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Immunology and Infection

Un protocolo para el análisis de la hepatitis C de replicación del virus

Published: June 26, 2014 doi: 10.3791/51362
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Liver Program at Regenerative Medicine Institute, Department of Biomedical Sciences, Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA
* These authors contributed equally

Abstract

Virus de Hepatitis C (VHC) afecta a 3% de la población mundial y causa graves enfermedades del hígado incluyendo hepatitis crónica, cirrosis y carcinoma hepatocelular. El VHC es un virus de ARN con envoltura que pertenece a la familia Flaviviridae. El tratamiento actual no es totalmente eficaz y causa efectos secundarios adversos. No existe una vacuna contra el VHC disponible. Por lo tanto, se requiere un esfuerzo continuado para el desarrollo de una vacuna y mejor terapia. Un sistema de cultivo celular VHC es crítica para el estudio de varias etapas de crecimiento del VHC incluyendo la entrada del virus, la replicación del genoma, el envasado, y la salida. En el procedimiento actual presentado, se utilizó un virus de tipo salvaje intragenotype 2a quimérico, FNX-VHC, y un virus FNX-Rluc recombinante que lleva un gen indicador de luciferasa de Renilla para estudiar la replicación del virus. Una línea celular de hepatoma humano se utilizó (basa Huh-7) para la transfección de transcritos in vitro de VHC ARN genómicos. Sobrenadantes de cultivo libres de células, lisados ​​de proteínas y tARN otal se recogieron en varios puntos de tiempo después de la transfección para evaluar el crecimiento del VHC. VHC estado de la replicación del genoma se evaluó mediante RT-PCR cuantitativa y la visualización de la presencia de VHC ARN de doble cadena. La expresión de la proteína del VHC se verificó por transferencia de Western y ensayos de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos para las proteínas del VHC NS3 y NS5A. Células transfectadas de ARN del VHC liberadas partículas infecciosas en sobrenadante de cultivo y el título viral se midió. Se utilizaron ensayos de luciferasa para evaluar el nivel de replicación y la infectividad del VHC reportero. En conclusión, se presentan varios ensayos virológicos para la caracterización de las diferentes etapas del ciclo de replicación del VHC.

Introduction

Virus de Hepatitis C (VHC) causa la cirrosis y cáncer de hígado. Afecta a 170 millones de personas en todo el mundo, con 350.000 personas que mueren cada año 1-3. El VHC es un virus ARN de cadena positiva con un tamaño de genoma de 9,6 kb. El genoma del HCV se traduce como una sola poliproteína de ~ 3.000 residuos de aminoácidos que se escinde proteolíticamente por diversas proteasas celulares y virales en 10 polipéptidos. VHC es el virus prototipo del género Hepacivirus y pertenece a la familia Flaviviridae 4. Tras la exposición, el VHC establece la infección crónica en el 80% de los individuos. La infección generalmente es asintomática y oportuno diagnóstico puede permitir la intervención terapéutica para evitar el deterioro del hígado. El tratamiento actual es subóptimo y no se dispone de vacuna 5,6.

La etiología de la hepatitis C fue descrita por primera vez en 1989 7. Estudiar la replicación del VHC es importante para la vacuna contra la hepatitis C y la investigación del tratamiento, pero había sidolargo obstaculizada por la falta de un sistema de cultivo viral eficiente. Un clon molecular del VHC ha demostrado ser infecciosa en los chimpancés a la inoculación intrahepática 8. Posteriormente, replicones del VHC sub-genómicas se describen, lo que permitió a diseccionar la etapa de la replicación del genoma viral en un 9,10 sistema de cultivo celular. El descubrimiento de un VHC genotipo 2 bis aislar JFH-1 (hepatitis fulminante-1 japonés), capaz de infectar un cultivo celular abierto nuevas vías para la investigación la replicación del VHC 11-13. Cepa del genotipo 2 bis JFH-1 basada virus quiméricos inter e intra-genotípica y el genotipo 1 del VHC sistemas de cultivo basados ​​infecciosas son disponibles también 14-18.

Hemos utilizado con éxito JFH-1 cepa y VHC intragenotype 2a virus quimérico obtener el mapa de alta resolución del perfil funcional de los dominios de la proteína y cis-elementos que actúan de ARN 19,20. De acuerdo con esto, aquí se describe un sistema de cultivo eficaz utilizado rutinariamente que permiteel estudio de las diversas etapas del ciclo de replicación del VHC y la interacción huésped-patógeno. Presentamos los ensayos virológicos para evaluar la replicación del genoma viral y la infectividad de novo de intragenotype VHC 2a y un reportero de VHC basado en la luciferasa de Renilla.

