Abstract
Вирус гепатита С (HCV) влияет 3% населения мира и вызывает серьезные заболевания печени, включая хронический гепатит, цирроз печени и гепатоцеллюлярной карциномы. ВГС оболочечным РНК вируса, принадлежащий к семейству Flaviviridae. Современное лечение не полностью эффективными и вызывает неблагоприятные побочные эффекты. Там нет ВГС вакцина. Таким образом, по-прежнему требуются усилия для разработки вакцины и лучшую терапию. Система HCV культуры клеток имеет решающее значение для изучения различных стадий роста ВГС в том числе вирусного входа, репликации генома, упаковки и выхода. В текущей процедуры, представленной мы использовали дикого типа intragenotype 2а химерный вирус, FNX-HCV, и рекомбинантный вирус FNX-Rluc, несущий ген-репортер люциферазы Renilla изучать репликацию вируса. Клеточной линии гепатомы человека (Хух-7 на основе) был использован для трансфекции в пробирке транскрипции ВГС геномных РНК. Бесклеточные супернатанты культуры, белковые лизаты и тг о РНК собирали в разное время указывает после трансфекции для оценки роста HCV. HCV геном состояние репликации оценивали путем количественного RT-PCR и визуализации на присутствие вируса гепатита двухцепочечной РНК. Экспрессии белка ВГС была проверена Вестерн-блот и иммунофлюоресценции анализов с помощью антител, специфичных для HCV NS3 и NS5A белков. РНК ВГС трансфицированные клетки выпущенные инфекционных частиц в культуральном супернатанте и титра вируса была измерена. Люциферазы анализы были использованы для оценки уровня репликации и инфекционность репортера ВГС. В заключение приведем различные вирусологических анализов для характеристики различных этапов цикла репликации ВГС.
Introduction
Вирус гепатита С (HCV) вызывает цирроз печени и рак печени. Это влияет 170 миллионов человек во всем мире с 350 000 человек умирают ежегодно 1-3. ВГС является положительным нить РНК вируса с размером генома 9,6 кб. Геном HCV переводится как единое полипротеина ~ 3000 аминокислотных остатков, который протеолитически расщеплен на различных клеточных и вирусных протеаз в 10 полипептидов. ВГС является вирус прототип в род Hepacivirus и принадлежит к семейству Flaviviridae 4. Под воздействием, ВГС устанавливает хронической инфекции в 80% лиц. Инфекция в основном бессимптомно и своевременная диагностика может позволить терапевтического вмешательства, чтобы предотвратить ухудшение печени. Современное лечение не является оптимальным и ни одна вакцина не доступна 5,6.
Этиология гепатита С был впервые описан в 1989 7. Изучение репликацию ВГС важно для гепатита С вакцины и научных исследований лечения, но это былодолго сдерживается отсутствием эффективной вирусной системе культуры. Молекулярный клон ВГС было показано, что инфекционное у шимпанзе на внутрипеченочного прививки 8. Впоследствии ВГС суб-геномные репликоны были описаны, что позволило вскрыть вирусную сцену геном репликации в системе культуры клеток 9,10. Обнаружение генотип 2а ВГС изолировать JFH-1 (японский Молниеносный гепатит-1), способны инфицировать культуры клеток открывает новые возможности для исследования репликации ВГС 11-13. Штамм Генотип 2а JFH-1 на основе меж-и внутри-генотипических химерные вирусы и генотип 1 HCV инфекционные системы культуры, основанной также доступны 14-18.
Мы успешно использовали JFH-1 напряжение и ВГС intragenotype 2а химерный вирус для получения высокого разрешения функциональной профилирования карту белковых доменов и цис-действующих РНК элементов 19,20. В соответствии с этим здесь мы опишем эффективную систему культуры, используемую обычно, что позволяетизучения различных этапов цикла репликации ВГС и хост-возбудителя взаимодействия. Мы представляем вирусологических анализов для оценки вирусной репликации генома и De Novo инфекционность intragenotype 2а ВГС и Renilla люциферазы журналистом ВГС.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Общая схема протокола показан на рисунке 1.
