיף בFFU למיליליטר מוצגים בגרף. המוטציה null פולימראז לא לייצר חלקיקים מזהמים. WT: wild-type; Pol-:. Null פולימראז אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. הערכת שכפול הגנום והדבקה של HCV כתב. א) קריקטורה של וירוס כתב chimeric 2a intragenotype מוצגת. הגן בלוציפראז Renilla הוא infram המוכנסדואר בין 5'NTR וליבה. B) קינטיקה שכפול הגנום של wild-type ו וירוסי כתב Pol-מוטציה בזמן מצויין מציינת שלאחר transfection מוצג בגרף. lysates החלבון נקצרו בשעה 6, 48 שעות ו96 נקודות זמן שעות למדידת פעילות האנזימטית לוציפראז Renilla. הממוצע וסטיית התקן מחושבת מערכי שלושה עותקים Renilla לוציפראז (RLV) עבור כל וירוס מוצגים בגרף. C) פנל מערבי סופג מציג את ביטוי חלבון HCV NS3. אנטיגן שאינו ספציפי זוהה על ידי נוגדן ראשוני NS3 פועל כטעינה מלאה. Wild-type (WT) וירוס כתב מייצר רמה גבוהה של חלבון NS3. ד ') ניתוח של infectivity וירוס. נאיביים הא-7.5.1 תאים היו מחוסן עם supernatant התא ללא המתקבל מתרבות transfected ב48 שעות ו96 נקודות זמן שעה. פעילויות לוציפראז Renilla של תאים נגועים נמדדו ב48 לאחר זיהום משאבי אנוש.ערכים ממוצע עם סטיית תקן מוצגים בגרף. וירוס Pol-הכתב נגוע היו תאים ברמת רקע בלבד של פעילות לוציפראז, ואילו וירוס כתב WT הציג רמה גבוהה של infectivity.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
איור זה מתאר שיטה לניתוח מחזור השכפול של וירוס הצהבת מסוג C. HCV הוא הפתוגן אנושי ופרוטוקול הבטיחות הביולוגי שנקבע יהיה חייב להיות אחריו בקפדנות. מערכות תרבות זיהומיות HCV תא תוארו בעבר 11-13,16,17. יש כמה נקודות קריטיות שאנחנו ליישם כאשר בעקבות הפרוטוקול המאויר. ראשית, זה הוא בעל חשיבות גבוהה שיש באיכות טובה של רנ"א הנגיפי שלם באורך מלא גנומי ללימודים במורד הזרם. פלסמיד שנשא הקלט cDNA הנגיפי צריך להיות לינארית והקהה בזהירות. Nuclease מונג השעועית מועסק כדי להקהות את הסככה Xba אני הוא nuclease אינו ספציפי ודגירה ממושכת תגרום לניזק או השפלה של 3 סוף 'של הגנום נגיפי. יש nuclease שיש להסירו מייד לאחר הדגירה 30 דקות שצוינה על ידי מיצוי פנול, כלורופורם או טיהור עמודת אניוני. חילוץ ג'ל של nuclease טופל DNA לא יכול להיות מומלץ כהאנזים פעיל במהלך תהליך ג'ל אלקטרופורזה.
שללאחר מכן בצעדי שעתוק RNA חוץ גופית, בדרך כלל, אחד יהיה גם לנקוט באמצעי זהירות ספקטרום הרחב למזעור ribonuclease זיהום (RNase). כל חומרים כימיים וחומרים המשמשים צריכים להיות RNase חינם. כדי לייצר RNA הגנומי באיכות גבוהה עם הפסקות גדיל RNA המינימום, RNA צריך להיות נתונה ללחץ פיזי פחות על ידי הימנעות vortexing קשה וpipetting חוזר ונשנה במהלך טיהור וצעדי טיפול במורד הזרם. לאחר השלמת שעתוק RNA, תבניות פלסמיד דנ"א הקלט צריכים להסיר מתמהיל RNA עיבד ידי טיפול DNase (RNase חינם). ההסרה שלמה יכולה לגרום לשריד של ה-DNA פלסמיד לתוך תאי transfected ומשפיעה על הכימות של עותק מספר הגנום המוחלט של רנ"א הנגיפי משוכפל. לפיכך להשתמש אנזים DNase בריכוז של 1 יחידה למיקרוגרם של ה-DNA וגם לאחר 15 דקות נוספות של הדגירה DNase על 37 º C יכוללעזור. RNA עיבד יכול להיות מטוהר על ידי מי ממיצוי פנול, כלורופורם או עמודת אניוני. טיפול צריך להיות למימוש, כדי למנוע שריד של פנול או חומרים כימיים אחרים למדגם RNA מטוהר, אשר יכול להיות ציטוטוקסיות ולהפריע למבחנים מולקולריים.
למטרות electroporation, RNA המטוהרים צריך להיות מומס במים סטריליים RNase ללא. אם גלולה RNA קשה לפזר, חימום הדגימה ל65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות יעזרו. ברגע שהשעתוק הושלם, חשוב לאחסן את RNA באופן מיידי ב10 מיקרוגרם של aliquots עבודה שנעשו במי RNase ללא ב -80 º C. מטרת aliquots היא למנוע השפלה RNA תיווך הקפאה / הפשרה חוזרת ונשנית. לתוצאות ניסוי עולות בקנה אחד, מומלץ לתמלל את כל הדגימות ובקרות באותו הזמן. RNA באיכות גבוהה מומלץ לתשואת כייל נגיף גבוהה יותר. עבור גם transfecting RNA הגנומי HCV, פולימר ושומנים מבוססים סוכני transfection יכול bהדואר משמש 21,22.