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Protocol

Un esquema general del protocolo se ilustra en la Figura 1.

1. Las células

  1. Preparar medio de crecimiento completo que contiene suero de 10-15% de bovino fetal (FBS), 10 mM de aminoácidos no esenciales, 10 mM de Hepes, penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 mg / ml), y 2 mM de L-glutamina.
  2. Mantener Huh-7.5.1 células 13 en medio de crecimiento completo que contienen los suplementos anteriores para el análisis in vitro de la hepatitis C ciclo de replicación viral.
  3. Cepas virales Cultura en Huh-7.5.1 células con el medio de cultivo complementado especificada a 37 ° C con 5% de CO 2.

2. Virus y Construcciones de plásmidos

  1. Generar la forma complementaria de ADN (ADNc) del ARN del VHC y clonar en un vector plásmido para la facilidad de manipulación genética. Nota: El descubrimiento de los japoneses hepatitis fulminante 1, JFH-1 (genotipo 2a HCV), aísle ha sido fundamental para la investigación y el VHC esutilizado principalmente para estudiar el ciclo de 11-13 replicación del VHC. Virus quiméricos inter e intragenotypic basados ​​en JFH-1 del VHC se utilizan comúnmente en la investigación 14-18. Construcción de intragenotype 2a sintética virus quimérico, FNX-VHC, y una cepa reportera quimérico monocistronic fue descrito previamente 19 y los detalles de construcción están más allá del alcance de este protocolo.
  2. Utilice el virus intragenotype 2a pFNX-VHC, ya que contiene una NTR 5 ', regiones y P7 estructurales, y parte de las regiones no estructurales NS2 (nucleótidos 1 hasta 2878) de la cepa parental J6CF (NCBI n º de acceso. AF177036), como así como los componentes no estructurales de la JFH-1 cepa viral (NCBI n º de acceso. AB047639). Nota: FNX-VHC se sintetizó basándose en la secuencia de Jc1 intragenotype 2a VHC quimérico se informó anteriormente 15.
  3. Generar un constructo monocistrónico quimérico reportero viral, el pFNX-Rluc, basado en la cepa pFNX-VHC (antes en la etapa 2.2) mediante la inserción de un Rgen de la luciferasa enilla entre el 5 'NTR y el gen del núcleo (entre nt 388 y 389). Posteriormente, conecte el gen de la luciferasa y el gen del núcleo de esta construcción usando un 2A del virus de la fiebre aftosa (F2A) secuencia del péptido, que funcionaría como una señal de la escisión.
  4. Ingeniero de la ARN polimerasa nulo (Pol-) construcción viral utilizando el pFNX-VHC o el fondo viral pFNX-Rluc. Reemplazar los residuos catalíticos de la polimerasa NS5B, GDD (aa 2759-2761; nt 8615 a 8.623), de cualquiera de estas cadenas principales virales con residuos de aminoácidos de la AAG.

3. In vitro el ARN del VHC Transcripción

  1. Utilice un intragenotype 2a quimérico virus FNX-HCV y nulo Pol FNX-HCV (Pol-) HCV para la evaluación de la replicación viral (Figura 2A).
  2. Linealice los plásmidos virales con la enzima de restricción XbaI y después tratar con nucleasa de judía mung para generar extremos romos. Purifica los plásmidos digeridos por cromatografía de intercambio de aniones. Verificar la integridad of el plásmido linealizado de ADN sometiendo a electroforesis en gel de agarosa (Figura 2B).
  3. Transcribir los plásmidos virales linealizadas utilizando la T7 ARN polimerasa.
  4. Se purifica el ARN tratado con DNasa recién sintetizado usando un kit de purificación de ARN.
  5. Verifique la producción de ARN mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 2C).
  6. Cuantificar el RNA por espectrofotometría.
  7. Almacenar el ARN generados en -80 ° C en 10 g alícuotas de trabajo. Nota: Para minimizar la variación de la calidad del ARN dentro de cada diseño experimental por la transcripción de todos los ARN para cada muestra viral y de control al mismo tiempo.