1. Клетки
- Подготовить всю питательной среды, которая содержит 10-15% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 10 мМ заменимые аминокислоты, 10 мМ Hepes, пенициллин (100 ед / мл), стрептомицином (100 мг / мл) и 2 мМ L-глутамина.
- Поддерживать Хух-7.5.1 ячеек 13 в полной среды роста, содержащих вышеуказанные добавки для анализа в пробирке гепатита С вирусной цикла репликации.
- Культура вирусных штаммов в Хух-7.5.1 клеток с заданным дополненной питательной среды при 37 ° С с 5% CO 2.
2. Вирус и Плазмидные Конструкции
- Генерирование комплементарную ДНК (кДНК) форму РНК ВГС и клонировать его в плазмидный вектор для простоты генетических манипуляций. Примечание: Открытие японского Молниеносный гепатит 1, JFH-1 (генотип 2а ВГС), изолят имеет решающее значение для исследований ВГС ив основном используется для изучения 11-13 репликации ВГС цикла. Inter-и intragenotypic химерные вирусы на основе JFH-1 ВГС, как правило, используется в исследованиях 14-18. Строительство синтетический intragenotype 2а химерный вирус, FNX-ВГС, и monocistronic химерных репортера штамма был описан ранее 19 и строительные детали выходят за рамки этого протокола.
- Используйте вирус intragenotype 2а pFNX-HCV как он содержит 5'NTR, структурные регионы и Р7, и часть неструктурных регионах NS2 (нуклеотиды с 1 по 2878) из родительского штамма J6CF (NCBI присоединение нет. AF177036), а а также не-структурных компонентов JFH-1 вирусного штамма (NCBI вступления нет. AB047639). Примечание: FNX-ВГС было синтезировано на основе последовательности Jc1 intragenotype 2а химерных ВГС сообщалось ранее 15.
- Генерирование monocistronic химерного вируса репортер конструкцию, то pFNX-Rluc, на основе штамма pFNX-HCV (выше на стадии 2.2), вставив Rген люциферазы enilla между 5 'NTR и основной гена (между нт 388 и 389). Затем подключите ген люциферазы и основные ген этой конструкции с использованием ног и рта вирусной болезни 2А (F2A) пептидной последовательности, которая будет работать в качестве сигнала расщепления.
- Инженер по РНК-полимераза-нуль (Pol-) вирусную конструкцию, используя либо pFNX-HCV или pFNX-Rluc вирусный фон. Замените полимеразы NS5B каталитические остатки, ДДГ (AA 2759-2761; NT 8615-8623), любого из этих вирусных магистралей с остатками AAG аминокислот.
3. In Vitro РНК HCV Транскрипция
- Используйте intragenotype 2а химерный вирус FNX-HCV и FNX-HCV Pol ноль (Pol-) HCV для оценки вирусной репликации (рис. 2а).
- Линеаризуем вирусных плазмид с XbaI рестриктазы, затем обрабатывают маш нуклеазы генерировать тупые концы. Очищают переваренных плазмид путем анионообменной хроматографии. Проверьте целостность ое линеаризованной плазмиды ДНК, подвергая электрофорезу в агарозном геле (фиг. 2b).
- Расшифруйте линеаризованные вирусных плазмид с помощью Т7-РНК-полимеразы.
- Очищают вновь синтезированный ДНКазы обработанных РНК с использованием набора для очистки РНК.
- Убедитесь, производство РНК с помощью электрофореза в агарозном геле (фиг. 2С).
- Количественная РНК спектрофотометрически.
- Храните сгенерированный РНК в -80 ° С в течение 10 мкг рабочих аликвоты. Примечание: Чтобы свести к минимуму изменение качества РНК внутри каждого эксперимента путем расшифровки все РНК для каждого образца вирусной и контроля одновременно.
4. РНК HCV Трансфекцию и сбора проб
- Урожай Хух-7.5.1 клетки, используя трипсин.
- Для полоскания клеток, центрифуги и ресуспендируйте подвеску дважды холодным низкой сыворотки СМИ. Ресуспендируют клеток в условиях низкой сыворотки среде при 1 × 10 7 клеток на мл.
- Смешайте в общей сложности 10 & #956; г транскрибируется вирусной РНК с 400 мкл ресуспендировали клеток (4 х 10 6 клеток) в 0,4-см кювету для электропорации. Трансфекции клеток с помощью электропорации в 270 V, 100 Ω и 950 мкФ.