גורמים נגיפיים ומארח להשפיע באופן משמעותי את קינטיקה הצמיחה של זני HCV. נגזרי שורת תאי hepatoma אדם (הא-7) הא-7.5, הא-7.5.1 ושורות תאי Huh7-Lunet משמשים בדרך כלל להערכת 11-13,15 צמיחה נגיפיות. הייצור הנגיפי השיא של מתח JFH-1 בתאי Huh7-Lunet הוא ב3-4 ימים לאחר transfection, ואילו בHuh-7.5.1 תאים זה ב21 ימים שלאחר transfection 13,15. יש וירוס chimeric 2a intragenotype FNX-HCV יש גנים שאינם מבניים מזן JFH-1 כייל שיא ב 4 ימים לאחר transfection בHuh-7.5.1 תאי 19,20. לייצור נגיפי בRNA מבחנה עיבד, שורת תאי hepatoma אדם מעבר מוקדם היא מועדפת. ייצור נגיפי מצטמצם משמעותי תוך שימוש הא-7.5.1 תאים על פני מספר מעבר 20. כדי להבטיח שרידות תא מוגברות לאחר electroporation, מופשר הא-7.5.1 תאים מותר תקופת שתי התאוששות בשבוע שלפני ביצוע ניסוי ומייntained ב12% FBS -15%. יחד עם קריטריון זה, resuspension של התאים בתקשורת צמיחה המכילים FBS 15% מייד לאחר electroporation מגביר את הישרדות התא המאפשרת ייצור נגיפי טוב יותר. לאחר נקודת זמן שעות הראשונה 8, התאים ולאחר מכן עברו לתקשורת מכילה 10% FBS. כדי למזער את carry over cellular, פסולת, supernatant התרבות הנגיפי הוא נתון לצנטריפוגה וסינון דרך 4 מסנן מיקרון. Supernatants הנגיפי unconcentrated או מרוכז הם aliquoted ומאוחסן ב-80 º C לעוד יותר במבחנה בניסויי vivo. אמצעי זהירות והצעות אלה יכולים לסייע לחוקרים לביצוע הניתוח של מחזור שכפול HCV בהצלחה.
וריאציה נוספת של HCV כתב שמטפחת גן סמן כגון חלבון פלואורסצנטי וצורה מופרשת של בלוציפראז Gaussia (Gluc) מתוארות למחקר HCV 18,23,24. לחוקרים מתמקדים בחקירת HCVשכפול הגנום, replicon HCV תת גנומי (חסרי ליבת גנים לNS2) הוא 9,10 כלי רב ערך. Replicons HCV הם שאינם זיהומיות, ובכך דורשים התקנות ביו בטיחות פחות וקלות יותר לעבוד עם לעומת HCV תרבית תאים זיהומיות וקליני מבודדים. HCV הלקוי בפעילות פולימרז NS5B הוא שליטה קריטית ללימוד 11,12 מחזור השכפול של HCV. HCV חסר גליקופרוטאינים מעטפה (דלתא E1E2), או פעילות P7-NS2 יכולה להיות פקדים שימושיים עבור מחקרים שכלל כניסת HCV, המורפוגנזה virion ויציאה 12,19,25-27.
לגבי מגבלות, כיום מערכת תרבית תאים זיהומיות זמינה רק עבור גנוטיפים HCV 1 ו -2. זנים נגיפיים אותנטיים שייכים לגנוטיפים 3 עד 6, כי הם מסוגלים לגדול ביעילות רבה בתרבית תאים שעדיין לא זוהה. וירוסי רקומביננטי Intergenotypic חלופות שימושיות לחקר מחזור שכפול של גנוטיפים שונים. harbori וירוס chimeric המוסמך שכפולליבת ng לאזור NS2 מגנוטיפים 1 עד 7 ושאר הרצף מהגנום 2a גנוטיפ JFH-1 תוארו 15,18. מגבלה נוספת היא שהתשואה ויראלי של JFH-1 וזני chimeric הנגזרים שלה היא בטווח של 3 אוקטובר - 6 אוקטובר מיליליטר לכל, שהוא נמוך יחסית בהשוואה לזה של וירוסי RNA אחרים כגון פוליו ושפעת. זן HCV עם צמיחה חזקה צריך להיות מפותח. חקירת עתיד כוללת את השימוש של HCV הכתב להקרנת ספריית תפוקה גבוהה לזהות antivirals החזק ולהתמקד בפיתוח מועמדי חיסון למניעת הדבקה ב-HCV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Non essential amino acid | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red | Life Technologies | 11058-021 | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center | |
| Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) | Cedars-Sinai Medical Center | The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. | |
| XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145S | |
| Mung Bean Nuclease | New England Biolabs Inc. | M0250S | |
| T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Electroporation Cuvette (4 mm) | Bioexpress | E-5010-4 | |
| Gene Pulser Xcell Total System | Bio-Rad | 165-2660 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| PVDF membrane package | Bio-Rad | 162-0263 | |
| Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531XTU | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] | Abcam | ab65407 | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] | Abcam | ab13830 | |
| Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents | GE Healthcare Life Sciences | RPN2236 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| ViiA 7 real-time PCR system | Life Technologies | NA | |
| Renilla Luciferase Assay System kit | Promega | E2810 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| GloMax-Multi Detection System (Luminometer) | Promega |
References
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
- Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
- Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).
- Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
- Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
- Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
- Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
- Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
- Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
- Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
- Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
- Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
- Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
- Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
- Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
- Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
- Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
- Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
- Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
- Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
- Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
- Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
- Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).