4. VHC ARN transfección y toma de muestras

  1. Recoger las células Huh-7.5.1 usando tripsina.
  2. Para enjuagar las células, centrifugar y resuspender la suspensión dos veces con los medios de comunicación en frío bajo suero. Resuspender las células en medios de baja de suero con 1 x 10 7 células por ml.
  3. Mezclar con un total de 10 & #956; g de ARN viral transcrito con 400 l de células resuspendidas (4 x 10 6 células) en una cubeta de electroporación de 0,4-cm. Transfectar las células mediante electroporación a 270 V, 100 Ω y 950 mF.
  4. Resuspender las células a electroporación en 10 ml de medio de crecimiento completo con 15% de FBS. Nota: El aumento de la supervivencia de las células sometidas a electroporación se observa cuando las células Huh-7.5.1 se cultivaron en 15% suero bovino fetal.
  5. Placa de las células en los dos matraces T-25 (~ 1,2 x 10 6 células por matraz) y las placas de 48 pocillos (1 x 10 4 células por pocillo) para cada uno de los siguientes puntos de tiempo: 4, 48 y 96 h.
  6. Reemplazar los medios de comunicación a 4-8 h después de la transfección con medio de crecimiento suplementado fresco con 10% de FBS para eliminar los residuos de células muertas de los matraces y placas de cultivo.
  7. Sobrenadantes de cultivo celular de cosecha en los 48, 96 puntos de tiempo hr y eliminar los desechos celulares de las muestras recogidas por centrifugación de las células a 1.500 rpm durante 10 min a 4 º C.
  8. Almacene los sobrenadantes libres de células a -80 º C. Lisar las células para la proteína y el análisis por Western blot de ARN y la transcripción inversa-PCR cuantitativa en los puntos de tiempo indicados.

5. Transcripción inversa-PCR cuantitativa (RT-qPCR) para la evaluación de las copias del VHC Genoma

  1. Realice una de dos etapa de RT-qPCR para determinar el número de copias de ARN genómico del VHC.
  2. Transcribir inversamente 1 g de ARN celular total utilizando la transcriptasa inversa y un cebador específico para el VHC cadena con sentido que se une a NTR 5 '(JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3') o un cebador específico para el gen de mantenimiento peptidilprolil isomerasa G (R ppig : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '). También transcribir inversamente FNX-HCV RNA (generado en el paso 3) de copias del genoma conocidos (enero 10-09 10 estándar), utilizando el sentido del VHC primer capítulo.
  3. Llevar a cabo qPCR utilizando 50 ng del ADNc transcrito resultante utilizando cebadores específicos de HCV (JFH RTQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') y el ADN vinculante tinte verde que contiene qPCR súper mezcla. Realice qPCR para la limpieza gen ppig también (cebadores ppig F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; ppig R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') Nota: Para calcular el nivel de ARN del VHC intracelular exacta a través de muestras, utilice gen de mantenimiento celular, ppig , el nivel de expresión (ciclo Ct) para la normalización. Utilice el número de copias del genoma FNX-VHC como el estándar para la determinación del número de copias.
  4. Utilice las siguientes condiciones cuando se ejecuta qPCR para determinar el número de copias de ARN del VHC: 95 º C durante 15 segundos y 60   º C durante 30 segundos (40 ciclos) usando el sistema de PCR en tiempo real.
  5. Véanse las Figuras 3A y 3B para resultados replicación del genoma.

6. Análisis Western Blot para detectar la expresión de proteínas del VHC (Figura 3C)

  1. Utilice lisados ​​de células FRARN viral om transfectadas a 96 h después de la transfección de proteínas análisis Western Blot.
  2. Resolver el lisado celular utilizando SDS-PAGE y transferencia de difluoruro de polivinilideno (PVDF).
  3. Bloquear la membrana utilizando una solución de bloqueo que contiene leche desnatada 5%, 0,2% de Tween 20 en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  4. Incubar la membrana con el anticuerpo primario monoclonal de ratón NS3 (1 en 1000 de dilución) y beta-actina (1 en 5000 de dilución).
  5. Añadir IgG de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (1 en 5000 de dilución) y detectar por quimioluminiscencia.

7. Ensayo de inmunofluorescencia (IFA)

  1. Fijar las células infectadas con el VHC y se transfectaron usando metanol durante 30 min a -20 º C para el ensayo de inmunofluorescencia.
  2. Lavar la célula con PBS tres veces y bloquear con tampón de bloqueo IFA.
  3. Utilice conejo policlonal anti-NS5A principalmente anticuerpo (amablemente proporcionados por el doctor Dasgupta, UCLA) o monoclonales de ratón anti-DSRNA J2 anticuerpo a una dilución de 1:200 (1 mg / ml) y se incuba durante 5 horas a la noche a 4 º C.
  4. Lavar las células con PBS tres veces después de que el anticuerpo primario.
  5. Añadir cabra anti-IgG de conejo-488 anticuerpo secundario policlonal o anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón-594 anticuerpo secundario policlonal a una dilución 1:1.000 (1 g / ml) e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.
  6. Lavar las células con PBS tres veces y núcleos de tinción utilizando colorante Hoechst y vista con microscopio de fluorescencia (Figura 3D).