- Ресуспендируют электропорации клетки в 10 мл полной среды рост с 15% FBS. Примечание: Увеличение живучесть электропорации клеток видно, когда Ха-7.5.1 клетки культивировали в 15% сыворотки плода коровы.
- Пластина клеток в обоих Т-25 колб (~ 1.2 х 10 6 клеток на колбу) и 48-луночных планшетах (1 х 10 4 клеток на лунку) для каждого из следующих временных точках: 4, 48 и 96 часов.
- Замените носитель на 4-8 ч после трансфекции свежего дополнена питательной среды с добавлением 10% FBS, чтобы удалить остатки мертвых клеток из культивированных колб и пластин.
- Урожай супернатантах клеточных культур в 48, 96 временных точках ч и удаление клеточного дебриса от собранных образцов центрифугированием клеток в 1500 оборотах в минуту в течение 10 мин при 4 ° С.
- Храните супернатантами бесклеточных при -80 º C. Лизиса клеток для анализа белка и РНК с помощью Вестерн-блоттинга и обратной транскрипции-Количественную ПЦР в указанные моменты времени.
5. Обратной транскрипцией количественной ПЦР (RT-КПЦР) для оценки генома ВГС копий
- Выполните двухэтапный RT-КПЦР для определения ВГС геномной количество РНК копирования.
- Обратный транскрибиров 1 мкг общей клеточной РНК с помощью обратной транскриптазы и грунтовки, специфический для HCV смысловой цепи, который связывается с 5'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') или грунтовки, специфического для гена уборка peptidylprolyl изомераза G (PPIG R : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '). Также обратного транскрибировать FNX-РНК ВГС (сгенерированный на шаге 3) известных копий генома (10 1 до 10 9 стандарт), используя чувство ВГС нити грунтовку.
- Провести КПЦР с помощью 50 нг полученного транскрибируется кДНК с использованием специфических праймеров HCV (RT JFHQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') и ДНК-связывающий зеленую краску, содержащую КПЦР супер микс. Выполните КПЦР для домашнего хозяйства гена PPIG а (праймеры PPIG F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; PPIG R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') Примечание: Для расчета точной уровень внутриклеточного РНК ВГС через образцов, использовать ген клеточного Уборка номеров, PPIG , уровень экспрессии (Ct цикл) для нормализации. Используйте числа копий FNX-генома ВГС в качестве стандарта для определения количества копий.
- Используйте следующие условия при работе КПЦР для определения РНК ВГС число копий: 95 ° C в течение 15 сек и 60 º C в течение 30 сек (40 циклов) с использованием реального времени система PCR.
- См. фиг.3А и 3В для результатов репликации генома.
6. Вестерн блот анализ для выявления вируса гепатита Экспрессия белка (рис. 3C)
- Используйте клеточных лизатов фром вирусной РНК трансфицировали в 96 часов после трансфекции для белка вестерн-блоттинга.
- Решить клеточного лизата с помощью SDS-PAGE и трансфер в поливинилидендифторидную (ПВДФ) мембраны.
- Блок мембрану с использованием блокирующего раствора, содержащего 5% обезжиренное молоко, 0,2% Tween 20 в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS).
- Выдержите мембрану с первичной мышиных моноклональных антител NS3 (1 в 1000 разбавления) и бета-актина (1 в 5000 разведение).
- Добавить антимышиного IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена (1 в 5000 разбавление) и обнаружить по хемилюминесценции.
7. Иммунофлуоресцентной (IFA)
- Закрепить HCV-инфицированных и трансфицированные клетки с использованием метанола в течение 30 мин при -20 ° С для иммунофлуоресцентного анализа.
- Вымойте клетки с PBS три раза и блок с IFA блокирующем буфере.
- Используйте кроличьи поликлональные антитела к NS5A прежде всего антител (любезно предоставлены доктором Дасгупта, UCLA) или моноклональные антитела мыши DSRАнтитело J2 NA в разведении 1:200 (1 мкг / мл) и инкубировали в течение 5 ч в течение ночи при 4 ° С.
- Промывают клетки с PBS три раза после первичного антитела.