8. Titulación de medición Virus

  1. Ingenuos células Plate Huh-7.5.1 en aproximadamente 3 x 10 3 células / pocillo utilizando una placa de 96 pocillos. Al día siguiente, realizar diluciones seriadas de 10 veces de sobrenadante de cultivo libre de células recolectadas a partir de células transfectadas de ARN del VHC utilizando medio de cultivo e inocular por triplicado en Huh-7.5.1 células.
  2. Fijar las células a las 72 horas después de la infección usando metanol (durante 30 min a -20
  3. Utilice la dilución más alta que contar para los focos NS5A positivo y calcular el número medio de foco unidad de formación (UFF) por mililitro. Consulte la Figura 4 para el título del VHC.

9. Renilla Luciferase reportero de ensayo para el genoma viral de replicación e infectividad

  1. Para la evaluación de la replicación del genoma viral, Huh-7.5.1 células de ARN-VHC a electroporación placa por triplicado en placas de 48 pocillos (1 x 10 4 células / pocillo).
  2. Lyse las células con 75 l de tampón de lisis pasiva al 6 horas, 48 ​​horas y 96 horas después de la transfección.
  3. Rock the placas suavemente durante 15 minutos a temperatura ambiente y se almacena a -80 º C.
  4. Para medir la actividad enzimática de luciferasa de Renilla, descongelar el lisado de proteínas y la luciferasa de Renilla reactivos de ensayo a temperatura ambiente.
  5. Añadir 20 l de lisado de proteína por pocillo de una 96-WEL l placa luminiscencia blanca y coloque la placa en un luminómetro.
  6. Vierta 100 l de Renilla luciferasa reactivo de ensayo (sustrato coelenterazina + buffer) por pozo y después de un retraso de 2 segundos antes de la lectura; integrar la luz emitida por 10 seg.
  7. Calcular la media y la desviación estándar para cada muestra a partir de los valores de luciferasa de triplicados biológicos y someter los datos a análisis estadístico (Figura 5).
  8. Para evaluar la infectividad, inocular 500 l de sobrenadante libre de células obtenidas a partir de células de ARN-VHC transfectadas para el tiempo indicado puntos (48 hy 96 h), por triplicado, en células de los animales Huh-7.5.1 en placas de 48 pocillos.
  9. Vuelva a colocar el inóculo viral con 500 l de medio fresco por pocillo después de las 6 horas después de la infección.
  10. Lisar las células en 48 horas después de la infección y sujetos a ensayo de luciferasa de Renilla tal como se describe en los pasos 8.2 a 8.7 (figura 5).
í tulo "> 10. Análisis estadístico

  1. Las barras de error en los gráficos indican las desviaciones estándar (DE). Los valores de p se calcularon por el test t no apareado.

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Representative Results

Virus de la hepatitis C es un virus de ARN. Por lo tanto para el propósito de la manipulación genética, el ADNc genómico del VHC ha sido clonado en un plásmido vector bacteriano. Una secuencia promotora de ARN polimerasa de T7 se introdujo inmediatamente antes del extremo 5 'del genoma del VHC. Un esquema general de flujo de trabajo de análisis de VHC se presenta en la Figura 1. Para generar ARN genómico del VHC con el extremo precisa 3 ', del genoma del VHC que contiene el plásmido se cortó con la enzima de restricción Xba I y el saliente monocatenario generado se romo con la digestión de nucleasa de judía mungo . La calidad del plásmido linealizado VHC se evaluó por electroforesis en gel de agarosa (Figura 2B). El ADN del VHC se sometió a ARN polimerasa de T7 mediada por la transcripción in vitro y el ARN resultante produjo un solo producto a 9,6 kilobases (Figura 2C).

Pusimos a prueba la cinética de crecimiento de un intragenotype 2a VHC (Figura60, 3). Las células Huh-7.5.1 se electroporated con ARN transcrito in vitro de tipo salvaje (WT) y la polimerasa del virus nulos. Evaluamos el sentido replicación del genoma viral por RT-qPCR. Los resultados indicaron que el WT virus replica el genoma de manera eficiente (figuras 3A y 3B). La de tipo salvaje exhibió dos y cincuenta y nueve de registro mayor nivel de replicación del genoma en comparación con la de Pol-virus. El WT virus produce la proteína NS3 (Figura 3C) que está implicado en la escisión de proteínas virales (actividad de la proteasa), y la replicación del genoma (la actividad helicasa). También el WT virus expresó la proteína NS5A tal como se evaluó mediante el ensayo de inmunofluorescencia (Figura 3D). Proteína NS5A es parte del complejo de replicasa ARN del VHC. Para visualizar la replicación del genoma viral, se examinó la presencia de ARN de doble cadena (ds) de HCV usando un anticuerpo que reconoce específicamente ARN de doble cadena. Durante la amplificación del genoma del VHC, la cadena con sentido de ARN es Copied al genoma anti-sentido, por lo tanto los dobles intermedios de ARN de cadena están presentes en el citoplasma de la célula infectada. La proteína NS5A y dsRNA co-localiza en el citoplasma celular (Figura 3D) de las células transfectadas WT que sugieren la replicación viral activa. En su conjunto, el WT virus estableció replicación activa en las células transfectadas Huh-7.5.1.

Los avances en la investigación del VHC se ha limitado debido a la falta de un sistema de cultivo de células infecciosas. El descubrimiento de JFH-1 cepa de VHC y la posterior caracterización de cepas de laboratorio quiméricos nos permitió investigar todo el ciclo de replicación del VHC en cultivo celular incluyendo la entrada viral, la traducción del ARN, la replicación del ARN y la formación de la progenie viral infecciosa. Para evaluar el título de VHC y la infectividad de novo, se inocularon los sobrenadantes de cultivo de células recolectadas a partir de células transfectadas de ARN del VHC. La infección por el VHC se visualizó mediante la detección de la proteína NS5A del VHC y calculael título viral contando el focos infecciosos (Figura 4). Consideramos aislado grupo de células (más de 2 células) positivos para NS5A como un único foco. Los resultados indicaron que el WT virus es contagioso y produce más de 10 4 focos forman unidades / ml de partículas infecciosas.

También establecimos un reportero virus HCV albergar Renilla luciferasa (Rluc) gen reportero (Figura 5). Un reportero del VHC puede ser utilizado para las pruebas de gran número de virus mutantes, así como para ensayos de selección de alto contenido. Aquí presentamos la evaluación de los fenotipos de crecimiento de WT y virus Pol-reportero. Si el genoma viral se replica, la actividad de la luciferasa se incrementaría mensaje sobretiempo transfección. El aumento de los niveles de replicación del genoma se pueden deducir de aumento de la actividad de la luciferasa. Por lo tanto, la actividad de la luciferasa proporciona indirectamente la medición del nivel de la replicación del genoma. Los lisados ​​cosechadas a partir de WT o Pol-VIARN RAL células transfectadas en los puntos de tiempo indicados se ensayaron para determinar las actividades de luciferasa. A las 6 horas después de la transfección, ambos WT y Pol-virus tuvieron luciferase actividades similares, lo que indica el nivel de entrada similar de ARN transfectado que había sido traducido (Figura 5B). Sin embargo, en 48 horas y 96 horas después de la transfección, el WT virus exhibieron aumento de los niveles de replicación del genoma en comparación con la de Pol-virus. Asimismo, el WT virus produce proteínas NS3 del virus que se han verificado por análisis de Western Blot (Figura 5C). Posteriormente, se evaluó la infectividad del virus WT y Pol-reportero inoculando ingenuo células Huh-7.5.1 con los sobrenadantes libres de células recolectadas de 48 horas y 96 cultivos de células de correos transfectadas hr. El virus Pol tenido actividad luciferasa a nivel de base, mientras que el WT virus tenía 2-3 registro más alto nivel de replicación con la de Pol-reportero virus (Figura 5D). Los resultados demuestran que tenemos un HCV robusta cultu célula infecciosa re sistema.

Figura 1
Figura 1. Esquema general de análisis de la replicación del VHC flujo de trabajo. Linealizada plásmido constructo VHC que contiene T7 promotor de ARN polimerasa (T7P) sometido a transcripción in vitro. El genoma de ARN del VHC purificada se sometió a electroporación en células Huh-7.5.1 y chapada en frascos y placa de 48 pocillos. A las 4 h, 48 h, y 96 h después de la transfección, el ARN celular y la cultura sobrenadantes se recogen de los matraces. Las células de placa de 48 pocillos se utilizan para la cosecha proteína lisado y se fijan para el ensayo de inmunofluorescencia. El análisis del número de copias del genoma por RT-qPCR, título viral secante y medir Occidental se realizan para evaluar la replicación del VHC.