- Добавить козьего анти-кроличьего IgG-488 поликлональное антитело или вторичное козла против мышиного IgG-594 поликлональных вторичного антитела при разведении 1:1000 (1 мкг / мл) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Вымойте клеток с PBS три раза и пятно ядер с использованием Hoechst краситель и вид при помощи флуоресцентного микроскопа (рис. 3D).
8. Измерение Вирус Титр
- Пластинчатые наивные Ха-7.5.1 клетки приблизительно в 3 х 10 3 клеток / лунку с использованием 96-луночного планшета. На следующий день, выполнять 10-кратные серийные разведения бесклеточной супернатанта культуры собирают из РНК ВГС трансфецировали клеток с использованием средств массовой информации роста и привить в трех экземплярах на Ха-7.5.1 клеток.
- Исправить клеток при 72 ч после инфекции с использованием метанола (в течение 30 мин при -20
- Используйте наибольшее разведение рассчитывать на положительный очагов NS5A и рассчитать среднее количество формирующего устройства фокусировки (ФФУ) на миллилитр. См. рисунок 4 для титра ВГС.
9. Renilla Люциферазную Репортер Анализ на вирусный геном репликации и инфекционности
- Для оценки вирусной репликации генома, пластина РНК ВГС-электропорации Хух-7.5.1 клетки в трех экземплярах в 48-луночных планшетах (1 х 10 4 клеток / лунку).
- Лизиса клеток с 75 мкл лизирующего буфера пассивной на 6 часов, 48 часов и 96 часов после трансфекции.
- Rock тарелки мягко в течение 15 мин при комнатной температуре и хранить при температуре -80 ° С.
- Для измерения ферментативной активности люциферазы Renilla, оттаивать лизата белка и активности люциферазы Renilla реагенты до комнатной температуры.
- Добавить 20 мкл лизата белка на лунку в 96-сва л белого свечения пластины и поместите пластину в люминометре.
- Внесите 100 мкл Renilla люциферазы реагента (целентеразин субстрат + буфер) на лунку и после 2 сек предварительно прочитать задержкой; интегрировать испускаемого света в течение 10 сек.
- Рассчитайте среднее значение и стандартное отклонение для каждого образца из люциферазных значений биологических трижды и подвергнуть данные в статистическом анализе (рис. 5).
- Для оценки инфективности, инокуляции 500 мкл бесклеточной надосадочной жидкости, полученной из РНК ВГС-трансфицированных клеток для указанных временных точках (48 ч и 96 ч) в трех экземплярах на наивных Ха-7.5.1 клеток в 48-луночных планшетах.
- Заменить вирусного посевного материала с 500 мкл свежей среды на лунку после 6 ч после инфекции.
- Lyse клетки через 48 часов после заражения и в зависимости от Renilla люциферазы, как описано в шагах 8,2 до 8,7 (рис. 5).
- Столбики ошибок в графах указывают на стандартные отклонения (SD). Значения P рассчитывались по непарным т теста.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Вирус гепатита С является РНК-содержащий вирус. Таким образом, для генетической манипуляции цели HCV геномной кДНК была клонирована в плазмидный вектор бактериальной. Т7 РНК-полимераза последовательность промотора была введена непосредственно перед 5'-конце генома ВГС. Общая схема анализа HCV процесса представлена на рисунке 1. Для генерации HCV геномной РНК с точным 3 'конце, геном ВГС содержащей плазмиды разрезают Xba I рестриктазы и сгенерированный одноцепочечной свес был притупляются с маш нуклеазой . Качество линеаризованной плазмиды HCV оценивали электрофорезом в агарозном геле (фиг. 2В). HCV ДНК подвергали РНК-полимеразы Т7 опосредованной транскрипции в пробирке, и полученный РНК получали один продукт в 9,6 т.п.о. (рис. 2в).
Мы протестировали кинетики роста в intragenotype 2а HCV (рис.60, 3). В Хух-7.5.1 клетки электропорации с в пробирке транскрибируется РНК дикого типа (WT) и полимеразы нулевых вирусов. Мы оценили вирусную смысл репликации генома с помощью ОТ-кПЦР. Результаты показали, что вирус WT репликации генома эффективно (фиг.3А и 3В). Дикого типа выставлены 2:59 журнала высокий уровень репликации генома по сравнению с Поль-вируса. Вирус WT производит белок NS3 (фиг.3С), который участвует в расщеплении белка вирусной протеазы (активность) и репликации генома (геликаза активности). Также вирус WT выразил NS5A белок по оценке иммунофлуоресцентной (рис. 3D). NS5A белок является частью ВГС РНК репликазы комплекса. Для визуализации репликации вирусного генома, мы исследовали наличие двухцепочечной (DS) РНК ВГС с использованием антитела, которые специфически распознает дсРНК. Во HCV усиления генома, смысловая цепь РНК сopied в антисмысловой геном, таким образом двухцепочечной РНК промежуточные присутствуют в цитоплазме инфицированной клетки. Белок NS5A и дсРНК ко-локализуется в клеточной цитоплазме (рис. 3D) из WT трансфекции клеток предлагая активную репликацию вируса. Взятые вместе, вирус WT создан активной репликации вируса в трансфицированных Хух-7.5.1 клеток.
Прогресс в исследованиях ВГС был ограничен из-за отсутствия инфекционного системе культуры клеток. Открытие JFH-1 штамма ВГС и последующей характеризации химерных лабораторных штаммов позволяет исследовать весь цикл репликации HCV в клеточной культуре в том числе вирусного входа, перевод РНК, РНК репликации и формирования инфекционного вирусного потомства. Для оценки титра ВГС и De Novo инфекционность, мы прививали сотового-культуральных супернатантов найденным HCV РНК трансфецировали клеток. ВГС визуализировали путем обнаружения NS5A белок HCV и рассчитываетсятитр вируса путем подсчета инфекционных очагов (рис. 4). Мы рассмотрели изолированные кластер из мобильных телефонов (более 2 клетки) положительный результат на NS5A как единый фокус. Результаты показали, что вирус является инфекционным WT и производит свыше 10 4 очаги образующих единиц / мл инфекционного частицы.
Мы также установили репортер вирус гепатита укрывательство Renilla люциферазы (Rluc) ген-репортер (Рисунок 5A). Репортер HCV может быть использован для тестирования большое количество мутантных вирусов, а также для высокого содержания скрининга. Здесь мы представляем оценку роста фенотипов WT и Поль-репортер вирусов. Если вирусный геном реплицируется, активность люциферазы увеличит сверхурочные после трансфекции. Повышенные уровни репликации генома могут быть выведены из повышенной активности люциферазы. Таким образом, активность люциферазы косвенно обеспечивает измерение уровня репликации генома. Лизаты собранные с WT или Pol-VIRAL РНК трансфицированные клетки в указанные моменты времени испытывали на люциферазных деятельности. В 6 ч после трансфекции, как WT и Pol-вирусы были подобные мероприятия люциферазы, указывая подобный уровень входного трансфицированной РНК, которые были переведены (рис. 5Б). Однако через 48 часов и 96 часов после трансфекции, вирус WT выставлены увеличенные уровни репликации генома по сравнению с Поль-вируса. Кроме того, вирус WT производится вирусный белок NS3, как проверено с помощью Вестерн-блоттинга (фиг. 5C). Впоследствии, мы протестировали инфекционность WT и Поль-репортер вирусов путем посева наивные Хух-7.5.1 клетки с бесклеточных супернатантах, собранных из 48 часов и 96 часов после трансфекции клеточных культурах. Pol-вирус имел активность люциферазы базового уровня, в то время как вирус WT было 2-3 журнала высокий уровень репликации, что и Поль-репортера вируса (рис. 5D). Результаты показывают, что у нас есть надежный ВГС инфекционное Cultu клеток Re системы.
Рисунок 1. Общая схема процесса анализа репликации ВГС. Линеаризованная HCV плазмиды конструкцию, содержащую РНК-полимеразы Т7 промотор (T7P) подвергается в пробирке транскрипции. Очищенный РНК HCV геном электропорации в Huh-7.5.1 клеток и высевали в колбы и 48-луночный планшет. На 4 ч, 48 ч и 96 ч после трансфекции, клеточную РНК и культуральные супернатанты собирают из колб. Клетки из 48-луночного планшета используются для уборки белка лизата и фиксируются для иммунофлуоресцентного анализа. Число Геном копия анализ RT-КПЦР, вестерн-блоттинга и измерения титр вируса проводятся, чтобы оценить репликацию HCV.