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Figura 2. Producción de VHC ARN genómicos por transcripción in vitro de ADN de los plásmidos construidos. A) Organización genómica de los J6CF/JFH-1 intragenotype 2a virus quiméricos, FNX-HCV y FNX-VHC Pol nulo. La región cepa J6CF (NTR 5 'a una parte de NS2) se representa en color gris oscuro y la región cepa JFH-1 (parte de NS2 a 3'NTR) se muestra en color gris claro. NS5B polimerasa mutación dominio catalítico (GDD a AAG) se indica con un asterisco. B) Pasos involucrados en la generación de plásmido linealizado VHC. Foto del gel muestra los ADN linealizado, de extremo romo del plásmido producidos por Xba I y la digestión nucleasa de judía mungo, listos para la transcripción in vitro. 0,8% de gel de agarosa se ​​utilizó para resolver el ADN. C) representa la imagen del gel de los ARN genómicos del VHC producidos por transcripción in vitro usando el sistema de polimerasa de ARN de T7. WT: de tipo salvaje; Pol-: null Polimerasa; M:marcador.

Figura 3
Figura 3. Evaluación de los fenotipos de crecimiento de las construcciones de HCV. A) La evaluación de la cinética de replicación del genoma de tipo salvaje (WT) y la polimerasa nula virus (Pol-). Los números de copias del genoma de ARN de hebra sentido evaluado por RT-qPCR se presentan en el gráfico de barras. Las copias del genoma viral de Pol-virus disminuyó durante el período de tiempo que indica la replicación del fenotipo deficiente. B) relativa nivel de replicación del genoma de VHC de tipo salvaje se compara con la de. C) Análisis de transferencia de Western de la expresión de proteínas del VHC Pol de virus. La proteína NS3 del VHC se detecta y beta-actina se utilizó como control celular. D) Ensayo de inmunofluorescencia para la investigación de la replicación viral. A las 96 horas después de la electroporación las células se fijaron y se sometieron a IMMunostaining para la proteína NS5A de VHC y ARN de doble cadena (ds ARN), un marcador para intermediarios de replicación de ARN del VHC. Los núcleos se visualizaron con tinción de Hoechst (barra de escala 50 micras). HPT:. horas después de la transfección Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Examinar la capacidad de infección de VHC de tipo salvaje y la medición de título del virus. A) las células Naïve Huh-7.5.1 se utilizaron para estudios de infección. El sobrenadante libre de células recogido a las 48 y 96 horas después de la transfección (hpt) de ARN de VHC se sometió a 10 veces la dilución en serie y se añade a las células en una placa de 96 pocillos por triplicado. 72 horas después de la infección, las células se fijaron y se inmunotiñeron para la proteína NS5A de VHC. Las células con NTinción positiva S5A (rojo) están infectados con el virus. Para la evaluación de focos unidad de formación (UFF), el focos positivos en la dilución más alta se contaron. Paneles representativos de las imágenes se muestran (barra de escala 100 micras). B) Valores medios y desviaciones estándar de título viral en uff por mililitro se muestran en el gráfico. El mutante nulo polimerasa no produjo partículas infecciosas. WT: de tipo salvaje; Pol-:. Nula Polimerasa Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La figura 5
Figura 5. Evaluación de la replicación del genoma y la infectividad del VHC reportero. A) Se presenta una caricatura del reportero virus quimérico intragenotype 2a. El gen de la luciferasa de Renilla es infram insertadae entre NTR 5 'y el núcleo. B) La cinética de replicación del genoma de tipo salvaje y virus reportero Pol-mutantes en el tiempo indicado puntos después de la transfección se muestra en el gráfico. Proteína lisados ​​se recogieron a las 6 h, 48 hy 96 h puntos temporales para la medición de la actividad enzimática de luciferasa Renilla. La media y la desviación estándar calculada a partir de valores por triplicado de luciferasa de Renilla (RLV) para cada virus se presentan en el gráfico. C) panel de transferencia Western muestra la expresión de la proteína NS3 del VHC. Un antígeno no específico detectado por NS3 del anticuerpo primario actúa como control de carga. De tipo salvaje (WT) reportero virus produce alto nivel de proteína NS3. D) Análisis de la infectividad del virus. Naïve células Huh-7.5.1 se inocularon con el sobrenadante libre de células obtenido a partir del cultivo transfectadas a las 48 h y 96 puntos de tiempo hr. Se midieron las actividades de luciferasa de Renilla de las células infectadas a las 48 h después de la infección.Los valores medios con desviación estándar se muestran en el gráfico. El virus de Pol-reportero células infectadas sólo tenían nivel de fondo de la actividad de la luciferasa, mientras que el virus reportero PESO exhibió alto nivel de infectividad.

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Discussion

Esta ilustración describe un método para analizar el ciclo de replicación de la hepatitis C virus. HCV es un patógeno humano y el protocolo de bioseguridad prescritas tendrá que ser seguido estrictamente. Sistemas de cultivo celular de VHC infecciosas se han descrito anteriormente 11-13,16,17. Hay algunos puntos cruciales que implementamos cuando se sigue el protocolo ilustrado. En primer lugar, es de gran importancia para tener una buena calidad de intacta longitud viral ARN genómico completo para estudios posteriores. El plásmido de entrada que lleva el ADNc viral tiene que ser linealizado y romo cuidadosamente. La nucleasa mung-bean empleadas para embotar el voladizo XbaI es una nucleasa no específica y la incubación prolongada puede causar daños o degradación del extremo 3 'del genoma viral. La nucleasa tiene que ser eliminado inmediatamente después de la especificada 30 min de incubación por extracción con fenol-cloroformo o purificación en columna de intercambio aniónico. Extracción del gel de nucleasa tratada ADN no puede ser recomendada como laenzima es activa durante el proceso de electroforesis en gel.

Para la posterior en los pasos de transcripción de ARN in vitro, por lo general, uno va a tomar también precauciones de amplio espectro para minimizar ribonucleasa (RNasa) contaminación. Todos los reactivos y los materiales utilizados deben ser libre de RNasa. Para generar el ARN genómico de alta calidad con ARN de cadena mínimo descansos, necesitan ser sometidos a menos estrés físico al evitar vórtice dura y pipeteo repetido durante la purificación y pasos de manejo de aguas abajo del ARN. Después de la terminación de la transcripción del ARN, las plantillas de ADN de plásmido de entrada tienen que ser eliminado de la mezcla de ARN transcrito por tratamiento con DNasa (libre de RNasa). La eliminación incompleta puede resultar en arrastre de ADN plásmido en las células transfectadas y afectar la cuantificación del genoma absoluta del número de copias de ARN viral replicado. Por lo tanto utilizar enzima DNasa a una concentración de 1 unidad por microgramo de ADN y que tiene también extra de 15 min de incubación a 37 DNasa º C puedeayudar. El ARN transcrito se puede purificar por cualquiera de extracción con fenol-cloroformo o columna de intercambio aniónico. Se debe tener cuidado para evitar el arrastre de fenol u otros reactivos a la muestra de ARN purificado, que puede ser citotóxica e interferir con los análisis moleculares.

Para los propósitos de electroporación, el ARN purificado tiene que ser disuelto en agua estéril libre de RNasa. Si el sedimento de ARN es difícil de disolver, calentando la muestra a 65 º C durante 5 min ayudará. Una vez que la transcripción se ha completado, es importante para almacenar el ARN inmediatamente en 10 g de alícuotas de trabajo realizadas en RNasa libre de agua a -80 º C. El propósito de las alícuotas es para evitar el contacto repetido de congelación / descongelación mediada por la degradación del ARN. Para resultados experimentales consistentes, se recomienda para transcribir todas las muestras y los controles en el mismo tiempo. Se recomienda ARN de alta calidad para un mayor rendimiento título viral. Para la transfección de ARN genómico del VHC, de polímero y de los lípidos basados ​​agentes de transfección pueden también be utiliza 21,22.

Factores virales y del huésped influyen en gran medida la cinética de crecimiento de las cepas de VHC. Derivados de la línea celular de hepatoma humano (Huh-7) Huh-7.5, Huh-7.5.1 y líneas celulares Huh7-Lunet se utilizan comúnmente para evaluar el crecimiento viral 11-13,15. El pico de la producción viral de la cepa JFH-1 en las células Huh7-Lunet es a los 3-4 días después de la transfección, mientras que en las células Huh-7.5.1 es a los 21 días después de la transfección 13,15. El virus quimérico intragenotype 2a FNX-VHC tener genes no estructurales de JFH-1 cepa tiene título máximo a los 4 días después de la transfección en células Huh-7.5.1 19,20. Para la producción viral a partir del ARN transcrito in vitro, se prefiere la línea de paso precoz de células de hepatoma humano. Producción viral se redujo significativamente durante el uso de células Huh-7.5.1 sobre el paso número 20. Para aumentar a la supervivencia celular después de la electroporación, se descongeló Huh-7.5.1 células se les permite un período de una semana de recuperación de dos antes de la realización de un experimento y maintained en el 12% -15% de SFB. Junto con este criterio, la resuspensión de las células en medio de cultivo conteniendo 15% de FBS inmediatamente después de la electroporación aumenta la supervivencia de las células, permitiendo una mejor producción viral. Después de la primera punto de tiempo 8 horas, las células se cambiaron a medio que contenía 10% de FBS. Para reducir al mínimo el arrastre sobre los restos celulares, el sobrenadante de cultivo viral se sometió a centrifugación y filtración a través de filtro de 4 micras. Los sobrenadantes virales no concentrados o concentrados se dividen en partes alícuotas y se almacenaron en -80 º C para su posterior in vitro e in vivo. Estas precauciones y sugerencias pueden ayudar a los investigadores para llevar a cabo con éxito el análisis de ciclo de replicación del VHC.