1362fig2highres.jpg "ширина =" 400 "/>
Рисунок 2. Производство HCV геномных РНК по транскрипции в пробирке, построенных плазмидных ДНК. А) Геномная организация J6CF/JFH-1 intragenotype 2а химерных вирусов, FNX-ВГС и FNX-HCV-Поль нуль. Штамм область J6CF (5'NTR в части NS2) изображен темно-серого цвета и деформации области JFH-1 (часть NS2 к 3'NTR) отображается в светло-серый. NS5B полимеразы мутация каталитический домен (ДДГ, чтобы AAG) обозначается звездочкой. B) операций, связанных генерации линеаризованную плазмиды HCV. Гель картина показывает линеаризованные, с тупыми концами плазмиды ДНК, произведенные Xba I и маш нуклеазой, готовые к в пробирке транскрипции. 0,8% агарозном геле был использован для решения ДНК. С) Гель картина изображает HCV генома РНК, произведенные в пробирке транскрипции с использованием Т7 РНК полимеразы системы. WT: дикого типа; Pol-полимеразная нуль; М:маркер.
Рисунок 3. Оценивая фенотипы роста конструкций HCV. А) Оценка кинетики репликации генома дикого типа (WT) и полимеразной нуль (Pol-) вирусов. Цифры геном копирования из смысловой РНК нити оцененной с помощью ОТ-количественной ПЦР представлены в гистограмме. Вирусный геном копии Pol-вируса снизилась за период времени с указанием репликации с дефицитом фенотип. B) Относительный уровень репликации генома дикого типа ВГС по сравнению с Поль-вируса. C) Вестерн-блот анализ экспрессии белка ВГС. Белок NS3 HCV обнаруживается и бета-актина используется в качестве клеточного контроля. D) иммунофлуоресцентного анализа для исследования репликацию вируса. На 96 часов после электропорации клетки фиксировали и подвергали IMMunostaining для NS5A ВГС белка и двухцепочечной РНК (DS РНК), маркера для промежуточных репликации РНК ВГС. Ядра были визуализированы с Hoechst пятно (Шкала бар 50 мкм). HPT:. часов после трансфекции Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Рассматривая инфекционность дикого типа HCV и измерения титра вируса. А) Наивное Хух-7.5.1 клетки были использованы для заражения исследований. Бесклеточный супернатант собирали в 48 и 96 ч после трансфекции (ТВД) РНК ВГС были подвергнуты 10-кратного серийного разведения и добавляли к клеткам в 96-луночный планшет трижды. 72 часа после заражения, клетки фиксировали и иммунологически окрашивали для NS5A HCV белок. Клетки с NS5A положительное окрашивание (красный) заражены вирусом. Для оценки очагов формирующего устройства (ФФУ), положительный очаги на самом высоком разведении были подсчитаны. Типичные панели приведены изображений (Шкала бар 100 мкм). B) Средние значения и стандартные отклонения титра вируса в ФФУ на миллилитр показаны на графике. Полимеразной нуль мутант не производят инфекционных частиц. WT: дикого типа; Pol-:. Полимеразной нуль Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Оценивая репликации генома и инфекционность репортера ВГС. А) мультфильм intragenotype 2а химерный вирус репортера представлен. Ген люциферазы Renilla вставляется inframе между 5'NTR и сердцевины. б) кинетика репликации генома дикого типа и мутантных Pol-репортер вирусов по указанной временных точках после трансфекции показано на графике. Белковые лизаты собирали через 6 ч, 48 ч и 96 ч точек времени для измерения Renilla ферментативную активность люциферазы. Среднее значение и стандартное отклонение вычисляется из трех параллельных значений люциферазных Renilla (RLV) для каждого вируса представлены на графике. C) Вестерн-блоттинга панель показывает экспрессию белка ВГС NS3. Не-специфический антиген обнаружен NS3 первичного антитела действует как управления загрузкой. Дикого типа (WT) вирус репортер производит высокий уровень белка NS3. D) анализ инфекционности вируса. Наивные Ха-7.5.1 клетки инокулировали в бесклеточной надосадочной жидкости, полученной из культуры трансфицированных на 48 ч и 96 ч времени. Renilla люциферазы деятельность инфицированных клеток были измерены при 48 ч после инфекции.Средние значения со стандартным отклонением показаны на графике. Вирус Pol-репортер зараженные клетки был только фоновый уровень активности люциферазы, в то время как вирус WT репортер выставлены высокий уровень инфекционной.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта иллюстрация описывает способ анализа цикл репликации вируса гепатита С. ВГС является человеческий патоген, и предписанная протокол биобезопасности должны быть строго соблюдены. Инфекционные системы HCV клеток культуры были описаны ранее 11-13,16,17. Есть несколько важных моментов мы внедряем, когда после иллюстрированный протокол. Во-первых, это имеет большое значение, чтобы иметь хорошее качество неповрежденной полной длины вирусной геномной РНК для последующих исследований. Входной плазмида, несущая вирусную кДНК должен быть линеаризованы и притупляются тщательно. Маш-бобов нуклеаза занятых притупить Xba I свес является неспецифическим нуклеазы и длительной инкубации может привести к повреждению или деградации 3 'конце вирусного генома. Нуклеазы должен быть удален сразу после указанного 30-минутной инкубации путем экстракции фенол-хлороформ или очистки анионообменной колонки. Добыча Гель нуклеазы обработанной ДНК не может быть рекомендован в качествефермент активен в процессе гель-электрофореза.
Для последующего в пробирке шагов транскрипции РНК, как правило, один также примет широкого спектра действия меры предосторожности для минимизации рибонуклеазу (РНКазы) загрязнение. Все реагенты и материалы, используемые следует РНКазы. Для создания высококачественного геномной РНК с минимальной РНК разрывов ДНК, РНК должны подвергаться малой физической нагрузки, избегая суровую вихревание и повторяющегося пипетирование во время очистки и последующих стадиях обработки. После завершения транскрипции РНК, шаблоны ДНК вход плазмиды должны быть удалены от транскрибируется РНК смеси по-аз (РНКазы) лечения. Неполное удаление может привести к переносу ДНК плазмиды в трансфицированных клеток и влияет на количественную оценку абсолютной генома числа копий реплицированную вирусной РНК. Следовательно использовать ДНКазы фермента при концентрации 1 единица на микрограмм ДНК и также имеющий дополнительные 15 мин инкубации при ДНКазы 37 º C можетпомочь. Транскрипции РНК может быть очищен с помощью либо экстракцией фенол-хлороформ или анионообменную колонку. Следует принимать меры предосторожности, чтобы избежать уноса фенола или других реагентов к очищенной РНК образца, который может быть цитотоксическое и мешать молекулярных анализов.
Для целей электропорации, очищенный РНК должен быть растворен в РНКазу стерильной водой. Если осадок РНК трудно растворим, нагрева образца до 65 ° С в течение 5 мин помогут. После завершения транскрипции, важно, чтобы немедленно сохранить РНК в 10 мкг аликвот рабочих сделанных в РНКазы свободной воды при температуре -80 ° С. Цель аликвоты, чтобы предотвратить повторный замораживания / оттаивания, опосредованной деградации РНК. Для достижения одинаковых результатов эксперимента, рекомендуется, чтобы расшифровать все образцы и элементы управления в то же время. Высокое качество РНК рекомендуется для более высокой выхода вируса титра. Для трансфекции ВГС геномной РНК, полимер и липидов основе трансфекции агенты могут также бе используется 21,22.