Otra variación de VHC reportero que alberga un gen marcador tal como la proteína fluorescente y una forma secretada de la luciferasa Gaussia (Gluc) se describen para la investigación del VHC 18,23,24. Para los investigadores se centra en la investigación de HCVreplicación del genoma, sub-genómica replicón de HCV (que carece de los genes del núcleo a NS2) es una valiosa herramienta de 9,10. Replicones del VHC no son infecciosas, por lo tanto requieren menos regulaciones de bioseguridad y más fácil de trabajar en comparación con el VHC cultivo de células infecciosas y aislados clínicos. VHC deficiente en actividad de la polimerasa NS5B es un control crítico para el estudio de ciclo de 11,12 replicación del VHC. VHC carente glicoproteínas de la envoltura (delta E1E2), o de la actividad-p7 NS2 puede haber controles útiles para estudios con la entrada del VHC, la morfogénesis del virión y salida 12,19,25-27.

En cuanto a las limitaciones, actualmente el sistema de cultivo de células infecciosas está disponible sólo para los genotipos del VHC 1 y 2. Cepas virales auténticas pertenecen a los genotipos 3 a 6 que son capaces de crecer de manera eficiente en cultivo celular aún no se ha identificado. Virus recombinantes intergenotypic son alternativas útiles para el estudio de ciclo de replicación de varios genotipos. Replicación Harbori virus quimérico competenteng núcleo a la región NS2 de los genotipos 1 a 7 y el resto de la secuencia de JFH-1 genotipo 2a genoma se describe 15,18. Otra limitación es que el rendimiento viral de JFH-1 y sus cepas quiméricos derivados está en el intervalo de desde 03 10 hasta 06 10 por ml, que es relativamente baja en comparación con la de otros virus de ARN tales como poliomielitis y la influenza. Cepa HCV con un fuerte crecimiento necesita ser desarrollado. Investigaciones futuras incluye el uso del VHC reportero de selección de la biblioteca de alto rendimiento para identificar los antivirales potentes y se centran en el desarrollo de vacunas candidatas para la prevención de la infección por VHC.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Fisher Scientific 10-017-CV
Non essential amino acid Fisher Scientific MT25025CI
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red Life Technologies 11058-021
Huh-7.5.1 The Scripps Research Institute The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center
Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null)  Cedars-Sinai Medical Center The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. 
XbaI New England Biolabs Inc. R0145S
Mung Bean Nuclease New England Biolabs Inc. M0250S
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System Promega P1320
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 mm) Bioexpress E-5010-4
Gene Pulser Xcell Total System Bio-Rad 165-2660
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 Life Technologies A11008
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
PVDF membrane package Bio-Rad 162-0263
Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk Bio-Rad 170-6404XTU
Tween-20 Bio-Rad 170-6531XTU
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] Abcam ab65407
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] Abcam ab13830
Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP)  Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents  GE Healthcare Life Sciences RPN2236
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
ViiA 7 real-time PCR system Life Technologies NA
Renilla Luciferase Assay System kit Promega E2810
RNase-Free DNase Promega M6101
GloMax-Multi Detection System (Luminometer) Promega

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References

  1. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
  2. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
  3. Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
  4. Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).
  5. Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
  6. Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
  7. Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
  8. Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
  9. Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
  10. Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
  11. Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
  12. Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
  13. Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
  14. Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
  15. Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
  16. Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
  17. Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
  18. Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
  19. Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
  20. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
  21. Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
  22. Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
  23. Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
  24. Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
  25. Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
  26. Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
  27. Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).

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Ren, S., Contreras, D., Arumugaswami, V. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (88), e51362, doi:10.3791/51362 (2014).

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