Вирусные и принимающие факторы оказывают большое влияние кинетики роста штаммов HCV. Гепатомы человека клеточной линии (Huh-7) производные 7,5-Ха, Ха-7.5.1 и клеточные линии Huh7-Lunet обычно используются для оценки вирусной 11-13,15 роста. Пик вирусной производство JFH-1 штамма в Huh7-Lunet клеток на 3-4 дня после трансфекции, тогда как в Хух-7.5.1 клеток это на 21 дня после трансфекции 13,15. Intragenotype 2а химерный вирус FNX-ВГС, имеющих не-структурные гены от JFH-1 штамма имеет пиковую титр на 4 дня после трансфекции в Хух-7.5.1 клеток 19,20. Для вирусного продукции из экстракорпоральное транскрибируется РНК, является предпочтительным рано проход гепатомы человека клеточной линии. Вирусный производство значительно сокращается время использования Хух-7.5.1 клетки над пассажа 20. Для обеспечения повышенную живучесть клеток после электропорации, таял Хух-7.5.1 клетки допускаются период две недели восстановления, прежде чем проводить эксперимент и почтаntained в 12% -15% FBS. Наряду с этим критерием, ресуспендирования клеток в питательной среде, содержащей 15% FBS сразу после электропорации повышает выживаемость клеток позволяет лучше вирусной производства. После первого временного 8 час точке, клетки затем перешел на среде, содержащей 10% FBS. Чтобы свести к минимуму перенести распада клеток, вирусная супернатант культуры подвергается центрифугирования и фильтрации через 4 микронный фильтр. В неконцентрированные или концентрированные вирусные супернатанты аликвоты и хранили в -80 ° С для дальнейшего в пробирке и в естественных экспериментов. Эти меры предосторожности и предложения могут помочь исследователям для успешного выполнения анализ HCV цикла репликации.
Другой вариант репортера ВГС, что таит в себе ген-маркер, такие как флуоресцентный белок и секретируется виде Gaussia люциферазы (Gluc) описаны для исследования HCV 18,23,24. Для исследователей упором на расследование ВГСгенома репликация, ВГС суб-геномной Репликон (отсутствует ядро генов в NS2) является ценным 9,10 инструментом. Репликоны HCV не являются инфекционными, таким образом, требуют меньше правил биологической безопасности и проще работать с по сравнению с инфекционным гепатитом культуры клеток и клинических изолятов. ВГС дефицит NS5B полимеразной активности является одним из важнейших управления для изучения 11,12 репликации ВГС цикла. ВГС не хватает гликопротеинов (дельта E1E2), или P7-NS2 деятельности могут быть полезными управления для исследований с участием запись HCV, вириона морфогенез и выход 12,19,25-27.
Что касается ограничений, в настоящее время инфекционный система культуры клеток доступен только для генотипов ВГС 1 и 2. Аутентичные вирусные штаммы принадлежат генотипы с 3 по 6, которые способны расти эффективно в культуре клеток еще не были идентифицированы. Intergenotypic рекомбинантные вирусы являются полезными альтернативы для изучения цикл репликации различных генотипов. Репликация компетентным химерный вирус harboriЯдро нг до NS2 области от генотипов 1 до 7 и остальная часть последовательности от JFH-1 генотип 2а генома были описаны 15,18. Другим ограничением является то, что вирусный выход JFH-1 и его производных химерных штаммов находится в диапазоне от 10 3 до 10 6 на мл, которая является относительно низким по сравнению с другими РНК-содержащих вирусов, таких как полиомиелит и гриппа. Штамм вируса гепатита с устойчивым ростом должна быть разработана. Будущее исследование включает в себя использование репортера ВГС для высокой пропускной скрининга библиотеки для выявления мощные противовирусные препараты и сосредоточиться на развитии вакцин-кандидатов для профилактики инфекции HCV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Non essential amino acid | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red | Life Technologies | 11058-021 | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center | |
| Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) | Cedars-Sinai Medical Center | The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. | |
| XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145S | |
| Mung Bean Nuclease | New England Biolabs Inc. | M0250S | |
| T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Electroporation Cuvette (4 mm) | Bioexpress | E-5010-4 | |
| Gene Pulser Xcell Total System | Bio-Rad | 165-2660 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| PVDF membrane package | Bio-Rad | 162-0263 | |
| Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531XTU | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] | Abcam | ab65407 | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] | Abcam | ab13830 | |
| Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents | GE Healthcare Life Sciences | RPN2236 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| ViiA 7 real-time PCR system | Life Technologies | NA | |
| Renilla Luciferase Assay System kit | Promega | E2810 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| GloMax-Multi Detection System (Luminometer) | Promega |
References
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
- Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
- Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).
- Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
- Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
- Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
- Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
- Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
- Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
- Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
- Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
- Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
- Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
- Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
- Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
- Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
- Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
- Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
- Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
- Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
- Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
- Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
- Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).
